Summary
Denne dyremodel gør det muligt for forskerne at fremkalde statistisk signifikant sekundært lymfom i den bagdel af mus, som varede mindst 8 uger. Modellen kan bruges til at studere lymfophysiologien og til at undersøge nye behandlingsmuligheder.
Abstract
Dyremodeller er af afgørende betydning for forskningen af lymfom, for at forstå sygdommens Patofysiologi, men også for at udforske potentielle behandlingsmuligheder. Denne musemodel giver forskerne mulighed for at inducere signifikant lymfom, som varer mindst 8 uger. Lymfom er induceret ved hjælp af en kombination af fraktioneret strålebehandling og kirurgisk ablation af lymfeknuder. Denne model kræver, at musene får en dosis på 10 grå (Gy) stråling før og efter operationen. Den kirurgiske del af modellen involverer ligering af tre lymfeknuder og ekstraktion af to lymfeknuder fra musens bagled. At have adgang til mikrokirurgiske værktøjer og et mikroskop er afgørende på grund af muternes små anatomiske strukturer. Fordelen ved denne model er, at det resulterer i statistisk signifikant lymfom, som giver et godt grundlag for at evaluere forskellige behandlingsmuligheder. Det er også en stor og let tilgængelig mulighed for mikrokirurgisk træning. Begrænsningen af denne model er, at proceduren kan være tidskrævende, især hvis ikke praktiseres på forhånd. Modellen resulterer i objektivt kvantificerbare lymfom i mus, uden at forårsage alvorlig sygelighed og er blevet testet i tre separate projekter.
Introduction
Lymfom er karakteriseret ved en ophobning af lymfevæske, der fører til lokaliseret vævshævelse, som hovedsagelig opstår på grund af nedsat eller forstyrret strøm af lymfevæske i lymfekarrene1. Lymfe strømmen kan blive forringet eller forstyrret af infektion, obstruktion, tilskadekomst eller medfødte defekter i lymfesystemet2. Disse ætiologier resulterer i ophobning af lymfatisk væske, hvilket fører til en kronisk tilstand af betændelse, resulterer i efterfølgende fibrose, samt aflejring af fedtvæv3. Lymphedema kan kategoriseres som primær eller sekundær lymfom. Primær lymfom er forårsaget af udviklingsmæssige abnormiteter eller genetisk mutation2,4. Sekundær lymfom opstår på grund af underliggende systemisk sygdom, kirurgi eller traumer2,4. Sekundær lymfom er den mest almindeligt forekommende form for lymfom i verden2. I de udviklede lande er den mest almindeligt forekommende årsag til sekundær lymfom er onkologisk behandling såsom adjuverende strålebehandling og lymfeknude dissektion5. Lymfomer er hyppigste blandt brystkræftpatienter, men kan også udvikle hos patienter med gynækolog, melanom, urogenitale eller nakke kræft6. Det er blevet foreslået, at ud af alle kvinder diagnosticeret med brystkræft, 21% vil udvikle lymfom7.
Lymfom kan være stressende for patienten både fysisk og psykisk. Patienter med lymfom har en øget risiko for infektion5,8,9, dårlig livskvalitet og kan udvikle social angst og symptomer på depression10. Komplikationer af kronisk lymfom fører til høje udgifter til pleje og en øget sygdomsbyrde9,11. Fund har også antydet, at lymfom kan være forbundet med øget risiko for død efter brystkræft behandling12. Konservativ ledelse såsom kompression af det berørte område, manuel lymfe dræning og generel hudpleje forbliver den første linje tilgang. Der er i øjeblikket ingen helbredende behandling6. Selv om der er gjort fremskridt inden for kirurgisk og medicinsk behandling, er det stadig plads til forbedring. Mere forskning, der giver indsigt i Patofysiologi og progression af sygdommen, er nødvendig for at give klinikere til at give bedre behandlingsmuligheder for patienterne5.
Dyremodeller anvendes i præklinisk forskning til at forstå Patofysiologi af sygdomme og udvikle potentielle behandlingsmuligheder. Flere forskellige lymfom-dyremodeller er blevet etableret i hjørnetænder13,14, kaniner15, får16, grise17,18 og gnavere19,20, 21,22,23,24. Gnaver modellen synes at være den mest omkostningseffektive model, når man undersøger genopbygningen af lymfe funktionen, fordi gnavere er let tilgængelige og relativt lavpris25. De fleste af de mus modeller har fokuseret på inducerende lymfom i halen af musene21,22,23. Hale modellen er meget pålidelig, men den nøjagtige kirurgiske teknik til inducerende lymfom, varierer betydeligt i tidligere offentliggjorte materialer. Dette resulterer i udsving i varighed og robusthed af det udviklede lymfom, præsenteret i kendt litteratur25. Der anvendes også forskellige teknikker til at inducere lymfom i baglemmer-modellen, og de giver også varierende resultater, men modellen med baglemmer kan være lettere at forstå ud fra et translationelt perspektiv. Tidligere Lymphedema-modeller er blevet hæmmet af spontan lymfom-opløsning, og derfor er der behov for en reproducerbar og permanent lymfafhedema-model25. Forskere har tidligere forsøgt at øge dosis af stråling, for at forhindre spontan lymfom opløsning, men dette har ofte ført til efterfølgende svær sygelighed25.
Denne model resulterer i statistisk signifikant lymfom, uden at forårsage alvorlig sygelighed, ved at kombinere mikrokirurgi med stråling. Modellen er blevet revideret fra en tidligere kirurgisk model ved at tilføje en dosis bestråling, der inducerer lymfom, uden at forårsage alvorlig sygelighed26. Det giver også en fantastisk mulighed for mikrokirurgisk træning. At have adgang til mikrokirurgisk udstyr og et mikroskop er nødvendigt, på grund af musene små anatomiske strukturer. Den kirurgiske procedure kan udføres, når brugeren er blevet undervist grundlæggende mikrokirurgiske teknikker, såsom suturering med mikrokirurgiske instrumenter. De operatører, der udførte denne procedure alle kiggede tutorial videoer af Acland om forudsætningerne for mikrokirurgiske færdigheder (1981) og grundlæggende mikrosutur teknik (1985). Vi anbefaler at øve den kirurgiske procedure 8 − 10 gange, før du bruger den i forskning. Øve proceduren sikrer, at færre fejl er lavet, og at proceduren kan udføres mere effektivt. Når mestrer, kan den kirurgiske procedure udføres i 45 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr blev anbragt på det sydlige Danmarks Universitet for dyrepleje som pr. institutionelle retningslinjer. Alle procedurer, der involverer dyr, er blevet godkendt af Inspektoratet for dyreforsøg, Ministeriet for miljø og fødevarer i Danmark.
1. bestråling før operationen
Bemærk: bestråling forud for operationen finder sted 7 dage før operationen.
- Inducerer anæstesi.
- Placer musen i en induktions boks og sæt vaporizer til 3% isofluran med en iltflow hastighed på 0,8 − 1,2 L/min for at inducere indånding anæstesi.
Bemærk: Alternativt kan injicerbare anæstetika anvendes, men for den korte varighed af bestråling inducerende indånding anæstesi var tilstrækkelig. For at opnå de resultater, der præsenteres i denne artikel, 9-ugers gamle kvindelige C57BL6 mus blev brugt. - Sørg for, at musen er fuldt bedøvet af hale eller pote knibe test.
- Placer musen i en induktions boks og sæt vaporizer til 3% isofluran med en iltflow hastighed på 0,8 − 1,2 L/min for at inducere indånding anæstesi.
- Placer musen til bestråling.
- Hvis fuldt bedøvede, skal du flytte musen fra induktions boksen og placere den under strålekilden i liggende position og forsigtigt fikseres bagbenene med tape.
Bemærk: musen vil forblive bedøvede i den korte varighed af strålingen. - Placer en 1,5 mm tyk blypad for at sikre, at kun det område, der gennemgår operationen (dvs. det cirkulære område med en diameter på 25 mm rundt om knæet) bliver bestrålet.
- Hvis fuldt bedøvede, skal du flytte musen fra induktions boksen og placere den under strålekilden i liggende position og forsigtigt fikseres bagbenene med tape.
- Giv en dosis på 10 Gy stråling ved en dosishastighed på 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
Forsigtig: sikkerhedsforanstaltninger skal træffes, når der arbejdes med stråling. Under dette eksperiment blev al bestråling udført i et strålings isoleret rum, og strålekilden blev kun tændt, når alt personale havde forladt og forseglet rummet. - Placer musen tilbage i sit bur.
2. opsætning af udstyr
Bemærk: kirurgi bør udføres i et rum dedikeret til kirurgiske indgreb. Den operative overflade skal være steril.
- Rengør alle operative overflader grundigt med 70% ethanol. Bær hårnet og overtræksdragter. Brug sterile kirurgiske instrumenter og sterile handsker.
- Forbered anæstesi.
- 1 ml fentanyl (0,315 mg/mL), 1 mL midazolam (5 mg/mL) og 2 mL sterilt vand. Brug forskellige sprøjter og nåle til de forskellige komponenter.
- Bland fentanyl og sterilt vand ved langsomt at tømme sprøjterne i et sterilt glasrør. Tilsæt midazolam, når det blandes, for at færdiggøre arbejdsopløsningen.
- Forbered analgesi.
- 0,2 mL buprenorphin (0,3 mg/mL) og 2 mL saltvand.
- Bland mængderne ved langsomt at tømme sprøjterne i et sterilt glasrør for at fuldføre arbejdsopløsningen.
- Tænd for mikroskopet, og sørg for, at belysningen er tilstrækkelig, og at mikroskopet er godt justeret for operatørens øjne.
Bemærk: alle kirurgiske indgreb skal udføres under et operativt mikroskop. Et forstørrelses interval fra 4X − 25x er tilstrækkeligt.
3. forberedelse
- Vejning af musen før operationen ved at placere musen i en tom container på en ryddet skala.
- Anæstetika.
- Træk 0,1 mL bedøvelsesmiddel pr. 10 g legemsvægt i mus. Injicer anæstetika subkutant som en injektion af en bolt.
- Lad musen hvile i et bur med masser af sengetøj og husly i ca 10 min indtil fuldt bedøvede. Undersøg bedøvelses dybden ved at vurdere muskel afslapning og udføre pote eller hale knibe test.
- Når det er helt bedøvede, barberer du den baglemmer valgt til proceduren ved hjælp af elektriske Clippers. Sørg for at tørre af overskydende hår.
- Tænd for varmeenheden, såsom en varmepude og dække den med en kirurgisk klud.
- Indstil strømmen af ilt til 0,8 L/min og Tilslut den med en nosecone. Brug 100% ilt.
Bemærk: til er kun til ilttilførsel og ikke anæstesi. - Påfør oftalmisk salve og Injicer 0,5 mL saltvand subkutant, fortrinsvis i skruen af musen, for at forhindre hypovolæmi under operationen.
- Placer musen til kirurgi.
- Placer musen på den kirurgiske klud i liggende position. Placer til over snude.
- Fixate enden af bagbenene forsigtigt med tape for at forhindre musen i at skifte under operationen.
- Steriliser huden ved hjælp af alkohol/chlorhexidin eller alkohol/povidon jod.
4. kirurgi
Bemærk: i dette eksempel er den venstre bagled (når musen ses i liggende position), valgt til proceduren.
- Lav en cirkulær incision.
- Løft huden med glatte pincet og klip en lille åbning ca. 5 mm proksimalt til popliteale fossa.
- Skub skarp saks ind i åbningen og klip mod knæet, så indsnittet ender lige over knæet. Sørg for ikke at punktere de underliggende beholdere ved at løfte huden med pincet under klipning.
- Flyt musen til tilbøjelig position og Fortsæt med at klippe fra knæet mod popliteale fossa indtil den circumferentielle indsnit er komplet.
- Dissekere huden under knæet.
- Forsigtigt stump dissekere området under knæet til et par millimeter over anklen, ved langsomt at åbne og lukke mikrosaks, mens du løfter huden med pincet.
- Forsigtigt klip resterende synlige sammenvoksninger ved hjælp af mikrosaks. Brug steril saltvand regelmæssigt for at holde vævet fugtig under hele proceduren.
- Dissekere huden ved den proksimale rand af det circumferentielle snit, så den kan trækkes med en elastisk retractor.
Bemærk: retraktoren giver operatøren et bedre over syn af det proximale lymfe fartøj og forhindrer den proksimale rand i at skifte under operationen. - Mens du stadig er i en udsat position, drej bagbenet forsigtigt og Fiksér det med tape, så den ischiatiske vene er synlig fra det mest proksimale punkt i det udsatte område til det mest distale punkt.
- Injicér ca. 0,01 mL patent blåt V subkutant mellem anden og tredje tå med en 0,5 mL sprøjte med en 30 G nål. Tryk forsigtigt på pote et par gange for at distribuere patentet blå V. Visualiser lymfekarrene og lymfeknude gennem mikroskopet som patentet blå V fylder lymfekarrene.
Bemærk: Hvis den blå farve af lymfekarrene svinder under proceduren, forsigtigt massere pote til at fremme optagelsen, snarere end injicere mere patent blå V. overskydende brug af patent Blue V kan føre til lækage og farvning af vævet omkring lymfekarrene, som kan gå på kompromis med proceduren. - Find de vigtige strukturer: popliteale lymfeknude (PLN), de to lymfeknuder, distale til lymfeknude (DLV1 og DLV2), og den ene lymfe fartøj proksimale til lymfeknude (PLV).
Bemærk: alle lymfekarrene kan findes ved siden af den ischiatiske vene. Det proksimale lymfe fartøj findes sædvanligvis medialt i venen, de to distale lymfe beholdere findes mediale og laterale til venen. Forkortelserne af strukturerne anvendes i den medfølgende video. - Forstørre for klart at visualisere PLV og ligere det med en 10-0 nylon sutur ved hjælp af mikro-nål holder og micropincet. Tryk på pote et par gange for at sikre, at ingen patent Blue V passerer proksimalt til suturen.
Bemærk: det kan være nødvendigt at trimme fedtet omkring lymfe beholderen. - Gentag trin 4,7 for at ligere de to distale lymfe beholdere. Tryk pote flere gange for at sikre, at ingen patent Blue V passerer proksimalt til ligatur. Hvis lymfekarrene ligger tæt på den ischiatiske vene, kan du prøve at dissekere endnu mere distally.
Bemærk: i dette eksempel kan det ses, at en af lymfekarrene sprænger på grund af den ligatur, der hæmmer lymfe strømmen. Lymfekarrene vil ofte opdeles fra vene længere nede. - Fjern den popliteale lymfeknude.
- Find den popliteale lymfeknude og klip et lille hul med mikrosaks for at få adgang til det og fjern det med mikropincer og mikrosaks.
Bemærk: lymfe knudepunktet har en glat perlelignende overflade i modsætning til det omgivende fedtvæv. - For at teste om det fjernede væv er en lymfeknude, skal det placeres i et prøveglas fyldt med vand.
Bemærk: Hvis vævet består af fedt, vil vævet flyde. Hvis vævet er en lymfeknude, det vil synke til bunden.
- Find den popliteale lymfeknude og klip et lille hul med mikrosaks for at få adgang til det og fjern det med mikropincer og mikrosaks.
- Fjerne den lyske fat pad og lymfeknude.
- Før du fjerner lyske fat pad, skal du bruge en bipolar koagulator til at ætse de fartøjer, der løber gennem fedtet.
- Brug mikropincet og mikrosaks til at resect den ingininale fedtpude. Klip forsigtigt de kautererede fartøjer, der løber gennem fedtet. Derefter forsigtigt genbruge fedtvævet i lyskeområdet.
Bemærk: lymfeknude placeret i fedt er sjældent farvet af patent blå V og kan være svært at skelne fra fedt. Fjernelse af fat pad i ét stykke er den bedste måde at sikre, at lymfeknude er blevet fjernet.
- Skyl benet grundigt med sterilt saltvand og bekræft gennem mikroskopet, at eventuelle små hår og partikler er blevet grundigt fjernet fra operationsområdet for at undgå sårkontaminering og infektion. Sørg for, at der ikke er nogen aktiv blødning.
- Sutur huden kanter ned til musklen instrumentbrædtmonterede med en 6-0 nylon sutur ved hjælp af pincet og nål holder, efterlader et hul på 2 − 3 mm for at begrænse den overfladiske lymfe strøm.
Bemærk: den medfølgende video viser et eksempel på færdige suturer. - Administration af analgesi. Tegn op 0,1 ml analgesi pr. 30 g legemsvægt i mus. Injicerer analgesien subkutant som en injektion af en bolt.
- Veje musen til post-kirurgi til sammenligning.
- Placer musen i et bur i et kabinet opvarmet til nyttiggørelse.
5. postoperative pleje
- Giv musene individuelle bure til at komme sig efter operationen med vand og mad ad libitum.
- Giv en subkutan dosis af en pulus på 0,02 mL buprenorphin 3x dagligt i 3 dage for analgesi.
- Overvåge dyret dagligt for passende sårheling, tegn på smerte og infektion. Hvis der forekommer tegn på infektion, brug antibiotika salve.
6. bestråling efter operationen
- Tre dage efter operationen gentages proceduren for bestråling før operationen (trin 1.1 − 1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne procedure har tidligere været anvendt i tre forskellige eksperimenter. Alle eksperimenter blev foretaget af forskellige bly efterforskere, der alle er medforfattere af denne artikel. I alle tre eksperimenter blev der taget stor omhu for at overholde den samme procedure som beskrevet i denne protokol. I alle tre eksperimenter blev sekundær lymfom fremkaldt i en baglemmer, mens den anden baglemmer fungerede som kontrol. Mængderne af bagbenene var det primære resultat i alle tre eksperimenter. Figur 1 illustrerer undersøgelsens design.
Alle mus gennemgik mikro-computertomografi (μCT) scanninger i ugerne efter operationen for at måle lydstyrken af baglemmer. De μCT scanninger blev udført på en multimodalitet præklinisk scanner (tabel over materialer) og mængden af baglemmer blev målt via regionen-of-INTEREST (ROI) funktion i den tilhørende software som tidligere beskrevet26. Den distale tibiofibulære fælles var placeret i tredimensionale (3D) axonal billeder ved hjælp af en metode, der tidligere er beskrevet27. ROI startede ved den distale tibiofibular fælles og omfattede alle væv distale til dette punkt. Hounsfield-intervallet for analysen blev sat til-500 til 4000.
Alle data blev analyseret ved hjælp af statistisk software (tabel over materialer). Sidaks multiple sammenligningstest blev brugt til at sammenligne volumenet af den inducerede lymfom baglemmer, med kontrol bagben. En signifikant forskel mellem kontrol hindlemmer og lymfom baglemmer er defineret som en P-værdi < 0,05.
Figur 1: studiedesign og tidspunkter for resultatmålinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Eksperiment 126 inkluderede 32 mus fordelt i grupper på fire. Et af formålene var at studere flere forskellige doser af stråling og finde den mest foretrukne dosis, for inducerende vedvarende lymfom, uden at forårsage alvorlig sygelighed. Den gruppe, der fik to doser af 10 Gy bestråling omfattede fire mus. Figur 2 viser, at der blev opnået en konsistent tilstand af lymfom i alle 8 uger. Tabel 1 viser, at der var en signifikant forskel i volumenet mellem lymfom-bagben og kontrol hindlemmer i uge 1, 7 og 8. Mens en konsistent tilstand af induceret lymfom blev opnået, der var ikke en statistisk signifikant forskel mellem bagbenene i alle 8 uger. Dette resultat adskiller sig fra de to andre eksperimenter og kan forklares på grund af den relativt mindre stikprøvestørrelse på fire mus. En forøgelse af antallet af målinger vil øge undersøgelsens effekt og hermed sandsynligheden for at opdage en forskel, hvis der er en forskel på28.
Figur 2: middel volumen for baglemmer: eksperiment 1. Målinger af 4 mus fra gruppen, der fik to doser på 10 Gy bestråling, er inkluderet i denne figur. Denne graf viser de gennemsnitlige baglemmer i mm3 i de 8 uger efter operationen. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Uge | Lymfafeder volumen i mm3 (n = 4) | Kontrol volumen i mm3 (n = 4) | P-værdi | 95% konfidensinterval |
| 1 | 218,53 ± 9,3 | 136,78 ± 2,48 | 0,002 | 53.77 − 109.73 |
| 2 | 202,25 ± 10,24 | 141,88 ± 8,02 | 0,066 | (-6.53) − 127.28 |
| 3 | 193,28 ± 10,80 | 141,20 ± 6,80 | 0,060 | (-3,7) − 107.85 |
| 4 | 194,95 ± 21,05 | 141,50 ± 8,03 | 0,224 | (-41.85) − 148.75 |
| 5 | 193,75 ± 7,07 | 141,70 ± 8,60 | 0,051 | (-0.27) − 104.37 |
| 6 | 193,23 ± 3,42 | 141,78 ± 10,29 | 0,054 | (-1.56) − 104.46 |
| 7 | 194,95 ± 7,26 | 143,23 ± 8,90 | 0,050 | 0.17 − 103.28 |
| 8 | 195,8 ± 9,65 | 152,18 ± 5,81 | 0,009 | 19.88 − 67.38 |
Tabel 1: Sidaks multiple sammenligninger test: eksperiment 1. Denne tabel viser den statistiske sammenligning mellem de gennemsnitlige mængder af inducerede lymfom baglemmer og kontrol baglemmer i de 8 uger efter operationen. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Værdier vises som: middel ± SD i mm3. P-værdi < 0,05 betragtes som en signifikant forskel mellem kontrol hindlemmer og lymfom bagdel. n (antal observationer) = 4.
Eksperiment 2 inkluderede 45 mus. 15 mus fungerede som kontrol og fik saltvands injektioner. Kontrollerne anvendes som repræsentative resultater, da vi antager, at saltvands indsprøjtningerne ikke havde nogen effekt på mængden af induceret lymfom. Figur 3 viser, at Lymphedema var mindre stabilt end i eksperiment 1. Derudover steg volumen af kontrol hindlemmerne i løbet af de 8 uger. Dette mindsker den relative forskel, der fremgår af tabel 2. Det er blevet spekuleret, at musene bruger deres ikke-opererede baglemmer mere, i ugerne efter operationen, og at dette fører til hypertrofi og stigning i lemmer volumen af den ikke-opererede bagled. Vigtigst er det, at tabel 3 viser, at der er statistisk signifikant forskel mellem lymfom-bagbenet og kontrol hindlem under alle 8 uger efter operationen. Det højere antal mus beviser, at denne procedure kan fremkalde statistisk signifikant lymfom i mindst 8 uger.
Figur 3: middel volumen for baglemmer: eksperiment 2. Målinger af 15 mus fra kontrolgruppen er inkluderet i denne figur. Denne graf viser de gennemsnitlige baglemmer i mm3 i de 8 uger efter operationen. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Fejllinjerne repræsenterer SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksperiment 1 | Eksperiment 2 | Eksperiment 3 | Eksperiment 1, 2 og 3 kombineret | |||||
| Uge | Absolut forskel (mm3) | Relativ forskel (%) | Absolut forskel (mm3) | Relativ forskel (%) | Absolut forskel (mm3) | Relativ forskel (%) | Absolut forskel (mm3) | Relativ forskel (%) |
| 1 | 81,75 ± 7,20 | 0,60 ± 0,04 | 104,34 ± 25,96 | 0,76 ± 0,23 | 85,20 ± 35,05 | 0,64 ± 0,27 | 94,02 ± 29,57 | 0,69 ± 0,24 |
| 2 | 60,38 ± 17,21 | 0,43 ± 0,14 | 107,12 ± 44,33 | 0,79 ± 0,33 | 85,63 ± 37,94 | 0,63 ± 0,29 | 92,77 ± 41,68 | 0,68 ± 0,31 |
| 3 | 52,08 ± 14,35 | 0,37 ± 0,11 | 78,77 ± 39,45 | 0,57 ± 0,28 | 74,67 ± 49,57 | 0,54 ± 0,38 | 73,74 ± 41,51 | 0,53 ± 0,31 |
| 4 | 53,45 ± 24,51 | 0,38 ± 0,19 | 50,67 ± 29,94 | 0,36 ± 0,21 | 50,62 ± 16,35 | 0,37 ± 0,11 | 51,01 ± 24,03 | 0,37 ± 0,17 |
| 5 | 52,05 ± 13,46 | 0,37 ± 0,11 | 32,74 ± 24,66 | 0,22 ± 0,17 | 42,67 ± 11,81 | 0,31 ± 0,07 | 39,08 ± 20,02 | 0,27 ± 0,14 |
| 6 | 51,45 ± 13,63 | 0,36 ± 0,11 | 26,80 ± 22,35 | 0,18 ± 0,14 | 32,86 ± 10,90 | 0,22 ± 0,08 | 32,32 ± 18,96 | 0,21 ± 0,13 |
| 7 | 51,73 ± 13,26 | 0,36 ± 0,11 | 19,04 ± 17,22 | 0,12 ± 0,11 | - | - | 25,92 ± 21,15 | 0,17 ± 0,15 |
| 8 | 43,63 ± 6,11 | 0,29 ± 0,04 | 15,15 ± 11,70 | 0,10 ± 0,08 | - | - | 21,15 ± 15,96 | 0,14 ± 0,10 |
Tabel 2: absolut og relativ forskel. Denne tabel viser den absolutte forskel i volumen mellem lymfom og kontrol hindlemmer ± SD i mm3 og den relative forskel ± SD i procent.
| Uge | Lymfafeder volumen i mm3 (n = 15) | Kontrol volumen i mm3 (n = 15) |
P-værdi | 95% konfidensinterval |
| 1 | 241,82 ± 35,69 | 137,48 ± 21,54 | < 0,001 | 82.21 − 126.47 |
| 2 | 242,41 ± 45,13 | 135,29 ± 5,81 | < 0,001 | 69.33 − 144.89 |
| 3 | 216,85 ± 41,47 | 138,08 ± 5,31 | < 0,001 | 45.15 − 112.39 |
| 4 | 193,10 ± 31,27 | 142,43 ± 5,29 | < 0,001 | 25.15 − 76.18 |
| 5 | 180,03 ± 26,03 | 147,29 ± 6,45 | 0,002 | 11.72 − 53.76 |
| 6 | 179,89 ± 25,00 | 153,09 ± 6,56 | 0,004 | 7.74 − 45.85 |
| 7 | 176,45 ± 19,77 | 157,41 ± 7,49 | 0,008 | 4.35 − 33.71 |
| 8 | 166,97 ± 11,8 | 151,82 ± 10,07 | 0,002 | 5.18 − 25.12 |
Tabel 3: Sidaks multiple sammenligninger test: eksperiment 2. Denne tabel viser den statistiske sammenligning mellem de gennemsnitlige mængder af inducerede lymfom baglemmer og kontrol hindlemmer i de 8 uger efter operationen. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Værdier vises som: middel ± SD i mm3. P-værdi < 0,05 betragtes som en signifikant forskel mellem kontrol hindlemmer og lymfom bagdel. n (antal observationer) = 15.
Eksperiment 3 inkluderede 36 mus. 12 mus fungerede som kontrol og fik saltvands injektioner. Kontrollerne anvendes som repræsentativt resultat, da vi antager, at saltvands indsprøjtningerne ikke havde nogen effekt på mængden af induceret lymfom. I dette eksperiment blev muternes baglemmer målt i 6 uger i stedet for 8. Eksperimentet varede kun 6 uger på grund af logistiske vanskeligheder, da eksperimentet blev udført. Figur 4 viser et mere konsistent lymfom end eksperiment 2. Tabel 4 viser, at der er statistisk signifikant lymfom i de 6 uger efter operationen.
Figur 4: middel volumen for baglemmer: eksperiment 3. Målinger af 12 mus fra kontrolgruppen er inkluderet i denne figur. Denne graf viser de gennemsnitlige baglemmer i mm3 i de 6 uger efter operationen. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Fejllinjerne repræsenterer SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Uge | Lymfafeder volumen i mm3 (n = 12) | Kontrol volumen i mm3 (n = 12) | P-værdi | 95% konfidensinterval |
| 1 | 219,06 ± 35,00 | 133,86 ± 10,02 | < 0,001 | 51.66 − 118.74 |
| 2 | 220,90 ± 36,98 | 135,27 ± 5,89 | < 0,001 | 49.33 − 121.94 |
| 3 | 211,74 ± 47,30 | 137,07 ± 7,56 | 0,002 | 27.24 − 122.11 |
| 4 | 186,09 ± 20,36 | 135,47 ± 5,70 | < 0,001 | 34.98 − 66.27 |
| 5 | 182,35 ± 18,25 | 139,68 ± 7,45 | < 0,001 | 31.37 − 53.98 |
| 6 | 183,44 ± 12,11 | 150,58 ± 8,37 | < 0,001 | 22.42 − 43.29 |
Tabel 4: Sidaks multiple sammenligninger test: eksperiment 3. Denne tabel viser den statistiske sammenligning mellem de gennemsnitlige mængder af inducerede lymfom baglemmer og kontrol hindlemmer i de 6 uger efter operationen. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Værdier vises som: middel ± SD i mm3. P-værdi < 0,05 betragtes som en signifikant forskel mellem kontrol hindlemmer og lymfom bagdel. n (antal observationer) = 12.
Figur 5 og tabel 5 viser den gennemsnitlige bagbords volumen af alle tre eksperimenter tilsammen. Tabel 5 viser, at anvendelsen af denne procedure resulterer i statistisk signifikant lymfom, der varer mindst 8 uger. Data fra de første 6 uger, er de kombinerede målinger af 31 mus fra eksperimenter 1, 2 og 3. I uge 7 − 8 havde vi kun data fra eksperimenter 1 og 2, hvilket resulterede i kombinerede målinger fra 19 mus.
Figur 5: samlet middel volumen for baglemmer: eksperiment 1, 2 og 3. Tredive-en mus inkluderet i de første 6 uger efter operationen og 19 mus inkluderet i de følgende 2 uger. Denne graf viser de gennemsnitlige baglemmer i mm3 i de 8 uger efter operationen. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Fejllinjerne repræsenterer SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Uge | Lymfafeder volumen i mm3 (uge 1 − 6 n = 31) (Uge 7 − 8 n = 19) |
Kontrol volumen i mm3 (uge 1 − 6 n = 31) (Uge 7 − 8 n = 19) |
P-værdi | 95% konfidensinterval |
| 1 | 230,00 ± 34,46 | 135,99 ± 16,03 | < 0,001 | 78.19 − 109.84 |
| 2 | 228,90 ± 40,91 | 136,13 ± 6,32 | < 0,001 | 70.47 − 115.07 |
| 3 | 211,83 ± 41,15 | 138,09 ± 6,36 | < 0,001 | 51.53 − 95.95 |
| 4 | 190,63 ± 25,81 | 139,62 ± 6,54 | < 0,001 | 38.15 − 63.87 |
| 5 | 182,70 ± 21,52 | 143,62 ± 7,79 | < 0,001 | 28.36 − 49.79 |
| 6 | 182,98 ± 19,11 | 150,66 ± 8,36 | < 0,001 | 22.18 − 42.47 |
| 7 | 180,34 ± 19,31 | 154,43 ± 9,60 | < 0,001 | 11.61 − 40.22 |
| 8 | 173,04 ± 16,42 | 151,89 ± 9,19 | < 0,001 | 10.35 − 31.94 |
Tabel 5: Sidaks multiple sammenligninger test: eksperiment 1, 2 og 3 kombineret. Denne tabel viser den statistiske sammenligning mellem de gennemsnitlige mængder af inducerede lymfom baglemmer og kontrol baglemmer af 31 mus i de første 6 uger efter operationen og 19 mus i de følgende 2 uger. Alle mus fik en dosis på 10 Gy bestråling før og efter operationen. Værdier vises som: middel ± SD i mm3. P-værdi < 0,05 betragtes som en signifikant forskel mellem kontrol hindlemmer og lymfom bagdel. n (antal observationer) = 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er nogle få kritiske trin i denne protokol. For det første er det vigtigt, at forskerne tager sikkerhedsforanstaltninger, når de arbejder med radioaktivitet. For det andet, under den kirurgiske del af denne protokol, er det vigtigt at starte proceduren, når musen er blevet bedøvet og afslutte det uden unødvendige pauser. Dette er vigtigt for at undgå en alt for lang kirurgisk periode for dyret og for at forhindre, at anæstesi mister virkning under operationen. Det anbefales kun at administrere en injektion af en bolsjeanæstetika og fuldføre den kirurgiske procedure i ét møde. Det er også et kritisk skridt, ikke at administrere for meget patent blå V, som overskydende patent Blue V vil misfarve vævet omkring lymfekarrene. Hvis det omgivende væv bliver misfarvet, kan det være næsten umuligt at visualisere lymfekarrene, og dette kompromitterer proceduren. Selv hvis man formår at visualisere lymfekarrene, vil det misfarvede væv gøre det svært at vurdere, om patentet blå V passerer proksimalt til ligatur eller ej. Dette er problematisk, fordi operatøren skal være sikker på, at de placerede ligaturer er begrænset lymfe strømmen, for at sikre, at proceduren vil blive en succes. Det er også vigtigt at efterlade et hul på 2 − 3 mm, når såret lukkes. Som en midlertidig hudkløft er ofte nødvendig for at efterligne den menneskelige sårheling proces29.
Begrænsningerne ved denne metode er, at det er en tidskrævende procedure, der kræver adgang til et mikroskop og tidligere mikrokirurgisk træning. Når du udfører den kirurgiske del af denne protokol, er det vigtigt at planlægge tiden i-mellem de kirurgiske procedurer. En masse tid går i vente for dyret at blive bedøvet, barbering bagdel og generelt forberede hver kirurgisk procedure. Derfor anbefales det at forberede boliger og bedøvelsesmiddel på forhånd. Det er vigtigt at bemærke, at for at være sikker på, at kronisk lymfom er blevet induceret, histopatologi skal analyseres. Vi har ikke inkluderet histopatologi i denne artikel, som er en begrænsning. Uden histopatologi understøtter det faktum, at histologiske ændringer er sket med lymfekarrene ændringer i volumen i bagbenene kan kun beskrives som ødem. Den artikel, der indeholder alle data om de fire mus fra eksperiment 126 omfatter histopatologi og viser, at der var betydelige ændringer i histopatologi ved hjælp af denne teknik. Artiklen omfatter også lymfatisk billeddannelse. Samme fremgangsmåde blev anvendt på musene i eksperiment 2 og 3, men histopatologi viste ingen signifikant forskel mellem lymfom baglemmer og kontrol bagdel i disse eksperimenter. Yderligere undersøgelser, herunder histopatologi er nødvendige for denne model til at afklare, om lymfom er induceret på et histologisk niveau. Eksperimenter 2 og 3 er endnu ikke blevet offentliggjort, og vi kan derfor ikke henvise til dem.
Mens du bruger μCT scanninger til at måle baglemmer volumen kan argumenteres for at være mere objektiv end ved hjælp af vandfortrængning metode eller circumferentielle målinger, det stadig har sine begrænsninger. Måleteknikken er dyr, tidskrævende og kræver adgang til en μCT-scanner og analyse af software.
En af de største udfordringer med gnaver Lymphedema modeller i almindelighed, har været spontan lymfom opløsning, medmindre overdreven stråling blev udført25. Ved udviklingen af denne model, vi testede flere forskellige doser af stråling for at finde en dosis, der ville fremkalde varige lymfom, uden at forårsage alvorlig sygelighed26. Tidligere, lymfhedema modeller er ikke blevet standardiseret i metoderne til lymfom induktion eller udfald vurderinger. Oashi et al.20 brugte en enkelt dosis på 30 Gy bestråling, og ligerede hvert lymfe fartøj på tre separate punkter. I denne undersøgelse, den kirurgiske procedure tog 90 min til at udføre. Selv om den metode, der præsenteres i denne artikel kan betragtes som tidskrævende, kan den kirurgiske del af proceduren stadig udføres omtrent dobbelt så hurtigt som den metode, der præsenteres af Oashi et al.20. De havde også en opfølgningsperiode på 6 måneder, hvilket er betydeligt længere end nogen af de undersøgelser, der er beskrevet i denne artikel. De inkluderede dog kun én mus og de manuelt målte ekstremitets omkreds for at vurdere hævelsen, hvorimod de mængder, der præsenteres i denne artikel, blev målt på 31 mus ved hjælp af μCT-scanninger og 3D-analyse software. Komatsu et al.30 fjernede de inguinale lymfeknuder og de tilhørende perifere lymfeknuder og fedtvæv ved hjælp af en elektrisk kniv. Ved hjælp af en elektrisk kniv kan være en enklere tilgang, som ikke kræver mikrokirurgisk træning, men den inducerede ødem løst efter dag 4, mens den metode, der præsenteres i denne artikel tilbyder konsekvent lymfom, som varer mindst 8 uger.
Denne protokol vil forhåbentlig sætte forskerne i stand til at overveje begrænsningerne og fordelene ved den reviderede lymfom-model. Protokollen bør også hjælpe forskerne med at replikere modellen med succes. Metoden kan anvendes i fremtidige observations-og interventionelle undersøgelser for at forstå patofysiologien af lymfom og forskning nye behandlingsmuligheder. I fremtidige undersøgelser, det ville også være interessant at have en opfølgning længere end 8 uger til at observere, hvor længe den inducerede lymfom varer. Det ville også være interessant at observere effekten af at udføre mere målrettet bestråling af musene præ-og post-kirurgi. Dette kan gøres ved at udføre en CT-scanning og planlægge et mål volumen. I fremtidige undersøgelser kunne denne model også understøttes af fluorescens-guidet lymfatisk billeddannelse, perometri eller bioimpedans undersøgelser. Denne metode tilbyder statistisk signifikant lymfom, der varer mindst 8 uger, som er blevet målt direkte via CT volumetriske i tre separate eksperimenter af forskellige bly investigatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Peter Boll, lederen af det biomedicinske laboratorium for udlån af udstyr, der er nødvendigt for at registrere optagelserne set gennem Mikroskoperne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. , Springer International Publishing. New York, NY. 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment? Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R. 3rd, Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H. The psycho-social impact of lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 7 (2), 109-112 (2009).
- Gutknecht, M., et al. Cost-of-illness of patients with lymphoedema. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (11), 1930-1935 (2017).
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs' limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O'Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats' limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
