Summary
이 동물 모델은 연구원이 적어도 8 주 지속되는 마우스의 뒷다리에 있는 통계적으로 유의한 이차 림프부종을 유도하는 것을 가능하게 합니다. 이 모델은 림프부종의 병리생리학을 연구하고 새로운 치료 옵션을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
동물 모형은 질병의 병리생리학을 이해하기 위하여 림프부종의 연구에서 가장 중요하고 또한 잠재적인 처리 선택권을 탐구하기 위하여. 이 마우스 모형은 연구원이 적어도 8 주 지속되는 중요한 림프부종을 유도하는 것을 허용합니다. 림프부종은 분별 된 방사선 요법과 림프의 외과 적 절제의 조합을 사용하여 유도됩니다. 이 모형은 마우스가 수술 전후에 10 회색 (Gy) 방사선의 복용량을 얻을 것을 요구합니다. 모델의 외과 부분은 3 개의 림프관의 결찰과 마우스 뒷다리에서 두 개의 림프절추출을 포함합니다. 마우스의 작은 해부학 적 구조로 인해 미세 수술 도구와 현미경에 액세스 하는 것은 필수적이다. 이 모델의 장점은 다른 치료 옵션을 평가하기위한 좋은 기초를 제공하는 통계적으로 유의한 림프부종을 초래한다는 것입니다. 그것은 또한 미세 수술 훈련에 대 한 중대 하 고 쉽게 사용할 수 있는 옵션. 이 모델의 제한사항은 특히 사전에 실행하지 않은 경우 프로시저가 시간이 많이 소요될 수 있다는 것입니다. 이 모델은 쥐에서 객관적으로 정량화 할 수있는 림프부종을 초래하며, 심각한 이환율을 일으키지 않고 세 가지 별도 프로젝트에서 테스트되었습니다.
Introduction
림프부종은 주로 림프관에서 림프액의 손상 또는 중단 된 흐름으로 인해 발생하는 국소 조직 부종으로 이어지는 림프액의 축적을 특징으로합니다1. 림프 흐름은림프계의감염, 방해, 부상 또는 선천적 결함에 의해 손상되거나 중단 될 수 있습니다 2 . 이러한 병인은 림프액의 축적을 초래하여 만성 염증 상태로 이어져 후속 섬유증뿐만 아니라 지방 조직의 침착을 초래합니다3. 림프부종은 1 차 또는 이차 림프부종으로 분류 될 수있다. 1차 림프부종은 발달 이상 또는 유전적돌연변이에의해 유발된다2,4. 이차 림프부종은 근본적인 전신 질환, 수술 또는 외상으로 인해발생2,4. 이차 림프부종은세계2에서 림프부종의 가장 일반적인 형태입니다. 선진국에서는 보조 림프부종의 가장 흔한 원인은 보조 방사선 요법 및 림프절 해부5와같은 종양학 치료입니다. 림프부종은 유방암 환자 중 가장 빈번하지만 부인과 환자, 흑색종, 비뇨 생식기 또는 목암 환자에서 발병할 수도있습니다 6. 유방암으로 진단 된 모든 여성 중 21 %가 림프부종을 개발할 것이라는 것이 제안되었습니다7.
림프부종은 환자에게 신체적, 심리적으로 스트레스를 받을 수 있습니다. 림프부종을 가진 환자는 감염의 증가한리스크가 5,8,9,삶의 질이 좋지 않으며 사회적인 불안 및 불경기의 현상을 개발할 수 있습니다10. 만성 림프부종의 합병증은 높은 치료 비용과 증가 된 질병부담으로이어진다9,11. 사실 인정은 또한 림프부종이 유방암 처리 후에 죽음의 증가한 리스크와 연관될 지도 모르다는 것을 건의했습니다12. 영향을받는 지역의 압축, 수동 림프 배수 및 일반 스킨 케어와 같은 보수적 인 관리가 첫 번째 라인 접근 방식입니다. 현재 치료 치료는 없습니다6. 외과 및 의학 치료 분야에서 진전이 있었지만 여전히 개선의 여지가 있습니다. 질병의 병리생리학 및 진행에 대한 통찰력을 제공하는 더 많은 연구가 임상의가 환자에게 더 나은 치료 옵션을 제공 할 수 있도록하는 데 필요합니다5.
동물 모델은 질병의 병리생리학을 이해하고 잠재적인 치료 옵션을 개발하기 위해 전임상 연구에서 사용되고 있습니다. 여러 가지 림프부종 동물 모델은 개13,14,토끼15,양16,돼지17,18 및 설치류19,20, 21,22,23,24. 설치류 모델은 설치류가 쉽게 접근 할 수 있고 상대적으로 저렴한25로인해 림프 기능의 재구성을 조사 할 때 가장 비용 효율적인 모델인 것으로 보입니다. 마우스 모델의 대다수는마우스21,22,23의꼬리에 림프부종을 유도하는 데 초점을 맞추고 있다. 꼬리 모형은 아주 믿을 수 있습니다 그러나 림프부종을 유도하기 위한 정확한 외과 기술은 이전에 간행된 물자에서 현저하게 변화합니다. 이는 공지된 litterature25에제시된 개발된 림프부종의 지속 기간 및 견고성의 변동을 초래한다. 다른 기술은 또한 뒷다리 모형에 있는 림프부종을 유도하기 위하여 이용되고 있고 또한 다양한 결과를 산출합니다, 그러나 뒷다리 모형은 번역관점에서 이해하기 쉬울지도 모릅니다. 이전 림프부종 모델은 자발적인 림프부종 분해능에 의해 방해를 받았기 때문에 재현 가능하고 영구적인 림프부종 모델이25필요합니다. 연구원은 이전에 방사선의 복용량을 증가 하려고, 자발적인 림프 부 종 해상도 방지 하기 위해, 하지만이것은 종종 후속 심각한이환25.
이 모형은 방사선과 미세 수술을 결합하여, 가혹한 이환율을 일으키는 원인이 되지 않고, 통계적으로 유의한 림프부종을 초래합니다. 이 모델은 심한이환율(26)을유발하지 않고 림프부종을 유발하는 조사 용량을 추가하여 이전 수술 모델에서 개정되었습니다. 또한 미세 수술 훈련을위한 좋은 기회를 제공합니다. 마우스의 작은 해부학 적 구조로 인해 미세 수술 장비와 현미경에 액세스 할 필요가 있습니다. 외과 적 수술은 사용자가 미세 수술 기구로 봉합하는 것과 같은 기본적인 미세 수술 기술을 배웠을 때 수행 될 수 있습니다. 이 절차를 수행 한 운영자는 모두 미세 수술 기술 (1981)과 기본 미세 수화 기술 (1985)의 전제 조건에 Acland에 의해 튜토리얼 비디오를 보았다. 우리는 연구에 사용하기 전에 외과 적 수술을 8-10 번 연습하는 것이 좋습니다. 절차를 연습하면 실수가 줄어들고 절차를 보다 효율적으로 수행 할 수 있습니다. 마스터하면 45 분 안에 외과 적 수술을 수행 할 수 있습니다.
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Protocol
동물은 기관 지침에 따라 남부 덴마크 동물 관리 시설의 대학에 보관되었다. 동물 과목과 관련된 모든 절차는 덴마크 환경 식품부 동물 실험 검사관의 승인을 받았습니다.
1. 수술 전 조사
참고: 수술 전 조사는 수술 7일 전에 이루어집니다.
- 마취를 유도.
- 유도 상자에 마우스를 놓고 흡입 마취를 유도하는 0.8-1.2 L /min의 산소 유량으로 기화기를 3 %의 이소플루란으로 설정합니다.
참고 : 또는 주사용 마취제를 사용할 수 있지만 흡입 마취를 유도하는 조사의 짧은 기간 동안 충분했습니다. 이 문서에 제시 된 결과 얻기 위해, 9 주 된 여성 C57BL6 마우스를 사용 했다. - 마우스가 꼬리 또는 발 핀치 테스트로 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
- 유도 상자에 마우스를 놓고 흡입 마취를 유도하는 0.8-1.2 L /min의 산소 유량으로 기화기를 3 %의 이소플루란으로 설정합니다.
- 조사를 위해 마우스를 배치합니다.
- 완전히 진정되면 유도 상자에서 마우스를 이동하고 방사원 아래에 놓고 테이프로 뒷다리를 부드럽게 고정시십시오.
참고: 마우스는 방사선의 짧은 기간 동안 진정된 상태로 유지됩니다. - 1.5mm 두께의 리드 패드를 배치하여 수술을 받는 부위(즉, 무릎 주위 직경 25mm의 원형 영역)만 조사되도록 합니다.
- 완전히 진정되면 유도 상자에서 마우스를 이동하고 방사원 아래에 놓고 테이프로 뒷다리를 부드럽게 고정시십시오.
- 5.11 Gy/min (100 kVp, 10 mA)의 용량 속도로 10 Gy 방사선을 투여하십시오.
주의: 방사선 작업 시 안전 예방 조치를 취해야 합니다. 이 실험 동안 모든 방사선 절연 실에서 모든 방사선 조사가 수행되었으며 모든 직원이 방을 떠나 봉인 했을 때만 방사선원이 켜졌습니다. - 마우스를 케이지에 다시 놓습니다.
2. 장비 설정
참고 : 수술은 외과 적 수술 전용 방에서 수행해야합니다. 작동 표면은 멸균되어야 합니다.
- 70% 에탄올로 모든 작동 표면을 철저히 청소하십시오. 헤어넷과 커버올을 착용합니다. 멸균 수술 기구와 멸균 장갑을 사용하십시오.
- 마취를 준비하십시오.
- 펜타닐 1 mL(0.315 mg/mL), 미다졸람 1mL(5 mg/mL), 멸균수 2mL를 그립니다. 다른 구성 요소에 대해 다른 주사기와 바늘을 사용하십시오.
- 펜타닐과 멸균 수를 천천히 멸균 유리 튜브에 주사기를 비우십시오. 혼합할 때 midazolam을 추가하여 작업 용액을 완성하십시오.
- 진통제를 준비하십시오.
- 부프레노르핀 0.2 mL(0.3 mg/mL)과 식염수 2 mL를 그립니다.
- 주사기를 멸균 유리 튜브에 천천히 비우고 부피를 혼합하여 작동 용액을 완성합니다.
- 현미경을 켜고 조명이 충분한지, 그리고 현미경이 작업자의 눈에 잘 조정되었는지 확인하십시오.
참고 : 모든 외과 적 수술은 수술 현미경으로 수행해야합니다. 4x-25x의 배율 범위는 충분합니다.
3. 준비
- 마우스를 클리어된 눈금으로 빈 용기에 넣어 수술 전 마우스의 무게를 측정합니다.
- 마취제를 투여하십시오.
- 마우스 체중 10 g당 0.1 mL의 마취제를 그립니다. 볼루스 주사로 피하 마취제를 주입.
- 마우스를 침구가 충분한 케이지에 넣고 완전히 진정될 때까지 약 10분 동안 보호합니다. 근육 이완을 평가하여 마취 깊이를 검사하고 발 또는 꼬리 핀치 테스트를 수행합니다.
- 완전히 진정되면 전기 클리퍼를 사용하여 절차에 선택한 뒷다리를 면도하십시오. 여분의 머리카락을 닦아주세요.
- 가열 패드와 같은 가열 장치를 켜고 수술용 천으로 덮습니다.
- 산소의 흐름을 0.8 L/min으로 설정하고 노코콘과 연결합니다. 100 % 산소를 사용하십시오.
참고 : 노코콘은 산소 전달을위한 것이지 마취가 아닙니다. - 안과 연고를 바르고 식염수 0.5 mL을 피하주사, 바람직하게는 수술 중 저혈당을 예방하기 위해 마우스의 목덜미에 주입하십시오.
- 수술을 위해 마우스를 놓습니다.
- 수술용 천에 마우스를 놓습니다. 주전자 위에 노코콘을 놓습니다.
- 수술 중 마우스가 이동하는 것을 방지하기 위해 테이프로 뒷다리의 끝을 부드럽게 고정하십시오.
- 알코올/클로르헨시딘 또는 알코올/포비동 요오드를 사용하여 피부를 살균하십시오.
4. 수술
참고: 이 예제에서는 왼쪽 뒷다리(마우스가 척추 위치에서 볼 때)가 절차에 대해 선택되었습니다.
- 원형 절개를 합니다.
- 매끄러운 집게로 피부를 들어 올리고 포퓰리터 포사에 약 5mm 근사한 작은 구멍을 클립.
- 날카로운 가위를 개구부로 밀어 무릎 쪽으로 잘라 절개가 무릎 바로 위에 끝나게 합니다. 클리핑하는 동안 집게로 피부를 들어 올려 기본 혈관에 구멍을 뚫지 않도록하십시오.
- 마우스를 경향이 있는 위치로 이동하고 원주 절개가 완료될 때까지 무릎에서 포퓰럴 포사쪽으로 계속 클립합니다.
- 무릎 아래 피부를 해부하십시오.
- 부드럽게 무딘 발목 위의 몇 밀리미터에 무릎 아래 영역을 해부, 천천히 열고 집게로 피부를 들어 올리는 동안 마이크로 사이저를 닫습니다.
- 미세자극을 사용하여 눈에 보이는 접착력을 조심스럽게 잘라내소. 멸균 식염수로 정기적으로 사용하여 전체 시술 중에 조직을 촉촉하게 유지하십시오.
- 원주 절개의 근위 림에서 피부를 해부하여 탄성 리트랙터로 후퇴 할 수 있도록하십시오.
참고: 리트랙터를 통해 작업자는 근위 림프혈관을 더 잘 볼 수 있으며 수술 중 근위 림이 이동하는 것을 방지합니다. - 여전히 경향이 있는 위치에 있는 동안, 뒷다리를 부드럽게 회전하고 테이프로 고정하여, 이스키아성 정맥이 노출된 영역의 가장 근접한 지점에서 가장 말단지점까지 보이도록 합니다.
- 30 G 바늘로 0.5 mL 주사기를 사용하여 두 번째와 세 번째 발가락 사이에 약 0.01 mL의 특허 Blue V를 피하주입합니다. 특허 블루 V. 특허 블루 V가 림프혈관을 채울 때 현미경을 통해 림프관과 림프절을 시각화하기 위해 발을 몇 번 부드럽게 누릅니다.
참고 : 시술 중에 림프관의 파란색이 퇴색하면 발을 부드럽게 마사지하여 흡수를 촉진하십시오. 절차를 손상시면 됩니다. - 중요한 구조를 찾습니다 : 포피 라이트 림프절 (PLN), 림프절 (DLV1 및 DLV2)에 대한 두 개의 림프관, 림프절 (PLV)에 가까운 하나의 림프관.
참고 : 모든 림프관은 이스키아성 정맥에 인접한 곳에서 발견 될 수 있습니다. 근위 림프용기는 일반적으로 정맥내 측위를 발견하고, 두 개의 말단 림프관은 정맥내 및 측측측편에서 발견된다. 구조의 약어는 함께 제공되는 비디오에서 사용됩니다. - PLV를 명확하게 시각화하고 마이크로 니들 홀더와 마이크로 포스를 사용하여 10-0 나일론 봉합사로 돋보이게합니다. 발을 몇 번 눌러 특허 Blue V가 봉합사에 근접을 통과하지 않도록합니다.
참고 : 림프혈관을 둘러싼 지방을 다듬는 것이 필요할 수 있습니다. - 2개의 말단 림프관을 리게이트하기 위하여 단계 4.7를 반복합니다. 발을 여러 번 눌러 특허 블루 V가 합자에 근접하게 전달되지 않도록 합니다. 림프관이 이스키아성 정맥에 가깝게 거짓말을하면 해부하십시오.
참고 :이 예에서는 림프 흐름을 방해하는 합자로 인해 림프 관 중 하나가 파열되는 것을 볼 수 있습니다. 림프관은 종종 정맥에서 더 아래로 갈라집니다. - 포물성 림프절을 제거합니다.
- popliteal 림프절을 찾아 그것을 액세스하고 마이크로 포스와 마이크로 시저로 제거하기 위해 마이크로 시저와 작은 구멍을 클립.
참고 : 림프절은 주변 지방 조직과 는 대조적으로 매끄러운 진주 와 같은 표면을 가지고 있습니다. - 제거 된 조직이 림프절인지 테스트하려면 물로 채워진 시험관에 놓습니다.
참고 : 조직이 지방으로 구성되어 있으면 조직이 떠 있습니다. 조직이 림프절인 경우 바닥으로 가라 앉습니다.
- popliteal 림프절을 찾아 그것을 액세스하고 마이크로 포스와 마이크로 시저로 제거하기 위해 마이크로 시저와 작은 구멍을 클립.
- 잉구 지방 패드와 림프절을 제거합니다.
- 잉구인 지방 패드를 제거하기 전에 양극성 응고기를 사용하여 지방을 통과하는 혈관을 소작시하십시오.
- 마이크로포스와 마이크로시저를 사용하여 잉구인 지방 패드를 절제합니다. 지방을 통해 흐르는 소작 된 혈관을 부드럽게 잘라냅니다. 그런 다음 관인 부위의 지방 조직을 부드럽게 절제하십시오.
참고 : 지방에위치한 림프절은 거의 특허 블루 V에 의해 착색되지 않으며 지방과 구별하기 어려울 수 있습니다. 한 조각에 지방 패드를 제거하는 것은 림프절이 제거되었는지 확인하는 가장 좋은 방법입니다.
- 멸균 식염수로 다리를 철저히 헹구고 현미경을 통해 작은 머리카락과 입자가 상처 오염 및 감염을 피하기 위해 수술 부위에서 완전히 제거되었음을 확인하십시오. 활성 출혈이 없는지 확인하십시오.
- 집게와 바늘 홀더를 사용하여 6-0 나일론 봉합사로 근육 근막까지 피부 가장자리를 봉합하고 표면 림프 흐름을 제한하기 위해 2-3mm의 간격을 둡습니다.
참고: 함께 제공되는 비디오에는 완성된 봉합사의 예가 표시됩니다. - 진통을 관리하십시오. 마우스 체중 30 g 당 진통의 0.1 mL를 그립니다. 볼루스 주사로 피하 진통을 주입.
- 비교를 위해 수술 후 마우스를 무게.
- 회복을 위해 가열된 캐비닛에 마우스를 케이지에 놓습니다.
5. 수술 후 치료
- 마우스에게 물과 음식 광고 리비텀수술 후 회복할 수 있도록 개별 케이지를 주세요.
- 진통을 위해 매일 3x buprenorphine의 0.02 mL의 볼루스 피하 복용량을 관리하십시오.
- 적절한 상처 치유, 통증과 감염의 징후를 위해 매일 동물을 모니터링하십시오. 감염의 징후가 나타나면 항생제 연고를 사용하십시오.
6. 수술 후 조사
- 수술 3 일 후, 수술 전 조사 절차를 반복하십시오 (단계 1.1-1.4).
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Representative Results
이 절차는 이전에 세 가지 별도 실험에서 사용되었습니다. 모든 실험은 모두이 문서의 공동 저자 다른 수석 조사자에 의해 만들어졌다. 세 가지 실험 모두에서 이 프로토콜에 설명된 것과 동일한 절차를 준수하기 위해 세심한 주의를 기울였습니다. 모든 3개의 실험에서, 이차 림프부종은 다른 뒷다리가 대조군으로 봉사하는 동안 1개의 뒷다리에 유도되었습니다. 뒷다리의 부피는 세 가지 실험 모두의 주요 결과였다. 그림 1은 스터디 설계를 도시한다.
모든 마우스는 뒷다리의 부피를 측정하기 위하여 수술 다음 주에 있는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 검사를 겪었습니다. μCT 스캔은 다중 모달성 전임상스캐너(표 오브 머티리얼)에서수행되었고, 뒤26일 설명한 바와 같이 관련 소프트웨어에서 관심영역(ROI) 기능을 통해 뒷다리의 부피를 측정하였다. 상기 원위경골조는 앞서설명한 방법(27)을이용하여 3차원(3D) 축색 영상에 위치하였다. ROI는 말단 경골 관절에서 시작하고 그 시점에 모든 조직 말단을 포함. 해석을 위한 Hounsfield 범위는 -500에서 4000으로 설정되었습니다.
모든 데이터는 통계소프트웨어(자료표)를사용하여 분석하였다. Sidak의 다중 비교 시험은 유도된 림프부종 뒷다리의 부피를 대조군 뒷다리와 비교하기 위하여 이용되었습니다. 대조군 뒷다리와 림프부종 뒷다리 사이의 유의한 차이는 P-값 <0.05로 정의된다.
그림 1: 결과 측정을 위한 설계 및 시간 지점을 연구합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실험 126은 4개의 그룹으로 분포된 32개의 마우스를 포함하였다. 목표 중 하나는 방사선의 여러 가지 다른 복용량을 연구하고 가장 바람직한 복용량을 찾을 수 있었다, 심한 이환율을 유발하지 않고 지속적인 림프부종을 유도하기위한. 10 Gy 조사의 2개의 복용량을 주어진 단은 4개의 마우스를 포함했습니다. 도 2는 림프부종의 일관된 상태가 모든 8 주 동안 달성되었다는 것을 보여줍니다. 표 1은 림프부종 뒷다리와 대조군 뒷다리 사이의 부피의 현저한 차이가 1, 7, 및 8주에 있었다는 것을 나타낸다. 유도 된 림프부종의 일관된 상태가 달성되었지만, 모든 8 주 동안 뒷다리 사이의 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 이 결과는 2개의 그밖 실험과 다르고 4개의 마우스의 상대적으로 더 작은 견본 크기 때문에 설명될 수 있었습니다. 측정 횟수를 늘리면 연구의 힘이 증가하고 이에 따라 차이가 있을 경우 차이를 검출할 확률이28입니다.
그림 2: 평균 뒷다리 볼륨: 실험 1. 10 Gy 조사의 2개의 복용량을 주어진 군에서 4마리의 마우스의 측정은 이 그림에 포함된다. 이 그래프는 수술 후 8주 동안mm3의 평균 뒷다리 부피를 보여줍니다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 오류 막대는 표준 편차(SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 주 | mm3의 림프부종 부피 (n = 4) | 제어부피(n = 4) | P 값 | 95% 신뢰 구간 |
| 1 | 218.53 ± 9.3 | 136.78 ± 2.48 | 0.002 | 53.77−109.73 |
| 2 | 202.25 ± 10.24 | 141.88 ± 8.02 | 0.066 | (-6.53)-127.28 |
| 3 | 193.28 ± 10.80 | 141.20 ± 6.80 | 0.060 | (-3.7)−107.85 |
| 4 | 194.95 ± 21.05 | 141.50 ± 8.03 | 0.224 | (-41.85)-148.75 |
| 5 | 193.75 ± 7.07 | 141.70 ± 8.60 | 0.051 | (-0.27)-104.37 |
| 6 | 193.23 ± 3.42 | 141.78 ± 10.29 | 0.054 | (-1.56)-104.46 |
| 7 | 194.95 ± 7.26 | 143.23 ± 8.90 | 0.050 | 0.17-103.28 |
| 8 | 195.8 ± 9.65 | 152.18 ± 5.81 | 0.009 | 19.88−67.38 |
표 1: 시닥의 다중 비교 테스트: 실험 1. 이 표는 수술 후 8주 동안 유도된 림프부종 뒷다리와 대조군 뒷다리의 평균 부피 사이의 통계적 비교를 나타낸다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 값은 다음과 같이 표시됩니다 : mm3의평균 ± SD. P-값 < 0.05는 대조군 뒷다리와 림프부종 뒷다리 사이의 유의한 차이로 간주된다. n(관측값 수) = 4.
실험 2에는 45개의 마우스가 포함되었다. 15 마리의 마우스가 대조군으로 작용하고 식염수 주사를 받았다. 우리는 식염수 주사가 유도 된 림프종의 양에 영향을 미치지 않았다고 가정으로 컨트롤은 대표적인 결과로 사용됩니다. 도 3은 림프부종이 실험 1에 비하여 덜 안정적임을 나타낸다. 추가적으로, 대조군 뒷다리의 부피는 8 주 동안 증가했습니다. 이렇게 하면 표 2에제시된 상대적 차이가 줄어듭니다. 마우스가 수술 후 몇 주 동안 비수술 뒷다리를 더 많이 사용한다고 추측되고 있으며, 이로 인해 비대와 비수술 뒷다리의 사지 부피가 증가하게 됩니다. 가장 중요한 것은, 표 3은 수술 후 8주 동안 림프부종 뒷다리와 대조군 뒷다리 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있음을 보여준다. 마우스의 높은 수는이 절차는 적어도 8 주 동안 통계적으로 유의한 림프부종을 유도 할 수 있음을 증명한다.
그림 3: 평균 뒷다리 볼륨: 실험 2. 대조군으로부터의 15개의 마우스의 측정은 이 도면에 포함된다. 이 그래프는 수술 후 8주 동안mm3의 평균 뒷다리 부피를 보여줍니다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 실험 1 | 실험 2 | 실험 3 | 실험 1, 2 및 3 결합 | |||||
| 주 | 절대 차이 (mm3) | 상대적 차이(%) | 절대 차이 (mm3) | 상대적 차이(%) | 절대 차이 (mm3) | 상대적 차이(%) | 절대 차이 (mm3) | 상대적 차이(%) |
| 1 | 81.75 ± 7.20 | 0.60 ± 0.04 | 104.34 ± 25.96 | 0.76 ± 0.23 | 85.20 ± 35.05 | 0.64 ± 0.27 | 94.02 ± 29.57 | 0.69 ± 0.24 |
| 2 | 60.38 ± 17.21 | 0.43 ± 0.14 | 107.12 ± 44.33 | 0.79 ± 0.33 | 85.63 ± 37.94 | 0.63 ± 0.29 | 92.77 ± 41.68 | 0.68 ± 0.31 |
| 3 | 52.08 ± 14.35 | 0.37 ± 0.11 | 78.77 ± 39.45 | 0.57 ± 0.28 | 74.67 ± 49.57 | 0.54 ± 0.38 | 73.74 ± 41.51 | 0.53 ± 0.31 |
| 4 | 53.45 ± 24.51 | 0.38 ± 0.19 | 50.67 ± 29.94 | 0.36 ± 0.21 | 50.62 ± 16.35 | 0.37 ± 0.11 | 51.01 ± 24.03 | 0.37 ± 0.17 |
| 5 | 52.05 ± 13.46 | 0.37 ± 0.11 | 32.74 ± 24.66 | 0.22 ± 0.17 | 42.67 ± 11.81 | 0.31 ± 0.07 | 39.08 ± 20.02 | 0.27 ± 0.14 |
| 6 | 51.45 ± 13.63 | 0.36 ± 0.11 | 26.80 ± 22.35 | 0.18 ± 0.14 | 32.86 ± 10.90 | 0.22 ± 0.08 | 32.32 ± 18.96 | 0.21 ± 0.13 |
| 7 | 51.73 ± 13.26 | 0.36 ± 0.11 | 19.04 ± 17.22 | 0.12 ± 0.11 | - | - | 25.92 ± 21.15 | 0.17 ± 0.15 |
| 8 | 43.63 ± 6.11 | 0.29 ± 0.04 | 15.15 ± 11.70 | 0.10 ± 0.08 | - | - | 21.15 ± 15.96 | 0.14 ± 0.10 |
표 2: 절대 및 상대적 차이입니다. 이 표는 림프부종 과 대조군 뒷다리 사이의 절대적인 부피 차이를 mm3의 ±SD및 상대적 차이 ±SD 퍼센트로 나타낸다.
| 주 | mm3의 림프부종 부피 (n = 15) | 제어 부피(mm3) (n = 15) |
P 값 | 95% 신뢰 구간 |
| 1 | 241.82 ± 35.69 | 137.48 ± 21.54 | <0.001 | 82.21−126.47 |
| 2 | 242.41 ± 45.13 | 135.29 ± 5.81 | <0.001 | 69.33−144.89 |
| 3 | 216.85 ± 41.47 | 138.08 ± 5.31 | <0.001 | 45.15−112.39 |
| 4 | 193.10 ± 31.27 | 142.43 ± 5.29 | <0.001 | 25.15−76.18 |
| 5 | 180.03 ± 26.03 | 147.29 ± 6.45 | 0.002 | 11.72−53.76 |
| 6 | 179.89 ± 25.00 | 153.09 ± 6.56 | 0.004 | 7.74-45.85 |
| 7 | 176.45 ± 19.77 | 157.41 ± 7.49 | 0.008 | 4.35−33.71 |
| 8 | 166.97 ± 11.8 | 151.82 ± 10.07 | 0.002 | 5.18-25.12 |
표 3: 시닥의 다중 비교 테스트: 실험 2. 이 표는 수술 후 8주 동안 유도된 림프부종 뒷다리와 대조군 뒷다리의 평균 부피 사이의 통계적 비교를 나타낸다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 값은 다음과 같이 표시됩니다 : mm3의평균 ± SD. P-값 < 0.05는 대조군 뒷다리와 림프부종 뒷다리 사이의 유의한 차이로 간주된다. n(관측값 수) = 15.
실험 3에는 36개의 마우스가 포함되었다. 12마리의 마우스가 대조군으로 작용하고 식염수 주사를 받았다. 우리는 식염수 주사가 유도 된 림프종의 양에 영향을 미치지 않았다고 가정으로 컨트롤은 대표적인 결과로 사용됩니다. 본 실험에서 마우스의 뒷다리 부피는 8주 대신 6주 동안 측정하였다. 실험은 실험을 수행했을 때 물류적 어려움으로 인해 6주 동안만 지속되었습니다. 도 4는 실험 2보다 보다 일관된 림프부종을 나타낸다. 표 4는 수술 후 6주 동안 통계적으로 유의한 림프부종이 있음을 나타낸다.
그림 4: 평균 뒷다리 볼륨: 실험 3. 대조군으로부터의 12개의 마우스의 측정은 이 도면에 포함된다. 이 그래프는 수술 후 6주 동안mm3의 평균 뒷다리 부피를 보여줍니다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 주 | mm3의 림프부종 부피 (n = 12) | 제어부피(n = 12) mm 3 | P 값 | 95% 신뢰 구간 |
| 1 | 219.06 ± 35.00 | 133.86 ± 10.02 | <0.001 | 51.66−118.74 |
| 2 | 220.90 ± 36.98 | 135.27 ± 5.89 | <0.001 | 49.33−121.94 |
| 3 | 211.74 ± 47.30 | 137.07 ± 7.56 | 0.002 | 27.24−122.11 |
| 4 | 186.09 ± 20.36 | 135.47 ± 5.70 | <0.001 | 34.98−66.27 |
| 5 | 182.35 ± 18.25 | 139.68 ± 7.45 | <0.001 | 31.37−53.98 |
| 6 | 183.44 ± 12.11 | 150.58 ± 8.37 | <0.001 | 22.42−43.29 |
표 4: 시닥의 다중 비교 테스트: 실험 3. 이 표는 수술 후 6주 동안 유도된 림프부종 뒷다리와 대조군 뒷다리의 평균 부피 사이의 통계적 비교를 나타낸다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 값은 다음과 같이 표시됩니다 : mm3의평균 ± SD. P-값 < 0.05는 대조군 뒷다리와 림프부종 뒷다리 사이의 유의한 차이로 간주된다. n(관측값 수) = 12.
도 5 및 표 5는 결합된 세 가지 실험 모두의 평균 뒷다리 부피를 나타낸다. 표 5는 이러한 시술의 사용이 적어도 8주 동안 지속되는 통계적으로 유의한 림프부종을 초래한다는 것을 나타낸다. 처음 6주로부터의 데이터는, 실험 1, 2 및 3으로부터의 31개의 마우스의 결합된 측정이다. 7주-8주에는 실험 1과 2의 데이터만 으로 19개의 마우스를 합산한 결과.
그림 5: 결합된 평균 뒷다리 볼륨: 실험 1, 2 및 3. 수술 후 처음 6주에 포함된 31마리의 마우스와 다음 2주에 포함된 마우스 19마리. 이 그래프는 수술 후 8주 동안mm3의 평균 뒷다리 부피를 보여줍니다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 주 | mm3의 림프부종 부피 (주 1-6 n = 31) (주 7-8 n = 19) |
mm3의 제어 부피(주 1-6 n = 31) (주 7-8 n = 19) |
P 값 | 95% 신뢰 구간 |
| 1 | 230.00 ± 34.46 | 135.99 ± 16.03 | <0.001 | 78.19−109.84 |
| 2 | 228.90 ± 40.91 | 136.13 ± 6.32 | <0.001 | 70.47−115.07 |
| 3 | 211.83 ± 41.15 | 138.09 ± 6.36 | <0.001 | 51.53−95.95 |
| 4 | 190.63 ± 25.81 | 139.62 ± 6.54 | <0.001 | 38.15−63.87 |
| 5 | 182.70 ± 21.52 | 143.62 ± 7.79 | <0.001 | 28.36−49.79 |
| 6 | 182.98 ± 19.11 | 150.66 ± 8.36 | <0.001 | 22.18−42.47 |
| 7 | 180.34 ± 19.31 | 154.43 ± 9.60 | <0.001 | 11.61−40.22 |
| 8 | 173.04 ± 16.42 | 151.89 ± 9.19 | <0.001 | 10.35−31.94 |
표 5: Sidak의 다중 비교 테스트: 실험 1, 2 및 3을 결합했습니다. 이 표는 수술 후 처음 6주 동안 31명의 마우스와 다음 2주 동안의 19명의 마우스의 유도된 림프부종 뒷다리 및 대조군 뒷다리의 평균 부피 사이의 통계적 비교를 나타낸다. 모든 마우스는 수술 전 및 후 10Gy 조사의 복용량을 받았다. 값은 다음과 같이 표시됩니다 : mm3의평균 ± SD. P-값 < 0.05는 대조군 뒷다리와 림프부종 뒷다리 사이의 유의한 차이로 간주된다. n(관측값 수) = 31.
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Discussion
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 방사능으로 작업할 때 연구원들이 안전 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. 둘째, 이 프로토콜의 수술 부분 동안 마우스가 마취되면 절차를 시작하고 불필요한 휴식없이 완료하는 것이 중요합니다. 이것은 동물을 위한 지나치게 긴 수술 기간을 피하고 마취가 수술 도중 효력을 분실하는 것을 방지하기 위하여 중요합니다. 마취제의 볼루스 주사를 한 번만 투여하고 한 번 앉아서 수술 절차를 완료하는 것이 좋습니다. 또한 과도한 특허 블루 V가 림프관을 둘러싼 조직을 변색시키기 때문에 너무 많은 특허 블루 V를 투여하지 않는 것이 중요한 단계이다. 주변 조직이 변색되면 림프혈관을 시각화하는 것이 거의 불가능할 수 있으며 이로 인해 절차가 손상됩니다. 하나는 림프관을 시각화 관리하더라도, 변색 된 조직은 특허 블루 V가 합자에 근접 을 통과하는지 여부를 평가하기 어렵게 만들 것입니다. 작업자가 배치 된 합자가 림프 흐름을 수축하고 있는지 확인하여 절차가 성공할 수 있도록해야하기 때문에 문제가됩니다. 또한 상처를 닫을 때 2-3mm의 간격을 두는 것이 중요합니다. 일시적인 피부 갭은 종종 인간의 상처 치유 과정을 모방하는 데필요하다(29).
이 방법의 한계는 현미경및 이전 현미경 수술 훈련에 접근을 요구하는 시간 소모적인 절차이다. 이 프로토콜의 수술 부분을 수행 할 때, 수술 절차 사이의 시간을 계획하는 것이 중요하다. 많은 시간이 동물이 마취될 때까지 기다리며 뒷다리를 면도하고 일반적으로 각 수술 절차를 준비합니다. 따라서 사전에 주택과 마취제를 준비하는 것이 좋습니다. 만성 림프부종이 유발되었음을 확신하려면 조직 병리학을 분석해야합니다. 우리는 이 기사에 조직 병리학을 포함하지 않았으며, 이는 한계입니다. 조직 병리학이 림프관에 조직학적 변화가 일어났다는 사실을 지지하지 않으면 뒷다리의 부피 변화는 부종으로 만 설명 될 수 있습니다. 실험 126에서 4개의 마우스에 대한 모든 데이터를 포함하는 문서는 조직 병리학을 포함하고 이 기술을 사용하여 조직 병리학에 중요한 변경이 있었다는 것을 보여줍니다. 이 문서는 또한 림프 영상을 포함한다. 실험 2 및 3에서 마우스에 동일한 절차가 사용되었지만, 조직 병리학은 이러한 실험에서 림프부종 뒷다리와 대조군 뒷다리 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. 조직 병리학을 포함하여 추가 연구 결과는 림프부종이 조직학 수준에 유도되는지 명확히 하기 위하여 이 모형을 위해 필요합니다. 실험 2와 3은 아직 게시되지 않았기 때문에 이를 참조할 수 없습니다.
뒷다리 부피를 측정하기 위해 μCT 스캔을 사용하는 것은 물 변위 방법 이나 원주 측정을 사용하는 것보다 더 객관적이라고 주장 할 수 있지만 여전히 한계가 있습니다. 측정 기술은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 μCT 스캐너에 액세스하고 소프트웨어를 분석해야 합니다.
일반적으로 설치류 림프부종 모델의 가장 큰 과제 중 하나는 과도한 방사선이25수행되지 않는 한 자발적인 림프부종 분해능이었습니다. 이 모형을 개발할 때, 우리는 가혹한이환율26를일으키는 원인이 되지 않고 지속적인 임부종을 유도할 복용량을 찾아내기 위하여 방사선의 몇몇 다른 복용량을 시험했습니다. 이전에는 림프부종 모델이 림프부종 유도 또는 결과 평가 방법으로 표준화되지 않았습니다. Oashi 등20은 30 Gy 조사의 단일 용량을 사용하고, 3개의 분리된 지점에서 각 림프혈관을 결찰하였다. 그 연구에서, 외과 적 절차는 수행 90 분이 걸렸습니다. 본 조에 제시된 방법은 시간이 많이 소요되는 것으로 간주될 수 있지만, 수술 부위는 여전히 Oashi et al.20에의해 제시된 방법보다 약 2배 빠른 속도로 수행될 수 있다. 그(것)들은 또한 6 달의 후속 기간이 있었습니다, 이 문서에 제시된 어떤 연구 결과보다는 상당히 더 긴. 그러나, 그(것)들은 단지 1개의 마우스를 포함하고 그(것)들은 팽윤을 평가하기 위하여 사지 둘레를 수동으로 측정했습니다, 그러나 이 문서에 제시된 양은 μCT 검사 및 3D 분석 소프트웨어를 사용하여 31 마우스에 측정되었습니다. Komatsu 외30은 전기 칼을 사용하여 관음 림프절 및 관련 말초 림프관 및 지방 조직을 제거했습니다. 전기 칼을 사용하는 것은 미세 수술 훈련을 필요로하지 않는 간단한 접근 방식 일 수 있지만, 유도 부종은 이 문서에 제시 된 방법은 적어도 8 주 지속 일관된 림프부종을 제공하는 동안 4 일 후에 해결.
이 프로토콜은 연구원이 개정된 림프부종 모형의 한계 그리고 이점을 고려하는 가능하게 할 것입니다. 또한 이 프로토콜은 연구원이 모델을 성공적으로 복제할 수 있도록 지원해야 합니다. 이 방법은 림프부종의 병리생리학을 이해하고 새로운 치료 옵션을 연구하기 위해 향후 관찰 및 중재 연구에서 사용될 수 있습니다. 향후 연구에서는 유도 된 림프부종이 얼마나 오래 지속되는지 관찰하기 위해 8 주 보다 더 오래 후속 조치를 하는 것도 흥미로울 것입니다. 또한 수술 전 및 후 마우스의 표적 조사를 수행하는 효과를 관찰하는 것도 흥미로웠습니다. 이 작업은 CT 검사를 수행하고 대상 볼륨을 계획하여 수행할 수 있습니다. 미래 연구 결과에서, 이 모형은 또한 형광 유도한 림프 화상 진찰, perometry 또는 bioimpedance 연구 결과에 의해 지원될 수 있었습니다. 이 방법은 적어도 8 주 지속되는 통계적으로 유의한 림프부종을 제공하며, 이는 다른 리드 조사자들에 의해 3개의 별도 실험에서 CT 체적을 통해 직접 측정되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 현미경을 통해 본 영상을 기록하는 데 필요한 장비를 빌려 준 생물 의학 연구소의 피터 볼렌 (Peter Bollen)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
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