Summary
Эта модель животных позволяет исследователям индуцировать статистически значимые вторичные лимфедемы в задней конечности мышей, продолжительностью не менее 8 недель. Модель может быть использована для изучения патофизиологии лимфедемы и для изучения новых вариантов лечения.
Abstract
Модели животных имеют первостепенное значение в исследовании лимфедемы для того, чтобы понять патофизиологию болезни, но и изучить потенциальные варианты лечения. Эта модель мыши позволяет исследователям вызвать значительное лимфедема продолжительностью не менее 8 недель. Лимфедема индуцируется с помощью комбинации дробной лучевой терапии и хирургической абляции лимфатических. Эта модель требует, чтобы мыши получают дозу 10 серый (Gy) излучения до и после операции. Хирургическая часть модели включает в себя перевязку трех лимфатических сосудов и извлечение двух лимфатических узлов из задней конечности мыши. Наличие доступа к микрохирургическим инструментам и микроскопу имеет важное значение, из-за небольших анатомических структур мышей. Преимущество этой модели в том, что она приводит к статистически значимым лимфедема, который обеспечивает хорошую основу для оценки различных вариантов лечения. Это также отличный и легко доступный вариант для микрохирургического обучения. Ограничение этой модели заключается в том, что процедура может занять много времени, особенно если она не практикуется заранее. Модель приводит к объективно количественной лимфедемы у мышей, не вызывая тяжелой заболеваемости и был протестирован в трех отдельных проектах.
Introduction
Лимфедема характеризуется накоплением лимфатической жидкости, что приводит к локализованной отек тканей, который в основном происходит из-за нарушения или нарушения потока лимфатической жидкости в лимфатических сосудах1. Лимфатический поток может быть нарушен или нарушен инфекцией, обструкцией, травмой или врожденными дефектами в лимфатической системе2. Эти этиологии приводят к накоплению лимфатической жидкости, что приводит к хроническому состоянию воспаления, что приводит к последующему фиброзу, а также осаждению жировой ткани3. Лимфедема может быть классифицирована как первичная или вторичная лимфедема. Первичная лимфедема вызвана отклонениями в развитии или генетической мутацией2,4. Вторичный лимфедема возникает из-за основного системного заболевания, хирургии или травмы2,4. Вторичный лимфедема является наиболее распространенной формой лимфедемы в мире2. В развитых странах наиболее распространенной причиной вторичной лимфедемы является онкологическая терапия, такая как адъювантная лучевая терапия и вскрытие лимфатических узлов5. Лимфедема является наиболее частым среди больных раком молочной железы, но также может развиваться у пациентов с гинекологическими, меланомы, мочеполовой или рак шеи6. Было высказано предположение, что из всех женщин с диагнозом рака молочной железы, 21% будет развиваться лимфедема7.
Лимфедема может быть стресс для пациента как физически, так и психологически. Пациенты с лимфедема имеют повышенный риск заражения5,8,9, низкое качество жизни и может развиться социальная тревога и симптомы депрессии10. Осложнения хронической лимфедемы приводят к высокой стоимости медицинской помощи и увеличению бремени болезней9,11. Выводы также предположили, что лимфедема может быть связано с повышенным риском смерти после лечения рака молочной железы12. Консервативное управление, такие как сжатие пораженного участка, ручной лимфатический дренаж и общий уход за кожей остаются первой линией подхода. В настоящее время не лечит6. Хотя был достигнут прогресс в области хирургической и медицинской терапии, все еще есть возможности для совершенствования. Необходимы дополнительные исследования, обеспечивая понимание патофизиологии и прогрессирования заболевания, необходимы для того, чтобы врачи могли обеспечить лучшие варианты лечения для пациентов5.
Модели животных используются в доклинических исследованиях для понимания патофизиологии заболеваний и разработки потенциальных вариантов лечения. Несколько различных моделей лимфедемы животных были созданы в клыки13,14,кролики15, овец16,свиней17,18 и грызунов19,20, 21,22,23,24. Модель грызунов, как представляется, наиболее экономически эффективной моделью, при исследовании реконструкции лимфатической функции, из-за грызунов быть легко доступными и относительнонедорогой 25. Большинство моделей мышей были сосредоточены на индуцировании лимфедема в хвосте мышей21,22,23. Хвост модель очень надежна, но точный хирургический метод для индуцирования лимфедема значительно варьируется в предыдущих опубликованных материалов. Это приводит к колебаниям продолжительности и надежности разработанной лимфедемы, представленной в известной стифетуре25. Различные методы также используются для индуцирования лимфедема в модели задних конечностей, и они также дают различные результаты, но модель hindlimb может быть легче понять с точки зрения перевода. Предыдущие модели лимфедемы были затруднены спонтанное разрешение лимфедемы и, следовательно, воспроизводимый и постоянный лимфедема модель необходима25. Исследователи ранее пытались увеличить дозу радиации, чтобы предотвратить спонтанное разрешение лимфедемы, но это часто приводило к последующей тяжелой заболеваемости25.
Эта модель приводит к статистически значимой лимфедеме, не вызывая тяжелой заболеваемости, сочетая микрохирургию с радиацией. Модель была пересмотрена из предыдущей хирургической модели, добавив дозу облучения, что вызывает лимфедема, не вызывая тяжелой заболеваемости26. Он также предлагает прекрасную возможность для микрохирургического обучения. Доступ к микрохирургическому оборудованию и микроскопу необходим, благодаря небольшим анатомическим структурам мышей. Хирургическая процедура может быть выполнена, когда пользователь был обучен основным микрохирургическим методам, таким как зашивание микрохирургическими инструментами. Операторы, которые выполнили эту процедуру все смотрели учебник видео Acland на предварительные условия микрохирургических навыков (1981) и основной метод микросватуры (1985). Мы рекомендуем практиковать хирургическую процедуру 8–10 раз, прежде чем использовать ее в исследованиях. Практика процедуры гарантирует, что меньше ошибок, и что процедура может быть выполнена более эффективно. При освоении хирургическая процедура может быть выполнена за 45 минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В рамках институциональных руководящих принципов животные размещались в Университете южной Дании. Все процедуры, касающиеся животных, были одобрены Инспекцией по экспериментам на животных, министерством окружающей среды и продовольствия Дании.
1. Предоперационное облучение
ПРИМЕЧАНИЕ: Предоперационное облучение происходит за 7 дней до операции.
- Индуцировать анестезию.
- Поместите мышь в индукционную коробку и установите испаритель до 3% изофлуран с частотой потока кислорода 0,8-1,2 л/мин, чтобы вызвать ингаляционную анестезию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, инъекционные анестезии могут быть использованы, но в течение короткой продолжительности облучения индуцирования ингаляционной анестезии было достаточно. Для получения результатов, представленных в этой статье, были использованы 9-недельные самки мышей C57BL6. - Убедитесь, что мышь полностью обезвлена хвостом или лапой щепотку теста.
- Поместите мышь в индукционную коробку и установите испаритель до 3% изофлуран с частотой потока кислорода 0,8-1,2 л/мин, чтобы вызвать ингаляционную анестезию.
- Расположите мышь для облучения.
- Если полностью успокоительное, переместить мышь из индукционной коробки и поместить его под источником излучения в положении на спине и аккуратно зафиксировать задние конечности с лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь будет оставаться седативным в течение короткой продолжительности излучения. - Поместите 1,5 мм толщиной свинцовой площадки, чтобы гарантировать, что только область, которая проходит операцию (т.е. круговая область диаметром 25 мм вокруг колена) облучается.
- Если полностью успокоительное, переместить мышь из индукционной коробки и поместить его под источником излучения в положении на спине и аккуратно зафиксировать задние конечности с лентой.
- Вводят дозу 10 Ги радиации со скоростью 5,11 г/мин (100 кВт, 10 мА).
ВНИМАНИЕ: При работе с радиацией необходимо соблюдать меры предосторожности. В ходе этого эксперимента все облучение проводилось в радиационно-изолированной комнате, а источник излучения был включен только тогда, когда весь персонал вышел и опечатал помещение. - Поместите мышь обратно в клетку.
2. Установка оборудования
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургия должна быть выполнена в комнате, посвященной хирургическим процедурам. Оперативная поверхность должна быть стерильной.
- Тщательно очистите все оперативные поверхности с 70% этанола. Носите сетку для волос и кавер-версии. Используйте стерильные хирургические инструменты и стерильные перчатки.
- Приготовить анестезию.
- Нарисуйте 1 мл фентанила (0,315 мг/мл), 1 мл мидазолама (5 мг/мл) и 2 мл стерильной воды. Используйте различные шприцы и иглы для различных компонентов.
- Смешайте фентанил и стерильную воду, медленно опорожняя шприцы в стерильную стеклянную трубку. При смешивании добавьте мидазолам, чтобы завершить рабочее решение.
- Приготовьте анальгезию.
- Нарисуйте 0,2 мл бупренорфина (0,3 мг/мл) и 2 мл сольника.
- Смешайте объемы, медленно опорожнение шприцев в стерильную стеклянную трубку, чтобы завершить рабочее решение.
- Включите микроскоп и убедитесь, что освещение достаточно, и что микроскоп хорошо регулируется для глаз оператора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры должны выполняться под операционным микроскопом. Достаточно ежефрейта в диапазоне от 4x-25x.
3. Подготовка
- Взвесьте мышь до операции, поместив мышь в пустой контейнер на очищенной шкале.
- Администрирование анестезии.
- Нарисуйте 0,1 мл анестезии на 10 г мыши веса тела. Вводят анестезию подкожно в виде инъекции болуса.
- Пусть мышь отдохнуть в клетке с большим количеством постельных принадлежностей и жилья в течение примерно 10 минут до полного успокоительного. Изучите глубину анестезии, оценивая расслабление мышц и выполняйте тест на лапу или хвост.
- При полном успокоительном состоянии, брить заднюю конечность выбрали для процедуры с помощью электрических клиперов. Убедитесь в том, чтобы вытереть лишние волосы.
- Включите нагревательное устройство, например, грелку и накройте его хирургической тканью.
- Установите поток кислорода до 0,8 л/мин и соедините его с носеконом. Используйте 100% кислород.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носекон предназначен только для доставки кислорода, а не для анестезии. - Нанесите офтальмологическую мазь и введите 0,5 мл солей подкожно, предпочтительно в потертости мыши, чтобы предотвратить гиповолемию во время операции.
- Расположите мышь для операции.
- Поместите мышь на хирургической ткани в положении на спине. Поместите носекон над мдонов.
- Зафиксировать конец задних конечностей мягко с лентой, чтобы предотвратить мышь от смещения во время операции.
- Стерилизовать кожу с помощью алкоголя/хлоргексидина или спирта/повидона йода.
4. Хирургия
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере, левая задняя конечность (когда мышь рассматривается в положении на спине), был выбран для процедуры.
- Сделайте круговой разрез.
- Поднимите кожу с гладкими щипками и обкрепите небольшое отверстие примерно 5 мм проксимальной к поплитеальной ямсе.
- Сдвиньте острые ножницы в отверстие и клип к колену, так что разрез заканчивается чуть выше колена. Убедитесь в том, чтобы не проколоть основные сосуды, подняв кожу щипками во время отсечения.
- Переместите мышь в положение лежа и продолжайте клип с колена к popliteal ямки до окружного разреза завершена.
- Вскрыть кожу ниже колена.
- Аккуратно тупо вскрыть область ниже колена на пару миллиметров выше лодыжки, медленно открывая и закрывая микроскисора при подъеме кожи щипками.
- Тщательно резать оставшиеся видимые спайки с помощью микроскиссор. Используйте стерильный солен регулярно, чтобы сохранить ткань влажной в течение всей процедуры.
- Вскрыть кожу на проксимальном краю окружного разреза, так что он может быть убран с упругий втягиватель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ретрактор позволяет оператору лучше ею обзор проксимального лимфатического сосуда и предотвращает смещение проксимального обода во время операции. - Хотя все еще в положении подвержены, поверните заднюю лимбу осторожно и зафиксировать его с лентой, так что ишиатная вена видна из наиболее проксимальной точки открытой области до наиболее дистальной точки.
- Вводят примерно 0,01 мл патентного Blue V субкожно между вторым и третьим носом, используя шприц 0,5 мл с иглой 30 G. Аккуратно нажмите на лапу пару раз, чтобы распределить патент Blue V. Визуализировать лимфатические сосуды и лимфатические узлы через микроскоп, как патент Blue V заполняет лимфатические сосуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если синий цвет лимфатических сосудов исчезает во время процедуры, осторожно массируйте лапу, чтобы способствовать поглощению, а не вводить больше патента Blue V. Чрезмерное использование патента Blue V может привести к утечке и окраске тканей, окружающих лимфатические сосуды, которые могут скомпрометировать процедуру. - Найдите важные структуры: поплитовый лимфатический узло (PLN), два лимфатических сосуда дистального лимфатического узла (DLV1 и DLV2), и один лимфатический сосуд проксимальный для лимфатического узла (PLV).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все лимфатические сосуды могут быть найдены рядом с источетической вены. Проксимальный лимфатический сосуд обычно находится медиальным к вене, 2 дистальных лимфатических сосудов найдены медиальными и боковыми к вене. Аббревиальное проемы конструкций используются в сопроводительном видео. - Увеличить четко визуализировать PLV и ligate его с 10-0 нейлоновый шов с помощью микро-иглы держатель и микрофорспы. Нажмите на лапу пару раз, чтобы убедиться, что ни один патент Blue V проходит проксималь к шову.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка жира, окружающего лимфатический сосуд может быть необходимо. - Повторите шаг 4.7, чтобы свести на нет два дистальных лимфатических сосудов. Нажмите на лапу несколько раз, чтобы убедиться, что ни один патент Blue V не проходит проксималь к лигатуре. Если лимфатические сосуды лежат близко к источенской вены, попробуйте вскрыть еще больше дистально.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере, можно увидеть, что один из лимфатических сосудов разрывается из-за лигатуры, препятствующей лимфатиковому потоку. Лимфатические сосуды часто отделяются от вены дальше вниз. - Удалите поплит лимфатический узла.
- Найдите поплитический лимфатический узлы и закрепите небольшое отверстие с микросиссорами, чтобы получить к нему доступ и удалить его с помощью микроусилитов и микроскисфоров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатический узла имеет гладкую жемчужную поверхность в отличие от окружающей жировой ткани. - Чтобы проверить, является лимфатическим узлом, поместите его в пробирку, наполненную водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань состоит из жира, ткань будет плавать. Если ткань является лимфатическим узлам, она опустится на дно.
- Найдите поплитический лимфатический узлы и закрепите небольшое отверстие с микросиссорами, чтобы получить к нему доступ и удалить его с помощью микроусилитов и микроскисфоров.
- Удалите обивку для жира и лимфатических узлов.
- Перед удалением пищевого жира, используйте биполярный коагулятор, чтобы прижигать сосуды, протекающие через жир.
- Рассекать паховой жировой площадки с помощью микроусилитов и микросциссоров. Аккуратно обрезать прижигаемые сосуды, протекающие через жир. Затем аккуратно резечк фата в области глоток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатический узла, расположенный в жире редко окрашены патент blue V и может быть трудно отличить от жира. Удаление жира площадку в один кусок является лучшим способом обеспечить лимфатический узла была удалена.
- Тщательно промыть ногу стерильным сольнием и подтвердите через микроскоп, что любые маленькие волоски и частицы были тщательно удалены из хирургической области, чтобы избежать заражения ранами и инфекции. Убедитесь, что нет активного кровотечения.
- Шов края кожи до мышечной facia с 6-0 нейлоновый шов с помощью щипцы и держатель иглы, оставляя разрыв 2'3 мм, чтобы ограничить поверхностный поток лимфы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В сопроводительном видео показан пример готовых швов. - Администрирование анальгезии. Нарисуйте 0,1 мл обезболивания на 30 г массы тела мыши. Вводят обезболивание подкожно в виде инъекции болюса.
- Взвесьте мышь для послеоперационного для сравнения.
- Поместите мышь в клетку в шкаф с подогревом для восстановления.
5. Послеоперационный уход
- Дайте мышам отдельные клетки, чтобы восстановить после операции с водой и пищей объявление libitum.
- Администрирование bolus подкожной дозы 0,02 мл бупренорфина 3x ежедневно в течение 3 дней для обезболивания.
- Мониторинг животного ежедневно для соответствующего заживления ран, признаки боли и инфекции. Если признаки инфекции присутствуют, используйте антибиотик мазь.
6. Послеоперационное облучение
- Через три дня после операции повторите процедуру предоперационного облучения (шаги 1.1-1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта процедура ранее использовалась в трех отдельных экспериментах. Все эксперименты были сделаны различными ведущими следователями, которые все являются соавторами этой статьи. Во всех трех экспериментах было принято большое окоза придерживаться той же процедуры, что и описано в данном протоколе. Во всех трех экспериментах, вторичные лимфедема была индуцирована в одной задней конечности в то время как другие hindlimb служил в качестве контроля. Объемы задних конечностей были основным результатом во всех трех экспериментах. Рисунок 1 иллюстрирует дизайн исследования.
Все мыши прошли микро-компьютерную томографию (ККТ) в течение нескольких недель после операции по измерению объема задних конечностей. Сканирование ЗКТ проводилось на мультимодальном доклиническом сканере(Таблица материалов),а объем задних конечностей измерялся с помощью функции region-of-interest (ROI) в сопутствуном программном обеспечении, как ранее описано26. Дистальный тибиофибулярный сустав был расположен в трехмерных (3D) аксональных изображений с использованием метода, ранее описанного27. РЕНТАБЕЛЬНОСТь началась в дистальном тибиофибулярном суставе и включала в себя все ткани дистальных к этому моменту. Диапазон Hounsfield для анализа был установлен на от -500 до 4000.
Все данные были проанализированы с помощью статистического программного обеспечения(Таблица материалов). Многократный сравнительный тест Сидака был использован для сравнения объема индуцированной hindlimbly лимфедемы, с контрольной задней лидлимой. Значительное различие между контролем hindlimb и лимфедема hindlimb определяется как P-значение йlt;0.05.
Рисунок 1: Дизайн исследования и временные моменты для измерений результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Эксперимент 126 включал 32 мышей, распределенных по группам по четыре человека. Одна из целей состояла в том, чтобы изучить несколько различных доз радиации и найти наиболее предпочтительную дозу, для индуцирования прочного лимфедемы, не вызывая тяжелой заболеваемости. Группа, которая получила две дозы 10 Gy облучения включены четыре мышей. Рисунок 2 показывает, что последовательное состояние лимфедемы было достигнуто за все 8 недель. Таблица 1 показывает, что существует значительная разница в объеме между лимфедема hindlimb и контроля hindlimb в недели 1, 7 и 8. Хотя последовательное состояние индуцированной лимфедемы было достигнуто, не было статистически значимой разницы между задними в течение всех 8 недель. Этот результат отличается от двух других экспериментов и может быть объяснено из-за относительно меньшего размера выборки из четырех мышей. Увеличение числа измерений увеличит мощность исследования и, таким образом, вероятность обнаружения разницы, если разница существует28.
Рисунок 2: Средний объем задних конечностей: Эксперимент 1. В эту цифру включены измерения 4 мышей из группы, получившей две дозы облучения по 10 Ги. На этом графике показаны средние объемы задних конечностей в3 мм за 8 недель после операции. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Бары ошибок представляют стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Неделю | Объем лимфедемы в мм3 (n No 4) | Объем управления в мм3 (n No 4) | P-значение | 95% Доверительный интервал |
| 1 | 218.53 и 9.3 | 136,78 х 2,48 | 0.002 | 53.77-109.73 |
| 2 | 202.25 - 10,24 | 141,88 х 8,02 | 0.066 | (-6.53)-127.28 |
| 3 | 193,28 и 10,80 | 141.20 - 6,80 | 0.060 | (-3.7)-107.85 |
| 4 | 194,95 х 21,05 | 141.50 и 8.03 | 0.224 | (-41.85)-148.75 |
| 5 | 193,75 х 7,07 | 141,70 и 8,60 | 0.051 | (-0.27)-104.37 |
| 6 | 193,23 х 3,42 | 141,78 и 10,29 | 0.054 | (-1.56)-104.46 |
| 7 | 194,95 х 7,26 евро | 143,23 х 8,90 | 0.050 | 0,17-103,28 |
| 8 | 195,8 х 9,65 | 152.18 и 5,81 | 0.009 | 19.88-67.38 |
Таблица 1: Тест нескольких сравнений Сидака: Эксперимент 1. Эта таблица показывает статистическое сравнение между средними объемами индуцированной hindlimbs лимфедемы и контроля задних конечностей в течение 8 недель после операции. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Значения представлены как: среднее sD в мм3. P-значение злт; 0,05 рассматривается как существенная разница между контролем hindlimb и лимфедема hindlimb. n (количество наблюдений) No 4.
Эксперимент 2 включал 45 мышей. 15 мышей служили в качестве контроля и получили соточные инъекции. Элементы управления используются в качестве репрезентативных результатов, поскольку мы предполагаем, что соточные инъекции не повлияли на объем индуцированной лимфедемы. Рисунок 3 показывает, что лимфедема была менее стабильной, чем в эксперименте 1. Кроме того, объем контроля задних конечностей увеличился в течение 8 недель. Это уменьшает относительную разницу, представленную в таблице 2. Было спекулировано что мыши используют их non-operated hindlimb больше, в неделях следуя за хирургией, и что это водит к hypertrophy и увеличению в томе limb non-operated hindlimb. Самое главное, Таблица 3 показывает, что существует статистически значимая разница между hindlimb лимфедема и контроля hindlimb в течение всех 8 недель после операции. Большее число мышей доказывает, что эта процедура может вызвать статистически значимые лимфедемы, по крайней мере 8 недель.
Рисунок 3: Средний объем задних конечностей: Эксперимент 2. В этот показатель включены измерения 15 мышей из контрольной группы. На этом графике показаны средние объемы задних конечностей в3 мм за 8 недель после операции. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Бары ошибок представляют SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Эксперимент 3 | Эксперимент 1, 2 и 3 комбинированные | |||||
| Неделю | Абсолютная разница (мм3) | Относительная разница (%) | Абсолютная разница (мм3) | Относительная разница (%) | Абсолютная разница (мм3) | Относительная разница (%) | Абсолютная разница (мм3) | Относительная разница (%) |
| 1 | 81,75 и 7,20 | 0,60 и 0,04 | 104.34 и 25.96 | 0,76 и 0,23 | 85.20 - 35.05 | 0,64 и 0,27 | 94.02 - 29.57 | 0,69 и 0,24 |
| 2 | 60,38 и 17,21 | 0,43 и 0,14 | 107.12 и 44.33 | 0,79 и 0,33 | 85,63 и 37,94 | 0,63 и 0,29 | 92,77 и 41,68 | 0,68 и 0,31 |
| 3 | 52,08 и 14,35 | 0,37 и 0,11 | 78,77 и 39,45 | 0,57 и 0,28 | 74,67 и 49,57 | 0,54 и 0,38 | 73,74 и 41,51 | 0,53 и 0,31 |
| 4 | 53.45 и 24.51 | 0,38 и 0,19 | 50,67 и 29,94 | 0,36 и 0,21 | 50,62 и 16,35 | 0,37 и 0,11 | 51.01 - 24.03 | 0,37 и 0,17 |
| 5 | 52,05 и 13,46 | 0,37 и 0,11 | 32,74 и 24,66 | 0,22 и 0,17 | 42,67 и 11,81 | 0,31 и 0,07 | 39.08 и 20.02 | 0,27 и 0,14 |
| 6 | 51,45 и 13,63 | 0,36 и 0,11 | 26.80 и 22.35 | 0,18 и 0,14 | 32,86 и 10,90 | 0,22 и 0,08 | 32.32 и 18.96 | 0,21 и 0,13 |
| 7 | 51,73 и 13,26 | 0,36 и 0,11 | 19.04 и 17.22 | 0,12 и 0,11 | - | - | 25.92 и 21.15 | 0,17 и 0,15 |
| 8 | 43,63 и 6,11 | 0,29 и 0,04 | 15.15 и 11.70 | 0,10 и 0,08 | - | - | 21.15 и 15.96 | 0,14 и 0,10 |
Таблица 2: Абсолютная и относительная разница. В этой таблице показана абсолютная разница в объеме между лимфедемой- и контрольными задними конечностями - SD в мм3 и относительная разница в процентах.
| Неделю | Объем лимфедемы в мм3 (n No 15) | Объем управления в мм3 (n No 15) |
P-значение | 95% Доверительный интервал |
| 1 | 241,82 х 35,69 | 137.48 и 21.54 | Злт;0,001 | 82.21-126.47 |
| 2 | 242.41 и 45.13 | 135.29 и 5,81 | Злт;0,001 | 69.33-144.89 |
| 3 | 216.85 и 41.47 | 138.08 и 5,31 | Злт;0,001 | 45.15-112.39 |
| 4 | 193.10 - 31,27 | 142,43 х 5,29 | Злт;0,001 | 25.15-76.18 |
| 5 | 180,03 и 26,03 | 147.29 и 6.45 | 0.002 | 11.72-53.76 |
| 6 | 179,89 х 25,00 | 153,09 и 6,56 | 0.004 | 7,74–45,85 |
| 7 | 176,45 и 19,77 | 157.41 и 7.49 | 0.008 | 4.35-33.71 |
| 8 | 166.97 и 11.8 | 151,82 и 10,07 | 0.002 | 5.18-25.12 |
Таблица 3: Тест нескольких сравнений Сидака: Эксперимент 2. Эта таблица показывает статистическое сравнение между средними объемами индуцированной hindlimbs лимфедемы и контроля задних конечностей в 8 недель после операции. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Значения представлены как: среднее sD в мм3. P-значение злт; 0,05 рассматривается как существенная разница между контролем hindlimb и лимфедема hindlimb. n (количество наблюдений) No 15.
Эксперимент 3 включал 36 мышей. 12 мышей служили в качестве контроля и получили соточные инъекции. Элементы управления используются в качестве репрезентативного результата, поскольку мы предполагаем, что соточные инъекции не повлияли на объем индуцированной лимфедемы. В этом эксперименте объем задних конечностей мышей измерялся в течение 6 недель вместо 8. Эксперимент длился всего 6 недель из-за логистических трудностей, когда эксперимент был выполнен. Рисунок 4 показывает более последовательную лимфедему, чем эксперимент 2. Таблица 4 показывает, что существует статистически значимый лимфедема в течение 6 недель после операции.
Рисунок 4: Средний объем задних конечностей: Эксперимент 3. В этот показатель включены измерения 12 мышей из контрольной группы. На этом графике показаны средние объемы задних конечностей в3 мм за 6 недель после операции. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Бары ошибок представляют SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Неделю | Объем лимфедемы в мм3 (n No 12) | Объем управления в мм3 (n No 12) | P-значение | 95% Доверительный интервал |
| 1 | 219.06 - 35.00 | 133,86 и 10,02 | Злт;0,001 | 51.66-118.74 |
| 2 | 220.90 и 36.98 | 135.27 и 5.89 | Злт;0,001 | 49.33-121.94 |
| 3 | 211.74 и 47.30 | 137.07 - 7,56 | 0.002 | 27.24-122.11 |
| 4 | 186.09 и 20.36 | 135,47 х 5,70 | Злт;0,001 | 34.98-66.27 |
| 5 | 182,35 и 18,25 | 139,68 х 7,45 | Злт;0,001 | 31.37-53.98 |
| 6 | 183.44 и 12.11 | 150,58 и 8,37 | Злт;0,001 | 22.42-43.29 |
Таблица 4: Тест нескольких сравнений Сидака: Эксперимент 3. Эта таблица показывает статистическое сравнение между средними объемами индуцированной hindlimbs лимфедемы и контроля задних конечностей в течение 6 недель после операции. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Значения представлены как: среднее sD в мм3. P-значение злт; 0,05 рассматривается как существенная разница между контролем hindlimb и лимфедема hindlimb. n (количество наблюдений) No 12.
На рисунке 5 и таблице 5 показан средний объем задних конечностей всех трех вместе взятых экспериментов. Таблица 5 показывает, что использование этой процедуры приводит к статистически значимой лимфедеме продолжительностью не менее 8 недель. Данные за первые 6 недель, являются комбинированные измерения 31 мышей из экспериментов 1, 2 и 3. На 7-8 неделе у нас были только данные экспериментов 1 и 2, что привело к комбинированным измерениям с 19 мышей.
Рисунок 5: Комбинированный средний объем задних конечностей: Эксперимент 1, 2 и 3. Тридцать один мышей, включенных в первые 6 недель после операции и 19 мышей, включенных в течение следующих 2 недель. На этом графике показаны средние объемы задних конечностей в3 мм за 8 недель после операции. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Бары ошибок представляют SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Неделю | Объем лимфедемы в мм3 (Неделя 1 х 6 н no 31) (Неделя 7-8 н и 19) |
Объем управления в мм3 (Неделя 1-6 н no 31) (Неделя 7-8 н и 19) |
P-значение | 95% Доверительный интервал |
| 1 | 230.00 - 34,46 | 135.99 и 16.03 | Злт;0,001 | 78.19-109.84 |
| 2 | 228.90 и 40.91 | 136.13 и 6.32 | Злт;0,001 | 70.47-115.07 |
| 3 | 211,83 и 41,15 | 138.09 и 6.36 | Злт;0,001 | 51.53–95,95 |
| 4 | 190,63 и 25,81 | 139,62 и 6,54 | Злт;0,001 | 38.15-63.87 |
| 5 | 182,70 и 21,52 | 143,62 х 7,79 | Злт;0,001 | 28.36-49.79 |
| 6 | 182,98 и 19,11 | 150,66 и 8,36 | Злт;0,001 | 22.18-42.47 |
| 7 | 180,34 и 19,31 | 154.43 и 9.60 | Злт;0,001 | 11.61-40.22 |
| 8 | 173,04 и 16,42 | 151,89 х 9,19 | Злт;0,001 | 10.35-31.94 |
Таблица 5: Тест несколько сравнений Сидака: Эксперимент 1, 2 и 3 вместе взятые. Эта таблица показывает статистическое сравнение между средними объемами индуцированной hindlimbs лимфедемы и контроля hindlimbs 31 мышей в первые 6 недель после операции и 19 мышей в течение следующих 2 недель. Все мыши получили дозу 10 Gy облучения до и после операции. Значения представлены как: среднее sD в мм3. P-значение злт; 0,05 рассматривается как существенная разница между контролем hindlimb и лимфедема hindlimb. n (количество наблюдений) No 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, важно, чтобы исследователи принимали меры предосторожности при работе с радиоактивностью. Во-вторых, во время хирургической части этого протокола, важно начать процедуру, как только мышь была обезглавина и закончить его без лишних перерывов. Это важно, чтобы избежать чрезмерно длительного хирургического периода для животного и предотвратить, что анестезия теряет эффект во время операции. Рекомендуется проводить только одну инъекцию болиса обезболиваии и завершать хирургическую процедуру за один присест. Это также критический шаг, не управлять слишком много патента Blue V, как избыток патента Blue V будет обесцвечивать ткани, окружающие лимфатические сосуды. Если окружающие ткани получает обесцвечены это может быть почти невозможно визуализировать лимфатических сосудов, и это ставит под угрозу процедуру. Даже если вам удастся визуализировать лимфатические сосуды, обесцвеченные ткани будет трудно оценить, является ли патент Blue V проходит проксимальной к лигатуре или нет. Это проблематично, потому что оператор должен быть уверен, что размещенные лигатуры сужают лимфатический поток, чтобы гарантировать, что процедура будет успешной. Также важно оставить зазор в 2-3 мм при закрытии раны. Как временный разрыв кожи часто необходимо имитировать человека раны процесс заживления29.
Ограничения этого метода в том, что это трудоемкая процедура, которая требует доступа к микроскопу и предыдущей микрохирургической подготовки. При выполнении хирургической части этого протокола, важно планировать время между хирургическими процедурами. Много времени уходит на ожидание животного, чтобы быть под анатейти, бритье задней конечности и в целом подготовиться к каждой хирургической процедуры. Поэтому рекомендуется заранее подготовить жилье и анестезию. Важно отметить, что для того, чтобы быть уверенным, что хроническая лимфедема была индуцирована, гистопатология должна быть проанализирована. Мы не включили гистопатологию в эту статью, что является ограничением. Без гистопатологии, поддерживающей тот факт, что гистологические изменения произошли с лимфатическими сосудами, изменения объема в задних конечностях можно охарактеризовать только как отек. Статья, которая включает в себя все данные о четырех мышах из эксперимента 126 включает в себя гистопатологию и показывает, что были значительные изменения в гистопатологии с помощью этой техники. Статья также включает в себя лимфатическую визуализацию. Та же процедура была использована на мышах в эксперименте 2 и 3, но гистопатология не показала существенной разницы между hindlimb lymphedema и контролем hindlimb в этих экспериментах. Дальнейшие исследования, включая гистопатологию, необходимы для этой модели, чтобы выяснить, является ли лимфедема индуцированной на гистологическом уровне. Эксперименты 2 и 3 еще не опубликованы, и поэтому мы не можем ссылаться на них.
Хотя использование сканирования ЗКТ для измерения объема задних конечностей можно утверждать, что они более объективны, чем использование метода перемещения воды или обходных измерений, оно по-прежнему имеет свои ограничения. Измерительный метод является дорогостоящим, трудоемким и требует доступа к компьютере-сканеру и анализу программного обеспечения.
Одна из самых больших проблем с моделями лимфедемы грызунов в целом, были спонтанное разрешение лимфедемы, если чрезмерное излучение было выполнено25. При разработке этой модели, мы протестировали несколько различных доз радиации, чтобы найти дозу, которая будет вызывать прочного лимфедема, не вызывая тяжелой заболеваемости26. Ранее модели лимфедемы не были стандартизированы в методах индукции лимфедемы или оценки результатов. Oashi et al.20 использовали разовую дозу 30 Gy облучения, и ligated каждый лимфатический сосуд в трех отдельных точках. В этом исследовании, хирургическая процедура занимает 90 минут для выполнения. Хотя метод, представленный в этой статье, можно считать трудоемким, хирургическая часть процедуры все еще может быть выполнена примерно в два раза быстрее, чем метод, представленный Oashi et al.20. Кроме того, срок их наблюдения составил 6 месяцев, что значительно больше, чем в любом из исследований, представленных в этой статье. Тем не менее, они включали только одну мышь, и они вручную измеряли окружность конечностей, чтобы оценить опухоль, в то время как объемы, представленные в этой статье, были измерены на 31 мышах с помощью сканирования и 3D-анализа программного обеспечения. Komatsu et al.30 удалили ингиновые лимфатические узлы и связанные с ними периферийные лимфатические сосуды и жировую ткань с помощью электрического ножа. Использование электрического ножа может быть более простой подход, который не требует микрохирургической подготовки, но индуцированный отек решен после дня 4 в то время как метод, представленный в этой статье предлагает последовательную лимфедема продолжительностью не менее 8 недель.
Этот протокол, мы надеемся, позволит исследователям рассмотреть ограничения и преимущества пересмотренной модели лимфедемы. Протокол должен также помочь исследователям успешно воспроизвести модель. Метод может быть использован в будущих обсервационных и интервенционных исследований, чтобы понять патофизиологию лимфедемы и исследования новых вариантов лечения. В будущих исследованиях, было бы также интересно иметь последующие более чем на 8 недель, чтобы наблюдать, как долго индуцированной лимфедемы длится. Было бы также интересно наблюдать эффект выполнения более целенаправленного облучения мышей до и после операции. Это может быть сделано путем выполнения КТ и планирования целевого объема. В будущих исследованиях, эта модель может также быть поддержана флуоресценции наведения лимфатических изображений, пирометрии или биоимпеданс исследований. Этот метод предлагает статистически значимые лимфедема продолжительностью не менее 8 недель, которая была измерена непосредственно через КТ объемвой в трех отдельных экспериментов различных ведущих исследователей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Питера Боллена, главу Биомедицинской лаборатории, за предоставление оборудования, необходимого для записи видеоматериалов, увиденных через микроскопы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. , Springer International Publishing. New York, NY. 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment? Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R. 3rd, Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H. The psycho-social impact of lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 7 (2), 109-112 (2009).
- Gutknecht, M., et al. Cost-of-illness of patients with lymphoedema. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (11), 1930-1935 (2017).
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs' limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O'Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats' limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
