Summary
Este modelo animal permite a los investigadores inducir linfedema secundario estadísticamente significativo en la extremidad posterior de los ratones, que dura al menos 8 semanas. El modelo se puede utilizar para estudiar la fisiopatología del linfedema e investigar nuevas opciones de tratamiento.
Abstract
Los modelos animales son de suma importancia en la investigación del linfedema con el fin de entender la fisiopatología de la enfermedad, pero también para explorar posibles opciones de tratamiento. Este modelo de ratón permite a los investigadores inducir linfedema significativo que dura al menos 8 semanas. El linfedema se induce mediante una combinación de radioterapia fraccionada y ablación quirúrgica de linfáticos. Este modelo requiere que los ratones reciban una dosis de 10 radiación gris (gy) antes y después de la cirugía. La parte quirúrgica del modelo implica la ligadura de tres vasos linfáticos y la extracción de dos ganglios linfáticos de la extremidad posterior del ratón. Tener acceso a herramientas microquirúrgicas y un microscopio es esencial, debido a las pequeñas estructuras anatómicas de los ratones. La ventaja de este modelo es que resulta en un linfedema estadísticamente significativo, que proporciona una buena base para evaluar diferentes opciones de tratamiento. También es una gran opción y fácilmente disponible para el entrenamiento microquirúrgico. La limitación de este modelo es que el procedimiento puede llevar mucho tiempo, especialmente si no se practica de antemano. El modelo da como resultado un linfedema objetivamente cuantificable en ratones, sin causar morbilidad grave y ha sido probado en tres proyectos separados.
Introduction
El linfedema se caracteriza por una acumulación de líquido linfático que conduce a la hinchazón localizada del tejido, que se produce principalmente debido a la alteración o alteración del flujo de líquido linfático en los vasos linfáticos1. El flujo linfático puede verse afectado o interrumpido por infección, obstrucción, lesiones o defectos congénitos en el sistema linfático2. Estas etiologías dan lugar a la acumulación de líquido linfático, lo que conduce a un estado crónico de inflamación, lo que resulta en fibrosis posterior, así como la deposición de tejido adiposo3. El linfedema se puede clasificar como linfedema primario o secundario. El linfedema primario es causado por anomalías del desarrollo o mutación genética2,4. El linfedema secundario ocurre debido a una enfermedad sistémica subyacente, cirugía otraumatismo2,4. El linfedema secundario es la forma más común de linfedema en el mundo2. En los países desarrollados, la causa más común del linfedema secundario es la terapia oncológica como la radioterapia adyuvante y la disección5de los ganglios linfáticos. El linfedema es más frecuente entre los pacientes con cáncer de mama, pero también puede desarrollarse en pacientes con cáncer ginecológico, melanoma, genitourinario o de cuello6. Se ha sugerido que de todas las mujeres diagnosticadas con cáncer de mama, el 21% desarrollará linfedema7.
El linfedema puede ser estresante para el paciente tanto física como psicológicamente. Los pacientes con linfedema tienen un mayor riesgo de infección5,8,9, mala calidad de vida y pueden desarrollar ansiedad social y síntomas de depresión10. Las complicaciones del linfedema crónico conducen a un alto costo de atención y un aumento de la carga de morbilidad9,11. Los hallazgos también han sugerido que el linfedema podría estar asociado con un mayor riesgo de muerte después del tratamiento con cáncer de mama12. El manejo conservador, como la compresión de la zona afectada, el drenaje linfático manual y el cuidado general de la piel, siguen siendo el primer enfoque. Actualmente no existe un tratamiento curativo6. Aunque se han hecho progresos en el campo de la terapia quirúrgica y médica, todavía hay margen de mejora. Se necesita más investigación, que proporciona información sobre la fisiopatología y la progresión de la enfermedad, para permitir a los médicos proporcionar mejores opciones de tratamiento para los pacientes5.
Los modelos animales se utilizan en la investigación preclínica para comprender la fisiopatología de las enfermedades y desarrollar posibles opciones de tratamiento. Se han establecido varios modelos animales de linfedema diferentes en caninos13,14,conejos15,ovejas16,cerdos17,18 y roedores19,20, 21,22,23,24. El modelo de roedores parece ser el modelo más rentable, al investigar la reconstrucción de la función linfática, debido a que los roedores son fácilmente accesibles y relativamente de bajo precio25. La mayoría de los modelos de ratones se han centrado en inducir linfedema en la cola de los ratones21,22,23. El modelo de cola es muy fiable, pero la técnica quirúrgica exacta para inducir el linfedema varía significativamente en el material publicado anteriormente. Esto se traduce en fluctuaciones en la duración y robustez del linfedema desarrollado presentado en la litteratura conocida25. También se están utilizando diferentes técnicas para inducir linfedema en el modelo de la extremidad posterior y también producen resultados variables, pero el modelo de la extremidad posterior podría ser más fácil de entender desde una perspectiva traslacional. Los modelos de linfedema anteriores se han visto obstaculizados por la resolución espontánea del linfedema y, por lo tanto, se necesita un modelo de linfedema reproducible y permanente25. Los investigadores han tratado previamente de aumentar la dosis de radiación, para prevenir la resolución espontánea del linfedema, pero esto a menudo ha llevado a la posterior morbilidad grave25.
Este modelo resulta en un linfedema estadísticamente significativo, sin causar morbilidad grave, combinando microcirugía con radiación. El modelo ha sido revisado a partir de un modelo quirúrgico anterior añadiendo una dosis de irradiación que induce linfedema, sin causar morbilidad grave26. También ofrece una gran oportunidad para la formación microquirúrgica. Es necesario tener acceso a equipos microquirúrgicos y un microscopio, debido a las pequeñas estructuras anatómicas de los ratones. El procedimiento quirúrgico se puede realizar cuando al usuario se le han enseñado técnicas microquirúrgicas básicas, como la sutura con instrumentos microquirúrgicos. Los operadores que realizaron este procedimiento vieron videos tutoriales de Acland sobre las condiciones previas de las habilidades microquirúrgicas (1981) y la técnica básica de microsutura (1985). Recomendamos practicar el procedimiento quirúrgico 8 a 10 veces antes de usarlo en la investigación. La práctica del procedimiento garantiza que se cometan menos errores y que el procedimiento se pueda realizar de forma más eficiente. Cuando se domina, el procedimiento quirúrgico se puede realizar en 45 minutos.
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Protocol
Los animales fueron alojados en la Instalación de Cuidado de Animales de la Universidad del Sur de Dinamarca según las directrices institucionales. Todos los procedimientos relacionados con sujetos animales han sido aprobados por la Inspección de Experimentos Animales, Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca.
1. Irradiación prequirúrgica
NOTA: La irradiación previa a la cirugía tiene lugar 7 días antes de la cirugía.
- Inducir la anestesia.
- Coloque el ratón en una caja de inducción y ajuste el vaporizador a 3% de isoflurano con un caudal de oxígeno de 0,8 x 1,2 L/min para inducir anestesia por inhalación.
NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar anestésicos inyectables, pero durante la corta duración de la irradiación que indujo la anestesia por inhalación fue suficiente. Para obtener los resultados presentados en este artículo, se utilizaron ratones hembra C57BL6 de 9 semanas de edad. - Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado por la prueba de pellizco de cola o pata.
- Coloque el ratón en una caja de inducción y ajuste el vaporizador a 3% de isoflurano con un caudal de oxígeno de 0,8 x 1,2 L/min para inducir anestesia por inhalación.
- Coloque el ratón para la irradiación.
- Si está completamente sedado, mueva el ratón de la caja de inducción y colóquelo debajo de la fuente de radiación en posición supina y fije suavemente las extremidades posteriores con cinta adhesiva.
NOTA: El ratón permanecerá sedado durante la corta duración de la radiación. - Coloque una almohadilla de plomo de 1,5 mm de espesor para asegurarse de que sólo el área que se somete a cirugía (es decir, el área circular con un diámetro de 25 mm alrededor de la rodilla) se irradia.
- Si está completamente sedado, mueva el ratón de la caja de inducción y colóquelo debajo de la fuente de radiación en posición supina y fije suavemente las extremidades posteriores con cinta adhesiva.
- Administrar una dosis de 10 gy de radiación a una dosis de 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
ADVERTENCIA: Se deben tomar precauciones de seguridad cuando se trabaja con radiación. Durante este experimento, toda la irradiación se realizó en una sala con aislamiento radiacional, y la fuente de radiación sólo se encendió cuando todo el personal se había ido y sellado la habitación. - Vuelva a colocar el ratón en su jaula.
2. Configuración del equipo
NOTA: La cirugía debe realizarse en una sala dedicada a los procedimientos quirúrgicos. La superficie operativa debe ser estéril.
- Limpie a fondo todas las superficies operativas con un 70% de etanol. Use red para el cabello y fundas. Utilice instrumentos quirúrgicos estériles y guantes estériles.
- Prepara la anestesia.
- Elaborar 1 ml de fentanilo (0,315 mg/ml), 1 ml de midazolam (5 mg/ml) y 2 ml de agua estéril. Utilice diferentes jeringas y agujas para los diferentes componentes.
- Mezcle el fentanilo y el agua estéril vaciando lentamente las jeringas en un tubo de vidrio estéril. Cuando se mezcle, agregue midazolam para completar la solución de trabajo.
- Prepara la analgesia.
- Elaborar 0,2 ml de buprenorfina (0,3 mg/ml) y 2 ml de salina.
- Mezcle los volúmenes vaciando lentamente las jeringas en un tubo de vidrio estéril para completar la solución de trabajo.
- Encienda el microscopio y asegúrese de que la iluminación es suficiente y de que el microscopio está bien ajustado para los ojos del operador.
NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse bajo un microscopio operativo. Un rango de aumento de 4x a 25x es suficiente.
3. Preparación
- Pesar la precirugía del ratón colocando el ratón en un recipiente vacío en una escala despejada.
- Administrar anestésico.
- Elaborar 0,1 ml de anestésico por cada 10 g de peso corporal del ratón. Inyecte el anestésico por vía subcutánea como una inyección de bolo.
- Deje que el ratón descanse en una jaula con mucha ropa de cama y refugio durante aproximadamente 10 minutos hasta que esté completamente sedado. Examine la profundidad anestésica evaluando la relajación muscular y realice una prueba de pellizco de pata o cola.
- Cuando esté completamente sedado, asemegue la extremidad posterior elegida para el procedimiento utilizando cortadoras eléctricas. Asegúrese de limpiar el exceso de cabello.
- Encienda el dispositivo de calefacción, como una almohadilla de calentamiento, y cúbralo con un paño quirúrgico.
- Ajuste el flujo de oxígeno a 0,8 L/min y conéctelo con un nosecone. Use 100% de oxígeno.
NOTA: El nosecone es sólo para la administración de oxígeno y no para la anestesia. - Aplicar pomada oftálmica e inyectar 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea, preferiblemente en el escraro del ratón, para prevenir la hipovolemia durante la cirugía.
- Coloque el ratón para la cirugía.
- Coloque el ratón sobre el paño quirúrgico en posición supina. Coloque el nosecone sobre el hocico.
- Fije suavemente el extremo de las extremidades posteriores con cinta adhesiva para evitar que el ratón se desplace durante la cirugía.
- Esterilice la piel con alcohol/clorhexidina o alcohol/povidona.
4. Cirugía
NOTA: En este ejemplo, se ha elegido la extremidad posterior izquierda (cuando el ratón se ve en posición supina) para el procedimiento.
- Haga una incisión circular.
- Levante la piel con fórceps lisos y recorte una pequeña abertura aproximadamente 5 mm proximal a la fosa popliteal.
- Deslice las tijeras afiladas en la abertura y recorte hacia la rodilla para que la incisión termine justo por encima de la rodilla. Asegúrese de no perforar los vasos subyacentes levantando la piel con fórceps mientras se recorta.
- Mueva el ratón a la posición propensa y continúe recortando desde la rodilla hacia la fosa popliteal hasta que la incisión circunferencial esté completa.
- Disecciona la piel debajo de la rodilla.
- Diseccione suavemente el área por debajo de la rodilla a un par de milímetros por encima del tobillo, abriendo y cerrando lentamente las microtijeras mientras levanta la piel con fórceps.
- Recorte cuidadosamente las adherencias visibles restantes con microtijeras. Use solución salina estéril regularmente para mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento.
- Disseccionar la piel en el borde proximal de la incisión circunferencial para que pueda ser retraída con un retractor elástico.
NOTA: El retractor permite al operador una mejor vista del vaso linfático proximal y evita que el borde proximal cambie durante la cirugía. - Mientras esté en posición propensa, gire la extremidad posterior suavemente y fijarla con cinta adhesiva, de modo que la vena isquiatica sea visible desde el punto más proximal del área expuesta hasta el punto más distal.
- Inyectar aproximadamente 0,01 ml de Patente Azul V por vía subcutánea entre el segundo y el tercer dedo del dedo del dedo del dote utilizando una jeringa de 0,5 ml con una aguja de 30 G. Presione suavemente la pata un par de veces para distribuir el Patent Blue V. Visualice los vasos linfáticos y los ganglios linfáticos a través del microscopio mientras el Azul de Patente V llena los vasos linfáticos.
NOTA: Si el color azul de los vasos linfáticos se desvanece durante el procedimiento, masajee suavemente la pata para promover la sua) , en lugar de inyectar más Patente Azul V. El uso excesivo de Patente Azul V puede conducir a fugas y coloreación del tejido que rodea los vasos linfáticos que puede comprometer el procedimiento. - Localice las estructuras importantes: el ganglio linfático popliteal (PLN), los dos vasos linfáticos distales al ganglio linfático (DLV1 y DLV2) y el único vaso linfático proximal al ganglio linfático (VPL).
NOTA: Todos los vasos linfáticos se pueden encontrar junto a la vena isquiatica. El vaso linfático proximal generalmente se encuentra medial a la vena, los dos vasos linfáticos distales se encuentran mediales y laterales a la vena. Las abreviaturas de las estructuras se utilizan en el vídeo adjunto. - Amplíe para visualizar claramente el PLV y ligarlo con una sutura de nylon 10-0 usando soporte de microaguja y microfuerzas. Presione la pata un par de veces para asegurarse de que ninguna Patente Azul V pase proximal a la sutura.
NOTA: Puede ser necesario recortar la grasa que rodea el vaso linfático. - Repita el paso 4.7 para ligar los dos vasos linfáticos distales. Presione la pata varias veces para asegurarse de que ninguna Patente Azul V pase proximal a la ligadura. Si los vasos linfáticos se encuentran cerca de la vena isquiatica, intente disecizar aún más disérmicamente.
NOTA: En este ejemplo, se puede ver que uno de los vasos linfáticos estalla debido a la ligadura que dificulta el flujo linfático. Los vasos linfáticos a menudo se separan de la vena más abajo. - Retire el ganglio linfático popliteal.
- Localice el ganglio linfático popliteal y recorte un pequeño agujero con microtijeras para acceder a él y extirparlo con microcóceps y microtijeras.
NOTA: El ganglio linfático tiene una superficie lisa similar a una perla en contraste con el tejido graso circundante. - Para comprobar si el tejido extraído es un ganglio linfático, colóquelo en un tubo de ensayo lleno de agua.
NOTA: Si el tejido está compuesto de grasa, el tejido flotará. Si el tejido es un ganglio linfático, se hundirá hasta el fondo.
- Localice el ganglio linfático popliteal y recorte un pequeño agujero con microtijeras para acceder a él y extirparlo con microcóceps y microtijeras.
- Retire la almohadilla de grasa inguinal y el ganglio linfático.
- Antes de extraer la almohadilla de grasa inguinal, utilice un coagulador bipolar para cauterizar los vasos que corren a través de la grasa.
- Reseque la almohadilla de grasa inguinal usando microfónicos y microtijeras. Sujeta suavemente los vasos cauterizados que corren a través de la grasa. A continuación, reseque suavemente el tejido graso en el área inguinal.
NOTA: El ganglio linfático situado en la grasa rara vez es coloreado por Patente Azul V y puede ser difícil de diferenciar de la grasa. La eliminación de la almohadilla de grasa en una sola pieza es la mejor manera de asegurarse de que el ganglio linfático ha sido eliminado.
- Enjuague bien la pierna con solución salina estéril y confirme a través del microscopio que los pelos y partículas pequeños se han eliminado a fondo del área quirúrgica para evitar la contaminación e infección de la herida. Asegúrese de que no haya sangrado activo.
- Sutura los bordes de la piel hasta la facia muscular con una sutura de nylon 6-0 usando fórceps y soporte de aguja, dejando un espacio de 2 x 3 mm para restringir el flujo linfático superficial.
NOTA: El vídeo que lo acompaña muestra un ejemplo de suturas terminadas. - Administrar analgesia. Elaborar 0,1 ml de analgesia por cada 30 g de peso corporal del ratón. Inyectar la analgesia por vía subcutánea como una inyección de bolo.
- Pesar el ratón para post-cirugía para la comparación.
- Coloque el ratón en una jaula en un armario calentado para su recuperación.
5. Cuidado postoperatorio
- Dé a los ratones jaulas individuales para recuperarse después de la cirugía con agua y alimentos ad libitum.
- Administrar una dosis subcutánea de bolo de 0,02 ml de buprenorfina 3 veces al día durante 3 días para la analgesia.
- Monitoree al animal diariamente para la cicatrización adecuada de la herida, signos de dolor e infección. Si hay signos de infección, utilice un unción antibiótica.
6. Irradiación post-cirugía
- Tres días después de la cirugía, repita el procedimiento para la irradiación prequirúrgica (pasos 1.1-1.4).
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Representative Results
Este procedimiento se ha utilizado anteriormente en tres experimentos independientes. Todos los experimentos fueron realizados por diferentes investigadores principales que son coautores de este artículo. En los tres experimentos, se tuvo mucho cuidado de adherirse al mismo procedimiento descrito en este protocolo. En los tres experimentos, el linfedema secundario fue inducido en una extremidad posterior, mientras que la otra extremidad posterior sirvió como control. Los volúmenes de las extremidades posteriores fueron el resultado principal en los tres experimentos. La Figura 1 ilustra el diseño del estudio.
Todos los ratones se sometieron a tomografías microcomputadas en las semanas siguientes a la cirugía para medir el volumen de las extremidades posteriores. Las exploraciones de CT se realizaron en un escáner preclínico multimodal(Tabla de materiales)y el volumen de las extremidades posteriores se midió a través de la función de región de interés (ROI) en el software asociado, como se describió anteriormente26. La articulación tibiofibular distal se encontraba en imágenes axonales tridimensionales (3D) utilizando un método descrito anteriormente27. El ROI comenzó en la articulación tibiofibular distal e incluyó todo el tejido distal hasta ese momento. El rango Hounsfield para el análisis se estableció en -500 a 4000.
Todos los datos se analizaron utilizando software estadístico(Tabla de materiales). La prueba de comparación múltiple de Sidak se utilizó para comparar el volumen de la extremidad posterior del linfedema inducido, con la extremidad posterior de control. Una diferencia significativa entre la extremidad posterior de control y la extremidad posterior del linfedema se define como un valor P <0.05.
Figura 1: Diseño del estudio y puntos de tiempo para las mediciones de resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El experimento 126 incluyó 32 ratones distribuidos en grupos de cuatro. Uno de los objetivos era estudiar varias dosis diferentes de radiación y encontrar la dosis más preferible, para inducir linfedema duradero sin causar morbilidad grave. El grupo al que se le administraron dos dosis de 10 gy irradiación incluyó cuatro ratones. La Figura 2 muestra que se logró un estado constante de linfedema en las 8 semanas. La Tabla 1 muestra que hubo una diferencia significativa en el volumen entre la extremidad posterior del linfedema y la extremidad posterior de control en las semanas 1, 7 y 8. Si bien se logró un estado constante de linfedema inducido, no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las extremidades posteriores durante las 8 semanas. Este resultado difiere de los otros dos experimentos y podría explicarse debido al tamaño de muestra relativamente menor de cuatro ratones. Aumentar el número de mediciones aumentaría la potencia del estudio y por la presente la probabilidad de detectar una diferencia si existe una diferencia28.
Figura 2: Volumen medio de la extremidad posterior: Experimento 1. En esta figura se incluyen mediciones de 4 ratones del grupo al que se le administraron dos dosis de irradiación de 10 gy. Este gráfico muestra los volúmenes medios de las extremidades posteriores en mm3 en las 8 semanas posteriores a la cirugía. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Semana | Volumen de linfedema en mm3 (n x 4) | Volumen de control en mm3 (n x 4) | Valor P | 95% Intervalo de confianza |
| 1 | 218,53 a 9,3 | 136,78 a 2,48 | 0.002 | 53,77-109,73 |
| 2 | 202,25 a 10,24 | 141,88 a 8,02 | 0.066 | (-6,53)-127,28 |
| 3 | 193,28 a 10,80 | 141,20 a 6,80 | 0.060 | (-3,7)-107,85 |
| 4 | 194,95 a 21,05 | 141,50 a 8,03 | 0.224 | (-41,85)-148,75 |
| 5 | 193,75 a 7,07 | 141,70 a 8,60 | 0.051 | (-0,27)-104,37 |
| 6 | 193,23 a 3,42 | 141,78 a 10,29 | 0.054 | (-1.56)-104.46 |
| 7 | 194,95 a 7,26 | 143,23 a 8,90 | 0.050 | 0.17-103.28 |
| 8 | 195,8 a 9,65 | 152,18 a 5,81 | 0.009 | 19,88 a 67,38 |
Tabla 1: Prueba de comparaciones múltiples de Sidak: Experimento 1. Esta tabla muestra la comparación estadística entre los volúmenes medios de las extremidades posteriores del linfedema inducido y controlar las extremidades posteriores durante las 8 semanas posteriores a la cirugía. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Los valores se presentan como: media - SD en mm3. Valor P < 0.05 se considera como una diferencia significativa entre la extremidad posterior de control y la extremidad posterior del linfedema. n (número de observaciones) a 4.
El experimento 2 incluía 45 ratones. 15 ratones sirvieron como controles y se les administró inyecciones de salina. Los controles se utilizan como resultados representativos ya que suponemos que las inyecciones de salina no tuvieron ningún efecto en el volumen de linfedema inducido. La Figura 3 muestra que el linfedema fue menos estable que en el experimento 1. Además, el volumen de las extremidades posteriores de control aumentó durante las 8 semanas. Esto reduce la diferencia relativa presentada en el Cuadro 2. Se ha especulado que los ratones utilizan su extremidad posterior no operada más, en las semanas siguientes a la cirugía, y que esto conduce a la hipertrofia y el aumento en el volumen de las extremidades de la extremidad posterior no operada. Lo más importante, la Tabla 3 muestra que hay diferencia estadísticamente significativa entre la extremidad posterior del linfedema y la extremidad posterior de control durante las 8 semanas después de la cirugía. El mayor número de ratones demuestra que este procedimiento puede inducir linfedema estadísticamente significativo durante al menos 8 semanas.
Figura 3: Volumen medio de la extremidad posterior: Experimento 2. Las mediciones de 15 ratones del grupo de control se incluyen en esta figura. Este gráfico muestra los volúmenes medios de las extremidades posteriores en mm3 en las 8 semanas posteriores a la cirugía. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Las barras de error representan SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Experimento 1 | Experimento 2 | Experimento 3 | Experimento 1, 2 y 3 combinados | |||||
| Semana | Diferencia absoluta (mm3) | Diferencia relativa (%) | Diferencia absoluta (mm3) | Diferencia relativa (%) | Diferencia absoluta (mm3) | Diferencia relativa (%) | Diferencia absoluta (mm3) | Diferencia relativa (%) |
| 1 | 81,75 a 7,20 | 0,60 a 0,04 | 104,34 a 25,96 | 0,76 a 0,23 | 85,20 a 35,05 | 0,64 á 0,27 | 94,02 a 29,57 | 0,69 a 0,24 |
| 2 | 60,38 a 17,21 | 0,43 a 0,14 | 107,12 a 44,33 | 0,79 a 0,33 | 85,63 a 37,94 | 0,63 a 0,29 | 92,77 a 41,68 | 0,68 a 0,31 |
| 3 | 52,08 a 14,35 | 0,37 a 0,11 | 78,77 a 39,45 | 0,57 a 0,28 | 74,67 a 49,57 | 0,54 á 0,38 | 73,74 a 41,51 | 0,53 a 0,31 |
| 4 | 53,45 a 24,51 | 0,38 a 0,19 | 50,67 a 29,94 | 0,36 á 0,21 | 50,62 a 16,35 | 0,37 a 0,11 | 51,01 a 24,03 | 0,37 a 0,17 |
| 5 | 52,05 a 13,46 | 0,37 a 0,11 | 32,74 a 24,66 | 0,22 á 0,17 | 42,67 a 11,81 | 0,31 a 0,07 | 39,08 a 20,02 | 0,27 a 0,14 |
| 6 | 51,45 a 13,63 | 0,36 á 0,11 | 26,80 a 22,35 | 0,18 a 0,14 | 32,86 a 10,90 | 0,22 a 0,08 | 32,32 a 18,96 | 0,21 a 0,13 |
| 7 | 51,73 a 13,26 | 0,36 á 0,11 | 19,04 a 17,22 | 0,12 a 0,11 | - | - | 25,92 a 21,15 | 0,17 a 0,15 |
| 8 | 43,63 a 6,11 | 0,29 a 0,04 | 15,15 a 11,70 | 0,10 a 0,08 | - | - | 21,15 a 15,96 | 0,14 a 0,10 |
Tabla 2: Diferencia absoluta y relativa. Esta tabla muestra la diferencia absoluta en el volumen entre el linfedema y las extremidades posteriores de control - SD en mm3 y la diferencia relativa - SD en porcentaje.
| Semana | Volumen de linfedema en mm3 (n a 15) | Volumen de control en mm3 (n.o 15) |
Valor P | 95% Intervalo de confianza |
| 1 | 241,82 a 35,69 | 137,48 a 21,54 | <0.001 | 82,21-126,47 |
| 2 | 242,41 a 45,13 | 135,29 a 5,81 | <0.001 | 69,33 a 144,89 |
| 3 | 216,85 a 41,47 | 138,08 a 5,31 | <0.001 | 45,15-112,39 |
| 4 | 193,10 a 31,27 | 142,43 a 5,29 | <0.001 | 25,15 a 76,18 |
| 5 | 180,03 a 26,03 | 147,29 a 6,45 | 0.002 | 11,72 a 53,76 |
| 6 | 179,89 a 25,00 | 153,09 a 6,56 | 0.004 | 7,74 a 45,85 |
| 7 | 176,45 a 19,77 | 157,41 a 7,49 | 0.008 | 4,35 a 33,71 |
| 8 | 166,97 a 11,8 | 151,82 a 10,07 | 0.002 | 5.18 a 25,12 |
Tabla 3: Prueba de comparaciones múltiples de Sidak: Experimento 2. Esta tabla muestra la comparación estadística entre los volúmenes medios de las extremidades posteriores del linfedema inducido y las extremidades posteriores de control en las 8 semanas posteriores a la cirugía. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Los valores se presentan como: media - SD en mm3. Valor P < 0.05 se considera como una diferencia significativa entre la extremidad posterior de control y la extremidad posterior del linfedema. n (número de observaciones) a 15.
El experimento 3 incluyó 36 ratones. 12 ratones sirvieron como controles y se les administró inyecciones de salina. Los controles se utilizan como resultado representativo como suponemos que las inyecciones de salina no tuvieron ningún efecto en el volumen de linfedema inducido. En este experimento se midió el volumen de las extremidades posteriores de los ratones durante 6 semanas en lugar de 8. El experimento sólo duró 6 semanas debido a dificultades logísticas cuando se realizó el experimento. La Figura 4 muestra un linfedema más consistente que el experimento 2. La Tabla 4 muestra que hay linfedema estadísticamente significativo en las 6 semanas después de la cirugía.
Figura 4: Volumen medio de la extremidad posterior: Experimento 3. Las mediciones de 12 ratones del grupo de control se incluyen en esta figura. Este gráfico muestra los volúmenes medios de las extremidades posteriores en mm3 en las 6 semanas después de la cirugía. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Las barras de error representan SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Semana | Volumen de linfedema en mm3 (n x 12) | Volumen de control en mm3 (n a 12) | Valor P | 95% Intervalo de confianza |
| 1 | 219,06 a 35,00 | 133,86 a 10,02 | <0.001 | 51,66-118,74 |
| 2 | 220,90 a 36,98 | 135,27 a 5,89 | <0.001 | 49,33 a 121,94 |
| 3 | 211,74 a 47,30 | 137,07 a 7,56 | 0.002 | 27.24-122.11 |
| 4 | 186,09 a 20,36 | 135,47 a 5,70 | <0.001 | 34,98 a 66,27 |
| 5 | 182,35 a 18,25 | 139,68 a 7,45 | <0.001 | 31,37 a 53,98 |
| 6 | 183,44 a 12,11 | 150,58 a 8,37 | <0.001 | 22,42 a 43,29 |
Tabla 4: Prueba de comparaciones múltiples de Sidak: Experimento 3. Esta tabla muestra la comparación estadística entre los volúmenes medios de las extremidades posteriores del linfedema inducido y las extremidades posteriores de control en las 6 semanas posteriores a la cirugía. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Los valores se presentan como: media - SD en mm3. Valor P < 0.05 se considera como una diferencia significativa entre la extremidad posterior de control y la extremidad posterior del linfedema. n (número de observaciones) a 12.
La Figura 5 y la Tabla 5 muestran el volumen medio de las extremidades posteriores de los tres experimentos combinados. La Tabla 5 muestra que el uso de este procedimiento da como resultado un linfedema estadísticamente significativo que dura al menos 8 semanas. Los datos de las primeras 6 semanas, son las mediciones combinadas de 31 ratones de los experimentos 1, 2 y 3. En la semana 7-8 sólo tuvimos datos de los experimentos 1 y 2, lo que resultó en mediciones combinadas de 19 ratones.
Figura 5: Volumen medio combinado de las extremidades posteriores: Experimento 1, 2 y 3. Treinta y un ratones incluidos en las primeras 6 semanas después de la cirugía y 19 ratones incluidos en las siguientes 2 semanas. Este gráfico muestra los volúmenes medios de las extremidades posteriores en mm3 en las 8 semanas posteriores a la cirugía. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Las barras de error representan SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Semana | Volumen de linfedema en mm3 (Semana 1-6 n a 31) (Semana 7-8 n 19) |
Volumen de control en mm3 (Semana 1-6 n a 31) (Semana 7-8 n 19) |
Valor P | 95% Intervalo de confianza |
| 1 | 230.00 a 34,46 | 135,99 a 16,03 | <0.001 | 78,19-109,84 |
| 2 | 228,90 a 40,91 | 136,13 a 6,32 | <0.001 | 70,47-115,07 |
| 3 | 211,83 a 41,15 | 138,09 a 6,36 | <0.001 | 51,53 a 95,95 |
| 4 | 190,63 a 25,81 | 139,62 a 6,54 | <0.001 | 38,15 a 63,87 |
| 5 | 182,70 a 21,52 | 143,62 a 7,79 | <0.001 | 28,36 a 49,79 |
| 6 | 182,98 a 19,11 | 150,66 a 8,36 | <0.001 | 22,18 a 42,47 |
| 7 | 180,34 a 19,31 | 154,43 a 9,60 | <0.001 | 11,61 a 40,22 |
| 8 | 173,04 a 16,42 | 151,89 a 9,19 | <0.001 | 10,35 a 31,94 |
Tabla 5: Prueba de comparaciones múltiples de Sidak: Experimento 1, 2 y 3 combinados. Esta tabla muestra la comparación estadística entre los volúmenes medios de las extremidades posteriores del linfedema inducido y las extremidades posteriores de control de 31 ratones en las primeras 6 semanas después de la cirugía y 19 ratones en las siguientes 2 semanas. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 Gy irradiación antes y después de la cirugía. Los valores se presentan como: media - SD en mm3. Valor P < 0.05 se considera como una diferencia significativa entre la extremidad posterior de control y la extremidad posterior del linfedema. n (número de observaciones) a 31.
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Discussion
Hay algunos pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, es importante que los investigadores tomen precauciones de seguridad cuando trabajan con radiactividad. En segundo lugar, durante la parte quirúrgica de este protocolo, es importante iniciar el procedimiento una vez anestesiado el ratón y terminarlo sin pausas innecesarias. Esto es importante para evitar un período quirúrgico excesivamente largo para el animal y para evitar que la anestesia pierde efecto durante la cirugía. Se recomienda administrar sólo una inyección de bolo de anestésico y completar el procedimiento quirúrgico en una sola sesión. También es un paso crítico, no administrar demasiado Patent Blue V, ya que el exceso de Patente Azul V decolorará el tejido que rodea los vasos linfáticos. Si el tejido circundante se decolora puede ser casi imposible visualizar los vasos linfáticos y esto compromete el procedimiento. Incluso si uno logra visualizar los vasos linfáticos, el tejido decolorado dificultará la evaluación de si el Azul Patente V pasa proximal a la ligadura o no. Esto es problemático porque el operador debe estar seguro de que las ligaduras colocadas están limitando el flujo linfático, para asegurarse de que el procedimiento será exitoso. También es importante dejar un hueco de 2 x 3 mm al cerrar la herida. Como una brecha temporal de la piel a menudo se necesita para imitar el proceso de cicatrización de heridas humanas29.
Las limitaciones de este método son que es un procedimiento lento que requiere acceso a un microscopio y entrenamiento microquirúrgico previo. Al realizar la parte quirúrgica de este protocolo, es importante planificar el tiempo entre los procedimientos quirúrgicos. Se pasa mucho tiempo esperando a que el animal sea anestesiado, afeitándose la extremidad posterior y generalmente se prepara para cada procedimiento quirúrgico. Por lo tanto, se recomienda preparar la vivienda y el anestésico con antelación. Es importante tener en cuenta que para estar seguro de que se ha inducido el linfedema crónico, se debe analizar la histopatología. No hemos incluido la histopatología en este artículo, que es una limitación. Sin histopatología apoyando el hecho de que los cambios histológicos han ocurrido en los vasos linfáticos, los cambios en el volumen en las extremidades posteriores sólo pueden describirse como edema. El artículo que incluye todos los datos sobre los cuatro ratones del experimento 126 incluye histopatología y muestra que hubo cambios significativos en la histopatología utilizando esta técnica. El artículo también incluye imágenes linfáticas. El mismo procedimiento se utilizó en los ratones en los experimentos 2 y 3, pero la histopatología no mostró ninguna diferencia significativa entre la extremidad posterior del linfedema y la extremidad posterior de control en estos experimentos. Se necesitan más estudios, incluida la histopatología, para que este modelo aclare si el linfedema se induce a nivel histológico. Los experimentos 2 y 3 aún no se han publicado y, por lo tanto, no podemos referirnos a ellos.
Si bien se puede argumentar que el uso de las exploraciones de CT para medir el volumen de las extremidades posteriores es más objetivo que el uso del método de desplazamiento del agua o las mediciones circunferenciales, todavía tiene sus limitaciones. La técnica de medición es costosa, requiere mucho tiempo y requiere acceso a un escáner de CT y software de análisis.
Uno de los mayores desafíos con los modelos de linfedema de roedores en general, ha sido la resolución espontánea del linfedema, a menos que se haya realizado una radiación excesiva25. Al desarrollar este modelo, probamos varias dosis diferentes de radiación para encontrar una dosis que induciría linfedema duradero sin causar morbilidad grave26. Anteriormente, los modelos de linfedema no se han estandarizado en los métodos de inducción de linfedema o evaluaciones de resultados. 20 utilizaron una dosis única de irradiación de 30 Gy, y ligaron cada vaso linfático en tres puntos separados. En ese estudio, el procedimiento quirúrgico tardó 90 minutos en realizarse. Aunque el método presentado en este artículo puede considerarse lento, la parte quirúrgica del procedimiento todavía se puede realizar aproximadamente dos veces más rápido que el método presentado por Oashi et al.20. También tuvieron un período de seguimiento de 6 meses, que es considerablemente más largo que cualquiera de los estudios presentados en este artículo. Sin embargo, sólo incluían un ratón y medían manualmente la circunferencia de las extremidades para evaluar la hinchazón, mientras que los volúmenes presentados en este artículo se midió en 31 ratones utilizando escaneos de CT y software de análisis 3D. 30 extirpó los ganglios linfáticos inguinales y los vasos linfáticos periféricos asociados y el tejido graso utilizando un cuchillo eléctrico. El uso de un cuchillo eléctrico podría ser un enfoque más simple que no requiere entrenamiento microquirúrgico, pero el edema inducido se resolvió después del día 4, mientras que el método presentado en este artículo ofrece linfedema consistente que dura al menos 8 semanas.
Se espera que este protocolo permita a los investigadores considerar las limitaciones y ventajas del modelo de linfedema revisado. El protocolo también debe ayudar a los investigadores a replicar con éxito el modelo. El método se puede utilizar en futuros estudios observacionales e intervencionísticos para comprender la fisiopatología del linfedema y las nuevas opciones de tratamiento de investigación. En estudios futuros, también sería interesante tener un seguimiento de más de 8 semanas para observar cuánto tiempo dura el linfedema inducido. También sería interesante observar el efecto de realizar una irradiación más específica de los ratones antes y después de la cirugía. Esto podría hacerse realizando una tomografía computarizada y planificando un volumen objetivo. En estudios futuros, este modelo también podría estar respaldado por estudios de imágenes linfáticas guiadas por fluorescencia, perometría o bioimpedancia. Este método ofrece linfedema estadísticamente significativo que dura al menos 8 semanas, que se ha medido directamente a través de la tomografía computarizada volumétrica en tres experimentos separados por diferentes investigadores principales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Peter Bollen, jefe del Laboratorio Biomédico por prestar el equipo necesario para grabar las imágenes que se ven a través de los microscopios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. , Springer International Publishing. New York, NY. 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment? Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R. 3rd, Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H. The psycho-social impact of lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 7 (2), 109-112 (2009).
- Gutknecht, M., et al. Cost-of-illness of patients with lymphoedema. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (11), 1930-1935 (2017).
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs' limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O'Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats' limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
