Summary
転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。
Abstract
転写因子は、さまざまな下流プロセスに影響を与える多数の標的遺伝子の発現を変化させ、抗癌療法の良い標的となる可能性があります。しかし、転写因子を直接標的化することはしばしば困難であり、転写因子が1つ以上の成人組織で必要な場合には副作用を引き起こす可能性がある。がん細胞の転写因子を異常に活性化する上流の調節因子を特定することは、特にこれらのタンパク質が薬物に対して容易である場合、より実現可能な代替手段を提供する。ここでは、配列中規模レンチウイルスライブラリーと、がん細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するための二重ルシファーゼベースの転写レポーターアッセイを組み合わせることができるプロトコルについて説明する。当社のアプローチは、1回の実験で何百もの遺伝子をテストするための迅速で簡単で安価な方法を提供します。このアプローチの使用を実証するために、カバ経路の下流のエフェクターである2つの転写共活性化剤であるYes-関連タンパク質(YAP)およびPDZ結合モチーフ(TAZ)と転写共活性化剤のいくつかの調節因子を含む配列レンチウイルスRNAiライブラリのスクリーンを行った。しかし、このアプローチは、実質的に任意の転写因子または共因子のレギュレータをスクリーニングするように変更することができ、CRISPR /CAS9、cDNA、またはORFライブラリをスクリーニングするためにも使用できます。
Introduction
このアッセイの目的は、ウイルスライブラリーを使用して、比較的迅速かつ安価な方法で転写因子の調節因子を同定することにある。異常な転写活性は癌と,転移1、2、3、4、5、62,3に関連しているので、癌細胞における転写因子を標的化することは有望な治療アプローチである。1,4,56しかし、転写因子は、多くの場合、薬理学的に標的化することは困難である7、多くは、成体組織8、9、109,10の正常な細胞機能に必要とされる。8異常に転写因子を活性化して病気を引き起こす癌関連経路を標的にすることは、より重篤な副作用を有する可能性を有するより実現可能なアプローチである。配列レンチウイルスおよびレトロウイルスRNAi、CRISPR/CAS9、cDNA、またはORFライブラリの商業的利用により、研究者は単一の実験で多数の遺伝子の重要性をテストすることができます。しかし、転写活性の変化に対する信頼性の高い読み出しが必要です。
ここでは、がん細胞の転写因子を調節するタンパク質を同定するための、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイおよびアレイ化レンチウイルスライブラリーの使用について述べた。本アッセイでは、がん関連遺伝子を標的とするshRNAがレンチウイルス導入を介して哺乳動物癌細胞に送達され、細胞はプロマイシンを用いて安定な集積のために選択される。細胞は、次に、調査中の転写因子に特異的なプロモーターによって駆動されるホタルルシメラーゼを発現するレポーター構築物と、調査中の転写因子に反応しない構成的に活性なプロモーターからレニラルシメラーゼを発現する対照構造を発現させるレポーター構築物にトランスフェクトされる。我々は、YAPおよびTAZの調節因子,、カバ経路8、10、1110の重要な下流エフェクターのための概8念実証画面でこのアプローチを実証する。11YAPおよびTAZの異常な活性は、転移性カスケード11のいくつかのステップを促進し、多くの癌11、12、1312,13で観察される。11しかし、いくつかの癌細胞においてYAPおよびTAZがどのように異常に活性化されるのかはまだ完全には理解されていない。YAPとTAZはDNAを結合せず、代わりに他の転写因子によってプロモーターにリクルートされる。転写因子のTEAドメイン(TEAD)ファミリーのメンバーは、YAPおよびTAZの主要な結合パートナーであり、ほとんどのYAPおよびTAZ依存的な機能にとって重要である。我々のレポーター構築物は、YAP/TAZ-TEAD応答性プロモーターからのホタルルシメラーゼを発現しており、以前の研究では、YAP-TEADおよびTAZ-TEAD転写活性22、14、1514,15の変化を忠実に検出することを実証した。
当社のアプローチは、高速で中規模のスループットであり、スクリーニング施設、自動ロボット、またはプールされたライブラリの深いシーケンスを必要としません。コストは比較的低く、選択する多くの市販のライブラリがあります。必要な装置および試薬はほとんどの実験室で比較的標準的である。ルシファーゼベースのレポーターが存在するか、生成された場合、事実上任意の転写因子の調節因子をスクリーニングするために使用することができます。このアプローチを使用してがん細胞のshRNAをスクリーニングしますが、合理的な効率でトランスフェクトできる細胞株は、あらゆるタイプのアレイ化されたライブラリで使用できます。
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Protocol
注 : このプロトコルの概略的な概要を図 1に示します。
1. レンチウイルスベクターライブラリー調製
注:実証済みの画面では、96ウェルプレートでグリセロールストックとして購入した配列付きshRNAライブラリを使用していましたが、ライブラリは候補のリストに基づいて手動で組み立てることもできます。適切なコントロールを考慮し、ライブラリに含める必要があります。これには、非標的対照shRNA(shNTC)、調査中の転写因子を標的とするコントロールshRNA、および可能であれば、ホタルルシファーゼを標的とするshRNAが含まれる。
- 100 μg/mL のアンピシリンを含むルリアブロス(LB)(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH 7.5)を96ウェル深いウェルプレートの各ウェルに加えます。グリセロールストック2 μLで各ウェルウェルを接種し、225 rpmで一定の撹拌で一晩37°Cで成長させます。
- 各細菌培養物を1.5mL遠心分離チューブに移し、4°Cで21,000xgで10分間遠g心分離して細菌をペレット化します。
- メーカーのプロトコルに従って、細菌のミニプレップキットを使用して各ベクターを精製します。
- 分光光度計を用いて各ベクターの濃度を決定する。
- プラスミドは-20°Cで保管してください。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
2. 配列レンチウイルスライブラリのパッケージング
注:レンチウイルスに関するすべての作業は、感染細胞の包装、感染、およびその後の培養を含め、制度上のバイオセーフティ規則および規制に厳密に従う必要があります。
- 完全な成長培地(ダルベックの改変イーグル培地(DMEM)4 mM L-グルタミン、4,500mg/Lグルコース、ピルビン酸ナトリウム、10%のウシ胎児血清(FBS)、100μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレピシン、LM.抗生物質を含む293FT細胞を拡大します。
- ステップ 1.4 からライブラリ内の各ベクターに対して、1 x 105 293FT セルを 1 つの 24 ウェルにシードします。
注:コントロールウイルスベクターのいくつかの余分な井戸をパッケージ化し、ステップ3に進む前にウイルスのタイターをテストするために使用することをお勧めします(下記参照)。 - 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。
注:14の前に説明したレンチウイルスをパッケージ化するための一般的なプロトコルは、このプロトコルの 24 ウェルに縮小されました。レンチウイルス包装にはpsPAX2を、コートタンパク質としてVSVGを使用します。エトロピックウイルスが望ましい場合は、VSVGの代わりにEcoを送達するベクターを使用することができます。このプロトコルは、標的細胞の30%〜70%の感染効率を与えるウイルス力を達成するために最適化されることを強くお勧めします(議論参照)。使用されるすべてのベクトルのリストについては、補足表 1を参照してください。 - 以下に説明するステップ1.4から各ウイルスベクターにトランスフェクション混合物を設定する。各トランスフェクションには、250 ngのウイルスベクター、125 ngのpsPAX2、125 ngのVSVG、1.25 μLのトランスフェクション試薬1、および23.75 μLのトランスフェクションバッファーが含まれている必要があります(材料表を参照)。
- レンチウイルスベクターをヌクレアーゼを含まない水で50 ng/μLに希釈し、5 μL(250 ng)を96ウェルPCRプレートのウェルに移します。
- トランスフェクション試薬1と23.75 μLのトランスフェクション試薬1と23.75 μL*Xを混合してトランスフェクションスーパーミックスを行い、そこで「X」はトランスフェクションの総数とピペット処理中の体積損失を考慮する追加のトランスフェクション数です。
- トランスフェクションスーパーミックスを室温で5分間インキュベートします。
- ステップ2.4.3からトランスフェクションスーパーミックスのチューブにpsPAX2と125 ng * XのpsPAX2と125 ng * Xを追加し、ミックスするために上下に穏やかにピペット。ステップ 2.4.5 に迅速に進みます。
- 直ちにステップ2.4.4からPCRストリップの各チューブに混合物をアリコートし、マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ2.4.1からウイルスベクターを含む各ウェルに25μLの混合物を転送します。
- 室温で20分間インキュベートします。
- ステップ2.4.6の各96ウェルから、ステップ2.3から293 FTセルを含む293個のウェルのウェルに30μLすべてを転送します。
- 37°Cで24時間5%CO2で細胞2をインキュベートし、24ウェルプレートのすべてのウェルの培地を500μLの新鮮な完全成長培地に置き換えます。37°Cで細胞を5%CO2でインキュ2ベートし、さらに24時間培養します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルとアリコート220 μL(ステップ3の1感染と余分な体積に十分)からウイルス上清を2つの96ウェルに集めます。これらは配列されたウイルス上清の版である。
- 配列されたウイルス上清プレートを-80°Cに保存してください。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。また、ステップ 3 に進む前に、感染する細胞にパッケージ化されたコントロール ウイルス (上記を参照) の一部をテストすることをお勧めします。これは、力価が少なくとも30%の感染効率を達成するのに十分であることを保証するためである。
3. 画面の細胞の感染
注:ヒト黒色腫細胞(A375)は、このアプローチを実証するために使用されましたが、この方法はレンチウイルスに感染する任意の付着細胞に適用することができます。ただし、細胞培養とめっき条件は、細胞株ごとに最適化する必要があります(説明を参照)。
- 完全な増殖培地で感染する細胞を展開します。
- 1 x 10 5細胞を1x105細胞でシード24ウェルプレートに0.5 mlの完全な成長培地で使用します。シード1は、各ウイルスベクター(コントロールを含む)をテストし、ステップ3.7で薬物選択のための制御として機能する感染しない余分な井戸を含む。
- 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。
- ステップ3.2の各ウェルに、凍結配列されたレンチウイルス上清とは異なるウイルス上清を次のように感染させる。
- 20 μg/mL ポリブレンを含む完全な成長培地を準備します。
- ステップ2.7から室温まで配列レンチウイルスライブラリー上清を解凍します。
- ステップ3.2から24ウェルプレートから成長培地を吸引し、すぐに各ウェルに200μLのポリブレン含有成長培地を加えます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ3.4.2からステップ3.4.3から24ウェルに各96ウェルからウイルス上清の200 μLを移します。
- 24〜48時間の5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートする。
注:一部の細胞株は、shRNAを発現し、ピューロマイシン耐性になるために24時間より長く必要な場合があります。ここで使用されるウイルスベクターは、3'UTRのmiR30ベースのshRNAを持つターボGFP-IRES-puroRを提供する(図1)。プロマイシン耐性遺伝子及びshRNAの感染効率及び発現を緑色蛍光タンパク質によりモニタリングした。 - 2.5 μg/mL のピューロマイシンを含む完全な成長培地を準備します。
注:ピューロマイシンの選択濃度は細胞株によって異なります。スクリーンの前にアッセイされる細胞株ごとに抗生物質殺し曲線を実行することが推奨される。 - 各ウェルから培地を吸引し、500 μLのピューロマイシン含有完全成長培地に交換します。
注:また、ピューロマイシンの選択が完了したことを確認するために、後続の手順で使用することができるコントロール非感染井戸にピューロマイシンを追加してください。 - 37°Cで細胞を5%CO2で482時間インキュベートする。
注:48時間選択するのが最善なので、細胞が48時間より前に過剰にコンペラしないように、メッキ密度とウイルス性の強化剤を最適化する必要があります。 - 感染した細胞が蛍光顕微鏡下で緑色であり、プロロマイシンで処理されたコントロール上の細胞がすべて死んでいることを確認してから、ステップ4に進みます。
4. 二重ルシファーゼレポータートランスフェクション用の細胞の播種
注: テストトランスフェクションは、各新しいセルラインの最適な播種密度を決定するために行う必要があります。
- ステップ3.9から各ウェルをトリプシン化し、次のように新しい24ウェルプレート上の対応する位置でウェルに約1 x 105細胞を転送します。
注: このプロトコルは、数百の shRNA を持つライブラリのスクリーニング用に設計されているので、感染した細胞のすべてのウェルをカウントすることは不可能です。したがって、以下のステップを使用して、各ウェルのセル数を推定し、ほぼ等しいめっき密度を確保しました。- ステップ3.9から3-4グループにウェルをグループ化し、グループ内のすべてのウェルが同様の細胞密度を有する。
- トリプシンEDTAの200 μL(1x PBSは0.5 mM EDTAと0.1%トリプシンで補う)を37°Cで5分間、各グループから1代表ウェルにトリプシンします。その後、完全な成長培地を含む400 μLのピューロマイシンを添加してトリプシン-EDTAを中和します。
- 各代表ウェルをカウントして総細胞数を決定し、完全な増殖培地を使用して各代表ウェルから細胞懸濁液を2 x 105細胞/mLに希釈します。
- ステップ4.1.3から新しい24ウェルプレートの対応する位置に各ウェルの各ウェルのシード0.5 mL(1 x 105細胞)を新しい24ウェルプレートの対応する位置に、この新しい24ウェルプレートを37°Cで24時間5%CO2でインキュベートします。2
- ステップ 4.1.1 のグループごとに、ステップ 4.1.3 で決定した合計セル数を使用してトリプシン EDTA の量を計算し、結果として得られるセル懸濁液が 1 x 106セル/mL になるように各ウェルに加算します。
- 各ウェルに適切な量のトリプシン-EDTAを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
注:大きな画面では、細胞の生存率を確保するために、24ウェルプレートをトリプシン化し、一度にではなくグループに再入れすることをお勧めします。 - 上記のインキュベーション中に、マルチチャンネルピペットを使用して、400 μLのピューロマイシン含有完全成長培地を、新しい24ウェルプレートの対応するウェルに添加します。
- ステップ4.1.7で調製した新しい24ウェルプレート上の対応する位置に、各ウェルから100 μLの細胞懸濁液(約1 x 105細胞)を移します。
- ステップ 4.1.1.1 からグループ化されたウェルのすべてのプレートに対して、ステップ 4.1.6 ~ 4.1.8 を繰り返します(一度に 1 つのプレート)。
- 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。
5. 二重ルシファーゼレポーターのトランスフェクション
- ステップ4.2から各井戸を、次のようにデュアルルシファーゼレポーターを構築してトランスフェクトします。
注:レニラルシファーゼベクターを制御するホタルルシファーゼレポーターベクターのDNAの総量と最適比は、このアッセイを開始する前に決定する必要があります。ここでは、20部ホタルルシファーゼレポーターと1部制御レニラルシメラーゼを含むDNA混合物の400ngが使用された。- トランスフェクション希釈混合物(チューブA)とレポーター希釈混合物(チューブB)を各試薬の示された量(表1)にトランスフェクションの総数(プラス数個)を掛けたものにして作ります。
注: このプロトコルはトランスフェクション試薬 2 用に最適化されています(資料表を参照)。別のトランスフェクション試薬を使用する場合、トランスフェクションは、このステップの前に最適化する必要があります。 - トランスフェクション希釈混合物(チューブA)をレポーター希釈混合物(チューブB)と混合し、室温で15分間インキュベートしてトランスフェクション混合物を製造する。
- 上記のインキュベーション中に、ステップ4.2の各24ウェルを0.25 mLのリン酸緩衝塩(PBS)でリンスし、各ウェルに447μLの完全な成長培地を加えます。
- 15分インキュベーションの後、マルチチャンネルピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルに53 μLのトランスフェクションミックスを分配します。
- トランスフェクション希釈混合物(チューブA)とレポーター希釈混合物(チューブB)を各試薬の示された量(表1)にトランスフェクションの総数(プラス数個)を掛けたものにして作ります。
- 37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。
6. 二重ルシファーゼ活性の定量化
- プレートリーダーと、以下に説明するデュアルルシファーゼレポーターアッセイキットを用いてルシファーゼ活性を測定します。
注:このプロトコルは、示されたレポーターアッセイキット(資料表を参照)に最適化されており、メーカーの推奨プロトコルに従います。- 5x受動溶菌バッファー(キットに用意)1~5を脱イオン水で希釈して、すべてのウェルに加えていくつかの余分な(ウェルあたり75 μLが必要)十分な1x受動溶精バッファーを準備します。また、試薬Aおよび試薬Bバッファ(キットに設けられており、各ウェルにそれぞれ100μLずつ必要です)。
- ステップ5.2から24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。
- 1x受動リシスバッファーの 75 μL を各ウェルに加え、時折揺れで 30 分間室温でインキュベートします。
- 50x試薬B基板(キットに設けられている)を解凍した試薬Bバッファーで1:50希釈して試薬Bを調製した。
- 1x受動リシスバッファーの 30 μL をブランキング用の 4 ウェルに追加します (補足表 2を参照)。
- ステップ6.1.3から30 μLのライセートを96ウェルの平底白色アッセイプレートの重複ウェルに移します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50 μLの試薬Aを加え、プレートリーダーでホタルルシファーゼ信号を読み取ります。
- マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ6.1.4から50μLの試薬Bを各ウェルに加え、プレートリーダーでレニラルシファーゼ信号を読み取ります。
- 生データを次のように処理します (詳細については補足表2を参照)。
- 低い値として非常に低いレニラルシファーゼシグナルを有するサンプルを除外するウイルス構築物が有毒であったか、またはあまりにも少数のトランスフェクト細胞がアッセイされたことを示す。
注:議論で説明したように、大幅に「低い」レニラルシファーゼ信号は異常な結果をもたらすことができます。ここで、レニラルシファーゼシグナルが平均より1標準偏差を超えていたウェルは除外した(補足表2参照)。これは、これらの細胞14においてこのレポーターシステムを用いて行われた以前の研究に基づいていたが、他の細胞株では異なる場合がある。 - 各ウェルの生ホタルルシファーゼ値を同じウェルの生のレニラルシファーゼ値に正規化し、ホタル/レニラ比を得る。
- すべての複製制御井戸のホタル/レニラ比を平均し、その後、折り目の変化を得るために、その他のすべてのウェルのホタル/レニラ比を除算します。
- コントロールサンプルを割り当て、ホタル/レニラ比の値を1に設定します。
- 重複する井戸のホタル/レニラ比を平均し、標準偏差でプロットします。
注: 標準偏差は統計分析には使用されず、複製が大きく異なるウェルを識別する手段として使用されます。
- 低い値として非常に低いレニラルシファーゼシグナルを有するサンプルを除外するウイルス構築物が有毒であったか、またはあまりにも少数のトランスフェクト細胞がアッセイされたことを示す。
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Representative Results
当社のYAP/TAZ-TEADレポーターコンストラクト(pGL3-5xMCAT(SV)-492,14,15)14,15には、ホタルルシファラーゼ遺伝子を駆動する正規TEAD結合元素(MCAT)15の5つの反復を伴う最小SV-49プロモーターが含まれています(215図1)。PRL-TK制御ベクター(プロメガ)と共に細胞に共入反応され、構成活性HSV TKプロモーターからレニラルシファーゼを発現する(図1)。YAP/TAZ-TEAD レポーターコンストラクトが、テスト対象のセルラインで期待どおりに動作していることを確認することが重要です。そこで、まず、コントロールベクター、YAP(YAP2SA)の高活性LATS感受性変異体、またはTEADs(YAP2SA,S94A)を結合できないYAP2SAの変異体のいずれかを安定的に発現するA375細胞にPRL-TKおよびpGL3-5xMCAT(SV)-49を同時にトランスフェクトした。予想通り、ホタルルシメラーゼ活性は、YAP2SAによって有意に増加したが、制御ベクターまたはYAP2SA,S94Aではない(図2A)。これは、YAPがTeaD依存的な方法でYAP/TAZ-TEADレポーターの活性を増加させることを示唆している。重要なことに、YAP2SAはレニラルシファーゼのレベルを有意に変化しなかった。追加の制御として、YAP2SAがMCAT TEAD結合要素を欠いている最小限のプロモーター構築物の活性を変化しないことも確認した(図2B)。
また、A375細胞が非標的制御shRNA(shNTC)またはタンデムYAPおよびTAZ shRNAを有する構築物のいずれかを提供するウイルス構造に感染した2番目の対照実験も行われた。安定選択後、細胞はPRL-TKコンストラクトおよびYAP/TAZ-TEADレポーター構築物または最小限のプロモーター構築物のいずれかと共にトランスフェクトされた。YAP/TAZ-TEADレポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞では、YAP/TAZ shRNAはホタルルシメラーゼレベルを有意に低下させたが、コントロールshNTCは低下しなかった(図2C)。ホタルルシメラーゼレベルは、最小プロモーターを導入した細胞においてshNTCまたはYAP/TAZ shRNAによって変化しなかった(図2C)。上記の結果と一致して、各ウェルのレニラシグナルも、コントロールshNTCまたはYAP/TAZ shRNA(図2C)によって有意に変化しなかったが、さらにPRL-TK制御構造がYAPまたはTAZに応答しないことを示す。全体として、これらの実験は、レポーターシステムがA375細胞で期待どおりに動作していることを示しており、これはこれらのベクター22、1414を用いた以前の研究と一致している。
概念実証実験として、A375細胞の小さなレンチウイルスshRNAライブラリーをスクリーニングした。我々の試験ライブラリーには、他の細胞型においてYAP/TAZ機能を調節することが既に示されていたいくつかの遺伝子を標的とするshRNAが含まれていた。しかしながら、黒色腫におけるYAPおよびTAZの調節におけるこれらの遺伝子の幾つかの役割は不明である。私たちのライブラリには、YAP/TAZ活性に必要な遺伝子が含まれていました, そのような RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4,27CCNE216,,17,,18,,19,20,21,,22,,23, 24,,2025,,2427,,28,,28,29, 30,,31, 32,,33,,34,,35,,36,37,38, および遺伝子は、CSK、ERBB2、ATM、CDH1、ゲルソリン (GSN) 、PTEN、ATR、および RB139、40、41 、324242,43,44,、 45,,46,47,4848,49,50,51, 52,53,54,54.対照として、タンデムYAP/TAZ shRNA14、非標的対照shRNA(shNTC)、および以前に示したshRNA標的Srcを含み、A375細胞14における最大YAP/TAZ活性に必要であった。
この画面の生データと分析を補足表 2に示します。いくつかのshRNA(shPDK-1、shMDM2-1、shMDM2-2、shMAPK8-1およびshMAPK8-2)は、すべてのウェルの平均レニラシグナルに対するレニラルシファーゼシグナルを有意に減少させ、これらのshRNAがA375細胞に細胞毒性を引き起こしていたことを示唆した。実際にこれらのウェルは、アッセイ時に有意に少ない細胞を持っていた(図示しない)。このため、YAP/TAZ を調節する可能性のある候補と、細胞の生存に不可欠な候補を区別することは非常に困難です。したがって、これらのサンプルからの結果は、さらなるデータ分析から除外されます。予想通り、YAPおよびTAZまたはSrcを標的とするshRNAは、YAP/TAZ-TEAD活性を大幅に減少させた(図3)。PIK3CAがYAPおよびTAZ活性を促進することを示す公開された研究と一致し、21、26、31、PIK3CAを標的とするshRNAが正規化ホタルルシファーゼレベルを低下させたことがわかった。21,26,31ATM、CDH1、CSK、ERBB2、GSNを標的とするshRNAは、それぞれ正規化ホタルルシメラーゼレベルを増加させ、これらの,タンパク質がYAPおよび/またはTAZ,39、41、42、43、45、46、47、48、50、51、53、54を抑制することを示す公表された研究と一致する39,41,42,43,45,46,53,54,5148,5047.ATR、CCNE2、ERBB4の他の細胞タイプでは27、28、35、36、38、49の役割が確立されているにもかかわらず、これらの遺伝子を標的とするshRNAは、A375細胞における正規化ホタルルシフラーゼ濃度を有意に変化させなかった。,28,35,36,38,49EZH2およびRB1を標的とする,shRNAは、他の細胞タイプ32、34、40、5234,40の研究に基づいて期待32されていたものとは反対であったホタルルシファーゼレベルに対する効果を示した。52PTENとRAF1の両方がルシファーゼ活性に反対の効果を有する2つの異なるshRNAによって標的にされた。これまでの研究と矛盾する結果は、これらのタンパク質がYAP/TAZ-TEAD機能に及ぼす影響が細胞型依存性であることを示している可能性がある。ただし、一部の shRNA によるノックダウン効率の低下やオフターゲット効果が原因である可能性もあります。n = 1 "ブラインド" 画面として、いくつかの偽陽性と偽陰性も予想されます。議論で詳しく述べたように、YAPおよびTAZによって調節される遺伝子に対してはqPCR、およびYAP/TAZ機能に影響を与える翻訳後修飾のためのウェスタンブロットのような他のアッセイを使用して、追加の検証実験を行う必要があります。この検証には、どのshRNAが効果的に関心のあるタンパク質を倒したかを確認することも含まれます。また、レポーターはTEAD応答性であるため、画面で特定された遺伝子はTEADに影響を与える可能性がありますが、YAPとTAZには直接影響を与えない可能性があることに注意することも重要です。フォローアップの機械学的研究は、それがYAPおよび/またはTAZであるか、同定されたタンパク質が調節しているTEADであるかどうかを判断するために必要であろう。しかし、YAPとTAZはTEAD媒介転写の主要な原動力であるため、これらの遺伝子のほとんどがYAPおよびTAZを調節している可能性が高い。実際、上記のように、YAPおよび/またはTAZを直接調節することが知られているスクリーンターゲットタンパク質に当たるshRNAの大部分。
図 1: ワークフローのスケマティック ダイアグラムこのプロトコルの重要なステップは、プロトコルの番号に対応するステップ番号で要約されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:YAP/TAZ-TEADデュアルルシファーゼ転写レポーターシステムの最適化(A) A375細胞が安定して発現する制御ベクター (MSCV-IRES-ハイグロ)、LATS無神経 YAP (YAP2SA)、または LATS 非感受性 YAP が TEADs を結合できない (YAP2SA,S9)PRL-TK(レニラ)とpGL3-5xMCAT(SV)-49(YAP/TAZ-TEADレポーター)構築物と共にトランスフェクションした4A)を、24時間後にルシファーゼシグナルを測定した。n = 7独立した実験。(B)A375細胞をYAP2SAまたは対照ベクター2SAのいずれかで共感染させた、PRL-TK構築物、およびpGL3-5xMCAT(SV)-49構築物またはpGL3(SV)-49構築物(最小プロモーター)およびルシメラーゼシグナルを24時間後に測定した。Bn = 1実験は四重体でトランスフェクトした。(C) A375細胞は、非標的制御shRNA(shNTC)またはタンデムYAPおよびTAZ shRNA(shYAP/TAZ)をコードするレトロウイルスに感染した。安定選択後、細胞をPRL-TK構築物と共にトランスフェクトし、pGL3-5xMCAT(SV)-49コンストラクトまたはpGL3(SV)-49構築物とルシファーゼシグナルを24時間後に測定した。n = 4独立した感染症;統計的有意性は、一方向のANOVAを使用して、Tukeyの多重比較テストを使用して決定されました。n.s. = p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:代表画面の結果各ノックダウンベクトルからの結果はshNTCと比較され、折り目差として提示されます。棒グラフは、ホタルルシファーゼ/レニラルシメラーゼ比±標準偏差の平均を示しています。n = 1実験。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
チューブA – トランスフェクション希釈 | |
試薬 | ボリューム |
トランスフェクションバッファー | 反応あたり25 μl |
トランスフェクション試薬2(2番目を追加) | 反応あたり1.5 μl |
チューブB – レポーター希釈 | |
試薬 | ボリューム |
トランスフェクションバッファー | 反応あたり25 μl |
20:1 ホタルルシファーゼレポーター:コントロールレニラミックス(追加秒) | 反応あたり400 ng |
トランスフェクション試薬3(3分の1を追加) | 反応あたり1 μl |
合計:1反応あたり26.5 μl |
表1:トランスフェクションミックスの調製。24ウェルプレートの各ウェルのトランスフェクションについては、1.5 μLのトランスフェクション試薬2を25 μLのトランスフェクションバッファーに希釈してトランスフェクション希釈液(チューブA)を生成します。20:1ホタルルシファーゼレポーターの400 ngながら:制御レニラミックスとトランスフェクション試薬3の1μLは、レポーター希釈(チューブB)を生成するためにトランスフェクションバッファーの25 μLに希釈されます。
既存/購入/ギフトベクター | |
ベクトル | ソース |
GIPZ ヒト shRNA レンチウイルスベクター | GEヘルスケア |
VSVG | ハインズラボ [2] |
psPAX2 | アドジーン (#12260) |
ギャグ/ポール | アドジーン (#14887) |
pGL3-(SV)-49 | アイイン・ファランス [15] |
pGL3-5xMCAT(SV)-49 | アイイン・ファランス [15] |
PRL-TK | プロメガ |
MSCV-アイレスハイグロ | ラマーラボ [2] |
MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-ハイグロ | ラマーラボ [2] |
MSCV-ZSGreen-2A-プロ-hYAP7/hTAZ3 | ラマーラボ [14] |
新しいベクトル | |
ベクトル | ソースバックボーン |
MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-ハイグロ | MSCV-アイレスハイグロ |
補足表1:ベクトルの表使用されるすべてのベクトルは、説明された新しいベクトルとともにリストされています。標準的な分子生物学の技術は、新しいベクターを生成するために使用されました.
補足表2:ルシファーゼアッセイデータ分析shRNAライブラリーの配置は、第1表に示されている。第2表と第3表は、それぞれ生のホタルとレニラ・ルシメラーゼのシグナルを示しています。すべてのウェルのレニラルシファーゼシグナルの平均と標準偏差は黄色のボックスに示されています。平均より1標準偏差を超えるレニラルシファーゼ信号を有するウェルは、赤いテキストで強調表示され、さらなる分析から除外されます。すべてのウェルのホタル/レニラ比は、生のホタルルシファーゼ信号を生のレニラルシファーゼ信号で割って得られた(第4表)。各ウェルのホタル/レニラ比は、次に、コントロールウェル(第5表)のホタル/レニラ比の平均に正規化されました。重複ウェルは、次に各構成体について平均化され、標準偏差が計算された(6番目の表)。こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
本研究では、転写因子の新規調節因子を同定し、試験するために使用できるデュアルルシファーゼベースの転写レポーターアッセイと組み合わせて、アレイドウイルスライブラリの中スループットスクリーニングのアプローチを実証する。どの画面の前にも、各セル行に対してレポーター システムを特徴付けて最適化することが重要です。調査対象の転写因子の活動の変化にレポーターが反応し、活動の変化の大きさを制御ベクターに対して比較してテストする必要があることを確認する実験を行う必要があります。レポーターコンストラクトと共にPRL-TKコンストラクトのコトランスフェクションは、レポーターにトランスフェクトされた細胞の数とレポーターコンストラクトのコピー数を制御するのに役立ち、どちらもルシファーゼ信号の大きさを変化させることができるため重要です。最適化実験では、結果の解釈が複雑になる可能性があるため、転写因子が構成的なレニラ構築物または最小限のプロモーター構築物の活性に影響を与えないことを確認する必要があります。ライブラリに含めるコントロールも慎重に検討する必要があります。このプロトコルは、shRNA の数百のライブラリの「ブラインド スクリーン」のために設計されています, それは、各 shRNA による効果的なノックダウンを確認することは不可能です.したがって、いくつかの偽陽性と陰性が可能性が高いです。画面内の技術的および/または生物学的複製の数を増やすと、偽陽性および陰性の数を減らすのに役立つ可能性があります。しかし、これはまた、培養およびアッセイに対する井戸の数を大幅に増加させるので、これが最適でない培養条件にならないように注意する必要があります(下記参照)。偽陽性および陰性を減らすためのもう一つのアプローチは、同じ細胞株または追加の細胞株で画面全体を繰り返すか、または3つの生物学的複製を使用して「ヒット」のみを含む小さなライブラリをスクリーニングすることです。すべての場合において、既知の標的遺伝子のqPCRなど、レポーター以外の読み出しを使用してヒットを検証する必要があります。標的遺伝子の有効なノックダウンも、これらの検証ステップで確認されるべきである。shRNAによる効果的なノックダウンが確認されない限り、活性を変化させないshRNAについて結論を出すべきではない。検証実験では、調査対象の転写因子が標的遺伝子によって制御されるものであり、これらの遺伝子がレニラや最小限のプロモーター構築に影響を与えないことを確認する必要があります。
また、過剰合流、少なすぎる、細胞の生存率の悪さ、または可変増殖能力などの最適でない条件を避けるために、細胞株ごとに細胞培養条件を最適化することも重要です。細胞の播種密度は、デュアルルシファーゼレポーター構築物のトランスフェクション時(ステップ5)およびレポーター活性が測定される際に特に重要である(ステップ6)。トランスフェクション効率は、細胞密度とトランスフェクション効率の悪さで大きく変化する可能性があり、細胞集団のごく一部しかアッセイされていない場合、異常な結果をもたらす可能性があります。試験したほとんどの細胞株は、合流率が40~60%の場合に最も高いトランスフェクション効率を示しますが、蛍光タンパク質を送達するベクターを使用して、トランスフェクション条件と播種密度を所定の細胞株に最適化することが推奨されます。原発細胞などの感染やトランスフェクトが困難な細胞株は、この画面には適していない可能性があります。レポータートランスフェクション効率が悪いか、細胞生存率が悪い場合、通常、レニラルシファーゼシグナルが非常に低くなります。しかし、パイロット実験を行い、細胞株のレニラルシメラーゼ信号の範囲を決定する必要があります。アレイ化されたライブラリーから生成されるウイルスの価価は、アッセイされる細胞株中で少なくとも30%の感染効率を与えるのに十分高いことが重要である。感染効率は大きく異なり、いくつかの要因がウイルス力に影響を与える可能性があります。使用されるウイルス上清の量は、各細胞株に最適化されるべきであり、必要に応じて、ステップ2は、ウイルス力素を改善するためにさらに最適化することができます。
細胞密度および細胞生存率は転写因子を調節する細胞経路の活性にも影響を及ぼす可能性があるため、二重ルシファーゼアッセイが読み取られた日に細胞が同様の密度になるように、レポータートランスフェクションのために細胞を播種することが重要である(ステップ6)。また、中央の密集したパッチにクラスタリングするのではなく、ウェル全体に細胞が均一に接着するようにすることも重要です。上述したように、レニラルシファーゼシグナルの有意な変動は、解釈が困難なデータをもたらす可能性がある。これは、ウイルスベクターが細胞生存率を低下させるか、またはその井戸のトランスフェクション効率が非常に低かっていることを示唆しているので、他のすべてのウェルと比較して、レニラルシファーゼシグナルの有意な減少を示すウェルを除外するのが最善です。ここでは、平均レニラルシメラーゼシグナルから1標準偏差より大きいウェルを除外しましたが、最適化実験を行い、各細胞株に適切なカットオフを決定する必要があります。また、細胞の生存率を低下させるshRNAは、アッセイされる転写因子の活性を変化させることによってそうすることができる。これが懸念される場合、レニラルシファーゼシグナルを低減するshRNAは、誘導可能なshRNAまたは他のアッセイを使用して再テストすることができる。また、トリプシン化後に接着細胞が懸濁する時間を制限することも重要です。細胞のトリプシン化と播種中のほとんどのステップにマルチチャンネルピペットを使用し、大きな画面の場合は、バッチでプレートを操作します。また、細胞の感染とレポーターアッセイの間の時間を制限することが最善です。これは、転写因子が細胞増殖または生存を調節する場合に特に重要である。この場合、効果的なノックダウンを持つ細胞は、あまり効率的なノックダウンを持つ細胞によって上回るであろう。
記載されたプロトコルのいくつかの変更は、実現可能である。このアプローチは、ルシファーゼベースのレポーターが生成された場合に転写因子の調節因子を同定するために効果的に使用することができ、最も一般的な転写因子の多くのためにレポーター構築物が既に存在する。このプロトコルは、市販のライブラリまたは手動で組み立てられたライブラリ(RNAi、CRISPR/CAS9、ORF、またはcDNAなど)を使用するために変更できます。実際、以前は同様の戦略を使用して、YAP/TAZレギュレータ14用の小さなcDNAライブラリをテストしました。ライブラリーは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、または一過性トランスフェクションを使用して提供できます。ここで使用されるウイルスコートタンパク質(VSVG)は、ヒト感染性であるレンチウイルスを生成する。げっ歯類細胞が使用されており、非ヒト感染性エコトロピックウイルスが望まれる場合、VSVGの代わりにエココートタンパク質を送達するベクターを使用することができます。
他の方法は、転写因子のレギュレータのためのライブラリをスクリーニングするために使用することができます。ハイスループットスクリーニング機能へのアクセスにより、より大きなライブラリを自動でスクリーニングできます。同様に、ゲノムワイドスクリーンは、「ヒット」を識別する手段として深いシーケンシングを備えたプールされたライブラリを使用して行うことができます。しかし、これらのアプローチの両方は、多くの研究者がアクセスできない機器を必要とし、ハイスループットスクリーニングや深いシーケンシングのための手数料は非常に高いことができます。さらに、プールされたスクリーンは、蛍光レポーターまたは転写活性の所望の変化を示す細胞を豊かにする別の方法を使用して細胞の選別を必要とするであろう。デュアルルシファーゼベースの転写レポーターアッセイを用いた大配列式ライブラリーのスクリーニングは、以前ベンチトップロボット55を用いて実証されてきたが、これは全ての研究者にとって一般的に利用可能ではない。これに対し、ここで説明する方法は、高速で中程度のスループットで、比較的安価であり、ほとんどの研究者がアクセスできる可能性が高い装置および試薬を使用します。この方法は、1回の実験で複数の調節因子を明らかにすることができ、これは転写因子の上流の潜在的な調節経路を発見するための費用対効果が高く、便利な方法です。
記載されたアプローチでは、候補遺伝子を安定的に倒し、選択後、レポーター構築物を一時的に細胞にトランスフェクトした。しかし、トランスフェクション効率は多くの細胞株において悪く、変動性を引き起こし、細胞毒性を引き起こす可能性がある。改善された代替アプローチは、レポーターコンストラクトを目的の細胞株のゲノムに安定的に統合し、レポーター発現細胞をスクリーニング用のウイルスライブラリに感染させることである。この改善は、一過性トランスフェクションによってもたらされる変動性を減少させ、感染後の培養が長引くことによって転写因子活性の潜在的な変化を防ぐであろう。前述のように、小型のベンチトップロボットを使用すると、プロセスが大幅に合理化され、スクリーニング可能なライブラリのサイズが大きくなります。もう 1 つの大きな変更は、配列誘導可能ベクター ライブラリを使用する方法で、より効果的なノックダウンを伴う細胞に対する選択の可能性を減らし、細胞の生存率の変化によって生じる変動性を減らします。
多くの癌の効果的な治療を防ぐ重要な課題は、腫瘍細胞が最も効果的な標的療法に対する耐性を獲得することです。この治療抵抗性に必要なタンパク質の同定は、患者の転帰を改善するために必要である。記載されたアプローチは、これらの化合物に対する感受性または耐性の増加を引き起こす遺伝子を明らかにするために標的治療と組み合わせて容易に使用することができる。このアプローチのもう一つの潜在的な将来のアプリケーションは、組み合わせて候補治療ターゲットをテストするために、この配列スクリーニングを使用することです。このために、細胞は、転写因子活性に相乗効果を有するタンパク質を同定することを目的として、それぞれ2つのウイルスベクターに感染するであろう。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
エミリー・ノートンとミカエラン・クッチャレ・ストゥリグロスがshRNAベクターの調製を支援してくれたことに感謝します。この作品の一部は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支えられました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
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