Summary
Para identificar nuevos reguladores de los factores de transcripción, desarrollamos un enfoque para las bibliotecas de ARN lentivirales o retrovirales arrayed utilizando un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa. Este enfoque ofrece una forma rápida y relativamente económica de examinar a cientos de candidatos en un solo experimento.
Abstract
Los factores de transcripción pueden alterar la expresión de numerosos genes diana que influyen en una variedad de procesos posteriores, por lo que son buenos objetivos para las terapias contra el cáncer. Sin embargo, apuntar directamente a los factores de transcripción es a menudo difícil y puede causar efectos secundarios adversos si el factor de transcripción es necesario en uno o más tejidos adultos. La identificación de reguladores ascendentes que activan aberrantemente los factores de transcripción en las células cancerosas ofrece una alternativa más factible, especialmente si estas proteínas son fáciles de drogar. Aquí, describimos un protocolo que se puede utilizar para combinar bibliotecas lentivirales a escala media y un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa para identificar nuevos reguladores de factores de transcripción en las células cancerosas. Nuestro enfoque ofrece una manera rápida, fácil y económica de probar cientos de genes en un solo experimento. Para demostrar el uso de este enfoque, realizamos una pantalla de una biblioteca de ARN lentiviral esampliatizada que contiene varios reguladores de proteína asociada al Sí (YAP) y coactivadora transcripcional con motivo de unión a PDZ (TAZ), dos coactivadores transcripcionales que son los efectores descendentes de la vía Hippo. Sin embargo, este enfoque podría modificarse para detectar a los reguladores de prácticamente cualquier factor de transcripción o cofactor y también podría utilizarse para examinar las bibliotecas CRISPR/CAS9, cDNA u ORF.
Introduction
El propósito de este ensayo es utilizar bibliotecas virales para identificar reguladores de los factores de transcripción de una manera relativamente rápida y económica. La actividad transcripcional aberrante se asocia con el cáncer y la metástasis1,2,3,4,5,6, por lo que la orientación a los factores de transcripción en las células cancerosas es un enfoque terapéutico prometedor. Sin embargo, los factores de transcripción son a menudo difíciles de atacar farmacológicamente7 y muchos son necesarios para la función celular normal en los tejidos adultos8,9,10. Dirigirse a las vías asociadas al cáncer que activan aberrantemente los factores de transcripción para impulsar la enfermedad es un enfoque más factible con el potencial de tener efectos secundarios menos graves. La disponibilidad comercial de las bibliotecas arrayed lentiviral y retroviral RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA o ORF permite a los investigadores probar la importancia de numerosos genes en un solo experimento. Sin embargo, se requiere una lectura confiable para la actividad transcripcional alterada.
Aquí, describimos el uso de un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa y bibliotecas lentivirales arrayed para identificar proteínas que regulan los factores de transcripción en las células cancerosas. En este ensayo, los shRNA que se dirigen a los genes asociados al cáncer se entregan a las células cancerosas de los mamíferos a través de la transducción lentiviral y las células se seleccionan para una integración estable mediante puromicina. Las células se transtroculan a continuación con una construcción de reportero que expresa luciferasa de luciérnaga impulsada por un promotor específico para el factor de transcripción que se está investigando y una construcción de control que expresa Renilla luciferasse de un promotor constitutivamente activo que no responde al factor de transcripción que se está investigando. Demostramos este enfoque con una pantalla de prueba de concepto para reguladores de YAP y TAZ, los efectores descendentes críticos de la vía Hippo8,10,11. La actividad anormal de YAP y TAZ promueve varios pasos de la cascada metastásica11 y se observa en muchos cánceres11,,12,13. Sin embargo, aún no se entiende completamente cómo YAP y TAZ se activan aberrantemente en algunas células cancerosas. YAP y TAZ no unen EL ADN, sino que son reclutados a promotores por otros factores de transcripción. Los miembros de la familia de factores de transcripción del dominio TEA (TEAD) son los principales socios vinculantes para YAP y TAZ, y son críticos para la mayoría de las funciones dependientes de YAP y TAZ. Nuestra construcción de reportero expresa la luciferasa de la luciosel de un promotor yAP/TAZ-TEAD-responsive y estudios anteriores han demostrado que detecta fielmente los cambios en la actividad transcripcional YAP-TEAD y TAZ-TEAD2,14,15.
Nuestro enfoque es rápido, de rendimiento medio, y no requiere instalaciones de cribado, robots automatizados o secuenciación profunda de bibliotecas agrupadas. Los costos son relativamente bajos y hay numerosas bibliotecas disponibles comercialmente para elegir. Los equipos y reactivos requeridos también son relativamente estándar en la mayoría de los laboratorios. Se puede utilizar para detectar reguladores de prácticamente cualquier factor de transcripción si existe o se genera un reportero basado en luciferasa. Utilizamos este enfoque para examinar los shRNA en las células cancerosas, pero cualquier línea celular que pueda ser transllenada con una eficiencia razonable podría ser utilizada con cualquier tipo de biblioteca de matriz.
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Protocol
NOTA: En la Figura 1se muestra un resumen esquemático de este protocolo.
1. Preparación de la biblioteca de vectores Lentivirales
NOTA: La pantalla demostrada utilizaba una biblioteca de shRNA en matriz comprada como acciones de glicerol en placas de 96 pocillos, pero las bibliotecas también se pueden ensamblar manualmente en función de una lista de candidatos. Los controles adecuados deben ser considerados e incluidos en cualquier biblioteca. Esto incluye un shRNA de control no objetivo (shNTC), un shRNA de control dirigido al factor de transcripción que se está investigando y, si es posible, un ARNH dirigido a la luciferas de luciérnaga.
- Añadir 1,3 ml de caldo de luria (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7,5) que contiene 100 g/ml de ampicilina a cada pocil de una placa de pozo de 96 pocillos. Inocular cada pocal con 2 ml de culata de glicerol y crecer a 37 oC durante la noche con agitación constante a 225 rpm.
- Transfiera cada cultivo bacteriano a un tubo centrífugo de 1,5 ml y pelete las bacterias por centrifugación a 21.000 x g a 4 oC durante 10 min.
- Purifica cada vector usando un kit de mini-preparación bacteriana siguiendo el protocolo del fabricante.
- Determinar la concentración de cada vector utilizando un espectrofotómetro.
- Almacenar los plásmidos a -20oC.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Embalaje de la biblioteca lentiviral arrayed
NOTA: Todo trabajo relacionado con el lentivirus, incluyendo el empaquetado, la infección y el posterior cultivo de células infectadas debe seguir estrictamente las normas y regulaciones institucionales de bioseguridad.
- Expanda las células 293FT utilizando medios de crecimiento completos (medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 4 mM de L-glutamina, 4.500 mg/L de glucosa y piruvato sódico, complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina y 2 mM de antibiótico de glutaticina y 2 mM de lglutinamina).
- Para cada vector de la biblioteca del paso 1.4, aseque un 24-well con 1 x 105 celdas 293FT.
NOTA: Se recomienda empaquetar y utilizar algunos pozos adicionales de un vector viral de control para probar el mosaico del virus antes de continuar con el paso 3 (ver más abajo). - Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.
NOTA: Un protocolo general para empaquetar lentivirus que se describió anteriormente14 se ha reducido a 24 pozos para este protocolo. Utiliza psPAX2 para envases lentivirales y VSVG como proteína de capa. Si se desea un virus ectropic, se puede utilizar un vector que entrega Eco en lugar de VSVG. Se recomienda encarecidamente que este protocolo esté optimizado para lograr un titer viral que dé entre el 30%-70% de eficiencia de infección de las células objetivo (ver Discusión). Consulte la Tabla suplementaria 1 para obtener una lista de todos los vectores utilizados. - Configure una mezcla de transfección para cada vector viral del paso 1.4 como se describe a continuación. Cada transfección debe contener 250 ng del vector viral, 125 ng de psPAX2, 125 ng de VSVG, 1,25 ml de reactivo de transfección 1 y 23,75 l de tampón de transfección (ver Tabla de materiales).
- Diluir cada vector lentiviral a 50 ng/L con agua libre de nucleasas, y luego transferir 5 l (250 ng) en un pozo de una placa de PCR de 96 pocillos.
- Haga la súper mezcla de transfección mezclando 1.25 éL * X del reactivo de transfección 1 y 23.75 l * X de tampón de transfección precalentado donde "X" es el número total de transfecciones más varios adicionales para tener en cuenta la pérdida de volumen durante el pipeteo.
- Incubar la súper mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 125 ng * X de psPAX2 y 125 ng * X de VSVG al tubo de transfección super mezcla desde el paso 2.4.3 y canalizar suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Proceda rápidamente al paso 2.4.5.
- Alíce inmediatamente la mezcla del paso 2.4.4 en cada tubo de una tira de PCR, y luego utilice la pipeta multicanal para transferir 25 l de la mezcla a cada pozo que contenga un vector viral del paso 2.4.1.
- Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
- Transfiera los 30 ol de cada 96-bien del paso 2.4.6 a un pozo de los 24-bien que contienen 293 células FT del paso 2.3.
- Incubar las células a 37 oC con un 5% deCO2 durante 24 h y luego reemplazar los medios en cada pocal de la placa de 24 pocillos con 500 oC de medios de crecimiento completos frescos. Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 para otros 24 h.
- Usando una pipeta multicanal, recoge el sobrenadante viral de cada pozo y la alícuota 220 l (suficiente para 1 infección en el paso 3 más un poco de volumen adicional) en dos 96 pocillos cada uno. Estas son las placas de sobrenadantes virales.
- Almacene las placas de sobrenadantes virales arrayed a -80 oC.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. También se recomienda probar algunos de los virus de control adicional que se empaquetaron (ver arriba) en las células que se infectarán antes de continuar con el paso 3. Esto es para asegurar que el titer es suficiente para lograr al menos 30% de eficiencia de infección.
3. Infección de las células de la pantalla
NOTA: Las células del melanoma humano (A375) se utilizaron para demostrar este enfoque, pero este método se puede aplicar a cualquier célula adherente que infecte con lentivirus. Sin embargo, el cultivo celular y las condiciones de chapado deben optimizarse para cada línea de celda (consulte Discusión).
- Expanda las células que se infectarán en medios de crecimiento completos.
- Placas de semilla de 24 pocillos con 1 x 105 células en 0,5 ml de medios de crecimiento completos por poca. Semilla un pozo para cada vector viral a ser probado (incluyendo controles) e incluyen un pozo adicional que no se infectará que servirá como un control para la selección de fármacos en el paso 3.7.
- Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.
- Infectar cada pozo del paso 3.2 con un sobrenadante viral diferente del sobrenadante lentiviral de matriz congelada de la siguiente manera.
- Preparar medios de crecimiento completos que contengan 20 g/ml de polibreno.
- Descongelar los sobrenantes de la biblioteca lentiviral arrayed desde el paso 2.7 hasta la temperatura ambiente.
- Aspirar los medios de crecimiento de las placas de 24 pocillos del paso 3.2 y añadir inmediatamente 200 l de medios de crecimiento que contienen polibrino a cada pocal.
- Usando una pipeta multicanal, transfiera 200 ml de sobrenadante viral de cada 96 pozos del paso 3.4.2 a los 24 pozos del paso 3.4.3.
- Incubar las células a 37oC con 5% deCO2 durante 24 - 48 h.
NOTA: Algunas líneas celulares pueden requerir más de 24 h para expresar los shRNA y volverse resistentes a la puromicina. El vector viral utilizado aquí proporciona un Turbo-GFP-IRES-puroR con un shRNA basado en miR30 en el 3'UTR de puroR (Figura 1). La eficiencia de la infección y la expresión del gen de resistencia a la puromicina y el ARNH fueron controlados por proteínas fluorescentes verdes. - Preparar medios de crecimiento completos que contengan 2,5 g/ml de puromicina.
NOTA: La concentración de selección de puromicina varía entre líneas celulares. Se recomienda realizar una curva de eliminación de antibióticos para cada línea celular que se va a probar antes de la pantalla. - Aspirar los medios de cada pocal y reemplazarlo con 500 l de medios de crecimiento completos que contengan puromicina.
NOTA: Asegúrese de añadir también puromicina a un pozo de control no infectado que se puede utilizar en pasos posteriores para asegurarse de que la selección de puromicina se haya completado. - Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 48 h.
NOTA: Lo mejor es seleccionar para 48 h, por lo que la densidad de chapado y el título viral deben optimizarse para que las células no sean sobreconfluentes antes de 48 h. - Asegúrese de que las células infectadas estén verdes bajo el microscopio fluorescente, y que las células de un control no infectado estén bien tratadas con puromicina antes de continuar con el paso 4.
4. Células de sembración para la transfección del reportero de doble luciferasa
NOTA: Se debe realizar una prueba de transfección para determinar la densidad de sembrado óptima para cada nueva línea celular.
- Intente probar cada pozo desde el paso 3.9 y transfiera aproximadamente 1 x 105 células en pozos en la posición correspondiente en la nueva placa de 24 pocillos de la siguiente manera.
NOTA: Este protocolo está diseñado para la detección de bibliotecas con cientos de shRNA por lo que no es factible contar todos los pozos de células infectadas. Por lo tanto, los pasos siguientes se utilizaron para estimar los números de celda en cada pozo para ayudar a garantizar aproximadamente la misma densidad de chapado.- Agrupe los pozos del paso 3.9 en 3 - 4 grupos de modo que todos los pozos de un grupo tengan una densidad de celda similar.
- Trippsinizar 1 bien representativo de cada grupo con 200 l de trippsina-EDTA (1x PBS complementado con 0,5 mM EDTA y 0,1% de trippsina) durante 5 min a 37 oC. A continuación, neutralice la trippsina-EDTA añadiendo 400 l de puromicina que contenga medios de crecimiento completos.
- Cuente bien cada representante para determinar el número total de células y diluir la suspensión celular de cada representante a 2 x 105 células/ml de uso de medios de crecimiento completos.
- Semilla 0,5 ml (1 x 105 celdas) de cada pozo desde el paso 4.1.3 en la posición correspondiente en una nueva placa de 24 pocillos e incubar esta nueva placa de 24 pocillos a 37oC con 5%co2 durante 24 horas.
- Para cada grupo del paso 4.1.1, utilice el número de celda total determinado en el paso 4.1.3 para calcular el volumen de trippsin-EDTA que se agregará a cada pozo de modo que la suspensión celular resultante sea de 1 x 106 células/ml.
- Añadir el volumen adecuado de trippsina-EDTA a cada pocal e incubar durante 5 min a 37 oC.
NOTA: Para una pantalla más grande, se recomienda que las placas de 24 pocillos se triprinen y se vuelvan a encargar en grupos en lugar de todas a la vez para garantizar la viabilidad de las células. - Durante la incubación anterior, utilice una pipeta multicanal para añadir 400 ml de medios de crecimiento completos que contengan puromicina a los pozos correspondientes en una nueva placa de 24 pocillos.
- Transfiera 100 l de suspensión celular (aproximadamente 1 x 105 células) de cada pocal a la posición correspondiente en las nuevas placas de 24 pocillos preparadas en el paso 4.1.7.
- Repita los pasos 4.1.6 a 4.1.8 para todas las placas de pozos agrupados del paso 4.1.1, una placa a la vez.
- Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.
5. Transfección del reportero de doble luciferasa
- Transfect cada uno bien del paso 4.2 con las construcciones de reportero de doble luciferasa de la siguiente manera.
NOTA: Antes de iniciar este ensayo, se debe determinar la cantidad total de ADN y la proporción óptima del vector de reportero de luciferasa de luciérnaga para controlar el vector Renilla luciferase. Aquí, se utilizaron 400 ng de una mezcla de ADN que contiene 20 partes de reportero luciferasa luciérnaga y 1 parte de control Renilla luciferase.- Realizar la mezcla de dilución de transfección (tubo A) y la mezcla de dilución de reportero (tubo B) mezclando los volúmenes indicados de cada reactivo(Tabla 1) multiplicados por el número total de transfecciones (más varios adicionales).
NOTA: Este protocolo está optimizado para el reactivo de transfección 2 (ver Tabla de Materiales). Si se utiliza un reactivo de transfección diferente, el transfecto debe optimizarse antes de este paso. - Mezclar la mezcla de dilución de transfección (Tubo A) con la mezcla de dilución del reportero (Tubo B) e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos para producir la mezcla de transfección.
- Durante la incubación anterior, enjuague cada 24 pocillos desde el Paso 4.2 con 0,25 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) y agregue 447 ml de medios de crecimiento completos a cada poca.
- Después de la incubación de 15 minutos, utilice una pipeta multicanal para distribuir 53 ml de mezcla de transfección a cada pocal de las placas de 24 pocillos.
- Realizar la mezcla de dilución de transfección (tubo A) y la mezcla de dilución de reportero (tubo B) mezclando los volúmenes indicados de cada reactivo(Tabla 1) multiplicados por el número total de transfecciones (más varios adicionales).
- Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.
6. Cuantificación de la actividad de la dual-luciferasa
- Mida la actividad de la luciferasa usando un lector de placas y un kit de ensayo de reportero de doble luciferasa como se describe a continuación.
NOTA: Este protocolo está optimizado para el kit de ensayo de reportero indicado (consulte Tabla de materiales)y sigue el protocolo recomendado por el fabricante.- Preparar suficiente tampón de lisis pasiva 1x para todos los pozos más varios adicionales (se necesitan 75 l por pocto) diluyendo 5 x tampón de lisis pasiva (proporcionado en kit) 1 a 5 con agua desionizada. También se necesita el reactivo de descongelación A y el reactivo B Buffer (proporcionado en el kit, se necesitan 100 ml de cada uno para cada pociembre).
- Aspirar los medios de cada pozo de la placa de 24 pocillos del Paso 5.2.
- Añadir 75 l de 1x tampón pasivo de lisis a cada poca y incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación ocasional.
- Preparar el reactivo B diluyendo el sustrato B del reactivo 50x (proporcionado en el kit) 1:50 con tampón B del reactivo desalidedo.
- Añadir 30 l de 1 x tampón de lisis pasiva a 4 pozos para el vaciado (ver Tabla Suplementaria 2).
- Transfiera 30 ml de lisado desde el paso 6.1.3 a pozos duplicados de una placa de ensayo blanca inferior plana de 96 pocillos.
- Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 ml de reactivo A a cada poca y lea la señal de luciferasa de luciérnaga con un lector de placas.
- Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 ml de reactivo B del paso 6.1.4 a cada poca y lea la señal de Renilla luciferase con un lector de placas.
- Procese los datos sin procesar de la siguiente manera (para obtener una descripción detallada, véase Tabla suplementaria 2).
- Excluya las muestras con una señal de Renilla luciferasa muy baja, ya que los valores bajos indican que la construcción viral fue tóxica o que se analizaron muy pocas células transinfectadas.
NOTA: Como se explica en la discusión, significativamente "baja" señal de Renilla luciferasa puede resultar en resultados anómalos. Aquí, se excluyeron los pozos en los que la señal de Renilla luciferase era más de 1 desviación estándar por debajo de la media (véase el Cuadro Suplementario 2). Esto se basó en estudios previos realizados utilizando este sistema de reportero en estas celdas14,pero puede diferir en otras líneas celulares. - Normalizar el valor de la luciferasa de luciérnaga cruda de cada pocal al valor crudo de Renilla luciferasa del mismo pozo para obtener la relación luciérnaga/Renilla.
- Promedio de las relaciones de luciérnaga /Renilla de todos los pozos de control de réplica y luego dividir la relación luciérnaga /Renilla de cada otro pozo por ese número para obtener un cambio de pliegue.
- Asigne la muestra de control y establezca su valor de relaciónfirefly/Renilla en 1.
- Promedio de las relaciones deluciérnaga/Renilla de los pozos duplicados y traza con la desviación estándar.
NOTA: La desviación estándar no se utiliza para el análisis estadístico, sino como un medio para identificar pozos donde las réplicas difieren significativamente.
- Excluya las muestras con una señal de Renilla luciferasa muy baja, ya que los valores bajos indican que la construcción viral fue tóxica o que se analizaron muy pocas células transinfectadas.
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Representative Results
Nuestra construcción de reportero YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contiene un promotor SV-49 mínimo con 5 repeticiones del elemento canónico TEAD binding element (MCAT)15 conduciendo el gen de la luciosa luciérnaga(Figura 1). Se co-tranfectó en células junto con el vector de control PRL-TK (Promega), que expresa Renilla luciferase del promotor constitutivamente activo de hsv TK(Figura 1). Es fundamental asegurarse de que la construcción del reportero YAP/TAZ-TEAD se comporte como se esperaba en las líneas celulares que se están probando. Por lo tanto, primero co-transtamos las construcciones PRL-TK y pGL3-5xMCAT (SV)-49 en células A375 expresando establemente un vector de control, un mutante altamente activo insensible a LATS de YAP (YAP2SA),o un mutante de YAP2SA incapaz de enlazar TEADs (YAP2SA,S94A). Como era de esperar, la actividad de la luciferasa de la luciérnaga se incrementó significativamente por YAP2SA, pero no el vector de control o el YAP2SA,S94A (Figura 2A). Esto sugiere que YAP aumenta la actividad del reportero YAP/TAZ-TEAD de una manera dependiente del TEAD. Es importante destacar que YAP2SA no alteró significativamente los niveles de la Renilla luciferase. Como control adicional, también confirmamos que el YAP2SA no altera la actividad de una construcción promotora mínima que carece de los elementos de unión MCAT TEAD(Figura 2B).
También se realizó un segundo experimento de control en el que las células A375 estaban infectadas con construcciones virales que entregan un shRNA de control no objetivo (shNTC) o una construcción con shRNAs YAP y TAZ en tándem. Después de la selección estable, las células fueron co-transtrinfectadas con la construcción PRL-TK y la construcción de reportero YAP/TAZ-TEAD o la construcción mínima promotora. En las células transtorneadas con la construcción del reportero YAP/TAZ-TEAD, el shRNA YAP/TAZ redujo significativamente los niveles de luciferasa de luciérnaga, pero el shNTC de control no lo hizo (Figura 2C). Los niveles de luciferasa de luciérnaga no fueron cambiados por el shNTC o el ARNS YAP/TAZ en células infectadas con el promotor mínimo(Figura 2C). De conformidad con los resultados anteriores, la señal Renilla en cada pozo tampoco fue alterada significativamente por el shNTC de control o el shRNA YAP/TAZ(Figura 2C),lo que indica además que la construcción de control PRL-TK no responde a YAP o TAZ. Colectivamente, estos experimentos muestran que el sistema de reportero se comporta como se esperaba en las células A375, lo que es consistente con estudios previos utilizando estos vectores2,14.
Como prueba de experimento conceptual, analizamos una pequeña biblioteca de ARNs lentivirales en células A375. Nuestra biblioteca de pruebas contenía shRNAs dirigidos a varios genes que previamente se demostró que regulaban la función YAP/TAZ en otros tipos de células. Sin embargo, se desconoce el papel de varios de estos genes en la regulación de YAP y TAZ en el melanoma. Nuestra biblioteca incluía genes que se requieren para la actividad YAP/TAZ, como RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4 y CCNE216,,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31,32,33,34,3535,36,37,38, y genes previstos para inhibir la actividad YAP /TAZ, tales como CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR, y RB139,40,41,42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. Como controles, incluimos un shRNA14de YAP/TAZ en tándem, un shRNA de control sin objetivo (shNTC) y un Src dirigido al shRNA, que previamente mostramos necesario para la actividad máxima de YAP/TAZ en las células A37514.
Los datos sin procesar y el análisis de esta pantalla se muestran en la Tabla Suplementaria 2. Varios shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 y shMAPK8-2) redujeron significativamente la señal de Renilla luciferase en relación con la señal media de Renilla para todos los pozos, lo que sugiere que estos shRNA estaban causando citotoxicidad en células A375. De hecho, estos pozos tenían significativamente menos células en el momento del ensayo (no se muestra). Esto hace que sea muy difícil distinguir a los candidatos que pueden regular YAP/TAZ de los que son esenciales para la supervivencia celular. Por lo tanto, los resultados de estas muestras se excluyen de un análisis de datos posterior. Como era de esperar, los shRNA dirigidos a YAP y TAZ o Src redujeron significativamente la actividad DeAP/TAZ-TEAD(Figura 3). En consonancia con el trabajo publicado que muestra que PIK3CA promueve la actividad YAP y TAZ21,26,31, encontramos que los shRNAs dirigidos a PIK3CA redujeron los niveles normalizados de luciferas luciérnaga. shRNAs dirigidos a ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN cada uno aumentó los niveles normalizados de luciferasa de luciérnaga, lo que es consistente con estudios publicados que muestran que estas proteínas reprimen YAP y/ o TAZ39,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54 . A pesar de las funciones establecidas para ATR, CCNE2 y ERBB4 en otros tipos de células27,28,35,36,38,49, shRNAs apuntando a estos genes no cambiaron significativamente los niveles normalizados de luciferasa de luciérnaga en las células A375. los shRNAs dirigidos a EZH2 y RB1 mostraron un efecto sobre los niveles de luciferasa de luciérnaga que era opuesto a lo que se esperaba basado en estudios en otros tipos de células32,,34,40,52. Tanto PTEN como RAF1 fueron blanco de dos shRNAs distintos que tenían efectos opuestos en la actividad de la luciferasa. Los resultados incompatibles con estudios anteriores podrían indicar que la influencia de estas proteínas en la función YAP/TAZ-TEAD depende del tipo de célula; sin embargo, también puede deberse a una mala eficiencia de derribo o a efectos fuera del objetivo por parte de algunos shRNA. Como una pantalla "ciega" de n a 1, también se esperarían algunos falsos positivos y falsos negativos. Como se discutió con más detalle en el debate, sería necesario realizar experimentos de validación adicionales utilizando otros ensayos como qPCR para genes regulados por YAP y TAZ y manchas occidentales para modificaciones post traslacionales que influyen en la función YAP/TAZ. Esta validación también incluiría confirmar qué shRNAs derribó efectivamente la proteína de interés. También es importante tener en cuenta que dado que nuestro reportero responde al TEAD, cualquier gen identificado por nuestra pantalla podría estar influyendo en los TEAD, pero no en YAP y TAZ directamente. Se requerirían estudios mecánicos de seguimiento para determinar si se trataba de YAP y/o TAZ o de los TEAD que la proteína identificada está regulando. Sin embargo, YAP y TAZ son los principales impulsores de la transcripción mediada por TEAD, por lo que es probable que la mayoría de estos genes estén regulando YAP y TAZ. De hecho, como se indicó anteriormente, la mayoría de los shRNAs que golpean en la pantalla apuntan a proteínas que se sabe que regulan YAP y / o TAZ directamente.
Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo. Los pasos críticos de este protocolo se resumen con números de paso correspondientes a los números en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Optimización del sistema de reportero transcripcional de doble luciferasa YAP/TAZ-TEAD. (A) células A375 que expresan establemente el vector de control (MSCV-IRES-Hygro), YAP insensible a LATS (YAP2SA)o YAP insensible a LATS que no pueden unir TEAD (YAP2SA),S94A) fueron co-infectados con las construcciones PRL-TK (Renilla) y pGL3-5xMCAT (SV)-49 (reportero YAP/TAZ-TEAD) y la señal de luciferasse se midió 24 horas más tarde. n 7 experimentos independientes. (B) Las células A375 fueron co-transtrofadas con YAP2SA o vector de control, la construcción PRL-TK, y la construcción pGL3-5xMCAT (SV)-49 o la construcción pGL3 (SV)-49 (promotor mínimo) y la señal de luciferasa se midieron 24 horas más tarde. n 1 experimento transinfectado en cuadruplicado. (C) Las células A375 se infectaron con retrovirus que codificaban un shRNA de control no objetivo (shNTC) o shRNAs YAP y TAZ en tándem (shYAP/TAZ). Después de la selección estable, las células fueron co-transtrinfectadas con la construcción PRL-TK y la construcción pGL3-5xMCAT (SV)-49 o la construcción pGL3 (SV)-49 y la señal de luciferasa se midió 24 horas más tarde. n 4 infecciones independientes; La significancia estadística se determinó utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey; n.s. á p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados de la pantalla representativa. El resultado de cada vector de derribo se compara con shNTC y se presenta como diferencia de pliegue. El gráfico de barras muestra el promedio de la relación entre la luciferasa y la luciferasa de laluciérnaga/Renilla luciferase. N 1 experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tubo A – Dilución de la transfección | |
| Reactivo | Volumen |
| Tampón de transfección | 25 l por reacción |
| Reactivo de transfección 2 (añadir segundo) | 1,5 l por reacción |
| Tubo B – Dilución del reportero | |
| Reactivo | Volumen |
| Tampón de transfección | 25 l por reacción |
| 20:1 Firefly luciferase reporter: control Renilla mix (añadir segundo) | 400 ng por reacción |
| Reactivo de transfección 3 (añadir tercero) | 1 l por reacción |
| Total: 26,5 l por reacción | |
Tabla 1: Preparación de la mezcla de transfección. Para la transfección en cada pocal de las placas de 24 pocillos, 1,5 ml del reactivo de transfección 2 se diluye en 25 ml de tampón de transfección para producir la dilución de la transfección (tubo A); mientras que 400 ng de 20:1 firefly luciferase reportero: control Renilla mezcla y 1 l de reactivo de transfección 3 se diluye en 25 ol de búfer de transfección para producir la dilución del reportero (tubo B).
| Vectores existentes/comprados/de regalo | |
| Vector | Fuente |
| GIPZ vectores lentivirales de shRNA humanos | GE Healthcare |
| VSVG | Laboratorio Hynes [2] |
| psPAX2 | Addgene (#12260) |
| gag/pol | Addgene (#14887) |
| pGL3-(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| pGL3-5xMCAT(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| PRL-TK | Promega |
| MSCV-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 | LAMAR LAB [14] |
| Nuevos vectores | |
| Vector | Fuente Columna vertebral |
| MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro | MSCV-IRES-Hygro |
Tabla Suplementaria 1: Tabla de vectores. Todos los vectores utilizados se enumeran con nuevos vectores descritos. Se utilizaron técnicas de biología molecular estándar para generar nuevos vectores.
Tabla suplementaria 2: Análisis de datos de ensayo de Luciferase. La disposición de la biblioteca de ARNh se muestra en la primera tabla. La segunda y tercera tabla muestran las señales de luciérnaga cruda y Renilla luciferasa, respectivamente. La media y la desviación estándar para la señal Renilla luciferase para todos los pozos se indican en las cajas amarillas. Los pozos con una señal de Renilla luciferasa más de 1 desviación estándar por debajo de la media se resaltan con texto rojo y se excluyen de un análisis posterior. La relaciónluciérnaga/Renilla de cada pozo se obtuvo dividiendo la señal de luciferasa de luciérnaga cruda por la señal raw Renilla luciferase (cuarta tabla). La relaciónluciérnaga/Renilla de cada pozo se normalizó a la media de la relación luciérnaga/Renilla de los pozos de control (shNTC) (quinta tabla).Renilla Los pozos duplicados se promediaron a continuación para cada construcción y se calculó la desviación estándar (sexta tabla). Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
En este estudio, demostramos un enfoque para la detección de rendimiento medio de bibliotecas virales en conjunto con un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa que se puede utilizar para identificar y probar nuevos reguladores de factores de transcripción. Es fundamental caracterizar y optimizar el sistema de reportero para cada línea celular antes de cualquier pantalla. Se deben realizar experimentos para confirmar que el reportero responde a la actividad alterada del factor de transcripción que se está investigando y que la magnitud del cambio en la actividad debe probarse en relación con los vectores de control. La co-transfección de la construcción PRL-TK junto con la construcción del reportero es importante porque ayuda a controlar el número de células transllenas con el reportero y el número de copia de la construcción del reportero, lo que puede alterar la magnitud de la señal de luciferasa. Los experimentos de optimización también deben garantizar que el factor de transcripción no influya en la actividad de la construcción constitutiva de Renilla o en una construcción promotora mínima, ya que esto podría complicar la interpretación de los resultados. Los controles que se incluirán en la biblioteca también deben ser cuidadosamente considerados. Este protocolo está diseñado para una "pantalla ciega" de bibliotecas con cientos de shRNA, donde no es factible confirmar el derribo efectivo por cada shRNA. Por lo tanto, algunos falsos positivos y negativos son probables. Aumentar el número de réplicas técnicas y/o biológicas en la pantalla podría ayudar a reducir el número de falsos positivos y negativos. Sin embargo, esto también aumentará significativamente el número de pozos a la cultura y el ensayo, por lo que se debe tener cuidado para asegurarse de que esto no da lugar a condiciones de cultivo subóptimas (véase más adelante). Otro enfoque para reducir falsos positivos y negativos sería repetir toda la pantalla en la misma línea de celda o líneas celulares adicionales, o para examinar una biblioteca más pequeña que incluye solo los "hits" usando 3 réplicas biológicas. En todos los casos, cualquier acierto debe validarse utilizando lecturas además del reportero, como qPCR para genes diana conocidos. El derribo efectivo del gen objetivo también debe confirmarse en estos pasos de validación. No se deben sacar conclusiones sobre los shRNA que no alteran la actividad a menos que se confirme el derribo efectivo por parte del ARNH. Los experimentos de validación también deben garantizar que el factor de transcripción que se está investigando es lo que está regulado por los genes objetivo y que estos genes no influyen en el Renilla o en las construcciones mínimas de los promotores.
También es importante optimizar las condiciones de cultivo celular para cada línea celular para evitar condiciones subóptimas como sobre-confluencia, muy pocas células, mala viabilidad celular, o capacidad proliferativa variable. La densidad de sembración celular es particularmente importante en el momento de la transfección de la construcción del reportero de doble luciferasa (Paso 5) y cuando se mide la actividad del reportero (Paso 6). La eficiencia de la transfección puede variar significativamente con la densidad celular y la mala eficiencia de transfección puede dar lugar a resultados anómalos si sólo se está ensayando una pequeña fracción de la población celular. La mayoría de las líneas celulares probadas muestran la mayor eficiencia de transfección cuando están en 40 - 60% de confluencia, pero se recomienda que las condiciones de transfección y la densidad de semilla se optimizan para una línea celular dada utilizando un vector que entrega una proteína fluorescente. Las líneas celulares que son difíciles de infectar y/o transfect, como las células primarias, pueden no ser adecuadas para esta pantalla. La mala eficiencia de la transfección del reportero o la mala viabilidad celular suelen dar lugar a una señal muy baja de Renilla luciferase. Sin embargo, se debe realizar un experimento piloto para determinar el rango de señal de Renilla luciferase para una línea celular. Es importante que el titer del virus producido a partir de la biblioteca de matriz es lo suficientemente alto como para dar una eficiencia de infección de al menos 30% en la línea celular que se está ensayando. La eficiencia de la infección puede variar mucho y varios factores pueden influir en el titer viral. La cantidad de sobrenadante viral utilizado debe optimizarse para cada línea celular y, si es necesario, el Paso 2 se puede optimizar aún más para mejorar los valoradores virales.
La densidad celular y la viabilidad celular también pueden influir en la actividad de las vías celulares que regulan los factores de transcripción, por lo que es fundamental sembrar las células para la transfección del reportero para que todas estén en una densidad similar el día en que se lea el ensayo de doble luciferasa (Paso 6). También es importante asegurarse de que las células se adhieren uniformemente a través del pozo en lugar de agruparse en un parche denso en el centro. Como se describió anteriormente, variación significativa en la señal de Renilla luciferase de pozo a pozo puede resultar en datos que son difíciles de interpretar. Lo mejor es excluir los pozos que muestran una reducción significativa en la señal de Renilla luciferase en comparación con todos los demás pozos, ya que esto sugiere que el vector viral está reduciendo la viabilidad celular o la eficiencia de transfección para ese pozo era muy baja. Aquí excluimos pozos mayores de 1 desviación estándar de la señal media de Renilla luciferase, pero se deben hacer experimentos de optimización para determinar los cortes apropiados para cada línea celular. También es posible que los shRNA que reducen la viabilidad celular podrían hacerlo alterando la actividad del factor de transcripción que se está analizando. Si esto es una preocupación, los shRNA que reducen la señal de Renilla luciferase podrían ser re-probados usando shRNA inducibles u otros ensayos. También es fundamental limitar la cantidad de tiempo que las células adherentes están en suspensión después de la tripinización. Utilice una pipeta multicanal para la mayoría de los pasos durante la tripinización y la sembración de células, y para pantallas más grandes, trabaje con las placas en lotes. Además, es mejor limitar el tiempo entre la infección de las células y el ensayo del reportero. Esto es particularmente importante si el factor de transcripción que se está analizando regula la proliferación celular o la supervivencia. En este caso, las células con derribo efectivo serían superadas por las células con derribo menos eficiente.
Varias modificaciones del protocolo descrito son factibles. Este enfoque se puede utilizar eficazmente para identificar reguladores de cualquier factor de transcripción si se genera un reportero basado en luciferasa, y para muchos de los factores de transcripción más comunes ya existen construcciones de reporteros. Este protocolo se puede modificar para el uso de una amplia variedad de bibliotecas disponibles comercialmente o montadas manualmente, incluyendo RNAi, CRISPR/CAS9, ORF o cDNA. De hecho, anteriormente usamos una estrategia similar para probar una pequeña biblioteca de ADN para reguladores YAP/TAZ14. Las bibliotecas se pueden administrar mediante retrovirus, lentivirus, adenovirus o transfección transitoria. La proteína de capa viral utilizada aquí (VSVG) genera lentivirus que es infeccioso por el ser humano. Si se utilizan células de roedores y se desea un virus ecotrópico infeccioso no humano, se puede utilizar un vector que proporcione la proteína Eco coat en lugar de VSVG.
Otros métodos se pueden utilizar para examinar bibliotecas para reguladores de un factor de transcripción. El acceso a una instalación de cribado de alto rendimiento permitiría la selección de bibliotecas mucho más grandes de forma automatizada. Del mismo modo, las pantallas de todo el genoma se pueden hacer utilizando bibliotecas agrupadas con secuenciación profunda como un medio para identificar los "hits". Sin embargo, ambos enfoques requieren equipos que no sean accesibles para muchos investigadores, y las tarifas para el cribado de alto rendimiento o la secuenciación profunda pueden ser prohibitivamente altas. Además, las pantallas agrupadas requerirían la clasificación de celdas usando un reportero fluorescente u otra forma de enriquecer las celdas que muestran los cambios deseados en la actividad transcripcional. La detección de grandes bibliotecas de expresiones de matriz utilizando un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa se ha demostrado anteriormente utilizando un robot de sobremesa55,pero esto no está comúnmente disponible para todos los investigadores. Por el contrario, el método descrito aquí es rápido, de rendimiento medio, relativamente barato, y utiliza equipos y reactivos que probablemente sean accesibles para la mayoría de los investigadores. Este método puede revelar múltiples reguladores en un solo experimento, que es una manera rentable y conveniente de descubrir posibles vías regulatorias aguas arriba de un factor de transcripción.
En el enfoque descrito, los genes candidatos fueron derribados de forma estable y luego después de la selección, las construcciones del reportero fueron transfectó transitoriamente en las células. Sin embargo, la eficiencia de la transfección es pobre en muchas líneas celulares y puede introducir variabilidad y causar toxicidad celular. Un enfoque alternativo mejorado sería integrar de forma estable la construcción del reportero en el genoma de la línea de interés celular y luego infectar las células que expresan el reportero con las bibliotecas virales para su detección. Esta mejora reduciría la variabilidad introducida por la transfección transitoria y evitaría cualquier posible cambio en la actividad del factor de transcripción debido a un cultivo prolongado después de la infección. Como se mencionó anteriormente, el uso de un pequeño robot de sobremesa agilizaría en gran medida el proceso y aumentaría el tamaño de las bibliotecas que podrían ser examinadas. Otra alteración considerable es el uso de bibliotecas vectoriales inducibles en matriz, lo que reduciría la probabilidad de selección contra celdas con derribos más eficaces y reduciría la variabilidad causada por los cambios en la viabilidad celular.
Un desafío significativo que previene el tratamiento eficaz de muchos tipos de cáncer es que las células tumorales adquieren resistencia incluso a las terapias dirigidas más eficaces. La identificación de las proteínas necesarias para esta resistencia terapéutica es necesaria para mejorar el resultado del paciente. El enfoque descrito podría utilizarse fácilmente en combinación con terapias dirigidas para revelar genes que causan una mayor sensibilidad o resistencia a estos compuestos. Otra posible aplicación futura de este enfoque sería utilizar este cribado arreglo para probar las dianas terapéuticas candidatas en combinación. Para ello, las células se infectarían con dos vectores virales cada uno con el objetivo de identificar proteínas que tienen un efecto sinérgico en la actividad del factor de transcripción.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Emily Norton y Mikaelan Cucciarre-Stuligross por ayudar en la preparación de vectores de ARNH. Este trabajo fue apoyado en parte por una beca Susan G. Komen Career Catalyst que otorgó a J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
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