Summary
Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.
Abstract
Transcriptie factoren kunnen veranderen de expressie van tal van doelgenen die een verscheidenheid van downstream processen waardoor ze goede doelen voor anti-kanker therapieën beïnvloeden. Echter, direct gericht transcriptie factoren is vaak moeilijk en kan leiden tot nadelige bijwerkingen als de transcriptie factor nodig is in een of meer volwassen weefsels. Het identificeren van upstream regulatoren die afwijkend activeren transcriptie factoren in kankercellen biedt een meer haalbaar alternatief, vooral als deze eiwitten zijn gemakkelijk te drogeren. Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt om arrayed medium-scale lentivirale bibliotheken en een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie verslaggever assay te combineren om nieuwe regelgevers van transcriptie factoren in kankercellen te identificeren. Onze aanpak biedt een snelle, eenvoudige en goedkope manier om honderden genen in één experiment te testen. Om het gebruik van deze aanpak aan te tonen, hebben we een scherm uitgevoerd van een arrayed lentivirale RNAi-bibliotheek met verschillende regelgevers van Ja-geassocieerdeiwit (YAP) en transcriptieco-activator met PDZ-bindend motief (TAZ), twee transcriptieco-activators die de downstream-effectoren van het Hippo-pad zijn. Deze benadering kan echter worden aangepast om te screenen op regelgevers van vrijwel elke transcriptiefactor of cofactor en kan ook worden gebruikt om CRISPR/CAS9-, cDNA- of ORF-bibliotheken te screenen.
Introduction
Het doel van deze test is om virale bibliotheken te gebruiken om regelgevers van transcriptiefactoren op een relatief snelle en goedkope manier te identificeren. Afwijkende transcriptieactiviteit wordt geassocieerd met kanker en metastase1,,2,3,4,5,6, dus gericht op transcriptiefactoren in kankercellen is een veelbelovende therapeutische benadering. Echter, transcriptie factoren zijn vaak moeilijk te richten farmacologisch7 en velen zijn nodig voor de normale cellulaire functie in volwassen weefsels8,9,10. Gericht op de kanker-geassocieerde trajecten die aberrantly activeren transcriptie factoren om ziekte te rijden is een meer haalbare aanpak met het potentieel om minder ernstige bijwerkingen hebben. De commerciële beschikbaarheid van arrayed lentivirale en retrovirale RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, of ORF bibliotheken stelt onderzoekers in staat om het belang van talrijke genen te testen in een enkel experiment. Er is echter een betrouwbare uitlezing voor gewijzigde transcriptieactiviteit vereist.
Hier beschrijven we het gebruik van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie reporter test en arrayed lentivirale bibliotheken om eiwitten die transcriptie factoren in kankercellen te reguleren identificeren. In deze test worden shRNAs die zich richten op kanker-geassocieerde genen geleverd aan zoogdierkankercellen via lentivirale transductie en cellen worden geselecteerd voor stabiele integratie met behulp van puromycine. De cellen worden vervolgens getransfecteerd met een verslaggever constructie die firefly luciferase gedreven door een promotor die specifiek is voor de transcriptie factor die wordt onderzocht en een controle constructie die Renilla luciferase uitdrukt van een constitutief actieve promotor die niet reageert op de transcriptie factor wordt onderzocht. We demonstreren deze aanpak met een proof-of-concept scherm voor regelgevers van YAP en TAZ, de kritische downstream-effectors van het Hippo-pad8,10,11. Abnormale activiteit van YAP en TAZ bevordert verschillende stappen van de uitgezaaide cascade11 en wordt waargenomen bij veel vormen van kanker11,12,13. Echter, hoe YAP en TAZ worden aberrantly geactiveerd in sommige kankercellen is nog niet volledig begrepen. YAP en TAZ binden geen DNA, maar worden in plaats daarvan aangeworven om promotors door andere transcriptiefactoren. Leden van de TEA-domein (TEAD)-familie van transcriptiefactoren zijn de belangrijkste bindende partners voor YAP en TAZ en zijn van cruciaal belang voor de meeste YAP- en TAZ-afhankelijke functies. Onze verslaggever constructie drukt firefly luciferase van een YAP / TAZ-TEAD-responsieve promotor en eerdere studies hebben aangetoond dat het getrouw veranderingen in YAP-TEAD en TAZ-TEAD transcriptie activiteit2,14,15detecteert .15
Onze aanpak is snel, medium-throughput, en vereist geen screening faciliteiten, geautomatiseerde robots, of diepe volgorde van gepoolde bibliotheken. De kosten zijn relatief laag en er zijn tal van commercieel beschikbare bibliotheken om uit te kiezen. De benodigde apparatuur en reagentia zijn ook relatief standaard in de meeste laboratoria. Het kan worden gebruikt om te screenen voor regelgevers van vrijwel elke transcriptie factor als een luciferase-gebaseerde verslaggever bestaat of wordt gegenereerd. We gebruiken deze benadering om shRNAs in kankercellen te screenen, maar elke cellijn die met redelijke efficiëntie kan worden getransfecteerd, kan worden gebruikt met elk type arrayed-bibliotheek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een schematische samenvatting van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van de lentivirale vectorbibliotheek
OPMERKING: Het gedemonstreerde scherm gebruikte een arrayed shRNA-bibliotheek gekocht als glycerol-bestanden in 96-putplaten, maar bibliotheken kunnen ook handmatig worden samengesteld op basis van een lijst met kandidaten. Passende besturingselementen moeten in elke bibliotheek worden overwogen en opgenomen. Dit omvat een niet-targeting controle shRNA (shNTC), een controle shRNA gericht op de transcriptie factor wordt onderzocht, en indien mogelijk, een shRNA gericht firefly luciferase.
- Voeg 1,3 mL Luria Broth (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% gistextract, 1% NaCl, pH 7.5) met 100 μg/mL ampicillin toe aan elke put van een 96-well deep well plaat. Inent elk goed met 2 μL glycerolvoorraad en groei 's nachts bij 37 °C met constante agitatie bij 225 tpm.
- Breng elke bacteriële cultuur over in een centrifugebuis van 1,5 mL en pellet de bacteriën door centrifugering bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min.
- Zuiver elke vector met behulp van een bacteriële mini-prep kit door het volgen van het protocol van de fabrikant.
- Bepaal de concentratie van elke vector met behulp van een spectrofotometer.
- Bewaar de plasmiden op -20 °C.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
2. Verpakking van de arrayed lentivirale bibliotheek
OPMERKING: Alle werkzaamheden met betrekking tot lentivirus, met inbegrip van verpakking, infectie, en de daaropvolgende kweek van geïnfecteerde cellen moeten strikt voldoen aan de institutionele bioveiligheid regels en voorschriften.
- Breid de 293FT-cellen uit met behulp van volledige groeimedia (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 4 mM L-glutamine, 4.500 mg/L glucose en natriumpyruvaat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine antibioticum en 2 mM L-glutamine).
- Zaad voor elke vector in de bibliotheek vanaf stap 1.4 één 24-put met 1 x 105 293FT-cellen.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat sommige extra putten van een controle virale vector worden verpakt en gebruikt om de titer van het virus te testen voordat u doorgaat naar stap 3 (zie hieronder). - Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
OPMERKING: Een algemeen protocol voor de verpakking van lentivirus dat eerder werd beschreven14 is teruggebracht tot 24 putten voor dit protocol. Het gebruikt psPAX2 voor lentivirale verpakking en VSVG als laageiwit. Als ectropic virus gewenst is, kan een vector die Eco levert worden gebruikt in plaats van VSVG. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat dit protocol is geoptimaliseerd om een virale titer te bereiken die tussen de 30%-70% infectie-efficiëntie van de doelcellen geeft (zie Discussie). Zie Aanvullende tabel 1 voor een lijst met alle gebruikte vectoren. - Stel een transfection mengsel voor elke virale vector uit stap 1.4 zoals hieronder beschreven. Elke transfection moet 250 ng van de virale vector, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 μL transfection reagens 1 en 23,75 μL transfection buffer (zie Tabel van materialen)bevatten.
- Verdun elke lentivirale vector tot 50 ng/μL met nucleasevrij water en breng vervolgens 5 μL (250 ng) over in een put van een 96-put PCR-plaat.
- Maak de transfection super mix door het mengen van 1,25 μL * X van transfection reagens 1 en 23,75 μL * X van voorverwarmde transfection buffer waar "X" is het totale aantal transfections plus enkele extra om rekening te houden met volumeverlies tijdens pipetteren.
- Incubeer de transfection super mix bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Voeg 125 ng * X van psPAX2 en 125 ng * X van VSVG aan de buis van transfection super mix van Stap 2.4.3 en zachtjes pipet op en neer te mengen. Ga snel naar Stap 2.4.5.
- Onmiddellijk aliquot het mengsel uit stap 2.4.4 in elke buis van een PCR strip, en gebruik dan multi-channel pipet om 25 μL het mengsel over te brengen in elke put met virale vector uit stap 2.4.1.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Breng alle 30 μLs van elke 96-put van stap 2.4.6 over in een put van de 24-put met 293 FT cellen uit stap 2.3.
- Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor 24 uur en vervang vervolgens de media in elke put van de 24-putplaat door 500 μL verse volledige groeimedia. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor nog eens 24 uur.
- Met behulp van een multi-channel pipet, verzamel de virale supernatant van elke put en aliquot 220 μL (genoeg voor 1 infectie in stap 3 plus wat extra volume) in twee 96-putten elk. Dit zijn de matrixen virale supernatant platen.
- Bewaar de matrixen virale supernatant platen op -80 °C.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Het wordt ook aanbevolen om een deel van de extra controle virus dat werd verpakt (zie hierboven) op de cellen te worden besmet voordat u doorgaat naar stap 3 te testen. Dit is om ervoor te zorgen dat de titer voldoende is om ten minste 30% infectie efficiëntie te bereiken.
3. Infectie van de cellen voor het scherm
OPMERKING: Menselijke melanoomcellen (A375) werden gebruikt om deze aanpak aan te tonen, maar deze methode kan worden toegepast op alle aanhangende cellen die infecteren met lentivirus. Celkweek en beplatingmoeten echter voor elke cellijn worden geoptimaliseerd (zie Discussie).
- Breid de cellen uit om te worden geïnfecteerd in volledige groeimedia.
- Zaad 24-well platen met 1 x 105 cellen in 0,5 ml volledige groeimedia per put. Zaad een goed voor elke virale vector worden getest (met inbegrip van controles) en omvatten een extra goed dat niet zal worden besmet die zal dienen als een controle voor de selectie van geneesmiddelen in stap 3.7.
- Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Infecteer elk goed uit stap 3.2 met een andere virale supernatant van de bevroren arrayed lentivirale supernatant als volgt.
- Bereid complete groeimedia voor die 20 μg/mL polybreen bevatten.
- Ontdooi de arrayed lentiviral bibliotheek supernatants van Stap 2.7 naar kamertemperatuur.
- Vermeer de groeimedia van de 24-putplaten uit Stap 3.2 en voeg onmiddellijk 200 μL polybreenhoudende groeimedia toe aan elk goed.
- Breng met behulp van een meerkanaals pipet 200 μL virale supernatant van elke 96-put van stap 3.4.2 naar de 24 putten uit stap 3.4.3.
- Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor 24 - 48 uur.
OPMERKING: Sommige cellijnen kunnen langer dan 24 uur nodig hebben om de shRNAs uit te drukken en puromycine resistent te worden. De virale vector die hier wordt gebruikt levert een Turbo-GFP-IRES-puroR met een miR30-gebaseerde shRNA in de 3'UTR van puroR (Figuur 1). Infectie efficiëntie en expressie van de puromycine resistentie gen en de shRNA werden gecontroleerd door groene fluorescerende eiwitten. - Bereid complete groeimedia voor die 2,5 μg/mL puromycine bevatten.
OPMERKING: De selectieconcentratie van puromycine varieert tussen cellijnen. Het wordt aanbevolen dat een antibioticum doden curve worden uitgevoerd voor elke cellijn te worden tested voorafgaand aan het scherm. - Zuig de media van elke put aan en vervang met 500 μL puromycine-bevattende volledige groeimedia.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u ook puromycine toe te voegen aan een controle niet-geïnfecteerde goed dat kan worden gebruikt in de volgende stappen om ervoor te zorgen dat de puromycine selectie is voltooid. - Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
OPMERKING: Het is het beste om te selecteren voor 48 uur, dus beplating dichtheid en virale titer moet worden geoptimaliseerd, zodat de cellen niet overconfluent vóór 48 uur. - Zorg ervoor dat de geïnfecteerde cellen groen zijn onder de fluorescerende microscoop, en dat cellen op een controle niet-geïnfecteerde goed behandeld met puromycine zijn allemaal dood voordat u doorgaat naar stap 4.
4. Zaaien cellen voor transfection van dual-luciferase verslaggever
OPMERKING: Er moet een testtransfection worden uitgevoerd om de optimale zaaidichtheid voor elke nieuwe cellijn te bepalen.
- Trypsinize elk goed uit stap 3.9 en breng ongeveer 1 x 105 cellen in putten op de overeenkomstige positie op de nieuwe 24-well plaat als volgt.
OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor de screening van bibliotheken met honderden shRNAs, dus het is niet haalbaar om elke put van geïnfecteerde cellen te tellen. Daarom werden de onderstaande stappen gebruikt om celnummers in elke put te schatten om ongeveer dezelfde platingdichtheid te garanderen.- Groepeer de putten van stap 3.9 in 3 - 4 groepen zodanig dat alle putten in een groep een vergelijkbare celdichtheid hebben.
- Trypsinize 1 vertegenwoordiger goed van elke groep met 200 μL trypsin-EDTA (1x PBS aangevuld met 0,5 mM EDTA en 0,1% trypsin) voor 5 min bij 37 °C. Neutraliseer vervolgens de trypsine-EDTA door 400 μL puromycine toe te voegen met volledige groeimedia.
- Tel elke vertegenwoordiger goed om het totale celnummer te bepalen en verdun de celsuspensie van elke vertegenwoordiger goed tot 2 x 105 cellen/mL van het gebruik van volledige groeimedia.
- Zaad 0,5 mL (1 x 105 cellen) van elke put van stap 4.1.3 in de overeenkomstige positie op een nieuwe 24-putplaat en incubeer deze nieuwe 24-well plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Gebruik voor elke groep uit stap 4.1.1 het totale celnummer dat in stap 4.1.3 is bepaald om het volume van trypsine-EDTA te berekenen dat aan elke put moet worden toegevoegd, zodat de resulterende celsuspensie 1 x 106 cellen/mL bedraagt.
- Voeg het juiste volume trypsin-EDTA toe aan elke put en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C.
OPMERKING: Voor groter scherm wordt aanbevolen dat de 24-put platen worden trypsinized en opnieuw geplated in groepen in plaats van allemaal tegelijk om de levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen. - Gebruik tijdens de bovenstaande incubatie een multi-channel pipet om 400 μL puromycine-bevattende volledige groeimedia toe te voegen aan de overeenkomstige putten op een nieuwe 24-well plaat.
- Breng 100 μL celsuspensie (ongeveer 1 x 105 cellen) van elke put over naar de overeenkomstige positie op de nieuwe 24-putplaten die in stap 4.1.7 zijn voorbereid.
- Herhaal stap 4.1.6 tot en met 4.1.8 voor alle platen van gegroepeerde putten uit stap 4.1.1, één plaat tegelijk.
- Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
5. Transfection of dual-luciferase reporter
- Transfect elk goed uit Stap 4.2 met de dual-luciferase verslaggever bouwt als volgt.
OPMERKING: De totale hoeveelheid DNA en de optimale verhouding van firefly luciferase reporter vector te controleren Renilla luciferase vector moet worden bepaald voordat u begint met deze test. Hier, 400 ng van een DNA-mengsel dat 20 delen firefly luciferase verslaggever en 1 deel controle Renilla luciferase bevat werd gebruikt.- Maak het transfection verdunningsmengsel (Buis A) en het verdunningsmengsel van de melder (Buis B) door de aangegeven volumes van elk reagens (tabel 1) te mengen vermenigvuldigd met het totale aantal transfections (plus enkele extra).
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor transfection reagens 2 (zie Materiaaltabel). Als een ander transfection reagens wordt gebruikt, moet de transfection vóór deze stap worden geoptimaliseerd. - Meng het transfection verdunningsmengsel (Buis A) met reporter verdunningsmengsel (Buis B) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min om transfetiemengsel te produceren.
- Spoel tijdens de bovenstaande incubatie elke 24-put uit stap 4.2 met 0,25 mL fosfaatbufferzout (PBS) en voeg 447 μL complete groeimedia toe aan elke put.
- Gebruik na de incubatietijd van 15 min een multi-kanaals pipet om 53 μL transfection mix te verdelen over elke put van de 24-put platen.
- Maak het transfection verdunningsmengsel (Buis A) en het verdunningsmengsel van de melder (Buis B) door de aangegeven volumes van elk reagens (tabel 1) te mengen vermenigvuldigd met het totale aantal transfections (plus enkele extra).
- Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
6. Kwantificering van dual-luciferase-activiteiten
- Meet luciferase activiteit met behulp van een plaatlezer en een dual-luciferase reporter assay kit zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de aangegeven reporter assay kit (zie Tabel van materialen)en volgt het aanbevolen protocol van de fabrikant.- Bereid voldoende 1x passieve lysisbuffer voor alle putten plus enkele extra (75 μL is per put nodig) door 5x passieve lysisbuffer (meegeleverd in kit) 1 tot 5 te verdunnen met gedeïoniseerd water. Ook ontdooireagens A en reagens B Buffer (geleverd in kit, 100 μL van elk is nodig voor elke put).
- Aanzuigen de media van elke put van de 24-well plaat van Stap 5.2.
- Voeg 75 μL van 1x passieve lysis buffer aan elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min met af en toe schudden.
- Bereid reagens B door 50x reagens B substraat (geleverd in kit) 1:50 te verdunnen met ontdooide reagens B buffer.
- Voeg 30 μL van 1x passieve lysisbuffer toe aan 4 putten voor blanking (zie Aanvullende tabel 2).
- Breng 30 μL lysaat van stap 6.1.3 over in dubbele putten van een 96-put platte bodem witte testplaat.
- Gebruik een multi-channel pipet om 50 μL reagens A aan elke put toe te voegen en lees het firefly luciferase signaal met een plaatlezer.
- Gebruik een multi-channel pipet om 50 μL reagens B van stap 6.1.4 aan elke put toe te voegen en lees het Renilla luciferase signaal met een plaatlezer.
- Verwerk de ruwe gegevens als volgt (zie Aanvullende tabel 2voor een gedetailleerde beschrijving).
- Neem monsters met een zeer laag Renilla luciferase-signaal uit, omdat lage waarden aangeven dat de virale constructie giftig was of dat er te weinig getransfecteerde cellen werden gestoond.
OPMERKING: Zoals uitgelegd in de discussie, aanzienlijk "lage" Renilla luciferase signaal kan resulteren in afwijkende resultaten. Hier werden putten waarin het Renilla luciferasesignaal meer dan 1 standaarddeviatie onder het gemiddelde was uitgesloten (zie Aanvullende tabel 2). Dit was gebaseerd op eerdere studies uitgevoerd met behulp van dit reporter systeem in deze cellen14,maar kan verschillen in andere cellijnen. - Normaliseer de ruwe vuurvlieg luciferase waarde van elke put aan de ruwe Renilla luciferase waarde van dezelfde put om de firefly /Renilla ratio te verkrijgen.
- Gemiddelde de firefly /Renilla ratio's van alle repliceren controle putten en dan verdelen de firefly /Renilla verhouding van elke andere goed door dat aantal om een vouw verandering te krijgen.
- Wijs het controlemonster toe en stel defirefly/Renilla ratio waarde in op 1.
- Gemiddelde de firefly/Renilla ratio's van de dubbele putten en plot met de standaarddeviatie.
OPMERKING: De standaarddeviatie wordt niet gebruikt voor statistische analyse, maar als een middel om putten te identificeren waar de replicaties aanzienlijk verschillen.
- Neem monsters met een zeer laag Renilla luciferase-signaal uit, omdat lage waarden aangeven dat de virale constructie giftig was of dat er te weinig getransfecteerde cellen werden gestoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze YAP/TAZ-TEAD reporter construct (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) bevat een minimale SV-49 promotor met 5 herhalingen van het canonieke TEAD binding element (MCAT)15 die het firefly luciferase gen aandrijft ( Figuur1). Het wordt samen met de PRL-TK-controlevector (Promega) in cellen omgezet, die Renilla luciferase uitdrukt van de constitutieve actieve HSV TK promotor (Figuur 1). Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de YAP / TAZ-TEAD reporter constructie gedraagt zich zoals verwacht in de cellijn (s) wordt getest. Daarom hebben we eerst co-transfected de PRL-TK en pGL3-5xMCAT (SV)-49 constructies in A375 cellen stabiel uitdrukken van ofwel een controle vector, een zeer actieve LATS-ongevoelige mutant van YAP (YAP2SA), of een mutant van YAP2SA niet in staat om TEADs te binden (YAP2SA, S94A). Zoals verwacht, firefly luciferase activiteit werd aanzienlijk verhoogd door YAP2SA, maar niet de controle vector of de YAP2SA, S94A (Figuur 2A). Dit suggereert dat YAP verhoogt de activiteit van de YAP / TAZ-TEAD verslaggever in een TEAD-afhankelijke manier. Belangrijk is dat YAP2SA de niveaus van de Renilla luciferase niet significant heeft gewijzigd. Als extra controle hebben we ook bevestigd dat de YAP2SA de activiteit van een minimale promotorconstructie die de MCAT TEAD-bindende elementen mist (figuur 2B) niet verandert.
Een tweede controle-experiment werd ook gedaan waarin A375 cellen werden besmet met virale constructies die ofwel een niet-targeting controle shRNA (shNTC) of een constructie met tandem YAP en TAZ shRNAs leveren. Na een stabiele selectie werden de cellen gecoöfecteerd met de PRL-TK constructie en ofwel de YAP / TAZ-TEAD reporter construct of de minimale promotor constructie. In cellen die met de YAP/TAZ-TEAD verslaggeverbouw worden transfected, verminderde YAP/TAZ shRNA beduidend firefly luciferaseniveaus, maar de controle shNTC niet (Figuur 2C). Firefly luciferase niveaus werden niet veranderd door de shNTC of de YAP / TAZ shRNA in cellen transfected met de minimale promotor (Figuur 2C). In overeenstemming met de bovenstaande resultaten, de Renilla signaal in elke put was ook niet significant veranderd door de controle shNTC of de YAP / TAZ shRNA (Figuur 2C), verder aangeeft dat de PRL-TK controle constructie is niet reageert op YAP of TAZ. Gezamenlijk tonen deze experimenten aan dat het reportersysteem zich gedraagt zoals verwacht in A375-cellen, wat overeenkomt met eerdere studies met behulp van deze vectoren2,14.
Als proof of concept experiment hebben we een kleine lentivirale shRNA bibliotheek gescreend in A375 cellen. Onze testbibliotheek bevatte shRNAs gericht op verschillende genen waarvan eerder werd aangetoond dat ze de YAP/TAZ-functie in andere celtypen reguleren. Echter, de rol van een aantal van deze genen in de regulering van YAP en TAZ in melanoom is onbekend. Onze bibliotheek bevatte genen die nodig zijn voor YAP / TAZ activiteit, zoals RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4, en CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,, 30,31,32,33,34,35,36,37,38, en genen voorspeld om YAP / TAZ activiteit remmen, zoals CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR, en RB139,40,41,4242,43,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. Als controles, we opgenomen een tandem YAP / TAZ shRNA14, een niet-targeting controle shRNA (shNTC), en een shRNA gericht src, die we eerder toonden nodig was voor maximale YAP / TAZ activiteit in A375 cellen14.
De ruwe gegevens en analyse voor dit scherm wordt weergegeven in Aanvullende Tabel 2. Verschillende shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 en shMAPK8-2) aanzienlijk verminderd Renilla luciferase signaal ten opzichte van de gemiddelde Renilla signaal voor alle putten, wat suggereert dat deze shRNAs werden veroorzaakt cytotoxiciteit in A375 cellen. Inderdaad deze putten hadden aanzienlijk minder cellen op het moment van de test (niet getoond). Dit maakt het erg moeilijk om kandidaten te onderscheiden die YAP / TAZ kunnen reguleren van degenen die essentieel zijn voor celoverleving. Daarom zijn de resultaten van deze monsters uitgesloten van verdere gegevensanalyse. Zoals verwacht hebben de SHRNA's die zich richten op YAP en TAZ of Src, de YAP/TAZ-TEAD-activiteit aanzienlijk verminderd (figuur 3). In overeenstemming met gepubliceerd werk waaruit blijkt dat PIK3CA yap en TAZ activiteit bevordert21,26,31, vonden we dat shRNAs gericht pik3CA verminderde genormaliseerde firefly luciferase niveaus. shrnAs gericht atm, CDH1, CSK, ERBB2, GSN elk verhoogde genormaliseerde firefly luciferase niveaus, die in overeenstemming is met gepubliceerde studies waaruit blijkt dat deze eiwitten onderdrukken YAP en / of TAZ39,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54 . Ondanks gevestigde rollen voor ATR, CCNE2, en ERBB4 in andere celtypen27,28,35,36,38,49, shRNAs gericht op deze genen niet significant veranderen genormaliseerde firefly luciferase niveaus in A375 cellen. shRNAs gericht op EZH2 en RB1 toonde een effect op firefly luciferase niveaus die het tegenovergestelde was van wat werd verwacht op basis van studies in andere celtypen32,34,40,52. Zowel PTEN als RAF1 waren het doelwit van twee verschillende shRNA's die tegengestelde effecten hadden op luciferaseactiviteit. Resultaten die niet in overeenstemming zijn met eerdere studies kunnen erop wijzen dat de invloed van deze eiwitten op de YAP/TAZ-TEAD-functie celtypeafhankelijk is; echter, het kan ook te wijten zijn aan slechte knockdown efficiëntie of off-target effecten door sommige shRNAs. Als een n = 1 "blind" scherm, een aantal valse positieven en valse negatieven zou ook worden verwacht. Zoals besproken in meer detail in de discussie, extra validatie experimenten zou moeten worden gedaan met behulp van andere tests, zoals qPCR voor genen die worden gereguleerd door YAP en TAZ en westerse vlekken voor post translationele wijzigingen die invloed hebben op YAP / TAZ functie. Deze validatie zou ook bevestigen welke shRNAs effectief neergehaald het eiwit van belang. Het is ook belangrijk op te merken dat, aangezien onze verslaggever is TEAD responsief, alle genen geïdentificeerd door ons scherm kan worden beïnvloeding TEADs, maar niet YAP en TAZ direct. Vervolgmechanistische studies zouden nodig zijn om te bepalen of het YAP en/of TAZ of de TEADs was die het geïdentificeerde eiwit regueert. YAP en TAZ zijn echter de belangrijkste drijfveren van TEAD-gemedieerde transcriptie, dus het is waarschijnlijk dat de meeste van deze genen YAP en TAZ reguleren. Inderdaad, zoals hierboven vermeld, de meeste van de shRNAs die hit in het scherm doel eiwitten waarvan bekend is dat yap en / of TAZ direct te reguleren.
Figuur 1: Schematisch diagram van de werkstroom. De kritieke stappen van dit protocol worden samengevat met stapnummers die overeenkomen met de getallen in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Optimalisatie van het YAP/TAZ-TEAD dual-luciferase transcriptional reporter systeem. (A) A375 cellen die stabiel controlevector (MSCV-IRES-Hygro), LATS-ongevoelige YAP (YAP2SA)of LATS-ongevoelige YAP niet in staat om TEADs binden (YAP2SA, S9 4A) werden gecoöfected met de PRL-TK (Renilla) en pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP / TAZ-TEAD verslaggever) constructies en luciferase signaal werd gemeten 24 uur later. n = 7 onafhankelijke experimenten. (B) A375 cellen werden gecofected met ofwel YAP2SA of controle vector, de PRL-TK constructie, en ofwel de pGL3-5xMCAT (SV)-49 constructie of de pGL3 (SV)-49 constructie (minimale promotor) en luciferase signaal werd gemeten 24 uur later. n = 1 experiment getransfecteerd in viervoud. (C) A375 cellen werden besmet met retrovirus codering van een niet-targeting controle shRNA (shNTC) of tandem YAP en TAZ shRNAs (shYAP / TAZ). Na een stabiele selectie werden de cellen gecoötranseerd met de PRL-TK constructie en ofwel de pGL3-5xMCAT (SV)-49 constructie of de pGL3 (SV)-49 constructie en luciferase signaal werd 24 uur later gemeten. n = 4 onafhankelijke infecties; Statistische significantie werd bepaald aan de hand van eenrichtingsANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Tukey; n.s. = p>0,05, * p<0,05, ** p<0,01, **** p<0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Resultaten van representatief scherm. Het resultaat van elke knock down vector wordt vergeleken met shNTC en gepresenteerd als vouwverschil. De staafgrafiek toont het gemiddelde van firefly luciferase/Renilla luciferase ratio ± standaarddeviatie. n = 1 experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Buis A – Transfection Verdunning | |
| Reagens | Volume |
| Transfection Buffer | 25 μl per reactie |
| Transfection Reagent 2 (voeg tweede toe) | 1,5 μl per reactie |
| Tube B – Reporter Verdunning | |
| Reagens | Volume |
| Transfection Buffer | 25 μl per reactie |
| 20:01 Firefly luciferase reporter: controle Renilla mix (voeg tweede toe) | 400 ng per reactie |
| Transfection Reagent 3 (derde toevoegen) | 1 μl per reactie |
| Totaal: 26,5 μl per reactie | |
Tabel 1: Voorbereiding van de transfection mix. Voor de transfection in elke put van de 24-putplaten wordt 1,5 μL transfection reagens 2 verdund tot 25 μL transfetiebuffer om de transfetieverdunning (buis A) te produceren; terwijl 400 ng van 20:1 firefly luciferase reporter: controle Renilla mix en 1 μL van transfection reagens 3 wordt verdund in 25 μL van Transfection Buffer om de verslaggever verdunning (buis B) te produceren.
| Bestaande/gekochte/cadeauvectoren | |
| Vector | Bron |
| GIPZ menselijke shRNA lentivirale vectoren | GE Healthcare |
| VSVG VSVG | Hynes Lab [2] |
| psPAX2 | Addgene (#12260) |
| gag/pol | Addgene (#14887) |
| pGL3-(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| pGL3-5xMCAT(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| PRL-TK | Promega promega |
| MSCV-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-YAP-S127A, S381A-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 | LAMAR LAB [14] |
| Nieuwe vectoren | |
| Vector | Bron backbone |
| MSCV-YAP-S94A, S127A, S381A-IRES-Hygro | MSCV-IRES-Hygro |
Aanvullende tabel 1: Vectortabel. Alle gebruikte vectoren worden vermeld met nieuwe vectoren beschreven. Standaard moleculaire biologie technieken werden gebruikt om nieuwe vectoren te genereren.
Aanvullende tabel 2: Luciferase test gegevensanalyse. De opstelling van de shRNA bibliotheek wordt getoond in de eerste tabel. De tweede en derde tabellen tonen respectievelijk de ruwe firefly en Renilla luciferase signalen. De gemiddelde en standaarddeviatie voor het Renilla luciferase signaal voor alle putten zijn aangegeven in de gele dozen. Putten met een Renilla luciferase signaal meer dan 1 standaarddeviatie onder het gemiddelde worden gemarkeerd met rode tekst en uitgesloten van verdere analyse. De firefly/Renilla ratio van elke put werd verkregen door het ruwe vuurvlieg luciferase signaal te delen door het ruwe Renilla luciferase signaal (vierde tabel). De firefly/Renilla ratio van elke put werd vervolgens genormaliseerd tot het gemiddelde van firefly/Renilla ratio van de controle (shNTC) putten (vijfde tabel). De dubbele putten werden vervolgens gemiddeld voor elke constructie en de standaarddeviatie werd berekend (zesde tabel). Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie tonen we een aanpak voor medium-throughput screening van arrayed virale bibliotheken in combinatie met een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie reporter test die kan worden gebruikt om te identificeren en testen van nieuwe toezichthouders van transcriptie factoren. Het is van cruciaal belang om het reportersysteem voor elke cellijn voorafgaand aan een scherm te karakteriseren en te optimaliseren. Experimenten moeten worden gedaan om te bevestigen dat de melder reageert op veranderde activiteit van de transcriptiefactor die wordt onderzocht en de omvang van de verandering in activiteit moet worden getest ten opzichte van controlevectoren. Co-transfection van de PRL-TK constructie samen met de verslaggever constructie is belangrijk omdat het helpt de controle voor het aantal cellen transfected met de verslaggever en het kopienummer van de verslaggever constructie, die beide kunnen veranderen de omvang van de luciferase signaal. Optimalisatie-experimenten moeten er ook voor zorgen dat de transcriptiefactor geen invloed heeft op de activiteit van de constitutieve Renilla-constructie of een minimale promotorconstructie, aangezien dit de interpretatie van de resultaten zou kunnen bemoeilijken. Controles die in de bibliotheek moeten worden opgenomen, moeten ook zorgvuldig worden overwogen. Dit protocol is ontworpen voor een "blind screen" van bibliotheken met honderden shRNAs, waar het niet haalbaar is om effectieve knockdown door elke shRNA te bevestigen. Daarom zijn sommige valse positieven en negatieven waarschijnlijk. Het verhogen van het aantal technische en/of biologische replicaties in het scherm kan helpen het aantal false positives en negatives te verminderen. Dit zal echter ook het aantal putten naar cultuur en assay aanzienlijk verhogen, zodat ervoor moet worden gezorgd dat dit niet leidt tot suboptimale cultuuromstandigheden (zie hieronder). Een andere benadering om valse positieven en negatieven te verminderen zou zijn om het hele scherm te herhalen in dezelfde cellijn of extra cellijnen, of om een kleinere bibliotheek met inbegrip van alleen de "hits" met behulp van 3 biologische repliceert scherm. In alle gevallen moeten alle hits worden gevalideerd met behulp van uitlezingen naast de reporter, zoals qPCR voor bekende doelgenen. Effectieve knockdown van het beoogde gen moet ook worden bevestigd in deze validatiestappen. Conclusies mogen niet worden gemaakt over shRNAs die de activiteit niet veranderen, tenzij effectieve knockdown door de shRNA wordt bevestigd. Validatie-experimenten moeten er ook voor zorgen dat de onderzochte transcriptiefactor is wat wordt gereguleerd door het beoogde gen(en) en dat deze genen geen invloed hebben op de Renilla of minimale promotorconstructies.
Het is ook belangrijk om de celkweekomstandigheden voor elke cellijn te optimaliseren om suboptimale omstandigheden zoals over-samenloop, te weinig cellen, slechte cellevensvatbaarheid of variabele proliferative capaciteit te voorkomen. Cel zaaien dichtheid is vooral belangrijk op het moment van de transfection van dual-luciferase reporter constructie (Stap 5) en wanneer de verslaggever activiteit wordt gemeten (Stap 6). Transfection efficiëntie kan aanzienlijk variëren met de celdichtheid en een slechte transfection efficiëntie kan resulteren in afwijkende resultaten als slechts een klein deel van de celpopulatie wordt geassimeerd. De meeste geteste cellijnen tonen de hoogste transfection efficiëntie wanneer bij 40 - 60% samenvloeiing, maar het wordt aanbevolen dat transfection voorwaarden en zaaidichtheid zijn geoptimaliseerd voor een bepaalde cellijn met behulp van een vector die een fluorescerend eiwit levert. Cellijnen die moeilijk te infecteren en/of transfect zijn, zoals primaire cellen, zijn mogelijk niet geschikt voor dit scherm. Slechte reporter transfection efficiëntie of slechte levensvatbaarheid van de cel meestal resulteren in een zeer lage Renilla luciferase signaal. Er moet echter een proefexperiment worden uitgevoerd om het bereik van renilla luciferase-signaal voor een cellijn te bepalen. Het is belangrijk dat de titer van het virus geproduceerd uit de arrayed bibliotheek is hoog genoeg om een infectie efficiëntie van ten minste 30% in de cellijn wordt assayed geven. Infectie efficiëntie kan sterk variëren en verschillende factoren kunnen beïnvloeden virale titer. De hoeveelheid virale supernatant die wordt gebruikt, moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn en indien nodig kan stap 2 verder worden geoptimaliseerd om virale titers te verbeteren.
Celdichtheid en cellevensvatbaarheid kunnen ook de activiteit beïnvloeden van cellulaire trajecten die transcriptiefactoren reguleren, dus het is van cruciaal belang om de cellen voor de reporter-transfection te zaaien, zodat ze allemaal op een vergelijkbare dichtheid zijn op de dag dat de dual-luciferase test wordt gelezen (stap 6). Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig hechten over de put in plaats van clustering in een dichte patch in het centrum. Zoals hierboven beschreven, kan een aanzienlijke variatie in het Renilla luciferase signaal van goed tot goed resulteren in gegevens die moeilijk te interpreteren zijn. Het is het beste om putten die een aanzienlijke vermindering van Renilla luciferase signaal in vergelijking met alle andere putten uit te sluiten als dit suggereert dat ofwel de virale vector is het verminderen van de levensvatbaarheid van de cel of de transfection efficiëntie voor die put was zeer laag. Hier hebben we putten uitgesloten die groter zijn dan 1 standaardafwijking van het gemiddelde Renilla luciferase-signaal, maar optimalisatie-experimenten moeten worden gedaan om de juiste cutoffs voor elke cellijn te bepalen. Het is ook mogelijk dat shRNAs die de levensvatbaarheid van cellen verminderen dit zouden kunnen doen door de activiteit van de transcriptiefactor te wijzigen die wordt genoemd. Als dit een punt van zorg is, kunnen shRNAs die renilla luciferase-signaal verminderen opnieuw worden getest met behulp van ducible shRNAs of andere tests. Het is ook van cruciaal belang om de hoeveelheid tijd die aanhangende cellen zijn in suspensie na trypsinisatie te beperken. Gebruik een multi-channel pipet voor de meeste stappen tijdens het trypsiniseren en zaaien van cellen, en voor grotere schermen, werken met de platen in batches. Bovendien is het het beste om de tijd tussen de infectie van de cellen en de verslaggever test te beperken. Dit is vooral belangrijk als de transcriptiefactor die wordt geasssayeerd de celproliferatie of overleving reguleert. In dit geval zouden cellen met effectieve knockdown worden overconcurreerd door cellen met minder efficiënte knockdown.
Verschillende wijzigingen van het beschreven protocol zijn haalbaar. Deze aanpak kan effectief worden gebruikt om toezichthouders van een transcriptie factor te identificeren als een luciferase-gebaseerde verslaggever wordt gegenereerd, en voor veel van de meest voorkomende transcriptie factoren reporter constructies al bestaan. Dit protocol kan worden aangepast voor het gebruik van een breed scala aan commercieel beschikbare of handmatig geassembleerde bibliotheken, waaronder RNAi, CRISPR/CAS9, ORF of cDNA. Inderdaad, we eerder gebruikt een soortgelijke strategie om een kleine cDNA bibliotheek te testen voor YAP / TAZ toezichthouders14. Bibliotheken kunnen worden geleverd met behulp van retrovirus, lentivirus, adenovirus, of voorbijgaande transfection. Het virale vachteiwit dat hier wordt gebruikt (VSVG) genereert lentivirus dat mensbesmettelijk is. Als knaagdiercellen worden gebruikt en niet-menselijk besmettelijk ecotropic virus gewenst is, kan een vector die het Eco-laageiwit levert worden gebruikt in plaats van VSVG.
Andere methoden kunnen worden gebruikt om bibliotheken te screenen voor regelgevers van een transcriptiefactor. Toegang tot een screeningfaciliteit met hoge doorvoer zou het mogelijk maken om veel grotere bibliotheken op geautomatiseerde wijze te screenen. Ook genoombrede schermen kunnen worden gedaan met behulp van gepoolde bibliotheken met diepe volgorde als een middel om de "hits" te identificeren. Beide benaderingen vereisen echter apparatuur die niet toegankelijk is voor veel onderzoekers, en de kosten voor screening met hoge doorvoer of diepe sequencing kunnen onbetaalbaar hoog zijn. Bovendien, gepoolde schermen zou vereisen sorteren van cellen met behulp van een fluorescerende reporter of een andere manier om de cellen die de gewenste veranderingen in transcriptie activiteit tonen verrijken. Screening van grote arrayed expressie bibliotheken met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie reporter test is eerder aangetoond met behulp van een benchtop robot55, maar dit is niet algemeen beschikbaar voor alle onderzoekers. In tegenstelling, de hier beschreven methode is snel, medium-doorvoer, relatief goedkoop, en maakt gebruik van apparatuur en reagentia die waarschijnlijk toegankelijk zijn voor de meeste onderzoekers. Deze methode kan onthullen meerdere regelgevers in een enkel experiment, dat is een kosteneffectieve en handige manier om potentiële regelgevende trajecten stroomopwaarts van een transcriptie factor te ontdekken.
In de beschreven benadering werden kandidaat-genen stabiel neergehaald en na selectie werden de verslaggeversconstructies tijdelijk in de cellen getransfecteerd. Echter, transfection efficiëntie is slecht in veel cellijnen en kan variabiliteit introduceren en cellulaire toxiciteit veroorzaken. Een verbeterde alternatieve benadering zou zijn om de reporter constructie stabiel te integreren in het genoom van de cellijn van belang en vervolgens infecteren de verslaggever-uitdrukkende cellen met de virale bibliotheken voor screening. Deze verbetering zou de variabiliteit die door de voorbijgaande transfection wordt geïntroduceerd en eventuele veranderingen in de activiteit van de transcriptiefactor als gevolg van langdurige post-infectiecultuur voorkomen. Zoals hierboven vermeld, zou het gebruik van een kleine benchtop robot sterk stroomlijnen van het proces en verhoging van de grootte van de bibliotheken die kunnen worden gescreend. Een andere belangrijke wijziging is het gebruik van arrayed inducible vector bibliotheken, die de kans op selectie tegen cellen met meer effectieve knockdown zou verminderen en variabiliteit veroorzaakt door veranderingen in de levensvatbaarheid van de cel te verminderen.
Een belangrijke uitdaging die voorkomt dat de effectieve behandeling van veel vormen van kanker is dat tumorcellen verwerven weerstand tegen zelfs de meest effectieve gerichte therapieën. De identificatie van eiwitten die nodig zijn voor deze therapeutische resistentie is noodzakelijk om de uitkomst van de patiënt te verbeteren. De beschreven aanpak kan gemakkelijk worden gebruikt in combinatie met gerichte therapieën om genen te onthullen die verhoogde gevoeligheid of weerstand tegen deze verbindingen veroorzaken. Een andere potentiële toekomstige toepassing van deze aanpak zou zijn om deze arrayed screening te gebruiken om kandidaat therapeutische doelen te testen in combinatie. Hiervoor zouden cellen worden geïnfecteerd met twee virale vectoren elk met het doel van het identificeren van eiwitten die een synergetisch effect hebben op transcriptie factor activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Emily Norton en Mikaelan Cucciarre-Stuligross bedanken voor hun hulp bij de voorbereiding van shRNA-vectoren. Dit werk werd mede ondersteund door een Susan G. Komen Career Catalyst Grant die werd toegekend aan J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
