Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحديد منظمي عوامل النسخ باستخدام فحص متوسط الإنتاجية للمكتبات المصصفوفة ومراسل ثنائي لوسيفراز القائم

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Summary

لتحديد المنظمين الرواية من عوامل النسخ، وضعنا نهجا لفحص صفيفlentiviral أو retroviral المكتبات RNAI باستخدام النسخ المزدوج القائم على luciferase. هذا النهج يوفر طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لفحص مئات المرشحين في تجربة واحدة.

Abstract

يمكن لعوامل النسخ تغيير التعبير عن العديد من الجينات المستهدفة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من العمليات المصب مما يجعلها أهدافا جيدة للعلاجات المضادة للسرطان. ومع ذلك، استهداف عوامل النسخ مباشرة غالباً ما يكون صعباً ويمكن أن يسبب آثار جانبية سلبية إذا كان عامل النسخ ضروري في واحد أو أكثر من أنسجة البالغين. تحديد المنظمين المنبع التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ في الخلايا السرطانية يقدم بديلا أكثر جدوى، لا سيما إذا كانت هذه البروتينات سهلة للدواء. هنا ، نحن نصف بروتوكول يمكن استخدامه للجمع بين المكتبات المتوسطة النطاق على نطاق واسع والمكتبات ذات النسخة المزدوجة اللوسيفاز القائمة على القول لتحديد المنظمين الرواية لعوامل النسخ في الخلايا السرطانية. يقدم نهجنا طريقة سريعة وسهلة وغير مكلفة لاختبار مئات الجينات في تجربة واحدة. لإثبات استخدام هذا النهج، قمنا بإجراء شاشة مكتبة RNAI مصفّى تحتوي على العديد من المنظمين للبروتين المرتبط بنعم (YAP) والنسخ المشارك المنشط مع عزر PDZ-ملزمة (TAZ)، واثنين من المنشطات المشتركة النسخ التي هي تأثيرات المصب لمسار فرس النهر. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا النهج لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا أو العامل المشارك ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص CRISPR/CAS9، cDNA، أو مكتبات ORF.

Introduction

والغرض من هذا القول هو استخدام المكتبات الفيروسية لتحديد المنظمين لعوامل النسخ بطريقة سريعة نسبيا وغير مكلفة. ويرتبط النشاط النسخ الشاذ مع السرطان والانبثاث1،2،3،4،5،6، لذلك استهداف عوامل النسخ في الخلايا السرطانية هو نهج علاجي واعد. ومع ذلك، غالباً ما تكون عوامل النسخ صعبة لاستهداف الأدوية7 وكثير مطلوبة لوظيفة الخلوية العادية في أنسجة الكبار8,9,10. استهداف المسارات المرتبطة بالسرطان التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ لدفع المرض هو نهج أكثر جدوى مع احتمال أن يكون لها آثار جانبية أقل حدة. يتيح التوافر التجاري لـ RNAi أو CRISPR/CAS9 أو cDNA أو مكتبات ORF للباحثين اختبار أهمية العديد من الجينات في تجربة واحدة. ومع ذلك، يلزم قراءة موثوقة لنشاط النسخ المتغير.

هنا، نحن نصف استخدام فحص مراسل النسخ القائم على اللوسيفراز المزدوج والمكتبات المصصفوفة للصفات للبروتينات التي تنظم عوامل النسخ في الخلايا السرطانية. في هذا القول، يتم تسليم shRNAs التي تستهدف الجينات المرتبطة بالسرطان إلى الخلايا السرطانية الثديية عن طريق نقل الفيروس lentiviral ويتم اختيار الخلايا للتكامل المستقر باستخدام البورومايسين. يتم نقل الخلايا بعد ذلك مع بناء مراسل الذي يعبر عن اليراعات luciferase يقودها مروج محددة لعامل النسخ التي يجري التحقيق فيها وبناء التحكم الذي يعبر عن رينيلا luciferase من المروج نشطة بشكل تأسيسي التي لا تستجيب لعامل النسخ يجري التحقيق. نحن نبرهن على هذا النهج مع شاشة إثبات المفهوم للمنظمين من YAP و TAZ ، والآثار الحاسمة المصب لمسار فرس النهر8،10،11. نشاط غير طبيعي من YAP وTAZ يعزز عدة خطوات من سلسلة منالمنق11 ويلاحظ في العديد من أنواع السرطان11,12,13. ومع ذلك، كيف YAP وTAZ تصبح تنشيط بشكل خاطئ في بعض الخلايا السرطانية لم يفهم تماما بعد. YAP وTAZ لا تربط الحمض النووي، ولكن بدلا من ذلك يتم تجنيدهم إلى المروجين من قبل عوامل النسخ الأخرى. أعضاء عائلة مجال الشاي (TEAD) من عوامل النسخ هي الشركاء ملزمة الرئيسية لYAP وTAZ، وحاسمة بالنسبة لمعظم YAP وTAZ تعتمد على الوظائف. لدينا بناء مراسل يعبر عن luciferase اليراعات من YAP / TAZ-TEAD استجابة المروج والدراسات السابقة أظهرت أنه يكشف بأمانة التغيرات في YAP-TEAD وTAZ-TEAD نشاط النسخ2،14،15.

نهجنا سريع ومتوسط الإنتاجية، ولا يتطلب مرافق فحص، روبوتات آلية، أو تسلسل عميق للمكتبات المجمعة. التكاليف منخفضة نسبيا وهناك العديد من المكتبات المتاحة تجاريا للاختيار من بينها. كما أن المعدات والكواشف المطلوبة قياسية نسبيا في معظم المختبرات. ويمكن استخدامه لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا إذا كان المراسل القائم على luciferase موجود أو تم إنشاؤه. نحن نستخدم هذا النهج لفحص shRNAs في الخلايا السرطانية، ولكن أي خط الخلية التي يمكن أن تكون مصابة بكفاءة معقولة يمكن استخدامها مع أي نوع من مكتبة صفيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم عرض ملخص تخطيطي لهذا البروتوكول في الشكل 1.

1. إعداد مكتبة ناقلات العدول Lentiviral

ملاحظة: استخدمت الشاشة المثبتة مكتبة shRNA مصفوفة تم شراؤها كمخزونات الجلسرين في لوحات 96 بئر، ولكن يمكن أيضا أن يتم تجميع المكتبات يدويا استنادا إلى قائمة المرشحين. وينبغي النظر في الضوابط المناسبة وإدراجها في أي مكتبة. ويشمل ذلك عنصر تحكم غير مستهدف shRNA (shNTC)، وshRNA التحكم التي تستهدف عامل النسخ قيد التحقيق، وإذا كان ذلك ممكنا، shRNA تستهدف لوسيفيراز اليراعات.

  1. إضافة 1.3 مل من لوريا مرق (LB) (1٪ bacto-trypton، 0.5٪ استخراج الخميرة، 1٪ NaCl، درجة الحموضة 7.5) التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسيلين إلى كل بئر من 96 بئر عميق جيدا. Inoculate كل جيدا مع 2 ميكرولتر من مخزون الجلسرين وتنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع التحريض المستمر في 225 دورة في الدقيقة.
  2. نقل كل ثقافة بكتيرية إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 مل وبيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 21،000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. تنقية كل ناقلات باستخدام مجموعة الإعدادية المصغرة البكتيرية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  4. تحديد تركيز كل متجه باستخدام مطياف.
  5. تخزين البلازميدات في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.

2. التعبئة والتغليف من مكتبة lentiviral صفيف

ملاحظة: يجب أن تتبع جميع الأعمال التي تنطوي على فيروس الرضّح، بما في ذلك التعبئة والتغليف والعدوى وزراعة الخلايا المصابة اللاحقة بدقة قواعد وأنظمة السلامة البيولوجية المؤسسية.

  1. توسيع خلايا 293FT باستخدام وسائل النمو الكامل (جلبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على 4 mM L-الجلوتامين, 4,500 ملغ/ لتر الجلوكوز وبيروفات الصوديوم, تستكمل مع 10% مصل البقر الجنيني (FBS), 100 وحدة/ مل من البنسلين, 100 ميكروغرام / مل المضادات الحيوية العقدية العقدية و 2 mM L-الجلوتامين).
  2. لكل متجه في المكتبة من الخطوة 1.4، البذور واحد 24-جيدا مع 1 × 105 293FT الخلايا.
    ملاحظة: من المستحسن أن يتم حزم بعض الآبار الإضافية لناقل فيروسي مضاد واستخدامها لاختبار جهاز ضبط الفيروس قبل الشروع في الخطوة 3 (انظر أدناه).
  3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تم تحجيم بروتوكول عام للتغليف lentivirus التي تم وصفهاسابقاً 14 إلى 24 بئراً لهذا البروتوكول. ويستخدم psPAX2 للتغليف lentiviral وVSVG كبروتين معطف. إذا كان هناك رغبة في الإصابة بالفيروسات، يمكن استخدام ناقل يقوم بتسليم Eco بدلاً من VSVG. من المستحسن أن يتم تحسين هذا البروتوكول لتحقيق titer الفيروسية التي تعطي ما بين 30٪ -70٪ كفاءة العدوى من الخلايا المستهدفة (انظر المناقشة). راجع الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة بجميع المتجهات المستخدمة.
  4. قم بإعداد خليط التطفل لكل متجه فيروسي من الخطوة 1.4 كما هو موضح أدناه. وينبغي أن يحتوي كل نقل ة على 250 نانوغرام من الناقل الفيروسي، و 125 نانوغرام من psPAX2، و 125 نانوغرام من VSVG، و 1.25 ميكرولتر من كاشف الحلويات 1، و 23.75 ميكرولتر من عازل التقالات (انظر جدول المواد).
    1. تمييع كل متجه للصفص إلى 50 نانوغرام/ميكرولتر مع مياه خالية من النوكليس، ثم نقل 5 ميكرولتر (250 نانوغرام) إلى بئر من صفيحة PCR 96 بئر.
    2. جعل مزيج الحلويات السوبر عن طريق خلط 1.25 μL * X من الكاشف التدخيل 1 و 23.75 μL * X من المخزن المؤقت التقالي الدافئة مسبقا حيث "X" هو العدد الإجمالي للالحلويات بالإضافة إلى عدة إضافية لحساب فقدان الحجم أثناء الأنابيب.
    3. احتضان مزيج سوبر الحلويات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة.
    4. إضافة 125 نانوغرام * X من psPAX2 و 125 نانوغرام * X من VSVG إلى أنبوب مزيج سوبر الترانزمن الخطوة 2.4.3 وبلطف pipet صعودا وهبوطا لخلط. انتقل بسرعة إلى الخطوة 2.4.5.
    5. على الفور aliquotquots الخليط من الخطوة 2.4.4 في كل أنبوب من شريط PCR، ومن ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 25 ميكرولتر الخليط إلى كل بئر يحتوي على ناقلات الفيروسية من الخطوة 2.4.1.
    6. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    7. نقل جميع 30 μLs من كل 96-well من الخطوة 2.4.6 إلى بئر من 24 بئر تحتوي على 293 خلايا FT من الخطوة 2.3.
  5. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة ومن ثم استبدال وسائل الإعلام في كل بئر من لوحة 24 بئر مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام النمو الكامل الطازجة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة أخرى.
  6. باستخدام ماصة متعددة القنوات، وجمع supernatant الفيروسية من كل بئر وaliquot 220 μL (ما يكفي لعدوى 1 في الخطوة 3 بالإضافة إلى بعض حجم إضافي) في اثنين من 96 بئر لكل منهما. هذه هي لوحات سوبرناتان الفيروسية المصطمة.
  7. تخزين لوحات سوبرناتان الفيروسية في صفى في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. ومن المستحسن أيضا لاختبار بعض فيروس التحكم الإضافي الذي تم تعبئته (انظر أعلاه) على الخلايا التي سيتم إصابتها قبل الانتقال إلى الخطوة 3. هذا هو لضمان أن titer كافية لتحقيق ما لا يقل عن 30٪ كفاءة العدوى.

3. عدوى الخلايا للشاشة

ملاحظة: تم استخدام خلايا الورم الميلانيني البشري (A375) لإظهار هذا النهج، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي خلايا ملتصقة تصيب بفيروس lentivirus. ومع ذلك، يجب تحسين ثقافة الخلية وظروف الطلاء لكل سطر خلية (انظر المناقشة).

  1. توسيع الخلايا ليتم إصابة في وسائل الإعلام النمو الكامل.
  2. البذور لوحات 24 بئر مع 1 × 105 خلايا في 0.5 مل من وسائل الإعلام النمو الكامل لكل بئر. البذور بئر واحد لكل ناقل الفيروسية ليتم اختبارها (بما في ذلك الضوابط) وتشمل بئر إضافية لن تكون مصابة والتي ستكون بمثابة السيطرة على اختيار المخدرات في الخطوة 3.7.
  3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  4. تصيب كل بئر من الخطوة 3.2 مع [سوبرانت سّيّنست' مختلفة من المجمدة صفيفة [لينفيس سوبرانت كبّت كب].
    1. إعداد وسائل الإعلام النمو الكامل الذي يحتوي على 20 ميكروغرام / مل بوليبرين.
    2. إذاث واثب ة المنتثات الخارقة للمكتبة المصفّرة من الخطوة 2.7 إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. ينسخ وسائط النمو من لوحات 24 بئر من الخطوة 3.2 وأضيف على الفور 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام النمو المحتوية على البوليبرين إلى كل بئر.
    4. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بنقل 200 ميكرولتر من الفوقات الفيروسية من كل 96 بئراً من الخطوة 3.4.2 إلى الآبار الـ 24 من الخطوة 3.4.3.
  5. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 - 48 ساعة.
    ملاحظة: قد تتطلب بعض خطوط الخلايا أطول من 24 ساعة للتعبير عن shRNAs وتصبح مقاومة البوروميسين. ناقل الفيروسية المستخدمة هنا يسلم توربو-GFP-IRES-puroR مع shRNA مقرها miR30 في 3'UTR من puroR(الشكل 1). تم رصد كفاءة العدوى والتعبير عن جين مقاومة البوروماشين وshRNA بواسطة بروتين الفلورسنت الأخضر.
  6. إعداد وسائل الإعلام النمو الكامل الذي يحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل puromycin.
    ملاحظة: يختلف تركيز اختيار البوروماليسين بين خطوط الخلايا. من المستحسن أن يتم إجراء منحنى قتل مضاد حيوي لكل خط خلية ليتم اساينه قبل الشاشة.
  7. ينسخ وسائل الإعلام من كل بئر ويستبدل بـ 500 ميكرولتر من وسائط النمو الكامل المحتوية على البوروميسين.
    ملاحظة: تأكد أيضًا من إضافة البورومايسين إلى بئر غير مصاب بعنصر التحكم يمكن استخدامه في الخطوات اللاحقة لضمان اكتمال تحديد puromycin.
  8. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: من الأفضل تحديد لمدة 48 ساعة، لذلك يجب تحسين كثافة الطلاء وtiter الفيروسيبحيث الخلايا ليست مفرطة قبل 48 ساعة.
  9. تأكد من أن الخلايا المصابة خضراء تحت المجهر الفلوري ، وأن الخلايا على عنصر التحكم غير المصاب ة التي تعامل بشكل جيد مع puromycin كلها ميتة قبل الانتقال إلى الخطوة 4.

4. البذر خلايا لالتَلَثِم ِ مِنَ مراسلِ اللوسيفراز المزدوج

ملاحظة: يجب إجراء فحص اختبار لتحديد كثافة البذر المثلى لكل خط خلية جديد.

  1. Trypsinize كل بئر من الخطوة 3.9 ونقل ما يقرب من 1 × 105 خلايا في الآبار في الموقف المقابل على لوحة جديدة 24- جيدا على النحو التالي.
    ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لفحص المكتبات مع مئات من shRNAs بحيث لا يكون من الممكن لحساب كل بئر من الخلايا المصابة. لذلك، تم استخدام الخطوات أدناه لتقدير أرقام الخلايا في كل بئر للمساعدة في ضمان كثافة الطلاء متساوية تقريبا.
    1. تجميع الآبار من الخطوة 3.9 إلى 3 - 4 مجموعات من هذا القبيل أن جميع الآبار في مجموعة لديها كثافة خلية مماثلة.
    2. Trypsinize 1 ممثل جيد من كل مجموعة مع 200 ميكرولتر من التربسين-EDTA (1x PBS تستكمل مع 0.5 mM EDTA و 0.1٪ التربسين) لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم تحييد التربسين-EDTA بإضافة 400 ميكرولتر من puromycin التي تحتوي على وسائل الإعلام النمو الكامل.
    3. عد كل ممثل بشكل جيد لتحديد إجمالي عدد الخلية وتمييع تعليق الخلية من كل ممثل بشكل جيد إلى 2 × 105 خلايا / مل من استخدام وسائط النمو الكامل.
    4. البذور 0.5 مل (1 × 105 خلايا) من كل بئر من الخطوة 4.1.3 في الموقف المقابل على لوحة جديدة 24 بئر واحتضان هذا لوحة جديدة 24 بئر في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ل 24 ساعة.
    5. لكل مجموعة من الخطوة 4.1.1، استخدم إجمالي رقم الخلية المحدد في الخطوة 4.1.3 لحساب حجم التربسين-EDTA لإضافته ايضًا إلى كل بئر بحيث يكون تعليق الخلية الناتج 1 × 106 خلايا /مل.
    6. إضافة الحجم المناسب من التربسين-EDTA إلى كل بئر واحتضان لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: للشاشة الكبيرة فمن المستحسن أن لوحات 24 بئر يكون trypsinized وreplated في مجموعات بدلاً من كل مرة لضمان بقاء الخلايا.
    7. خلال فترة الحضانة المذكورة أعلاه، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 400 ميكرولتر من وسائط النمو الكامل المحتوية على البوروميسين إلى الآبار المقابلة على لوحة جديدة ذات 24 بئراً.
    8. نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (حوالي 1 × 105 خلايا) من كل بئر إلى الموقف المقابل على لوحات جديدة 24 بئر اُعدت في الخطوة 4.1.7.
    9. كرر الخطوات من 4.1.6 إلى 4.1.8 لجميع لوحات الآبار المجمعة من الخطوة 4.1.1، لوحة واحدة في كل مرة.
  2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.

5. التَغَيّف من مراسل ة مزدوجة اللوسيفراز

  1. الترانزستور كل جيدا من الخطوة 4.2 مع يبني مراسل المزدوج لوسيفراز على النحو التالي.
    ملاحظة: يجب تحديد الكمية الإجمالية للحمض النووي والنسبة المثلى لناقل مراسل اليراعات للسيطرة على متجه رينيلا لوسيراز قبل بدء هذا القول. هنا، 400 نانوغرام من خليط الحمض النووي الذي يحتوي على 20 أجزاء اليراعات لوسيفيراز مراسل و1 جزء التحكم رينيلا لوسيراز تم استخدامها.
    1. جعل خليط تخفيف التطفل (أنبوب A) وخليط تخفيف المراسل (أنبوب B) عن طريق خلط الأحجام المشار لها من كل كاشف(الجدول 1)مضروبة في العدد الإجمالي للالحلويات (بالإضافة إلى عدة إضافية).
      ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لكاشف الحلويات 2 (انظر جدول المواد). إذا تم استخدام التبرز مختلفة، يجب تحسين التطفل قبل هذه الخطوة.
    2. اخلطي خليط تخفيف التطفل (الأنبوب A) مع خليط تخفيف المراسل (الأنبوب ب) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإنتاج خليط الحلويات.
    3. خلال الحضانة المذكورة أعلاه، شطف كل 24 بئرا من الخطوة 4.2 مع 0.25 مل من ملالا العازلة الفوسفات (PBS)، وإضافة 447 μL من وسائل الإعلام النمو الكامل إلى كل بئر.
    4. بعد الحضانة 15 دقيقة، استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 53 ميكرولتر من مزيج الحلويات على كل بئر من لوحات 24 بئر.
  2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.

6- القياس الكمي لنشاط اللوسيفراز المزدوج

  1. قياس نشاط luciferase باستخدام قارئ لوحة ومزدوجة luciferase مراسل قياس عدة كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لمجموعة المراسلين المشار لها (انظر جدول المواد)ويتبع البروتوكول الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
    1. إعداد ما يكفي من 1x التحلل السلبي المخزن المؤقت لجميع الآبار بالإضافة إلى عدة إضافية (هناك حاجة إلى 75 μL لكل بئر) عن طريق تخفيف 5x التحلل السلبي المخزن المؤقت (المقدمة في عدة) 1 إلى 5 مع المياه المنقبدة. أيضا ذوبان كاشف A والكاشف B المخزن المؤقت (المقدمة في عدة، وهناك حاجة إلى 100 ميكرولتر من كل لكل بئر).
    2. يستنشق وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة 24 بئر من الخطوة 5.2.
    3. إضافة 75 ميكرولتر من 1x الانزل السلبي المخزن المؤقت لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز أحيانا.
    4. إعداد كاشف B عن طريق تخفيف 50x الركيزة الكاشف B (المقدمة في عدة) 1:50 مع الكاشف المذاب B المخزن المؤقت.
    5. إضافة 30 ميكرولتر من 1x الغسل السلبي المخزن المؤقت إلى 4 آبار للتفريغ (انظر الجدول التكميلي 2).
    6. نقل 30 ميكرولتر من الليسات من الخطوة 6.1.3 إلى آبار مكررة من لوحة تقسيم بيضاء مسطحة مسطحة 96 بئرا.
    7. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من كاشف A إلى كل بئر وقراءة إشارة لوسيفراز اليراعات مع قارئ لوحة.
    8. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من كاشف B من الخطوة 6.1.4 إلى كل بئر وقراءة إشارة رينيلا لوسيفراز مع قارئ لوحة.
  2. معالجة البيانات الخام على النحو التالي (للحصول على وصف مفصل، انظر الجدول التكميلي 2).
    1. استبعاد العينات مع إشارة منخفضة جدا رينيلا لوسيراز كما تشير القيم المنخفضة إلى أن بناء الفيروسية كانت سامة أو أن عدد قليل جدا من الخلايا المنقولة تم assayed.
      ملاحظة: كما هو موضح في المناقشة، يمكن أن تؤدي إشارة رينيلا لوسيراز "المنخفضة" بشكل ملحوظ إلى نتائج شاذة. هنا ، تم استبعاد الآبار التي كانت إشارة Renilla luciferase أكثر من 1 انحراف معياري تحت المتوسط (انظر الجدول التكميلي 2). وقد استند هذا إلى دراسات سابقة أجريت باستخدام هذا النظام الصحفي في هذه الخلايا14، ولكن قد تختلف في خطوط الخلايا الأخرى.
    2. تطبيع قيمة اليراعات الخام luciferase من كل بئر إلى قيمة رينيلا لوسيراز الخام من نفس البئر للحصول على نسبة اليراعات /رينيلا.
    3. متوسط نسب اليراعات /رينيلا من جميع الآبار السيطرة تكرار ومن ثم تقسيم نسبة اليراعات /رينيلا من كل بئر أخرى من قبل هذا العدد للحصول على تغيير أضعاف.
    4. تعيين عينة التحكم وتعيين قيمة نسبة اليراعات /رينيلا إلى 1.
    5. متوسط نسب اليراعات /رينيلا من الآبار المكررة ومؤامرة مع الانحراف المعياري.
      ملاحظة: لا يتم استخدام الانحراف المعياري للتحليل الإحصائي، ولكن بدلاً من ذلك كوسيلة لتحديد الآبار حيث تختلف النسخ المتماثلة بشكل كبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدينا YAP / TAZ-TEAD مراسل بناء (pGL3-5xMCAT (SV)-4922,14,,15)يحتوي على الحد الأدنى SV-49 المروج مع 5 يكرر من عنصر الربط TEAD الكنسي (MCAT)15 يقود اليراعات الزمرة الجين(الشكل 1). يتم نقلها إلى خلايا جنبا إلى جنب مع ناقل مكافحة PRL-TK (Promega)، الذي يعبر عن رينيلا لوسيفيراز من مروج المعارف التقليدية HSV النشط بشكل تأسيسي(الشكل 1). من الأهمية بمكان التأكد من أن بناء مراسل YAP/TAZ-TEAD يتصرف كما هو متوقع في خط الخلية (خطوط) التي يتم اختبارها. لذلك ، نحن أول من شارك في نقل PRL - TK و pGL3 - 5xMCAT (SV) - 49 يبني في خلايا A375 تعبر بشكل ثابت إما عن ناقل التحكم ، متحولة نشطة للغاية من YAP (YAP2SA)، أو متحولة من YAP2SA غير قادر على ربط TEADs (YAP2SA ، S94A). كما هو متوقع ، تم زيادة نشاط luciferase اليراعات بشكل كبير من قبل YAP2SA، ولكن ليس متجه المكافحة أو YAP2SA ، S94A (الشكل 2A). وهذا يشير إلى أن YAP يزيد من نشاط مراسل YAP/TAZ-TEAD بطريقة تعتمد على TEAD. الأهم من ذلك، لم YAP2SA تغيير كبير في مستويات لوسيراز رينيلا. كتحكم إضافي ، أكدنا أيضًا أن YAP2SA لا يغير نشاط بناء المروج الأدنى الذي يفتقر إلى عناصر ربط MCAT TEAD(الشكل 2B).

كما أجريت تجربة تحكم ثانية أصيبت فيها خلايا A375 ببنيات فيروسية توفر إما عنصر تحكم غير مستهدف (shNTC) أو بناء مع YAP و TAZ shRNAs. وبعد الاختيار المستقر، شُرِّطت الخلايا بالبناء المشترك بين المعارف التقليدية وإما بناء مراسل YAP/TAZ-TEAD أو الحد الأدنى من بناء المروج. في الخلايا التي تنتقل إلى منشئ مراسل YAP/TAZ-TEAD ، خفضت SRNA / TAZ shRNA مستويات السبخات الخالية من الحرائق بشكل كبير ، ولكن التحكم في shNTC لم يفعل(الشكل 2C). لم يتم تغيير مستويات اليراعات luciferase إما من قبل shNTC أو شرنا YAP / TAZ في الخلايا القابلة للإصابة بالحد الأدنى من المروج(الشكل 2C). بما يتفق مع النتائج المذكورة أعلاه ، لم يتم تغيير إشارة Renilla في كل بئر أيضًا بشكل كبير من قبل shNTC أو YAP / TAZ shRNA(الشكل 2C)، مما يشير إلى أن بناء التحكم PRL-TK لا يستجيب لـ YAP أو TAZ. مجتمعة، تظهر هذه التجارب أن نظام المراسل يتصرف كما هو متوقع في خلايا A375، وهو ما يتفق مع الدراسات السابقة باستخدام هذه المتجهات2،14.

وكدليل على تجربة المفهوم، قمنا بفحص مكتبة صغيرة لرنا في مجال الرضائية في خلايا A375. تحتوي مكتبة الاختبار الخاصة بنا على shRNAs التي تستهدف العديد من الجينات التي تم إثباتها سابقًا لتنظيم وظيفة YAP / TAZ في أنواع الخلايا الأخرى. ومع ذلك ، فإن دور العديد من هذه الجينات في تنظيم YAP و TAZ في سرطان الجلد غير معروف. وشملت مكتبتنا الجينات المطلوبة لنشاط YAP / TAZ، مثل RAF1، MDM2، PIK3CA، MAPK8، PAK4، EZH2، PDK1، ERBB4، وCCNE216،,17،,18،,19،,20،,21،,22،,23،,24،,25،,26،,27،,28،,29،, 30،31،32،33،34،35،36،37،38، والجينات المتوقع أن تمنع نشاط YAP / TAZ ، مثل CSK ، ERBB2 ، ATM ، CDH1 ، Gelsolin (GSN) ، PTEN ، ATR ، و RB139،40،41،42،43،44، 45،46،47،48،49،50،51،52،53،54. كضوابط، ونحن شملت جنبا إلى جنب YAP / TAZ shRNA14،والسيطرة غير الاستهداف shRNA (shNTC)، وshRNA استهداف Src، والتي أظهرنا سابقا كان مطلوبا لأقصى نشاط YAP / TAZ في الخلايا A37514.

يتم عرض البيانات الخام والتحليل لهذه الشاشة في الجدول التكميلي 2. العديد من shRNAs (shPDK-1، shMDM2-1، shMDM2-2، shPAK4، shMAPK8-1 وshMAPK8-2) خفضت بشكل كبير إشارة رينيلا لوسيفراز نسبة إلى إشارة رينيلا يعني لجميع الآبار، مما يشير إلى أن هذه shRNAs كانت تسبب السمية الخلايا في خلايا A375. في الواقع كان هذه الآبار خلايا أقل بكثير في وقت الاسهاب (غير مبين). وهذا يجعل من الصعب جدا ً التمييز بين المرشحين الذين قد ينظمون YAP/TAZ عن المرشحين الضروريين لبقاء الخلية. لذلك، يتم استبعاد نتائج هذه العينات من مزيد من تحليل البيانات. كما هو متوقع، shRNAs استهداف YAP وTAZ أو Src خفضت بشكل كبير YAP / TAZ-TEAD النشاط(الشكل 3). بما يتفق مع العمل المنشور الذي يظهر أن PIK3CA يعزز YAP وTAZ النشاط21،26،31، وجدنا أن shRNAs استهداف PIK3CA خفض مستويات اليراعات العادية luciferase. shRNAs استهداف أجهزة الصراف الوالي، CDH1، CSK، ERBB2، GSN كل زيادة مستويات اليراعات العادية luciferase، وهو ما يتفق مع الدراسات المنشورة التي تبين أن هذه البروتينات قمع YAP و / أو TAZ39،41،42،43,،45،46،47،48،50،51،53،54 . على الرغم من الأدوار الراسخة لATR، CCNE2، وERBB4 في أنواع الخلايا الأخرى27،28،35،36،38،49، shRNAs استهداف هذه الجينات لم تغير بشكل كبير مستويات اليراعات العادية luciferase في خلايا A375. shRNAs استهداف EZH2 وRB1 أظهرت تأثير على مستويات لوسيفيراز اليراعات التي كانت عكس ما كان متوقعا على أساس دراسات في أنواع الخلايا الأخرى32،34،40،52. تم استهداف كل من PTEN و RAF1 من قبل اثنين من shRNAs متميزة التي كان لها آثار عكسية على نشاط لوسيبريز. النتائج التي لا تتفق مع الدراسات السابقة يمكن أن تشير إلى أن تأثير هذه البروتينات على YAP /TAZ-TEAD وظيفة تعتمد على نوع الخلية; ومع ذلك، قد يكون أيضا بسبب ضعف كفاءة الضربة القاضية أو الآثار خارج الهدف من قبل بعض shRNAs. كشاشة n = 1 "أعمى"، بعض الإيجابيات الكاذبة والسلبيات الكاذبة من المتوقع أيضا. كما نوقش بمزيد من التفصيل في المناقشة، سوف تحتاج إلى إجراء تجارب التحقق إضافية باستخدام المقالات الأخرى مثل qPCR للجينات التي تنظمها YAP و TAZ وbbs الغربية للتعديلات الانتقالية بعد التي تؤثر على وظيفة YAP /TAZ. وسيشمل هذا التحقق أيضا تأكيد أي shRNAs أسقطت فعليا البروتين ذات الأهمية. من المهم أيضًا ملاحظة أنه نظرًا لأن مراسلنا يستجيب لـ TEAD ، فإن أي جينات تحددها شاشتنا يمكن أن تؤثر على TEADs ولكن ليس YAP و TAZ مباشرة. وستكون هناك حاجة إلى دراسات ميكانيكية للمتابعة لتحديد ما إذا كان YAP و / أو TAZ أو TEADs التي ينظمها البروتين المحدد. ومع ذلك ، YAP وTAZ هي المحركات الرئيسية للنسخ بوساطة TEAD ، لذلك من المرجح أن معظم هذه الجينات تنظم YAP و TAZ. في الواقع ، كما ذكر أعلاه ، فإن معظم shRNAs التي ضربت في الشاشة تستهدف البروتينات التي تعرف لتنظيم YAP و / أو TAZ مباشرة.

Figure 1
الشكل 1: الرسم التخطيطي لسير العمل. يتم تلخيص الخطوات الهامة لهذا البروتوكول بأرقام الخطوات المقابلة للأرقام الموجودة في البروتوكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحسين نظام المراسل المزدوجة النسخة YAP/TAZ-TEAD. (أ)A375 الخلايا التي تعبر بشكل ثابت ناقلات السيطرة (MSCV-IRES-Hygro)، LATS-غير حساسة YAP (YAP2SA)،أو YAP LATS غير حساسة غير قادر على ربط TEADs (YAP2SA، S 94A) تم نقلها معا مع PRL -TK(رينيلا)وpGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP/TAZ-TEAD مراسل) بنيات وقياس إشارة لوسيفيراز 24 ساعة في وقت لاحق. ن = 7 تجارب مستقلة. (B)تم إصابة خلايا A375 بـ YAP2SA أو متجه التحكم ، وبناء PRL-TK ، وإما بناء pGL3-5xMCAT (SV)-49 أو بناء pGL3 (SV) - 49 (الحد الأدنى من المروج) وإشارة luciferase تم قياسها بعد 24 ساعة. ن = 1 تجربة تنتقل في رباعية. (C)أصيبت خلايا A375 مع ترميز الفيروسات الرجعية shRNA التحكم غير المستهدفة (shNTC) أو جنبا إلى جنب YAP وTAZ shRNAs (shYAP / TAZ). وبعد الاختيار المستقر، تم نقل الخلايا بشكل مشترك مع بناء PRL-TK وإما بناء pGL3-5xMCAT (SV)-49 أو بناء pGL3 (SV)-49 وتم قياس إشارة لوسيبريز بعد 24 ساعة. ن = 4 إصابات مستقلة؛ تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه يليه اختبار المقارنات المتعددة لتوكي. n.s. = P> 0.05، * p<0.05، ** p<0.01، **** p<0.0001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نتائج الشاشة التمثيلية. تتم مقارنة النتيجة من كل متجه هدم أسفل مع shNTC وتقدم كفرق أضعاف. الرسم البياني شريط يظهر متوسط لوسيبريز اليراعات /رينيلا luciferase نسبة ± الانحراف المعياري. ن = تجربة واحدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أنبوب A – تخفيف الترانزة
كاشف حجم
المخزن المؤقت للإرسال 25 ميكرولتر لكل رد فعل
كاشف التغوط 2 (إضافة الثانية) 1.5 ميكرولتر لكل رد فعل
أنبوب B – تخفيف مراسل
كاشف حجم
المخزن المؤقت للإرسال 25 ميكرولتر لكل رد فعل
20:1 اليراعات لوسيفراز مراسل: السيطرة على مزيج رينيلا (إضافة الثانية) 400 نانوغرام لكل رد فعل
كاشف التغوط 3 (إضافة الثالث) 1 ميكرولتر لكل رد فعل
المجموع: 26.5 ميكرولتر لكل رد فعل

الجدول 1: إعداد مزيج الحلويات. بالنسبة للتطفل في كل بئر من الألواح ذات الـ 24 بئراً، يتم تخفيف 1.5 ميكرولتر من كاشف الحلويات 2 إلى 25 ميكرولتر من عازل التطفل لإنتاج تخفيف التغوط (الأنبوب A)؛ في حين أن 400 نانوغرام من 20:1 اليراعات luciferase مراسل: السيطرة رينيلا مزيج و1 μL من التبرز الكاشفة 3 يتم تخفيفها إلى 25 ميكرولتر من الصدق التطفل لإنتاج تخفيف المراسل (أنبوب B).

ناقلات موجودة/مشتراة/هدية
المتجه مصدر
GIPZ الإنسان shRNA ناقلات لارضية جنرال إلكتريك للرعاية الصحية
VSVG مختبر هاينز [2]
PSPAX2 أدجين (#12260)
هفوة / pol أدجين (#14887)
pGL3-(SV)-49 اين فارانس [15]
pGL3-5xMCAT (SV)-49 اين فارانس [15]
PRL-TK بروميجا
MSCV-IRES-Hygro لامار لاب [2]
MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro لامار لاب [2]
MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 لامار لاب [14]
ناقلات جديدة
المتجه العمود الفقري للمصدر
MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro MSCV-IRES-Hygro

الجدول التكميلي 1: جدول المتجهات. يتم سرد جميع المتجهات المستخدمة مع ناقلات جديدة موضحة. واستخدمت تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية لتوليد ناقلات جديدة.

الجدول التكميلي 2: لوسيفيراز تحليل بيانات القول. يتم عرض ترتيب مكتبة shRNA في الجدول الأول. ويظهر الجدولان الثاني والثالث إشارات اليراعات الخام وإشارات رينيلا لوسيفيراز على التوالي. يشار إلى الانحراف المتوسط والمعياري لإشارة رينيلا لوسيراز لجميع الآبار في الصناديق الصفراء. يتم تسليط الضوء على الآبار مع إشارة رينيلا لوسيفراز أكثر من 1 الانحراف المعياري تحت المتوسط مع النص الأحمر واستبعادها من مزيد من التحليل. تم الحصول على نسبة اليراعات /رينيلا من كل بئر عن طريق تقسيم إشارة لوسيفراز الطير الخام بواسطة إشارة رينيلا لوسيفراز الخام (الجدول الرابع). ثم تم تطبيع نسبة اليراعات/رينيلا لكل بئر إلى متوسط نسبة اليراعات/رينيلا لآبار التحكم (shNTC) (الجدول الخامس). وتم بعد ذلك حساب متوسط الآبار المكررة لكل بناء وتم حساب الانحراف المعياري (الجدول السادس). يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة ، ونحن نظهر نهجا للفرز المتوسطة الإنتاجية للمكتبات الفيروسية مصفوفة في تركيبة مع الازدواج ية القائمة على النسخة القائمة على القول مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد واختبار المنظمين رواية من عوامل النسخ. من الأهمية بمكان توصيف وتحسين نظام المراسل لكل خط خلية قبل أي شاشة. وينبغي إجراء التجارب للتأكد من أن المراسل يستجيب للنشاط المتغير لعامل النسخ الذي يجري التحقيق فيه، وينبغي اختبار حجم التغير في النشاط بالنسبة إلى ناقلات التحكم. إن التَشَيّف المشترك بين بناء PRL-TK إلى جانب بناء المراسل مهم لأنه يساعد على التحكم في عدد الخلايا المصابة بالمراسل وعدد نسخ بناء المراسل، وكلاهما يمكن أن يغير حجم إشارة اللوسيفراز. وينبغي أن تضمن تجارب التحسين أيضا أن عامل النسخ لا يؤثر على نشاط بناء رينيلا التأسيسية أو بناء الحد الأدنى من المروج لأن هذا يمكن أن يعقد تفسير النتائج. وينبغي أيضا النظر بعناية في الضوابط التي ستدرج في المكتبة. تم تصميم هذا البروتوكول ل "شاشة عمياء" من المكتبات مع مئات من shRNAs، حيث أنه ليس من الممكن تأكيد ضربة قاضية فعالة من قبل كل shRNA. لذلك ، من المرجح أن تكون بعض الإيجابيات والسلبيات الخاطئة. زيادة عدد من النسخ المتماثلة التقنية و / أو البيولوجية في الشاشة يمكن أن تساعد في تقليل عدد الإيجابيات والسلبيات كاذبة. ومع ذلك ، فإن هذا سيزيد أيضًا بشكل كبير من عدد الآبار إلى الثقافة والقول ، لذا يجب توخي الحذر لضمان عدم حدوث ذلك في ظروف ثقافية دون المستوى الأمثل (انظر أدناه). وثمة نهج آخر للحد من الإيجابيات والسلبيات كاذبة هو تكرار الشاشة بأكملها في نفس خط الخلية أو خطوط الخلية إضافية، أو لفحص مكتبة أصغر بما في ذلك فقط "يضرب" باستخدام 3 النسخ البيولوجية. في جميع الحالات، يجب التحقق من صحة أي إصابات باستخدام القراءة بالإضافة إلى المراسل، مثل qPCR للجينات المستهدفة المعروفة. وينبغي أيضا تأكيد الضربة القاضية الفعالة للجين المستهدف في خطوات التحقق من الصحة هذه. لا ينبغي التوصل إلى استنتاجات حول shRNAs التي لا تغير النشاط ما لم يتم تأكيد الضربة القاضية الفعالة من قبل shRNA. يجب أن تضمن تجارب التحقق من الصحة أيضًا أن عامل النسخ الذي يتم التحقيق فيه هو ما ينظمه الجين (الجينات) المستهدفة وأن هذه الجينات لا تؤثر على رينيلا أو الحد الأدنى من البنى المروجة.

من المهم أيضًا تحسين ظروف ثقافة الخلية لكل خط خلية لتجنب الظروف دون المستوى الأمثل مثل الإفراط في الالتقاء أو عدد قليل جدًا من الخلايا أو ضعف قدرة الخلية أو القدرة المتعددة التكاثرية المتغيرة. كثافة البذر الخلية مهم بشكل خاص في وقت التَجُرُيّة من بناء مراسل مزدوج اللوسيفراز (الخطوة 5) وعندما يتم قياس نشاط المراسل (الخطوة 6). يمكن أن تختلف كفاءة الترانزستور بشكل كبير مع كثافة الخلايا ويمكن أن تؤدي كفاءة التطفل الضعيفة إلى نتائج شاذة إذا كان يتم اعتبار جزء صغير فقط من سكان الخلية. معظم خطوط الخلية اختبار تظهر أعلى كفاءة التقالات عندما في 40 - 60٪ التقاء، ولكن من المستحسن أن يتم تحسين ظروف التطفل وكثافة البذر لخط خلية معينة باستخدام ناقلات أن يسلم بروتين الفلورسنت. قد لا تكون خطوط الخلايا التي يصعب إصابتها و/أو الترانزستور، مثل الخلايا الأساسية مناسبة لهذه الشاشة. ضعف كفاءة التطفل مراسل أو ضعف قدرة الخلية على البقاء عادة ما يؤدي إلى إشارة منخفضة جدا رينيلا لوسيفراز. ومع ذلك ، ينبغي إجراء تجربة تجريبية لتحديد نطاق إشارة رينيلا لوسيراز لخط الخلية. من المهم أن titer من الفيروس المنتجة من المكتبة المصفوفة عالية بما يكفي لإعطاء كفاءة العدوى ما لا يقل عن 30 ٪ في خط الخلية يجري assayed. يمكن أن تختلف كفاءة العدوى بشكل كبير ويمكن أن تؤثر عدة عوامل على التتر الفيروسي. وينبغي تحسين كمية supernatant الفيروسية المستخدمة لكل خط الخلية وإذا لزم الأمر، يمكن تحسين الخطوة 2 كذلك لتحسين titers الفيروسية.

كثافة الخلية وقابلية الخلية يمكن أن تؤثر أيضا على نشاط المسارات الخلوية التي تنظم عوامل النسخ، لذلك فمن الأهمية بمكان لبذور الخلايا لالتطفل مراسل بحيث تكون كلها في كثافة مماثلة في اليوم الذي يقرأ فيه قياس المزدوج لوسيفراز (الخطوة 6). من المهم أيضًا التأكد من أن الخلايا تلتزم بشكل موحد عبر البئر بدلاً من التجمع في رقعة كثيفة في المركز. كما هو موضح أعلاه، قد يؤدي الاختلاف الكبير في إشارة رينيلا لوسيراز من البئر إلى البئر إلى بيانات يصعب تفسيرها. فمن الأفضل لاستبعاد الآبار التي تظهر انخفاضا كبيرا في إشارة رينيلا لوسيراز بالمقارنة مع جميع الآبار الأخرى وهذا يشير إلى أن إما ناقلات الفيروسية هو الحد من قدرة الخلية على البقاء أو كفاءة التطفل لذلك البئر كانت منخفضة جدا. هنا استبعدنا الآبار أكبر من 1 الانحراف المعياري من إشارة رينيلا لوسيراز المتوسط ، ولكن يجب إجراء تجارب التحسين لتحديد قطع مناسبة لكل خط خلية. ومن الممكن أيضا أن shRNAs التي تقلل من صلاحية الخلية يمكن أن تفعل ذلك عن طريق تغيير نشاط عامل النسخ يجري assayed. إذا كان هذا هو مصدر قلق، يمكن إعادة اختبار shRNAs التي تقلل إشارة رينيلا لوسيراز باستخدام shRNAs القابلة للاختزال أو غيرها من المقالات. ومن الأهمية بمكان أيضا للحد من مقدار الوقت الذي الخلايا المعتمة في التعليق بعد trypsinization. استخدام ماصة متعددة القنوات لمعظم الخطوات خلال trypsinization والبذر من الخلايا، وشاشات أكبر، والعمل مع لوحات على دفعات. بالإضافة إلى ذلك ، من الأفضل الحد من الوقت بين عدوى الخلايا والقول الصحفي. وهذا مهم بشكل خاص إذا كان عامل النسخ الذي يتم تنظيمه ينظم انتشار الخلايا أو البقاء على قيد الحياة. في هذه الحالة، سيتم outcompeted الخلايا مع ضربة قاضية فعالة من قبل الخلايا مع ضربة قاضية أقل كفاءة.

ويمكن إدخال عدة تعديلات على البروتوكول الموصوف. ويمكن استخدام هذا النهج بشكل فعال لتحديد المنظمين لأي عامل النسخ إذا تم إنشاء مراسل القائم على luciferase، وبالنسبة للعديد من عوامل النسخ الأكثر شيوعا يبني مراسل موجودة بالفعل. يمكن تعديل هذا البروتوكول لاستخدام مجموعة واسعة من المكتبات المتاحة تجاريًا أو المجمعة يدويًا ، بما في ذلك RNAi أو CRISPR /CAS9 أو ORF أو cDNA. في الواقع ، استخدمنا في السابق استراتيجية مماثلة لاختبار مكتبة cDNA صغيرة لمنظمي YAP / TAZ14. يمكن تسليم المكتبات باستخدام الفيروسات الرجعية أو فيروس الرضّاني أو الفيروس الغدي أو التَسلّي العابر. بروتين معطف الفيروسية المستخدمة هنا (VSVG) يولد lentivirus التي هي الإنسان المعدية. إذا تم استخدام خلايا القوارض ومطلوب الفيروس البيئي ة المعدية غير البشرية، يمكن استخدام ناقل تسليم بروتين معطف إيكو بدلا من VSVG.

ويمكن استخدام أساليب أخرى لفحص المكتبات للمنظمين من عامل النسخ. ومن شأن الوصول إلى مرفق فحص عالي الإنتاجية أن يسمح بفحص مكتبات أكبر بكثير بطريقة آلية. وبالمثل، يمكن إجراء شاشات على نطاق الجينوم باستخدام مكتبات مجمعة ذات تسلسل عميق كوسيلة لتحديد "الزيارات". ومع ذلك، يتطلب كلا النهجين معدات لا يمكن للعديد من الباحثين الوصول إليها، ويمكن أن تكون رسوم الفحص عالي الإنتاجية أو التسلسل العميق مرتفعة للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الشاشات المجمعة فرز الخلايا باستخدام مراسل الفلورسنت أو طريقة أخرى لإثراء الخلايا التي تظهر التغييرات المطلوبة في النشاط النسخي. وقد ثبت من قبل فحص مكتبات التعبير كبيرة مصفوفة باستخدام النسخ المزدوج القائم على القول مراسل باستخدام الروبوت benchtop55، ولكن هذا ليس متاحا عادة لجميع الباحثين. وعلى النقيض من ذلك، فإن الطريقة الموصوفة هنا هي طريقة سريعة ومتوسطة الإنتاجية وغير مكلفة نسبياً وتستخدم معدات وكواشف يحتمل أن تكون في متناول معظم المحققين. يمكن أن تكشف هذه الطريقة عن العديد من المنظمين في تجربة واحدة ، وهي طريقة فعالة من حيث التكلفة ومريحة لاكتشاف المسارات التنظيمية المحتملة في المنبع من عامل النسخ.

في النهج الموصوف ، تم إسقاط الجينات المرشحة بشكل ثابت ثم بعد الاختيار ، تم نقل المنشئات المراسلة بشكل عابر إلى الخلايا. ومع ذلك، فإن كفاءة التَغَرَف ضعيفة في العديد من خطوط الخلايا ويمكن أن تُدخل التغيّر وتتسبب في السمية الخلوية. وثمة نهج بديل محسن يتمثل في دمج بناء المراسل بشكل ثابت في جينوم خط اهتمام الخلية ثم إصابة الخلايا المعبرة عن المراسلين بالمكتبات الفيروسية لفحصها. ومن شأن هذا التحسن أن يقلل من التباين الذي أدخله الترانزستور العابر ويمنع أي تغييرات محتملة في نشاط عامل النسخ بسبب ثقافة ما بعد العدوى المطولة. كما ذكر أعلاه ، فإن استخدام روبوت صغير من مقاعد البدلاء من شأنه أن يبسط العملية إلى حد كبير ويزيد من حجم المكتبات التي يمكن فحصها. وثمة تغيير كبير آخر يتمثل في استخدام مكتبات متجهية مصفيفة، مما يقلل من احتمال الاختيار ضد الخلايا ذات الضربة القاضية الأكثر فعالية ويقلل من التباين الناجم عن التغيرات في صلاحية الخلية.

التحدي الكبير الذي يمنع العلاج الفعال للعديد من أنواع السرطان هو أن الخلايا السرطانية تكتسب مقاومة حتى للعلاجات المستهدفة الأكثر فعالية. تحديد البروتينات المطلوبة لهذه المقاومة العلاجية ضروري لتحسين نتيجة المريض. ويمكن بسهولة استخدام النهج الموصوف في تركيبة مع العلاجات المستهدفة للكشف عن الجينات التي تسبب زيادة الحساسية أو المقاومة لهذه المركبات. ومن التطبيقات المستقبلية الأخرى لهذا النهج استخدام هذا الفحص الصفيف لاختبار الأهداف العلاجية المرشحة مجتمعة. لهذا، سوف تصاب الخلايا مع اثنين من ناقلات الفيروسية كل بهدف تحديد البروتينات التي لها تأثير التآزر على نشاط عامل النسخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونود أن نشكر إميلي نورتون وميكايلان كوتشياري - ستوليسغروس على المساعدة في إعداد ناقلات shRNA. وقد دعم هذا العمل جزئيا ً منحة سوزان ج. كومن المحفز المهني التي منحت لـ J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 157، عامل النسخ، شاشة RNAi مصفوفة، YAP، تاز، TEAD، مراسل مزدوج لوسيفراز، فحص مراسل النسخ، السرطان
تحديد منظمي عوامل النسخ باستخدام فحص متوسط الإنتاجية للمكتبات المصصفوفة ومراسل ثنائي لوسيفراز القائم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, Y., Lamar, J. M.… More

Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter