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Cancer Research

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Summary

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Abstract

Les facteurs de transcription peuvent modifier l’expression de nombreux gènes cibles qui influencent une variété de processus en aval, ce qui en fait de bonnes cibles pour les thérapies anticancéreuses. Cependant, le ciblage direct des facteurs de transcription est souvent difficile et peut causer des effets secondaires indésirables si le facteur de transcription est nécessaire dans un ou plusieurs tissus adultes. Identifier les régulateurs en amont qui activent aberrantement les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses offre une alternative plus faisable, en particulier si ces protéines sont faciles à droguer. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour combiner les bibliothèques de lentiviral à moyenne échelle et un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Notre approche offre un moyen rapide, facile et peu coûteux de tester des centaines de gènes dans une seule expérience. Pour démontrer l’utilisation de cette approche, nous avons effectué un écran d’une bibliothèque RNAi lentiviral à la sélection contenant plusieurs régulateurs de protéines associées au Oui (YAP) et co-activateur transcriptionnel avec le motif de liaison PDZ (TAZ), deux co-activateurs transcriptionnels qui sont les effecteurs en aval de la voie Hippo. Toutefois, cette approche pourrait être modifiée pour dépister les organismes de réglementation de pratiquement n’importe quel facteur de transcription ou co-facteur et pourrait également être utilisée pour filtrer les bibliothèques CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.

Introduction

Le but de cet essai est d’utiliser des bibliothèques virales pour identifier les organismes de réglementation des facteurs de transcription d’une manière relativement rapide et peu coûteuse. L’activité transcriptionnelle aberrante est associée au cancer et aux métastases1,2,3,4,5,6, ainsi cibler des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses est une approche thérapeutique prometteuse. Cependant, les facteurs de transcription sont souvent difficiles à cibler pharmacologiquement7 et beaucoup sont nécessaires pour la fonction cellulaire normale dans les tissus adultes8,9,10. Cibler les voies associées au cancer qui activent aberrantement les facteurs de transcription pour conduire la maladie est une approche plus faisable avec le potentiel d’avoir des effets secondaires moins graves. La disponibilité commerciale des bibliothèques RNAi lentiviral et rétroviral à réseau, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF permet aux chercheurs de tester l’importance de nombreux gènes dans une seule expérience. Cependant, une lecture fiable pour l’activité transcriptionnelle altérée est exigée.

Ici, nous décrivons l’utilisation d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase et de bibliothèques lentiviral à la rangée pour identifier les protéines qui régulent les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Dans cet essai, les shARN qui ciblent les gènes cancéreux sont livrés aux cellules cancéreuses des mammifères par transduction lentivirale et les cellules sont sélectionnées pour une intégration stable à l’aide de puromycine. Les cellules sont ensuite transfected avec une construction de journaliste qui exprime la luciferase de luciole conduite par un promoteur spécifique au facteur de transcription qui est étudié et une construction de contrôle qui exprime Renilla luciferase d’un promoteur constitutivement actif qui n’est pas sensible au facteur de transcription à l’étude. Nous démontrons cette approche avec un écran de preuve de concept pour les régulateurs de YAP et TAZ, les effecteurs en aval critiques de la voie Hippo8,10,11. L’activité anormale de YAP et TAZ favorise plusieurs étapes de la cascade métastatique11 et est observée dans de nombreux cancers11,12,13. Cependant, la façon dont YAP et TAZ deviennent activés aberrantement dans certaines cellules cancéreuses n’est pas encore entièrement comprise. YAP et TAZ ne lient pas l’ADN, mais sont plutôt recrutés pour les promoteurs par d’autres facteurs de transcription. Les membres de la famille de facteurs de transcription du domaine TEA (TEAD) sont les principaux partenaires contraignants de YAP et de TAZ, et sont essentiels pour la plupart des fonctions dépendantes du YAP et de la TAZ. Notre construction reporter exprime luciferase luciole d’un promoteur YAP/TAZ-TEAD-sensible et des études précédentes ont démontré qu’il détecte fidèlement les changements dans YAP-TEAD et TAZ-TEAD activité transcriptionnelle2,14,15.

Notre approche est rapide, à débit moyen, et ne nécessite pas d’installations de dépistage, de robots automatisés ou de séquençage profond des bibliothèques mises en commun. Les coûts sont relativement bas et il y a de nombreuses bibliothèques disponibles dans le commerce à choisir. L’équipement et les réactifs requis sont également relativement standard dans la plupart des laboratoires. Il peut être utilisé pour dépister les régulateurs de pratiquement n’importe quel facteur de transcription si un journaliste basé sur la luciferase existe ou est généré. Nous utilisons cette approche pour dépister les shARN dans les cellules cancéreuses, mais toute lignée cellulaire qui peut être transfected avec une efficacité raisonnable pourrait être utilisé avec n’importe quel type de bibliothèque à réseau.

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Protocol

REMARQUE : Un résumé schématique de ce protocole est présenté à la figure 1.

1. Préparation de la bibliothèque vectorielle lentiviral

REMARQUE : L’écran démontré a utilisé une bibliothèque de shRNA à bord achetée sous forme de stocks de glycérol dans des plaques de 96 puits, mais les bibliothèques peuvent également être assemblées manuellement en fonction d’une liste de candidats. Les contrôles appropriés doivent être pris en considération et inclus dans n’importe quelle bibliothèque. Cela comprend un shRNA de contrôle non-ciblage (shNTC), un shRNA de contrôle ciblant le facteur de transcription à l’étude, et si possible, un shRNA ciblant luciferase de luciole de pompier.

  1. Ajouter 1,3 ml de Luria Broth (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% d’extrait de levure, 1% de NaCl, pH 7,5) contenant 100 g/mL d’ampicilline à chaque puits d’une plaque de puits de 96 puits de profondeur. Inoculer chaque puits avec 2 L de bouillon de glycérol et croître à 37 oC pendant la nuit avec agitation constante à 225 tr/min.
  2. Transférer chaque culture bactérienne dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml et pelleter les bactéries par centrifugation à 21 000 x g à 4 oC pendant 10 min.
  3. Purifiez chaque vecteur à l’aide d’un mini-kit de mini-préparation bactérien en suivant le protocole du fabricant.
  4. Déterminer la concentration de chaque vecteur à l’aide d’un spectrophotomètre.
  5. Rangez les plasmides à -20 oC.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Emballage de la bibliothèque lentiviral à la brochette

REMARQUE : Tous les travaux impliquant le lentivirus, y compris l’emballage, l’infection et la culture subséquente des cellules infectées devraient suivre strictement les règles et règlements institutionnels de biosécurité.

  1. Étendre les cellules 293FT à l’aide de supports de croissance complets (du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4 mM L-glutamine, 4 500 mg/L de glucose et de pyruvate de sodium, complétés par un sérum bovin fœtal de 10 % (FBS), 100 unités/mL de pénicilline, un antibiotique de streptomycine de 100 g/mL et une lf-glutamine de 2 mM).
  2. Pour chaque vecteur de la bibliothèque de l’étape 1.4, semez un puits de 24 ans avec 1 x 105 cellules 293FT.
    REMARQUE : Il est recommandé que certains puits supplémentaires d’un vecteur viral de contrôle soient emballés et utilisés pour tester le titer du virus avant de passer à l’étape 3 (voir ci-dessous).
  3. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
    REMARQUE : Un protocole général pour l’emballage lentivirus qui a été décrit précédemment14 a été réduit à 24 puits pour ce protocole. Il utilise psPAX2 pour l’emballage lentiviral et VSVG comme protéine de couche. Si le virus ectropique est désiré, un vecteur de livraison Eco peut être utilisé au lieu de VSVG. Il est fortement recommandé que ce protocole soit optimisé pour atteindre un titer viral qui donne entre 30%-70% d’efficacité d’infection des cellules cibles (voir Discussion). Voir le tableau supplémentaire 1 pour une liste de tous les vecteurs utilisés.
  4. Configurez un mélange de transfection pour chaque vecteur viral de l’étape 1.4 tel que décrit ci-dessous. Chaque transfection doit contenir 250 ng du vecteur viral, 125 ng de psPAX2, 125 ng de VSVG, 1,25 l de réagent transfection 1 et 23,75 l de tampon transfection (voir Tableau des matériaux).
    1. Diluer chaque vecteur lentiviral à 50 ng/L avec de l’eau sans nucléase, puis transférer 5 L (250 ng) dans un puits d’une plaque PCR de 96 puits.
    2. Faire le super mélange transfection en mélangeant 1,25 L X de réagement transfection 1 et 23,75 L -L de tampon transfection pré-réchauffé où "X" est le nombre total de transfections plus plusieurs extras pour tenir compte de la perte de volume pendant le tuyautage.
    3. Incuber le super mélange transfection à température ambiante pendant 5 min.
    4. Ajoutez 125 ng X de psPAX2 et 125 ng - X de VSVG au tube de super mix transfection de l’étape 2.4.3 et doucement pipet de haut en bas pour mélanger. Procédez rapidement à l’étape 2.4.5.
    5. Alocalisez immédiatement le mélange de l’étape 2.4.4 dans chaque tube d’une bande PCR, puis utilisez la pipette multicanal pour transférer le mélange de 25 ll dans chaque vecteur viral contenant un puits de l’étape 2.4.1.
    6. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
    7. Transférer les 30 L de chaque puits de 96 à partir de l’étape 2.4.6 dans un puits de 24-puits contenant 293 cellules FT de l’étape 2.3.
  5. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h, puis remplacer les médias dans chaque puits de la plaque de 24 puits avec 500 l de nouveaux supports de croissance complète. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour un autre 24 h.
  6. À l’aide d’une pipette multicanal, collectez le supernatant viral de chaque puits et aliquot 220 L (assez pour 1 infection dans l’étape 3 plus un peu de volume supplémentaire) en deux 96 puits chacun. Ce sont les plaques virales supernatants.
  7. Rangez les plaques supernatantes virales à -80 oC.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Il est également recommandé de tester une partie du virus de contrôle supplémentaire qui a été emballé (voir ci-dessus) sur les cellules à infecter avant de passer à l’étape 3. Il s’agit de s’assurer que le titer est suffisant pour atteindre au moins 30% d’efficacité d’infection.

3. Infection des cellules pour l’écran

REMARQUE : Des cellules humaines de mélanome (A375) ont été employées pour démontrer cette approche, mais cette méthode peut être appliquée à toutes les cellules adhérentes qui infectent avec le lentivirus. Cependant, la culture cellulaire et les conditions de placage doivent être optimisées pour chaque lignée cellulaire (voir Discussion).

  1. Étendre les cellules à être infectées dans les médias de croissance complète.
  2. Graines plaques de 24 puits avec 1 x 105 cellules dans 0,5 ml de support de croissance complète par puits. Le premier puits de semence pour chaque vecteur viral doit être testé (y compris les contrôles) et inclure un puits supplémentaire qui ne sera pas infecté qui servira de contrôle pour la sélection des médicaments à l’étape 3.7.
  3. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
  4. Infectez chaque puits de l’étape 3.2 avec un supernatant viral différent du supernatant lentiviral à la broche congelée comme suit.
    1. Préparer un support de croissance complet qui contient 20 g/mL polybrene.
    2. Décongeler les supernatants de bibliothèque lentiviral à la carte de l’étape 2.7 à la température ambiante.
    3. Aspirez les supports de croissance des plaques de 24 puits de l’étape 3.2 et ajoutez immédiatement 200 L de supports de croissance contenant du polybrene à chaque puits.
    4. À l’aide d’une pipette multicanal, transférez 200 L de supernatant viral de chaque puits 96 de l’étape 3.4.2 aux 24 puits de l’étape 3.4.3.
  5. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 - 48 h.
    REMARQUE : Certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter plus de 24 h pour exprimer les shARN et devenir résistantes à la puromycine. Le vecteur viral utilisé ici délivre un Turbo-GFP-IRES-puroR avec un shRNA miR30 dans le 3'UTR de puroR (Figure 1). L’efficacité et l’expression de l’infection du gène de résistance de puromycine et du shRNA ont été surveillées par protéine fluorescente verte.
  6. Préparer un support de croissance complet qui contient 2,5 g/mL puromycine.
    REMARQUE : La concentration de sélection de puromycine varie d’une lignée cellulaire à l’autre. Il est recommandé qu’une courbe antibiotique de tuer soit effectuée pour chaque lignée cellulaire à être analysée avant l’écran.
  7. Aspirez les médias de chaque puits et remplacez par 500 L de puromycine contenant un support de croissance complète.
    REMARQUE : Assurez-vous également d’ajouter de la puromycine à un puits de contrôle non infecté qui peut être utilisé dans les étapes suivantes pour s’assurer que la sélection de puromycine est terminée.
  8. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 48 h.
    REMARQUE : Il est préférable de sélectionner pour 48 h, de sorte que la densité de placage et le titer viral doivent être optimisés de sorte que les cellules ne sont pas trop influentes avant 48 h.
  9. Assurez-vous que les cellules infectées sont vertes sous le microscope fluorescent, et que les cellules d’un contrôle non infecté bien traités par puromycine sont toutes mortes avant de passer à l’étape 4.

4. Cellules d’ensemencement pour la transfection du journaliste dual-luciferase

REMARQUE : Une transfection d’essai doit être effectuée pour déterminer la densité optimale d’ensemencement pour chaque nouvelle lignée cellulaire.

  1. Trypsinize chaque puits de l’étape 3.9 et transférer environ 1 x 105 cellules dans des puits à la position correspondante sur la nouvelle plaque de 24 puits comme suit.
    REMARQUE : Ce protocole est conçu pour le dépistage des bibliothèques avec des centaines de shRNAs de sorte qu’il n’est pas possible de compter tous les puits de cellules infectées. Par conséquent, les étapes ci-dessous ont été utilisées pour estimer le nombre de cellules dans chaque puits pour aider à assurer une densité de placage à peu près égale.
    1. Regroupez les puits de l’étape 3.9 en 3 - 4 groupes de telle sorte que tous les puits d’un groupe ont une densité cellulaire similaire.
    2. Trypsinize 1 représentant bien de chaque groupe avec 200 L de trypsin-EDTA (1x PBS complété avec 0,5 mM EDTA et 0,1% trypsin) pour 5 min à 37 oC. Ensuite, neutralisez la trypsine-EDTA en ajoutant 400 L de puromycine contenant des supports de croissance complets.
    3. Comptez chaque représentant bien pour déterminer le nombre total de cellules et diluer la suspension cellulaire de chaque puits représentatif à 2 x 105 cellules/mL de l’utilisation de supports de croissance complète.
    4. Graine de 0,5 mL (1 x 105 cellules) de chaque puits de l’étape 4.1.3 dans la position correspondante sur une nouvelle plaque de 24 puits et incuber cette nouvelle plaque de 24 puits à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
    5. Pour chaque groupe de l’étape 4.1.1, utilisez le nombre total de cellules déterminé dans l’étape 4.1.3 pour calculer le volume de trypsin-EDTA à ajouter à chaque puits de sorte que la suspension cellulaire résultante sera de 1 x 106 cellules/mL.
    6. Ajouter le volume approprié de trypsin-EDTA à chaque puits et incuber pendant 5 min à 37 oC.
      REMARQUE : Pour un écran plus grand, il est recommandé que les plaques de 24 puits soient trypsinisées et republiées en groupes plutôt que toutes à la fois pour assurer la viabilité des cellules.
    7. Pendant l’incubation ci-dessus, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 400 L de puromycin contenant des supports de croissance complète aux puits correspondants sur une nouvelle plaque de 24 puits.
    8. Transférer 100 L de suspension cellulaire (environ 1 x 105 cellules) de chaque puits à la position correspondante sur les nouvelles plaques de 24 puits préparées dans l’étape 4.1.7.
    9. Répétez les étapes 4.1.6 à 4.1.8 pour toutes les plaques de puits groupés de l’étape 4.1.1, une plaque à la fois.
  2. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.

5. Transfection du journaliste dual-luciferase

  1. Transfect chaque puits de l’étape 4.2 avec le journaliste dual-luciferase construit comme suit.
    REMARQUE : La quantité totale d’ADN et le rapport optimal du vecteur de la luciferase de luciferase de luciferase pour commander le vecteur de rennière luciferase doivent être déterminés avant de commencer cet essai. Ici, 400 ng d’un mélange d’ADN qui contient 20 pièces de luciferase journaliste luciferase et 1 partie de contrôle Renilla luciferase a été utilisé.
    1. Faire le mélange de dilution transfection (Tube A) et le mélange de dilution reporter (Tube B) en mélangeant les volumes indiqués de chaque réactif(tableau 1) multiplié par le nombre total de transfections (plus plusieurs extras).
      REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour le réactif transfection 2 (voir Tableau des matériaux). Si un réactif transfection différent est utilisé, la transfection doit être optimisée avant cette étape.
    2. Mélanger le mélange de dilution transfection (Tube A) avec le mélange de dilution reporter (Tube B) et incuber à température ambiante pendant 15 minutes pour produire le mélange transfection.
    3. Pendant l’incubation ci-dessus, rincez chaque puits de 24 puits à partir de l’étape 4.2 avec 0,25 ml de saline tampon de phosphate (PBS), et ajoutez 447 L de support de croissance complète à chaque puits.
    4. Après l’incubation de 15 min, utilisez une pipette multicanal pour distribuer 53 L de mélange transfection à chaque puits des plaques de 24 puits.
  2. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.

6. Quantification de l’activité dual-luciferase

  1. Mesurez l’activité de luciferase à l’aide d’un lecteur de plaque et d’un kit d’analyse double-luciferase reporter tel que décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour le kit d’analyse du journaliste indiqué (voir tableau des matériaux) et suit le protocole recommandé par le fabricant.
    1. Préparer suffisamment de tampon de lyse passive 1x pour tous les puits plus plusieurs extras (75 l est nécessaire par puits) en diluer 5x tampon de lyse passive (fourni en kit) 1 à 5 avec de l’eau déionisée. Dégelez également le réactif A et le réactif B Buffer (fourni en kit, 100 l’un de chacun est nécessaire pour chaque puits).
    2. Aspirez les médias de chaque puits de la plaque de 24 puits de l’étape 5.2.
    3. Ajouter 75 L de tampon de lyse passive de 1x à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes avec des secousses occasionnelles.
    4. Préparer le réactif B en dilant le substrat B de 50x (fourni en kit) 1:50 avec tampon de réactif B décongelé.
    5. Ajouter 30 L de tampon de lyse passive de 1x à 4 puits pour l’effacement (voir tableau supplémentaire 2).
    6. Transférer 30 L de lysate de l’étape 6.1.3 dans des puits en double d’une plaque d’essai blanche à fond plat de 96 puits.
    7. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 L de réactif A à chaque puits et lisez le signal de luciferase de la luciole avec un lecteur de plaque.
    8. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 L de réactif B de l’étape 6.1.4 à chaque puits et lisez le signal renmélement luciferase avec un lecteur de plaque.
  2. Traiter les données brutes comme suit (pour une description détaillée, voir tableau supplémentaire 2).
    1. Exclure les échantillons avec le signal très faible de renilla luciferase car de faibles valeurs indiquent que la construction virale était toxique ou que trop peu de cellules transfected ont été analysées.
      REMARQUE : Comme expliqué dans la discussion, le signal de luciferase de Renilla de manière significative « faible » peut avoir comme conséquence des résultats anormaux. Ici, les puits dans lesquels le signal de la luciferase renillailla était plus d’un écart standard inférieur à la moyenne ont été exclus (voir tableau supplémentaire 2). Ceci a été basé sur des études précédentes exécutées utilisant ce système de reporter dans ces cellules14, mais peut différer dans d’autres lignées cellulaires.
    2. Normaliser la valeur luciferase de luciferase brute de chaque puits à la valeur brute Renilla luciferase du même puits pour obtenir le rapport luciole/Renilla.
    3. Moyenne des rapports luciole /Renilla de tous les puits de contrôle de reproduction, puis diviser le rapport luciole /Renilla de tous les autres bien par ce nombre pour obtenir un changement de pli.
    4. Attribuez l’échantillon de contrôle et définissez sa valeur de rapportfirefly/Renilla à 1.
    5. Moyenne des rapports luciole/Renilla des puits en double et de la parcelle avec l’écart standard.
      REMARQUE : L’écart standard n’est pas utilisé pour l’analyse statistique, mais plutôt comme un moyen d’identifier les puits où les répliques diffèrent considérablement.

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Representative Results

Notre construction de reporter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contient un promoteur SV-49 minimal avec 5 répétitions de l’élément de liaison canonique TEAD (MCAT)15 conduisant le gène luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de la luciole(figure 1). Il est co-transfected dans les cellules avec le vecteur de lutte PRL-TK (Promega), qui exprime Renilla luciferase du promoteur de HSV TK constitutivement actif (Figure 1). Il est essentiel de s’assurer que la construction du journaliste YAP/TAZ-TEAD se comporte comme prévu dans la lignée cellulaire(s) en cours d’essai. Par conséquent, nous avons d’abord co-transfected le PRL-TK et pGL3-5xMCAT (SV)-49 construit en cellules A375 exprimant de façon stable soit un vecteur de contrôle, un mutant très actif LATS-insensible de YAP (YAP2SA), ou un mutant de YAP2SA incapable de lier TEADs (YAP2SA,S94A). Comme prévu, l’activité de luciferase des lucioles a été considérablement augmentée par YAP2SA, mais pas le vecteur de lutte ou le YAP2SA,S94A (figure 2A). Cela suggère que YAP augmente l’activité du journaliste YAP/TAZ-TEAD d’une manière dépendante de TEAD. Fait important, YAP2SA n’a pas modifié de manière significative les niveaux de la luciferase Renilla. En tant que contrôle supplémentaire, nous avons également confirmé que le YAP2SA ne modifie pas l’activité d’une construction de promoteur minimal qui n’a pas les éléments contraignants MCAT TEAD(figure 2B).

Une deuxième expérience de contrôle a également été réalisée dans laquelle les cellules A375 ont été infectées par des constructions virales qui fournissent soit un shRNA de contrôle non-ciblage (shNTC) ou une construction avec des shRNAs tandem YAP et TAZ. Après une sélection stable, les cellules ont été co-transfected avec la construction PRL-TK et soit la construction de journaliste YAP/TAZ-TEAD ou la construction minimale de promoteur. Dans les cellules transfected avec la construction de journaliste YAP/TAZ-TEAD, le SHRNA YAP/TAZ a considérablement réduit les niveaux de luciferase des lucioles, mais le shNTC de contrôle n’a pas(figure 2C). Les niveaux de luciferase firefly n’ont pas été modifiés ni par le shNTC ou le SHRNA YAP/TAZ dans les cellules transposées par le promoteur minimal (figure 2C). Conformément aux résultats ci-dessus, le signal Renilla dans chaque puits n’a pas non plus été modifié de manière significative par le shNTC de contrôle ou le shRNA YAP/TAZ(figure 2C), indiquant en outre que la construction de contrôle PRL-TK n’est pas sensible à YAP ou TAZ. Collectivement, ces expériences montrent que le système de reporter se comporte comme prévu dans les cellules A375, ce qui est compatible avec les études précédentes utilisant ces vecteurs2,14.

Comme preuve de concept, nous avons examiné une petite bibliothèque de shRNA lentiviral dans les cellules A375. Notre bibliothèque d’essai contenait des shARN ciblant plusieurs gènes qui étaient auparavant montrés pour réguler la fonction YAP/TAZ dans d’autres types de cellules. Cependant, le rôle de plusieurs de ces gènes dans la régulation de YAP et TAZ dans le mélanome est inconnu. Notre bibliothèque comprenait des gènes qui sont nécessaires pour l’activité YAP/TAZ, tels que RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4, et CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38, et les gènes prévus pour inhiber l’activité YAP/TAZ, tels que CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR, et RB139,40,41,42,43,444, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. En tant que contrôles, nous avons inclus un tandem YAP/TAZ shRNA14, un shRNA de contrôle non-ciblage (shNTC), et un shRNA ciblant Src, que nous avons précédemment montré était nécessaire pour l’activité maximale YAP/TAZ dans les cellules A37514.

Les données brutes et l’analyse de cet écran sont affichées dans le tableau supplémentaire 2. Plusieurs shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 et shMAPK8-2) ont considérablement réduit le signal de Renilla luciferase par rapport au signal moyen de Renilla pour tous les puits, suggérant que ces shRNAs causaient la cytotoxicité dans les cellules A375. En effet, ces puits avaient beaucoup moins de cellules au moment de l’essai (non montré). Il est donc très difficile de distinguer les candidats qui peuvent réglementer YAP/TAZ de ceux qui sont essentiels à la survie cellulaire. Par conséquent, les résultats de ces échantillons sont exclus d’une analyse plus approfondie des données. Comme prévu, les shARN ciblant YAP et TAZ ou Src ont considérablement réduit l’activité YAP/TAZ-TEAD(figure 3). Conformément aux travaux publiés montrant que PIK3CA favorise l’activité de YAP et TAZ21,26,31, nous avons constaté que les shARN ciblant PIK3CA ont réduit les niveaux normalisés de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase. shRNAs ciblant ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN chacun a augmenté normalisé les niveaux de luciferase de luciole normalisée, ce qui est compatible avec les études publiées montrant que ces protéines répriment YAP et/ou TAZ39,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,544 . Malgré les rôles établis pour ATR, CCNE2, et ERBB4 dans d’autres types de cellules27,28,35,36,38,49,shRNAs ciblant ces gènes n’a pas modifié de manière significative normalisé les niveaux normalisés de luciferase de luciole dans les cellules A375. shRNAs ciblant EZH2 et RB1 a montré un effet sur les niveaux de luciferase de luciferase de luciole qui était opposé à ce qui était prévu basé sur des études dans d’autres types de cellules32,34,40,52. PTEN et RAF1 ont été ciblés par deux shARN distincts qui ont eu des effets opposés sur l’activité de luciferase. Des résultats incompatibles avec des études antérieures pourraient indiquer que l’influence de ces protéines sur la fonction YAP/TAZ-TEAD est dépendante du type cellulaire; cependant, il peut également être dû à une faible efficacité knockdown ou des effets hors cible par certains shRNAs. Comme un n 1 "aveugle" écran, certains faux positifs et faux négatifs seraient également attendus. Comme nous l’avons vu plus en détail dans la discussion, d’autres expériences de validation devraient être effectuées à l’aide d’autres essais tels que le QPCR pour les gènes qui sont réglementés par YAP et TAZ et les taches occidentales pour les modifications post-traductionnelles qui influencent la fonction YAP/TAZ. Cette validation comprendrait également la confirmation des shARN effectivement fait tomber la protéine d’intérêt. Il est également important de noter que puisque notre journaliste est sensible TEAD, tous les gènes identifiés par notre écran pourrait influencer TEADs, mais pas YAP et TAZ directement. Des études mécanistes de suivi seraient nécessaires pour déterminer si c’est YAP et/ou TAZ ou les TEA que la protéine identifiée régule. Cependant, YAP et TAZ sont les principaux moteurs de la transcription TEAD-négociée, il est donc probable que la plupart de ces gènes régulent YAP et TAZ. En effet, comme indiqué ci-dessus, la plupart des shRNAs qui ont frappé dans l’écran ciblent les protéines qui sont connus pour réguler YAP et / ou TAZ directement.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique du flux de travail. Les étapes critiques de ce protocole sont résumées avec des nombres d’étapes correspondant aux nombres du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Optimisation du système de reporter transcriptionnel bi-luciferase YAP/TAZ-TEAD. (A) A375 cellules exprimant de façon stable vecteur de lutte (MSCV-IRES-Hygro), LATS-insensible YAP (YAP2SA), ou LATS-insensible YAP incapable de lier TEADs (YAP2SA,S94A) ont été co-transfected avec le PRL-TK (Renilla) et pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP/TAZ-TEAD reporter) constructions et le signal de luciferase a été mesuré 24 heures plus tard. n 7 expériences indépendantes. (B) Les cellules A375 ont été co-transfected avec YAP2SA ou vecteur de contrôle, la construction PRL-TK, et soit la construction pGL3-5xMCAT (SV)-49 ou la construction pGL3 (SV)-49 (promoteur minimal) et le signal de luciferase a été mesurée 24 heures plus tard. n - 1 expérience transfected dans le quadruplicate. (C) Les cellules A375 ont été infectées par le rétrovirus codant un shRNA de contrôle non-ciblage (shNTC) ou tandem YAP et TAZ shRNAs (shYAP/TAZ). Après sélection stable, les cellules ont été co-transfected avec la construction PRL-TK et soit la construction pGL3-5xMCAT (SV)-49 ou le pGL3 (SV)-49 construction et le signal de luciferase a été mesuré 24 heures plus tard. n 4 infections indépendantes; L’importance statistique a été déterminée à l’aide d’ANOVA à sens unique suivi du test de comparaisons multiples de Tukey; n.s. - p’gt;0.05, p’lt;0.05, p’lt;0.01, p’lt;0.001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Résultats de l’écran représentatif. Le résultat de chaque vecteur de renversement est comparé à shNTC et présenté comme différence de pli. Le graphique à barres montre la moyenneRenilla du rapport luciferase des lucioles/Renilla luciferase et d’écart standard. n - 1 expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tube A - Dilution transfection
Réactif Volume
Tampon transfection 25 l par réaction
Transfection Reagent 2 (ajouter deuxième) 1,5 l par réaction
Tube B - Dilution reporter
Réactif Volume
Tampon transfection 25 l par réaction
20:1 Firefly luciferase reporter: contrôle Renilla mix (ajouter deuxième) 400 ng par réaction
Transfection Reagent 3 (ajouter troisième) 1 l par réaction
Total: 26,5 l par réaction

Tableau 1 : Préparation du mélange transfection. Pour la transfection dans chaque puits des plaques de 24 puits, 1,5 l de réactif transfection 2 est dilué en 25 L de tampon transfection pour produire la dilution transfection (tube A); tandis que 400 ng de 20:1 luciferase firefly reporter: contrôle Renilla mix et 1 L de transfection reagent 3 est dilué en 25 'L de Transfection Buffer pour produire la dilution journaliste (tube B).

Vecteurs existants/achetés/cadeaux
Vecteur Source
Vecteurs humains de shRNA lentiviral de L’IRP GE Soins de santé
VSVG VSVG Laboratoire Hynes [2]
psPAX2 (en) Addgene (#12260)
gag/pol Addgene (#14887)
pGL3-(SV)-49 Iain Farrance [15]
pGL3-5xMCAT (SV)-49 Iain Farrance [15]
PRL-TK Promega
MSCV-IRES-Hygro LABORATOIRE DE LAMAR [2]
MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro LABORATOIRE DE LAMAR [2]
MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 LABORATOIRE DE LAMAR [14]
Nouveaux vecteurs
Vecteur Source Backbone
MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro MSCV-IRES-Hygro

Tableau supplémentaire 1 : Tableau des vecteurs. Tous les vecteurs utilisés sont répertoriés avec de nouveaux vecteurs décrits. Des techniques de biologie moléculaire standard ont été utilisées pour générer de nouveaux vecteurs.

Tableau supplémentaire 2 : Analyse des données d’analyse d’analyse des données d’analyse d’analyse d’analyses d’analyse d’analyses d’analyse d’analyses de Luciferase. L’agencement de la bibliothèque shRNA est indiqué dans le premier tableau. Les deuxième et troisième tableaux montrent les signaux de luciferase bruts et renilla, respectivement. L’écart moyen et standard pour le signal de luciferase Renilla pour tous les puits est indiqué dans les boîtes jaunes. Wells avec un signal Renilla luciferase plus d’un écart standard en dessous de la moyenne sont mis en évidence avec du texte rouge et exclus de l’analyse plus approfondie. Le rapportluciole/Renilla de chaque puits a été obtenu en divisant le signal de luciferase de luciole brute par le signal brut Renilla luciferase (quatrième tableau). Le rapportluciole/Renilla de chaque puits a ensuite été normalisé par rapport à la moyenne du rapport luciole/Renilla des puits témoins (shNTC) (cinquième tableau).Renilla Les puits en double ont ensuite été calculés en moyenne pour chaque construction et l’écart standard a été calculé (sixième tableau). S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).

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Discussion

Dans cette étude, nous démontrons une approche pour le dépistage à débit moyen des bibliothèques virales de gamme en combinaison avec un essai de journaliste transcriptionnel à double base de luciferase qui peut être employé pour identifier et tester de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription. Il est essentiel de caractériser et d’optimiser le système de reporter pour chaque ligne cellulaire avant n’importe quel écran. Des expériences devraient être faites pour confirmer que le journaliste est sensible à l’activité altérée du facteur de transcription à l’étude et l’ampleur du changement d’activité doit être testée par rapport aux vecteurs de contrôle. La co-transfection de la construction PRL-TK avec la construction du journaliste est importante parce qu’elle aide à contrôler le nombre de cellules transfectedes par le journaliste et le numéro de copie de la construction du journaliste, qui peuvent tous deux modifier l’ampleur du signal de luciferase. Les expériences d’optimisation devraient également s’assurer que le facteur de transcription n’influence pas l’activité de la construction constitutive de Renilla ou une construction minimale de promoteur car ceci pourrait compliquer l’interprétation des résultats. Les contrôles à inclure dans la bibliothèque doivent également être soigneusement examinés. Ce protocole est conçu pour un «écran aveugle» des bibliothèques avec des centaines de shRNAs, où il n’est pas possible de confirmer knockdown efficace par chaque shRNA. Par conséquent, certains faux positifs et négatifs sont probables. L’augmentation du nombre de répliques techniques et/ou biologiques à l’écran pourrait aider à réduire le nombre de faux positifs et négatifs. Toutefois, cela augmentera également considérablement le nombre de puits à la culture et il faut donc veiller à ce que cela n’entraîne pas de conditions de culture sous-optimales (voir ci-dessous). Une autre approche pour réduire les faux positifs et négatifs serait de répéter l’écran entier dans la même ligne cellulaire ou des lignes cellulaires supplémentaires, ou de filtrer une bibliothèque plus petite, y compris seulement les «hits» en utilisant 3 répliques biologiques. Dans tous les cas, tous les hits doivent être validés à l’aide de lectures en dehors du journaliste, comme qPCR pour les gènes cibles connus. L’élimination efficace du gène ciblé doit également être confirmée dans ces étapes de validation. Les conclusions ne devraient pas être faites au sujet des shARN qui ne modifient pas l’activité à moins que le knockdown efficace par le shRNA soit confirmé. Les expériences de validation devraient également s’assurer que le facteur de transcription étudié est ce qui est réglementé par le gène ciblé et que ces gènes n’influencent pas les constructions de Renilla ou de promoteur minimal.

Il est également important d’optimiser les conditions de culture cellulaire pour chaque lignée cellulaire afin d’éviter des conditions sous-optimales telles que la sur-confluence, trop peu de cellules, une faible viabilité cellulaire ou une capacité de prolifération variable. La densité d’ensemencement cellulaire est particulièrement importante au moment de la transfection de la construction de la construction de reporter à double luciferase (étape 5) et lorsque l’activité du journaliste est mesurée (étape 6). L’efficacité de la transfection peut varier considérablement avec la densité cellulaire et une faible efficacité de transfection peut entraîner des résultats anormaux si seulement une petite fraction de la population cellulaire est analysée. La plupart des lignées cellulaires testées montrent l’efficacité de transfection la plus élevée lorsqu’elles sont à 40 à 60 % de confluence, mais il est recommandé que les conditions de transfection et la densité d’ensemencement soient optimisées pour une lignée cellulaire donnée à l’aide d’un vecteur qui fournit une protéine fluorescente. Les lignées cellulaires difficiles à infecter et/ou transfectées, telles que les cellules primaires, peuvent ne pas convenir à cet écran. Une faible efficacité de transfection de journaliste ou une faible viabilité cellulaire entraînent généralement un signal très faible de Renilla luciferase. Cependant, une expérience pilote devrait être effectuée pour déterminer la portée du signal de la luciferase rennière d’une ligne cellulaire. Il est important que le théal du virus produit à partir de la bibliothèque à bord est assez élevé pour donner une efficacité d’infection d’au moins 30% dans la lignée cellulaire étant analysée. L’efficacité de l’infection peut varier considérablement et plusieurs facteurs peuvent influencer le titer viral. La quantité de supernatant viral utilisé doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire et si nécessaire, l’étape 2 peut être optimisée davantage pour améliorer les titres viraux.

La densité cellulaire et la viabilité cellulaire peuvent également influencer l’activité des voies cellulaires qui régulent les facteurs de transcription, il est donc essentiel de semer les cellules pour la transfection du journaliste de sorte qu’ils sont tous à une densité similaire le jour où le test de double luciferase est lu (étape 6). Il est également important de s’assurer que les cellules adhèrent uniformément à travers le puits plutôt que de se regrouper dans un patch dense au centre. Comme décrit ci-dessus, une variation significative du signal de luciferase Renilla de puits à puits peut entraîner des données difficiles à interpréter. Il est préférable d’exclure les puits qui montrent une réduction significative du signal de la luciferase de Renilla par rapport à tous les autres puits, car cela suggère que soit le vecteur viral réduit la viabilité cellulaire ou l’efficacité de la transfection pour ce puits était très faible. Ici, nous avons exclu les puits supérieurs à 1 déviation standard du signal moyen Renilla luciferase, mais des expériences d’optimisation devraient être faites pour déterminer les coupures appropriées pour chaque ligne cellulaire. Il est également possible que les shARN qui réduisent la viabilité cellulaire pourraient le faire en modifiant l’activité du facteur de transcription étant analysée. S’il s’agit d’une préoccupation, les shARN qui réduisent le signal de la luciferase rennière pourraient être ré-testés à l’aide d’androite inductibles ou d’autres essais. Il est également essentiel de limiter le temps pendant lequel les cellules adhérentes sont en suspension après la trypsinisation. Utilisez une pipette multicanal pour la plupart des étapes pendant la trypsinisation et l’ensemencement des cellules, et pour les écrans plus grands, travailler avec les plaques en lots. En outre, il est préférable de limiter le temps entre l’infection des cellules et l’analyse du journaliste. Ceci est particulièrement important si le facteur de transcription étant analysé régule la prolifération cellulaire ou la survie. Dans ce cas, les cellules avec knockdown efficace serait surpassé par des cellules avec knockdown moins efficace.

Plusieurs modifications du protocole décrit sont réalisables. Cette approche peut être utilisée efficacement pour identifier les régulateurs de tout facteur de transcription si un journaliste basé sur la luciferase est généré, et pour bon nombre des facteurs de transcription les plus courants des constructions journaliste existent déjà. Ce protocole peut être modifié pour l’utilisation d’une grande variété de bibliothèques disponibles dans le commerce ou assemblées manuellement, y compris les ARNI, CRISPR/CAS9, ORF ou cDNA. En effet, nous avons déjà utilisé une stratégie similaire pour tester une petite bibliothèque d’ADN pour les régulateurs YAP/TAZ14. Les bibliothèques peuvent être livrées à l’aide de rétrovirus, de lentivirus, d’adénovirus ou de transfection transitoire. La protéine de manteau viral utilisée ici (VSVG) génère le lentivirus qui est humain-infectieux. Si des cellules rongeurs sont utilisées et que le virus écotropic infectieux non humain est souhaité, un vecteur fournissant la protéine de pelage Eco peut être utilisé au lieu de VSVG.

D’autres méthodes peuvent être utilisées pour filtrer les bibliothèques pour les régulateurs d’un facteur de transcription. L’accès à une installation de dépistage à haut débit permettrait le dépistage automatisé des bibliothèques beaucoup plus grandes. De même, des écrans à l’échelle du génome peuvent être effectués à l’aide de bibliothèques mises en commun avec un séquençage profond comme moyen d’identifier les « hits ». Cependant, ces deux approches nécessitent un équipement qui n’est pas accessible à de nombreux chercheurs, et les frais de dépistage à haut débit ou de séquençage profond peuvent être prohibitifs. En outre, les écrans mis en commun nécessiteraient le tri des cellules à l’aide d’un journaliste fluorescent ou d’une autre façon d’enrichir les cellules qui montrent les changements souhaités dans l’activité transcriptionnelle. Le dépistage des bibliothèques d’expression à grande échelle à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase a déjà été démontré à l’aide d’un robot de banc55, mais ce n’est pas couramment disponible pour tous les chercheurs. En revanche, la méthode décrite ici est rapide, à débit moyen, relativement peu coûteux, et utilise de l’équipement et des réactifs qui sont probablement accessibles à la plupart des enquêteurs. Cette méthode peut révéler plusieurs régulateurs dans une seule expérience, qui est un moyen rentable et pratique de découvrir des voies réglementaires potentielles en amont d’un facteur de transcription.

Dans l’approche décrite, les gènes candidats ont été renversés de façon stable, puis après sélection, les constructions du journaliste ont été transitoirement transfected dans les cellules. Cependant, l’efficacité de la transfection est faible dans de nombreuses lignées cellulaires et peut introduire la variabilité et causer la toxicité cellulaire. Une approche alternative améliorée serait d’intégrer de façon stable la construction du journaliste dans le génome de la lignée d’intérêt cellulaire, puis d’infecter les cellules exprimant les journalistes avec les bibliothèques virales pour le dépistage. Cette amélioration réduirait la variabilité introduite par la passation transitoire et empêcherait tout changement potentiel dans l’activité du facteur de transcription dû à la culture post-infection prolongée. Comme mentionné ci-dessus, l’utilisation d’un petit robot de banc permettrait de rationaliser considérablement le processus et d’augmenter la taille des bibliothèques qui pourraient être examinées. Une autre modification considérable consiste à utiliser des bibliothèques vectorielles inductibles à la portée, ce qui réduirait la probabilité de sélection par rapport aux cellules ayant un renversement plus efficace et réduirait la variabilité causée par des changements dans la viabilité cellulaire.

Un défi important qui empêche le traitement efficace de nombreux cancers est que les cellules tumorales acquièrent une résistance même aux thérapies ciblées les plus efficaces. L’identification des protéines qui sont nécessaires pour cette résistance thérapeutique est nécessaire pour améliorer les résultats du patient. L’approche décrite pourrait facilement être utilisée en combinaison avec des thérapies ciblées pour révéler des gènes qui causent une sensibilité ou une résistance accrue à ces composés. Une autre application future potentielle de cette approche serait d’utiliser ce dépistage à l’échelle pour tester les cibles thérapeutiques des candidats en combinaison. Pour cela, les cellules seraient infectées par deux vecteurs viraux chacun dans le but d’identifier les protéines qui ont un effet synergique sur l’activité des facteurs de transcription.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Emily Norton et Mikaelan Cucciarre-Stuligross d’avoir participé à la préparation des vecteurs de shRNA. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention Susan G. Komen Career Catalyst qui a été décernée à J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

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Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase
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Xiao, Y., Lamar, J. M.… More

Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

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