Summary
전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.
Abstract
전사 인자는 항암 치료에 대한 좋은 표적을 만드는 다양한 다운스트림 과정에 영향을 미치는 수많은 표적 유전자의 발현을 바꿀 수 있습니다. 그러나, 직접 표적화 전사 인자는 종종 어렵고 전사 인자가 하나 이상의 성인 조직에서 필요한 경우 부작용을 일으킬 수 있다. 암세포에서 전사 인자를 비정상적으로 활성화시키는 업스트림 레귤레이터를 식별하는 것은 특히 이러한 단백질이 약물이 쉬운 경우 보다 실현 가능한 대안을 제공합니다. 여기서, 우리는 암세포에서 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하기 위해 배열된 중간 규모의 렌티바이러스 라이브러리 및 이중 루시퍼라제 기반 전사 리포터 분석기를 결합하는데 사용될 수 있는 프로토콜을 기술한다. 우리의 접근은 단 하나 실험에 있는 유전자의 수백을 시험하는 빠르고, 쉽고, 저렴한 쪽을 제안합니다. 이러한 접근법의 사용을 입증하기 위해, 우리는 예관련 단백질(YAP) 및 전사 공동 활성제와 PDZ 결합 모티프(TAZ)의 여러 조절제를 포함하는 배열된 렌티바이러스 RNAi 라이브러리의 스크린을 수행하였고, 이는 하마 통로의 하류 이펙터인 2개의 전사 공동 활성제이다. 그러나, 이 접근은 거의 모든 전사 요인 또는 공동 요인의 레귤레이터를 위해 스크린하기 위하여 수정될 수 있고 또한 CRISPR/CAS9, cDNA, 또는 ORF 라이브러리를 검열하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
Introduction
이 분석의 목적은 바이러스 성 라이브러리를 사용하여 상대적으로 빠르고 저렴한 방식으로 전사 인자의 조절자를 식별하는 것입니다. 비정상적인 전사 활성은 암 및 전이1,2,23,34,45,6,,6따라서 암세포에서 전사 인자를 표적으로 하는 것은 유망한 치료 접근법이다. 그러나, 전사 인자는 종종 약리학적으로표적화하기 어렵고 많은 것이 성인 조직에서 정상적인 세포 기능에 요구되며8,,9,,10. 질병을 유도하기 위하여 전사 인자를 비정상적으로 활성화하는 암 관련 통로를 표적으로 하는 것은 보다 적게 가혹한 부작용이 있을 가능성이 있는 더 실행 가능한 접근입니다. 배열된 렌티바이러스 및 레트로바이러스 RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA 또는 ORF 라이브러리의 상업적 가용성은 연구원이 단일 실험에서 수많은 유전자의 중요성을 테스트할 수 있게 합니다. 그러나 변경된 전사 활동에 대한 신뢰할 수 있는 판독이 필요합니다.
여기에서, 우리는 암세포에 있는 전사 인자를 조절하는 단백질을 확인하기 위하여 이중 luciferase 기지를 둔 전사 기자 분석및 배열된 lentiviral 도서관의 사용을 기술합니다. 이 분석에서, 표적 암 관련 유전자가 렌티바이러스 전달을 통해 포유류 암 세포로 전달되고 세포는 puromycin을 사용하여 안정된 통합을 위해 선택된다. 세포는 조사되고 있는 전사 인자에 특이적인 프로모터에 의해 구동되는 반딧불 루시퍼라아제를 발현하는 리포터 구조로 다음에 형질감염되고, 조사되고 있는 전사 인자에 반응하지 않는 구성활성 프로모터로부터 레닐라 루시퍼라을 발현하는 제어 컨스트럭트. 우리는 YAP 및 TAZ, 하마 경로8,,10,,11의중요한 다운 스트림 이펙터의 규제 기관에 대한 개념 증명 화면으로이 접근 방식을 보여줍니다. YAP 및 TAZ의 비정상적인 활성은 전이성캐스케이드(11)의 여러 단계를 촉진하고 많은 암11,,12,,13에서관찰된다. 그러나, YAP와 TAZ가 몇몇 암세포에서 비정상적으로 활성화되는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. YAP와 TAZ는 DNA를 결합하지 않고, 대신 다른 전사 인자에 의해 발기인에게 모집됩니다. 전사 인자의 TEA 도메인 (TEAD) 가족의 구성원은 YAP 및 TAZ에 대한 주요 결합 파트너이며 대부분의 YAP 및 TAZ 의존적 기능에 중요합니다. 우리의 기자 구성은 YAP/TAZ-TEAD 반응 프로모터로부터 반딧불 루시퍼라아제를 표현하고 이전 연구는 YAP-TEAD 및 TAZ-TEAD 전사 활성2,,14,,15의변화를 충실하게 검출한다는 것을 입증하였다.
당사의 접근 방식은 신속하고 중간 처리량이며 스크리닝 시설, 자동화 된 로봇 또는 풀링 된 라이브러리의 깊은 시퀀싱이 필요하지 않습니다. 비용은 상대적으로 낮으며 상업적으로 이용 가능한 라이브러리가 많이 있습니다. 필요한 장비와 시약은 또한 대부분의 실험실에서 상대적으로 표준입니다. 루시퍼라제 기반 리포터가 존재하거나 생성되는 경우 거의 모든 전사 계수의 조절자를 스크리브하는 데 사용할 수 있다. 우리는 암세포에 있는 shRNAs를 스크린하기 위하여 이 접근을 이용합니다, 그러나 적당한 효율성으로 형질전환될 수 있는 어떤 세포주든지 배열된 도서관의 어떤 모형든지로 이용될 수 있었습니다.
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Protocol
참고: 이 프로토콜의 회로도 요약은 그림 1에나와 있습니다.
1. 렌티 바이러스 벡터 라이브러리 준비
참고 : 시연 된 화면은 96 웰 플레이트에서 글리세롤 주식으로 구입 한 배열 된 shRNA 라이브러리를 사용했지만 라이브러리는 후보 목록을 기반으로 수동으로 조립 할 수도 있습니다. 적절한 컨트롤을 고려하고 라이브러리에 포함해야 합니다. 이는 비표적대조군 shRNA(shNTC), 조사중인 전사 인자를 표적으로 하는 대조군 shRNA를 포함하며, 가능하다면, 반딧불 루시퍼라아제를 표적으로 하는 shRNA를 포함한다.
- 1.3 mL의 루리아 국물 (LB) (1 % 바토 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 1 % NaCl, pH 7.5)을 100 μg / mL의 암피실린을 함유 한 96 웰 딥 웰 플레이트의 각 우물에 추가하십시오. 글리세롤 스톡 2 μL로 각 우물을 접종하고 225 rpm에서 일정한 교반으로 밤새 37 °C에서 성장합니다.
- 각 세균 배양을 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 21,000 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 박테리아를 펠렛한다.
- 제조자의 프로토콜에 따라 세균 미니 준비 키트를 사용하여 각 벡터를 정화합니다.
- 분광광도계를 사용하여 각 벡터의 농도를 결정합니다.
- 플라스미드를 -20°C에 보관합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
2. 배열 된 렌티 바이러스 라이브러리의 포장
참고 : 감염 된 세포의 포장, 감염 및 후속 배양을 포함하여 렌티 바이러스와 관련된 모든 작업은 엄격하게 제도적 생물 안전 규칙 및 규정을 따라야합니다.
- 완전한 성장 배지(Dulbecco의 변형 된 이글 배지(DMEM)를 사용하여 4mMM L-글루타민을 함유하는 293FT 세포를 확장, 4,500 mg/L 포도당과 나트륨 피루브산, 10% 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 100 단위 / mL, 100 μg / mL 스트렙토 마이신 항생제 및 2 mM L-글루타민으로 보충.
- 1.4단계에서 라이브러리의 각 벡터에 대해, 1 x 105 293FT 셀을 가진 1개의 24웰 시드를 시드한다.
참고: 3단계로 진행하기 전에 대조군 바이러스 벡터의 일부 추가 웰을 패키징하고 바이러스의 적기를 테스트하는 데 사용하는 것이 좋습니다(아래 참조). - 37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다.
참고: 이전에설명한 렌티바이러스 포장에 대한 일반적인 프로토콜은 이 프로토콜에 대해 24개의 웰로 축소되었습니다. 렌티바이러스 포장에는 psPAX2를 사용하고 VSVG를 코트 단백질로 사용합니다. 에스트로픽 바이러스가 필요한 경우 VSVG 대신 Eco를 제공하는 벡터를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표적 세포의 30%-70% 감염 효율을 제공하는 바이러스 성 적기를 달성하도록 최적화되는 것이 좋습니다(토론 참조). 사용된 모든 벡터 목록은 보충 표 1을 참조하십시오. - 아래에 설명된 바와 같이 단계 1.4로부터 각 바이러스 벡터에 대한 형질감염 혼합물을 설정한다. 각 형질감염은 바이러스 벡터의 250 ng, psPAX2의 125 ng, VSVG의 125 ng, 형질감염 시약 1의 1.25 μL 및 23.75 μL의 형질전환 버퍼를 포함해야 한다(재료 표참조).
- 각 렌티바이러스 벡터를 뉴클레아제없는 물로 50 ng/μL로 희석한 다음 5 μL (250 ng)을 96웰 PCR 플레이트의 우물로 옮니다.
- "X"가 총 형질 감염 수와 파이펫 팅 중 부피 손실을 고려한 몇 가지 추가 형질 전환 버퍼의 1.25 μL * X형형질 시약 1 및 23.75 μL * X를 혼합하여 형질감염 슈퍼 믹스를 만듭니다.
- 5 분 동안 실온에서 형질 전환 슈퍼 믹스를 배양.
- 2.4.3 단계에서 트랜스펙션 슈퍼 믹스 튜브에 psPAX2 및 125 ng * X의 125 ng * X를 추가하고 부드럽게 위아래로 파이펫을 섞습니다. 2.4.5단계로 빠르게 진행합니다.
- 즉시 단계 2.4.4에서 PCR 스트립의 각 튜브로 혼합물을 알리쿼트한 다음, 다중 채널 파이펫을 사용하여 25 μL의 혼합물을 단계 2.4.1로부터 바이러스 벡터를 함유하는 각각의 웰내로 이송한다.
- 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- 2.4.6단계에서 각 96웰로부터 30 μL을 2.3단계에서 293개의 FT 셀을 함유하는 24웰의 웰로 이송한다.
- 37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양한 다음 24웰 플레이트의 모든 웰에서 500 μL의 신선한 완전 성장 매체로 미디어를 교체합니다. 37°C에서 세포를 5%CO2로 배양하여 다른 24시간 동안 배양합니다.
- 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 각각의 웰및 aliquot 220 μL (3 단계에서 1 감염에 충분하고 약간의 추가 부피)에서 바이러스 상급체를 2 개의 96 웰로 수집합니다. 이들은 배열 된 바이러스 상판 플레이트입니다.
- 배열된 바이러스 상층 판을 -80°C에 보관한다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 또한 3단계로 진행하기 전에 감염될 세포에 패키징된 추가 제어 바이러스(위 참조)를 테스트하는 것이 좋습니다. 이는 적시자가 적어도 30% 감염 효율을 달성하기에 충분한지 확인하기 위한 것이다.
3. 스크린을 위한 세포의 감염
참고 : 인간 흑색종 세포 (A375)는이 접근법을 입증하는 데 사용되었지만,이 방법은 렌티 바이러스로 감염되는 모든 부착 세포에 적용 될 수 있습니다. 그러나, 세포 배양 및 도금 조건은 각 세포주별로 최적화되어야 한다(토론 참조).
- 완전한 성장 매체에 감염되는 세포를 확장한다.
- 종자 24-웰 플레이트와 1 x 105 세포를 0.5 ml의 완전한 성장 매체당. 시드는 각 바이러스 벡터에 대해 잘 테스트(대조군 포함)하고 3.7단계에서 약물 선택을 위한 대조군역할을 할 감염되지 않을 여분의 웰을 포함한다.
- 37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다.
- 3.2단계에서 각각 의기류로부터 상이한 바이러스성 상상류를 다음과 같이 동결배열된 렌티바이러스 상수체로 각각 잘 감염시켰다.
- 20 μg/mL 폴리브렌을 포함하는 완전한 성장 매체를 준비하십시오.
- 2.7단계에서 상온으로 배열된 렌티바이러스 라이브러리 과민제를 해동한다.
- 3.2단계로부터 24웰 플레이트로부터 성장 매체를 흡인하고 즉시 각 웰에 200 μL의 폴리브레인 함유 성장 매체를 첨가한다.
- 다중 채널 파이펫을 사용하여, 단계 3.4.2에서 24 웰에 각 96 웰에서 바이러스 상류의 200 μL을 전송 3.4.3.
- 24-48 h에 대해 5%CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다.
참고: 몇몇 세포주 shRNA를 표현하고 puromycin 저항하기 위하여 24 시간 이상 요구할 수 있습니다. 여기서 사용되는 바이러스 벡터는 3'UTR의 puroR에서 miR30-기반 shRNA를 이용한 터보-GFP-IRES-puroR를제공한다(도 1). 감염 효율 및 puromycin 저항 성 유전자 및 shRNA의 발현은 녹색 형광 단백질에 의해 모니터링되었다. - 2.5 μg/mL 푸로마이신을 포함하는 완전한 성장 매체를 준비하십시오.
참고 : puromycin의 선택 농도는 세포주에 따라 다릅니다. 각 세포주마다 항생제 사살 곡선을 투여하여 스크린 에 앞서 분석하는 것이 좋습니다. - 각 웰로부터 매폐를 흡인하고 500 μL의 푸로마이신 함유 완전 성장 매체로 교체한다.
참고 : 또한 puromycin 선택이 완료되도록 후속 단계에서 사용할 수있는 제어 비 감염 잘에 puromycin을 추가해야합니다. - 48 시간 동안 5 %CO2로 37 °C에서 세포를 배양하십시오.
참고 : 48 h를 선택하는 것이 가장 좋습니다, 그래서 도금 밀도와 바이러스 성가기는 세포가 48 시간 이전에 과잉 되지 않도록 최적화되어야한다. - 감염된 세포가 형광 현미경 의 밑에 녹색이고, puromycin으로 잘 처리된 통제에 세포가 4단계로 진행하기 전에 모두 죽은다는 것을 확인하십시오.
4. 이중 루시퍼라아제 리포터의 형질전환용 시종 세포
참고: 각 새로운 세포주에 대한 최적의 시드 밀도를 결정하기 위해 테스트 형질감염이 이루어져야 합니다.
- 트립시니화 단계 3.9에서 각 웰을 전송하고 다음과 같이 새로운 24-웰 플레이트에 해당 위치에서 우물로 대략 1 x 105 셀을 전송합니다.
참고: 이 프로토콜은 수백 개의 shRNA가 있는 라이브러리의 스크리닝을 위해 설계되었기 때문에 감염된 세포의 모든 우물을 계산하는 것은 불가능합니다. 따라서, 아래 단계는 대략 동등한 도금 밀도를 보장하기 위해 각 우물의 셀 수를 추정하는 데 사용되었다.- 3.9단계에서 3-4그룹으로 웰을 그룹화하여 그룹의 모든 웰이 유사한 세포 밀도를 갖도록 한다.
- 트립시니화 1 각 그룹에서 잘 1 트립신-EDTA의 200 μL (1 x PBS 보충 0.5 mM EDTA 와 0.1% 트립신) 5 분 동안 37 °C. 그런 다음 완전한 성장 매체를 함유하는 400 μL의 푸로마이신을 첨가하여 트립신-EDTA를 중화시켰다.
- 각 대표자 수를 잘 계산하여 전체 성장 매체를 사용하여 각 대표자로부터 세포 현탁액을 2 x 105 셀/mL로 잘 희석한다.
- 종자 0.5 mL (1 x 105 세포) 단계 4.1.3에서 새로운 24 웰 플레이트상에 해당 위치로 각 웰을 배양하고 37 °C에서 5 %CO2로 24 시간 동안 이 새로운 24 웰 플레이트를 배양합니다.
- 단계 4.1.1에서 각 그룹에 대해, 4.1.3 단계에서 결정된 총 셀 번호를 사용하여 결과 셀 서스펜션이 1 x 106 셀/mL이 되도록 각 웰에 추가할 트립신-EDTA의 부피를 계산합니다.
- 각 웰에 트립신-EDTA의 적절한 부피를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
참고 : 더 큰 화면의 경우 세포의 생존가능성을 보장하기 위해 24 웰 플레이트가 한 번에 아닌 그룹으로 트립시니화되고 보충되는 것이 좋습니다. - 상기 배양 동안, 다중 채널 파이펫을 사용하여 새로운 24웰 플레이트상에 상응하는 웰에 400 μL의 퓨로마이신 함유 완전 성장 매체를 첨가한다.
- 4.1.7단계에서 제조된 새로운 24웰 플레이트상에서 각각의 웰으로부터 100 μL의 셀 현탁액(약 1 x 105 셀)을 이송한다.
- 단계 4.1.6에서 4.1.8을 반복하여 단계 4.1.1에서 그룹화 된 우물의 모든 플레이트에 대해 한 번에 한 접시를 반복합니다.
- 37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다.
5. 이중 루시퍼라제 기자의 변형
- 4.2단계에서 각각 잘 트랜스펙트 하는 이중 루시퍼라아제 리포터는 다음과 같이 구성한다.
참고: 레닐라 루시퍼라제 벡터를 제어하는 반딧불 루시퍼라아제 리포터 벡터의 총 DNA 량 및 최적 비율은 이 분석기를 시작하기 전에 결정되어야 한다. 여기서, 20개의 반딧불이 루시퍼라제 리포터와 1개의 부품 대조군 레닐라 루시퍼라아제를 포함하는 DNA 혼합물의 400ng을 사용하였다.- 각 시약의 지시된 부피를 혼합하여 형질전환 혼합물(튜브 A)과 리포터 희석 혼합물(TubeTable 1B)을 확인하여 총 형질감염 수(플러스 몇 가지 추가)를 곱하였다.
참고: 이 프로토콜은 트랜스펙션 시약 2에 최적화되어 있습니다(재료 표참조). 다른 형질감염 시약을 사용하는 경우, 이 단계 이전에 형질감염이 최적화되어야 한다. - 형질감염 혼합물(튜브 A)을 리포터 희석 혼합물(튜브 B)과 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하여 형질감염 혼합물을 생성한다.
- 상기 배양 동안, 4.2단계에서 인산완충염수(PBS)의 0.25 mL로 각 24웰을 헹구고, 각각의 웰에 447 μL의 완전한 성장 매체를 첨가한다.
- 15분 배양 후, 다중 채널 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에 53 μl의 형질전환 혼합물을 분배한다.
- 각 시약의 지시된 부피를 혼합하여 형질전환 혼합물(튜브 A)과 리포터 희석 혼합물(TubeTable 1B)을 확인하여 총 형질감염 수(플러스 몇 가지 추가)를 곱하였다.
- 37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다.
6. 이중 루시퍼라아제 활성의 정량화
- 하기 아래에 설명된 바와 같이 플레이트 리더 및 이중 루시퍼라제 리포터 분석 키트를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
참고: 이 프로토콜은 표시된 리포터 분석 키트(재료 표참조)에 최적화되어 있으며 제조업체의 권장 프로토콜을 따릅니다.- 모든 웰에 대해 충분한 1x 수동 용해 버퍼를 준비하고 5x 수동 용해 버퍼(키트에 제공)를 탈이온수로 1-5로 희석하여 몇 가지 추가(웰당 75 μL필요)를 준비합니다. 또한 시약 A 및 시약 B 버퍼를 해동합니다(키트에 제공, 각 웰에 대해 각각 100 μL이 필요하다).
- 5.2 단계에서 24 웰 플레이트의 각 웰로부터 미디어를 흡인합니다.
- 각 웰에 75 μL의 1x 수동 용해 버퍼를 추가하고 가끔 흔들면서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 해동된 시약 B 완충액으로 50x 시약 B 기질(키트에 제공)을 1:50으로 희석하여 시약 B를 준비한다.
- 블랭킹을 위해 4개의 웰에 1x 수동 용해 버퍼 30 μL을 추가합니다(보충 표 2참조).
- 6.1.3단계에서 30 μL의 용해액을 96웰 의 평평한 바닥 백색 분석 판의 중복 우물로 옮김.
- 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 50 μL의 시약 A를 추가하고 플레이트 리더가있는 반딧불 루시 퍼라제 신호를 읽습니다.
- 다중 채널 파이펫을 사용하여 6.1.4 단계에서 50 μL의 시약 B를 각 우물에 추가하고 플레이트 리더가 있는 Renilla 루시퍼라제 신호를 판독합니다.
- 원시 데이터를 다음과 같이 처리합니다(자세한 설명은 보충 표 2참조).
- 낮은 값이 바이러스 구조가 독성 또는 너무 적은 형질 감염 세포가 분석되었다는 것을 나타내기 때문에 매우 낮은 Renilla luciferase 신호와 샘플을 제외합니다.
참고: 토론에서 설명한 대로, 상당히 "낮은" 레닐라 루시퍼라아제 신호는 비정상적인 결과를 초래할 수 있습니다. 여기서, 레닐라 루시퍼라아제 신호가 평균 이하의 1표준 편차 이상인 웰을 배제하였다(보충표 2참조). 이는 이들세포(14)에서이 리포터 시스템을 사용하여 수행된 이전 연구에 기초하였으나, 다른 세포주에서 다를 수 있다. - 반딧불/레닐라 비율을 얻기 위해 동일한 웰의 원시 레닐라 루시퍼라아제 값으로 각각의 원시 반딧불 루시퍼라아제 값을 정규화한다.
- 모든 복제 제어 우물의 반딧불 /레닐라 비율을 평균하고 배 변화를 얻기 위해 그 숫자로 다른 모든 우물의 반딧불 /레닐라 비율을 분할합니다.
- 컨트롤 샘플을 할당하고반딧불/레닐라 비율 값을 1로 설정합니다.
- 표준 편차로 중복 우물과 플롯의 반딧불 /레닐라 비율을 평균화합니다.
참고: 표준 편차는 통계 분석에 사용되지 않고 복제본이 크게 다른 웰을 식별하는 수단으로 사용됩니다.
- 낮은 값이 바이러스 구조가 독성 또는 너무 적은 형질 감염 세포가 분석되었다는 것을 나타내기 때문에 매우 낮은 Renilla luciferase 신호와 샘플을 제외합니다.
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Representative Results
우리의 YAP/TAZ-TEAD 리포터 구조(pGL3-5xMCAT(SV)-492,,14,,15)는반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 구동하는 정준적 TEAD 결합 요소(MCAT)15의 5회 반복을 가진 최소한의 SV-49 프로모터를 함유하고 있다(도1). 그것은 PRL-TK 대조군 벡터(Promega)와 함께 세포내로 병용되어, 이는 구성적으로 활성HSV TK 프로모터로부터 레닐라 루시퍼라제를 발현한다(도1). YAP/TAZ-TEAD 리포터 구문이 테스트 중인 세포주에서 예상대로 작동하도록 하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 먼저 PRL-TK 및 pGL3-5xMCAT (SV)-49 구아를 A375 세포로 공동 형질감염시켜 대조군 벡터, YAP(YAP2SA)의고활성 LATS 무감각 돌연변이체 또는 TEADs(YAP2SA,S94)를결합할 수 없는 돌연변이체를 안정적으로 발현한다.2SA 예상대로, 반딧불 루시퍼라아제 활성은 YAP2SA에의해 현저하게 증가하였으나, 대조군 벡터 또는 YAP2SA, S94A(도 2A)는그렇지 않았다. 이는 YAP가 TEAD 의존적 방식으로 YAP/TAZ-TEAD 리포터의 활동을 증가시킨다는 것을 시사한다. 중요 한 것은, YAP2SA 크게 레닐라 루시 퍼 라제의 수준을 변경 하지 않았다. 추가적인 대조군으로서, 우리는 또한 YAP2SA가 MCAT TEAD 결합 요소가 결여된 최소 프로모터 구문의 활성을 변화시키지 않는다는 것을 확인하였다(도2B).
두 번째 대조군 실험은 또한 A375 세포가 비 표적 대조군 shRNA (shNTC) 또는 탠덤 YAP 및 TAZ shRNA를 가진 구조물을 전달하는 바이러스 성 구조로 감염되었다는 것을 행하였다. 안정한 선택 후, 세포는 PRL-TK 구문 및 YAP/TAZ-TEAD 리포터 구문 또는 최소 프로모터 구문으로 공동 형질감염되었다. YAP/TAZ-TEAD 리포터 구조로 형질감염된 세포에서, YAP/TAZ shRNA는 반딧불 루시퍼라아제 수준을 현저히 감소시켰지만, 대조군 shNTC는 그렇지않았다(도 2C). 반딧불 루시퍼라아제 수준은 최소 프로모터로 형질감염된 세포에서 shNTC 또는 YAP/TAZ shRNA에 의해 변경되지않았다(도 2C). 상기 결과와 일치하여, 각 웰의 레닐라 신호는 또한 제어 shNTC 또는 YAP/TAZ shRNA(도2C)에의해 유의하게 변경되지 않았으며, PRL-TK 제어 컨포셔션이 YAP 또는 TAZ에 반응하지 않는다는 것을 더욱 나타낸다. 전체적으로, 이러한 실험은 리포터 시스템이 A375 세포에서 예상대로 행동하고 있음을 보여 주며, 이는 이들 벡터2,,14를사용하는 이전 연구와 일치한다.
개념 실험의 증명으로, 우리는 A375 세포에 있는 작은 lentiviral shRNA 라이브러리를 검열했습니다. 우리의 시험 라이브러리는 그밖 세포 모형에 있는 YAP/TAZ 기능을 통제하기 위하여 이전에 보인 몇몇 유전자를 표적으로 하는 shRNAs를 포함했습니다. 그러나, 흑색종에 있는 YAP와 TAZ의 규칙에 있는 이 유전자의 몇몇의 역할은 불명합니다. 우리의 라이브러리는 RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4 및 CCNE2,16,,17,18,,19,,20,,21,,22,, 23,,24,,25,,26,,27,,28, 29, 29와28, 같은 YAP/TAZ 활동에 필요한 유전자를 포함했습니다. 30,31,32,33,34,35,36,,,38,,38,CSK, ERBB2, ATM, CDH1, 겔솔린 (GSN), PTEN, ATR 및 RB139,40,41,41,43,44, 44 와 같은 YAP / TAZ 활동을 억제 할 것으로 예상되는 유전자, 45,46,47,48,49 ,50,,51,52,53,54.50 대조군으로서, 우리는 탠덤 YAP/TAZ shRNA14,비표적대조군 shRNA(shNTC) 및 이전에 보여준 shRNA 표적화 Src를 포함시켰으며, 이는 A375 세포14에서최대 YAP/TAZ 활성에 필요하였다.
이 화면의 원시 데이터 및 분석은 보충 표 2에나와 있습니다. 몇몇 shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 및 shMAPK8-2)는 모든 웰에 대한 평균 레닐라 신호에 비해 레닐라 루시퍼라아제 신호를 현저히 감소시켜 이러한 shRNA가 A375 세포에서 세포 독성을 유발했음을 시사합니다. 실제로 이러한 우물은 분석 의 시간에 상당히 적은 세포를 했다 (도시되지 않음). 이것은 세포 생존을 위해 필수적인 것과 YAP/TAZ를 통제할 수 있는 후보를 구별하는 것을 아주 어렵게 만듭니다. 따라서 이러한 샘플의 결과는 추가 데이터 분석에서 제외됩니다. 예상대로, yAP 및 TAZ 또는 Src를 대상으로 하는 shRNAs는 YAP/TAZ-TEAD 활성을 현저히 감소시켰습니다(그림3). PIK3CA가 YAP 및 TAZ 활동21,,26,,31을촉진한다는 것을 보여주는 출판 된 작업과 일치하여 PIK3CA를 대상으로 하는 shRNAs가 정규화 된 반딧불 루시퍼라아수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다. shRNAs 대상 ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN 각각 증가 정규화 반딧불 luciferase 수준, 이러한 단백질이 YAP 및 / 또는 TAZ39를억압하는 것을 보여주는 출판 된 연구와일치,41,,42,,43,,45,,46,47,,48,,,50,,51,51,,54 53 . ATR, CCNE2 및 ERBB4에 대한 확립된 역할에도 불구하고 다른 세포유형27,,28,,35,,36,,38,,49,shRNAs는 이러한 유전자를 표적으로 하여 A375 세포에서 정규화된 반딧불 루시퍼라아아수준을 크게 변화시키지 않았다. shRNAs는 EZH2 및 RB1을 표적으로 하여 다른 세포 유형32,,34,,40,,52의연구에 기초하여 기대했던 것과 반대인 반딧불 루시퍼라아제 수준에 대한 효과를 보였다. PTEN과 RAF1 둘 다 luciferase 활동에 반대 효력이 있던 2개의 명백한 shRNAs에 의해 표적으로 했습니다. 이전 연구와 일치하지 않는 결과는 YAP/TAZ-TEAD 기능에 대한 이러한 단백질의 영향이 세포 유형에 의존적이라는 것을 나타낼 수 있습니다. 그러나, 그것은 또한 일부 shRNAs에 의해 가난한 녹다운 효율 또는 오프 대상 효과 때문일 수 있습니다. n = 1 "블라인드" 화면으로 일부 거짓 긍정 및 거짓 부정도 예상됩니다. 토론에서 더 자세히 설명했듯이, YAP 및 TAZ에 의해 규제되는 유전자에 대한 qPCR 및 YAP/TAZ 기능에 영향을 미치는 사후 번역 수정을 위한 서부 블롯과 같은 다른 분석실험을 사용하여 추가 검증 실험을 수행해야 합니다. 이 검증은 또한 어떤 shRNAs가 효과적으로 관심의 단백질을 쓰러뜨린지 확인하는 것을 포함할 것이다. 또한 리포터가 TEAD 반응성이 있기 때문에 화면에서 식별된 모든 유전자가 TEADs에 영향을 줄 수 있지만 YAP 및 TAZ는 직접 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 후속 기계론적 연구는 확인된 단백질이 통제되고 있는 YAP 및/또는 TAZ 또는 TEADs인지 결정하기 위하여 요구될 것입니다. 그러나, YAP와 TAZ는 TEAD 중재한 전사의 주요 동인입니다, 그래서 이 유전자의 대부분은 YAP와 TAZ를 통제하고 있는 확률이 높습니다. 실제로, 위에서 언급한 바와 같이, YAP 및/또는 TAZ를 직접 조절하는 것으로 알려진 단백질을 표적으로 하는 스크린 표적 단백질에 명중된 shRNAs의 대부분.
그림 1: 워크플로의 회로도 다이어그램입니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 프로토콜의 숫자에 해당하는 단계 번호로 요약됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: YAP/TAZ-TEAD 이중 루시퍼라제 전사 리포터 시스템의 최적화. (A)A375 세포 안정적으로 발현 제어 벡터 (MSCV-IRES-Hygro), LATS 에 민감한 YAP (YAP2SA),또는 LATS 에 민감한 YAP 는 TEADs를 바인딩할 수 없습니다 (YAP2SA, S9 4A)를PRL-TK(르닐라)와 pGL3-5xMCAT(SV)-49(YAP/TAZ-TEAD 리포터)로 병용하였고 24시간 후에 루시퍼라아제 신호를 측정하였다.Renilla n = 7개의 독립적인 실험. (b)A375 세포는 YAP2SA 또는 대조군 벡터, PRL-TK 구문, 및 pGL3-5xMCAT(SV)-49 구제 또는 pGL3(SV)-49 구문(최소 프로모터) 및 루시퍼라제 신호를 24시간 후에 측정하였다. n = 4배로 형질전환된 실험 1회. (C)A375 세포는 비표적화 대조군 shRNA(shNTC) 또는 탠덤 YAP 및 TAZ shRNAs(shYAP/TAZ)를 코딩하는 레트로바이러스에 감염되었다. 안정한 선택 후, 세포는 PRL-TK 컨스트럭트와 함께 공동 형질감염되었고 pGL3-5xMCAT(SV)-49 구제 또는 pGL3(SV)-49 구조 및 루시퍼라아제 신호를 24시간 후에 측정하였다. n = 4 개의 독립적 인 감염; 통계적 유의성은 단방향 ANOVA를 사용하여 결정되었고 Tukey의 다중 비교 테스트가 뒤따랐습니다. n.s. = p>0.05, * p&0.05, ** p<0.01, **** p&0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표 화면의 결과. 각 노크 다운 벡터의 결과는 shNTC와 비교되고 접기 차이로 표시됩니다. 막대 그래프는 반딧불 루시퍼라아제/레닐라제라아라세비 ±표준 편차의 평균을 나타낸다.Renilla n = 1개의 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 튜브 A – 형질 감염 희석 | |
| 시약 | 볼륨 |
| 형질감염 버퍼 | 반응당 25 μl |
| 형질감염 시약 2(두 번째 추가) | 반응당 1.5 μl |
| 튜브 B – 리포터 희석 | |
| 시약 | 볼륨 |
| 형질감염 버퍼 | 반응당 25 μl |
| 20:1 반딧불 루시퍼라아제 리포터: 레닐라 믹스 제어(두 번째 추가) | 반응당 400 ng |
| 형질감염 시약 3 (세 번째 추가) | 반응당 1 μl |
| 총: 반응당 26.5 μl | |
표 1: 형질전환 혼합물의 제조. 24웰 플레이트의 각 웰에서의 형질감염의 경우, 1.5 μL의 형질감염 시약 2는 형질전환 희석 제(튜브 A)를 생성하기 위해 25 μL의 형질전환 완충제로 희석된다; 400 ng 의 20:1 반딧불 루시퍼라아제 리포터: 제어 르닐라 혼합물 및 1 μL의 트랜스펙션 시약 3은 25 μL의 트랜스펙션 버퍼로 희석되어 리포터 희석(튜브 B)을 생성한다.
| 기존/구매/기프트 벡터 | |
| 벡터 | 소스 |
| GIPZ 인간 shRNA 렌티바이러스 벡터 | GE 헬스케어 |
| VSVG | 하이네스 랩 [2] |
| psPAX2 | 애드진 (#12260) |
| 개그 /폴 | 애드진 (#14887) |
| pGL3-(SV)-49 | 이아인 패런스 [15] |
| pGL3-5xMCAT(SV)-49 | 이아인 패런스 [15] |
| PRL-TK | 프로메가 (주) |
| MSCV-이레스-하이그로 | 라마 랩 [2] |
| MSCV-YAP-S127A, S381A-IRES-하이그로 | 라마 랩 [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-푸로-hYAP7/hTAZ3 | 라마 랩 [14] |
| 새 벡터 | |
| 벡터 | 소스 백본 |
| MSCV-YAP-S94A, S127A, S381A-IRES-하이그로 | MSCV-이레스-하이그로 |
보충 표 1: 벡터 표. 사용된 모든 벡터는 설명된 새 벡터와 함께 나열됩니다. 표준 분자 생물학 기술은 새로운 벡터를 생성하기 위하여 이용되었습니다.
보충 표 2: 루시퍼라아제 분석 데이터 분석. shRNA 라이브러리의 배열은 제1 표에 도시된다. 두 번째와 세 번째 테이블은 각각 원시 반딧불과 레닐라제라아제 신호를 보여줍니다. 모든 웰에 대한 Renilla luciferase 신호의 평균 및 표준 편차는 노란색 상자에 표시됩니다. Renilla luciferase 신호가 평균 보다 1 개 이상의 표준 편차가 있는 웰은 빨간색 텍스트로 강조 표시되고 추가 분석에서 제외됩니다. 모든 웰의반딧불/레닐라 비율은 원시 반딧불 루시퍼라아제 신호를 원시 레닐라제라세라제 신호(제4표)로 나누어 얻어졌다. 각 웰의반딧불/레닐라 비율을 대조군(shNTC) 웰(5표)의 반딧불/레닐라 비율의 평균으로 정규화하였다.Renilla 중복 웰은 각 구문에 대해 다음으로 평균화되었고 표준 편차가 계산되었습니다(여섯 번째 표). 이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).
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Discussion
본 연구에서, 우리는 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하고 테스트하는 데 사용할 수있는 이중 luciferase 기반 전사 기자 분석과 함께 배열 된 바이러스 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝에 대한 접근법을 보여줍니다. 모든 스크린에 앞서 각 세포주별로 리포터 시스템을 특성화하고 최적화하는 것이 중요합니다. 실험은 리포터가 조사중인 전사 인자의 변경 된 활동에 반응하고 활성의 변화 규모를 제어 벡터에 비해 테스트해야하는지 확인하기 위해 수행해야합니다. 리포터 구문과 함께 PRL-TK 구문의 공동 형질감염은 리포터와 함께 형질전환된 세포의 수와 리포터 구문의 카피 수를 제어하는 데 도움이 되기 때문에 중요하며, 둘 다 루시퍼라제 신호의 크기를 변경할 수 있다. 최적화 실험은 또한 전사 계수가 결과 해석을 복잡하게 할 수 있으므로 구성적인 Renilla 구문 또는 최소 프로모터 구제의 활동에 영향을 미치지 않도록 해야 합니다. 라이브러리에 포함할 컨트롤도 신중하게 고려해야 합니다. 이 프로토콜은 수백 개의 shRNA가 있는 라이브러리의 "블라인드 스크린"을 위해 설계되었으며, 각 shRNA에 의한 효과적인 녹다운을 확인하는 것은 불가능합니다. 따라서 일부 거짓 긍정과 부정이 발생할 수 있습니다. 화면에서 기술 및/또는 생물학적 복제물의 수를 늘리면 거짓 긍정 및 부정의 수를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이것은 또한 현저하게 배양및 분석에 우물의 수를 증가시킬 것입니다 그래서 이것은 최적이 아닌 배양 조건이 발생하지 않도록주의해야한다 (아래 참조). 거짓 긍정 및 네거티브를 감소시키는 또 다른 접근법은 동일한 세포주 또는 추가 세포주에서 전체 화면을 반복하거나 3개의 생물학적 복제를 사용하여 "히트"만을 포함하는 더 작은 라이브러리를 스크리브하는 것입니다. 모든 경우에, 모든 조회는 알려진 표적 유전자를 위한 qPCR와 같은 리포터 외에 판독을 사용하여 검증되어야 합니다. 표적 유전자의 효과적인 녹다운은 또한 이들 검증 단계에서 확인되어야 한다. shRNA에 의한 효과적인 녹다운이 확인되지 않는 한 활성을 변경하지 않는 shRNA에 대한 결론은 이루어지지 않아야 합니다. 유효성 검사 실험은 또한 조사되는 전사 인자가 표적 유전자에 의해 조절되는 것과 이들 유전자가 레닐라 또는 최소 프로모터 구성에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인해야 한다.
또한 과잉 합류, 너무 적은 세포, 가난한 세포 생존력 또는 가변 증식 용량과 같은 최적이 아닌 조건을 피하기 위해 각 세포주에 대한 세포 배양 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. 셀 시드 밀도는 이중 루시퍼라제 리포터 시제(5단계)의 형질전환 시 및 리포터 활성이 측정될 때 특히 중요하다(6단계). 형질감염 효율은 세포 밀도와 함께 유의하게 달라질 수 있으며, 형질감염 효율이 떨어지는 것은 세포 집단의 극히 일부만 이뤄진 다면 비정상적인 결과를 초래할 수 있다. 시험된 대부분의 세포주는 40-60% 합류 시 가장 높은 형질전환 효율을 나타내지만 형질전환 조건 및 파종 밀도는 형광 단백질을 전달하는 벡터를 사용하여 주어진 세포주에 최적화되는 것이 좋습니다. 1차 세포와 같이 감염하기 어려운 세포주 및/또는 트랜스펙트는 이 스크린에 적합하지 않을 수 있다. 가난한 리포터 형질 감염 효율 또는 가난한 세포 생존은 전형적으로 매우 낮은 레닐라 루시퍼라아제 신호를 초래한다. 그러나, 시험 실험은 세포주에 대한 레닐라 루시퍼라아제 신호의 범위를 결정하기 위해 수행되어야 한다. 배열된 라이브러리로부터 생성된 바이러스의 적시가 분석되는 세포주에서 적어도 30%의 감염 효율을 줄 만큼 충분히 높다는 것이 중요하다. 감염 효율성은 크게 다를 수 있으며 여러 가지 요인이 바이러스 성소에 영향을 줄 수 있습니다. 사용되는 바이러스 상층의 양은 각 세포주마다 최적화되어야 하며, 필요한 경우, 2단계는 바이러스 성통을 개선하기 위해 더 최적화될 수 있다.
세포 밀도 및 세포 생존력은 또한 전사 인자를 조절하는 세포 경로의 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 이중 루시퍼라아제 분석이 판독되는 날에 모두 유사한 밀도로 되도록 리포터 형질감염에 대한 세포를 종화시키는 것이 중요합니다(단계 6). 또한 세포가 중앙에 있는 조밀한 패치에 있는 군집보다는 우물을 가로질러 균일하게 부착되도록 하는 것이 중요합니다. 전술한 바와 같이, 렌라 루시퍼라아제 신호의 현저한 변화는 잘 에서 잘 해석하기 어려운 데이터를 초래할 수 있다. 다른 모든 웰과 비교할 때 레닐라 루시퍼라아제 신호의 현저한 감소를 보여주는 웰을 배제하는 것이 가장 좋습니다. 여기서 우리는 평균 Renilla luciferase 신호에서 1 표준 편차보다 큰 우물을 제외하지만, 최적화 실험은 각 세포주에 대한 적절한 컷오프를 결정하기 위해 수행되어야한다. 세포 생존력을 감소시키는 shRNAs가 분석되는 전사 인자의 활성을 변경함으로써 그렇게 할 수 있다는 것도 가능하다. 이것이 관심사인 경우에, Renilla luciferase 신호를 감소시키는 shRNAs는 유도성 shRNAs 또는 그밖 시험을 사용하여 재시험될 수 있었습니다. 또한 부착 세포가 트립시니화 후 현탁액에 있는 시간을 제한하는 것도 중요합니다. 셀의 트립시니화 및 시드 중에 대부분의 단계에 다중 채널 파이펫을 사용하고 더 큰 화면의 경우 플레이트를 일괄 처리하여 작업합니다. 또한, 세포의 감염과 리포터 분석사이의 시간을 제한하는 것이 가장 좋습니다. 이는 분석되는 전사 인자가 세포 증식 또는 생존을 조절하는 경우에 특히 중요하다. 이 경우, 효과적인 녹다운을 가진 세포는 덜 효율적인 녹다운을 가진 세포에 의해 경쟁될 것입니다.
설명된 프로토콜의 여러 수정이 가능합니다. 이 접근법은 루시퍼라제 기반 리포터가 생성되는 경우 임의의 전사 계수의 조절자를 식별하는 데 효과적으로 사용될 수 있으며, 가장 일반적인 전사 인자 구조의 대부분은 리포터 구성이 이미 존재한다. 이 프로토콜은 RNAi, CRISPR/CAS9, ORF 또는 cDNA를 포함하는 다양한 상용 또는 수동으로 조립된 라이브러리의 사용을 위해 수정될 수 있다. 실제로, 우리는 이전에 YAP / TAZ 레귤레이터14에대한 작은 cDNA 라이브러리를 테스트하기 위해 유사한 전략을 사용했습니다. 라이브러리는 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 아데노 바이러스, 또는 일시적인 형질 감염을 사용하여 제공 할 수 있습니다. 여기에서 사용된 바이러스 성 외투 단백질 (VSVG)는 인간과 전염하는 렌티바이러스를 생성합니다. 설치류 세포가 사용되고 비인간적인 감염성 생태성 바이러스가 요구되는 경우, 에코 코트 단백질을 전달하는 벡터가 VSVG 대신사용될 수 있다.
다른 방법은 전사 계수의 조절자를 위한 라이브러리를 스크리브하는 데 사용될 수 있다. 처리량이 높은 스크리닝 시설에 액세스하면 자동화된 방식으로 훨씬 더 큰 라이브러리를 선별할 수 있습니다. 마찬가지로, 게놈 전체 화면은 "히트"를 식별하는 수단으로 깊은 시퀀싱풀 라이브러리를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 그러나 이러한 두 가지 접근 방식 모두 많은 연구자가 접근할 수 없는 장비를 필요로 하며, 높은 처리량의 스크리닝 또는 깊은 시퀀싱에 대한 수수료는 엄청나게 높을 수 있습니다. 또한, 풀링된 스크린은 형광 리포터 또는 전사 활성에서 원하는 변화를 보여주는 세포를 풍부하게 하는 다른 방법을 사용하여 세포를 분류해야 할 것이다. 이중 루시퍼라제 기반 전사 리포터 분석기를 이용한 대형 배열식 라이브러리의 스크리닝은 이전에 벤치탑로봇(55)을사용하여 입증되었지만, 이는 모든 연구자에게 일반적으로 제공되지는 않는다. 대조적으로, 여기에 설명된 방법은 빠른 중간 처리량, 상대적으로 저렴하며 대부분의 조사자가 액세스할 수 있는 장비 및 시약을 사용합니다. 이 방법은 단일 실험에서 여러 레귤레이터를 공개할 수 있으며, 이는 전사 계수의 상류에 잠재적인 규제 경로를 발견하는 비용 효율적이고 편리한 방법입니다.
기재된 접근법에서, 후보 유전자는 안정적으로 쓰러졌고, 그 후 선택 후, 리포터 구조는 세포 내로 일시적으로 형질감염되었다. 그러나, 형질감염 효율은 많은 세포주에서 가난하고 가변성을 소개하고 세포 독성을 일으킬 수 있습니다. 개선된 대안접근법은 관심 있는 세포주 게놈에 리포터 시동을 안정적으로 통합한 다음 리포터 발현 세포를 스크리닝을 위한 바이러스 라이브러리로 감염시키는 것이다. 이 개선은 일시적인 transfection에 의해 소개된 가변성을 감소시키고 장기간된 감염 후 문화 때문에 전사 인자 활동에 있는 어떤 잠재적인 변경든지 방지할 것입니다. 위에서 언급했듯이, 작은 벤치탑 로봇을 사용하면 공정이 크게 간소화되고 선별될 수 있는 라이브러리의 크기가 크게 증가할 것입니다. 또 다른 상당한 변화는 배열 된 유도 벡터 라이브러리를 사용 하 여, 더 효과적인 녹다운세포에 대 한 선택의 가능성을 줄이고 세포 생존의 변화에 의해 발생 하는 가변성을 줄일 것 이다.
많은 암의 효과적인 처리를 방지하는 중요한 도전은 종양 세포가 가장 효과적인 표적으로 한 치료에 저항을 취득한다는 것입니다. 이 치료 저항에 필요한 단백질의 식별은 환자의 결과를 개선하는 데 필요합니다. 기술된 접근은 이 화합물에 증가한 감도 또는 저항을 일으키는 원인이 되는 유전자를 밝히기 위하여 표적으로 한 치료와 조합에서 쉽게 이용될 수 있었습니다. 이 접근법의 또 다른 잠재적미래 적용은 후보 치료 표적을 조합하여 시험하기 위해 이 배열된 스크리닝을 사용하는 것이다. 이를 위해, 세포는 전사 인자 활동에 시너지 효과가 있는 단백질을 식별하는 것을 목표로 각각 2개의 바이러스 벡터로 감염될 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 shRNA 벡터의 준비를 지원에 대한 에밀리 노턴과 미카엘란 쿠치아레 - 스툴리그로스에게 감사드립니다. 이 작품은 J.M.L.에 수여 수잔 G. 코멘 경력 촉매 그랜트에 의해 부분적으로 지원되었다 (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
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- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
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