Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Summary

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Abstract

Transkripsiyon faktörleri onları anti-kanser tedavileri için iyi hedefler haline downstream süreçlerin çeşitli etkileyen çok sayıda hedef genlerin ekspresyonu değiştirebilirsiniz. Ancak, transkripsiyon faktörlerinin doğrudan hedef alınması genellikle zordur ve bir veya daha fazla erişkin dokuda transkripsiyon faktörü gerekliyse yan etkilere neden olabilir. Bu proteinlerin ilaçlanması kolaysa, kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerini anormal bir şekilde aktive eden upstream regülatörlerinin belirlenmesi daha uygulanabilir bir alternatif sunar. Burada, dizili orta ölçekli lentiviral kütüphaneleri birleştirmek için kullanılabilecek bir protokol ve kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicileri belirlemek için çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir test açıklar. Yaklaşımımız, yüzlerce geni tek bir deneyde test etmek için hızlı, kolay ve ucuz bir yol sunar. Bu yaklaşımın kullanımını göstermek için, Hippo yolunun alt etkileri olan iki transkripsiyonel koaktivatörler olan PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) ile Evet ilişkili protein (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün çeşitli düzenleyicileri içeren dizili lentiviral RNAi kütüphanesinin bir ekranını gerçekleştirdik. Ancak, bu yaklaşım hemen hemen herhangi bir transkripsiyon faktörü veya co-faktör düzenleyiciler için ekrana değiştirilebilir ve aynı zamanda CRISPR/CAS9, cDNA veya ORF kitaplıklarını taramak için de kullanılabilir.

Introduction

Bu takınç amacı nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde transkripsiyon faktörlerinin düzenleyicileri belirlemek için viral kütüphaneler kullanmaktır. Anormal transkripsiyonel aktivite kanser ve metastaz ile ilişkili1,2,3,4,5,6,bu yüzden kanser hücrelerinde transkripsiyon faktörleri hedefleme umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Ancak, transkripsiyon faktörleri genellikle farmakolojikolarak 7 hedef zordur ve birçok yetişkin dokularda normal hücresel fonksiyon için gereklidir8,9,10. Anormal hastalığı sürücü transkripsiyon faktörleri etkinleştirmek kanser ile ilişkili yolları hedefleme daha az şiddetli yan etkilere sahip potansiyeli ile daha uygulanabilir bir yaklaşımdır. Dizili lentiviral ve retroviral RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA veya ORF kütüphanelerinin ticari kullanılabilirliği, araştırmacıların tek bir deneyde çok sayıda genin önemini test etmesine olanak tanır. Ancak, değiştirilmiş transkripsiyonel etkinlik için güvenilir bir okuma gereklidir.

Burada, kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerini düzenleyen proteinleri tanımlamak için çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testin ve dizili lentiviral kütüphanelerin kullanımını tanımlıyoruz. Bu araştırmada, kanserle ilişkili genleri hedef alan shRNA'lar lentiviral transdüksiyon yoluyla memeli kanser hücrelerine ulaştırılır ve hücreler puromisin kullanılarak kararlı entegrasyon için seçilir. Hücreler sonraki araştırılmaktadır transkripsiyon faktörü ne özgü bir organizatör tarafından yönlendirilen firefly luciferase ve araştırılan transkripsiyon faktörü yanıt vermeyen bir kurucu aktif organizatörü renilla luciferase ifade eden bir kontrol yapısı tarafından yönlendirilen firefly luciferase ifade eden bir muhabir yapısı ile transfeced vardır. Biz YAP ve TAZ düzenleyicileri için bir proof-of-concept ekran ile bu yaklaşımı göstermek, Hippo yolukritikdownstream efektörleri 8,10,11. YAP ve TAZ anormal aktivite metastatik basamak birkaç adım teşvik11 ve birçok kanserlerde gözlenen11,12,13. Ancak, YAP ve TAZ'ın bazı kanser hücrelerinde nasıl anormal bir şekilde aktive olduğu henüz tam olarak anlaşılamamıştır. YAP ve TAZ DNA'yı bağlamaz, ancak bunun yerine diğer transkripsiyon faktörleri tarafından organizatörlere istihdam edilir. ÇAY etki alanı (TEAD) transkripsiyon faktörleri ailesinin üyeleri YAP ve TAZ için en önemli bağlayıcı ortaklardır ve çoğu YAP ve TAZ'a bağımlı fonksiyonlar için kritik öneme sahiptir. Muhabirimiz yapı bir YAP/TAZ-TEAD duyarlı organizatörü nden firefly luciferase ifade eder ve önceki çalışmalar da sadakatle YAP-TEAD ve TAZ-TEAD transkripsiyonel aktivite2,,14,15değişiklikleri algılar göstermiştir .

Yaklaşımımız hızlı, orta iş lenmedir ve tarama tesisleri, otomatik robotlar veya havuzlu kütüphanelerin derin sıralamasını gerektirmez. Maliyetler nispeten düşüktür ve aralarından seçim yapabileceğiniz çok sayıda ticari kütüphane vardır. Gerekli ekipman ve reaktifler de çoğu laboratuvarda nispeten standart. Luciferase tabanlı bir muhabir varsa veya oluşturulursa hemen hemen her transkripsiyon faktörü düzenleyicileri için ekran için kullanılabilir. Bu yaklaşımı kanser hücrelerinde shRNA'ları taramak için kullanıyoruz, ancak makul bir verimlilikle aktarılabilen herhangi bir hücre hattı, her türlü dizili kütüphanede kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu protokolün şematik bir özeti Şekil 1'degösterilmiştir.

1. Lentiviral vektör kütüphane hazırlama

NOT: Gösterilen ekran 96-iyi plakalar gliserol stokları olarak satın alınan bir dizili shRNA kütüphane kullanılan, ancak kütüphaneler de adayların bir listesine göre el ile monte edilebilir. Uygun denetimler dikkate alınmalı ve herhangi bir kitaplıkta yer almalıdır. Buna, hedefsiz bir kontrol shRNA (shNTC), transkripsiyon faktörünü hedefleyen bir kontrol shRNA'sı ve mümkünse firefly luciferase'i hedefleyen bir shRNA dahildir.

  1. 96-derin kuyu plakasının her bir kuyuya 100 g/mL ampisilin içeren 100 mL luria suyu (LB) (%1 bacto-trypton, %0,5 maya özü, %1 NaCl, pH 7,5) ekleyin. Her kuyuyu 2 μL gliserol stoku ile inoculate ve 225 rpm sürekli ajitasyon ile bir gecede 37 °C'de büyümek.
  2. Her bakteri kültürünü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bakterileri 10 dk boyunca 4 °C'de 21.000 x g'de santrifüj ile peletleyin.
  3. Üreticinin protokolünü izleyerek her vektörü bakteriyel bir mini hazırlık kiti kullanarak arındırın.
  4. Bir spektrofotometre kullanarak her vektörün konsantrasyonu belirleyin.
  5. Plazmidleri -20 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

2. Dizili lentiviral kütüphanenin ambalajı

NOT: Lentivirus içeren tüm çalışmalar, paketleme, enfeksiyon ve enfekte hücrelerin sonraki culturing dahil kesinlikle kurumsal biyogüvenlik kuralları ve yönetmeliklere uygun olmalıdır.

  1. 293FT hücreleri tam büyüme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Kartal orta (DMEM) içeren 4 mM L-glutamin, 4.500 mg / L glukoz ve sodyum piruvat, ile takviye 293FT hücreleri genişletin 100 adet / mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin antibiyotik ve 2 mM L-L-glutamin).
  2. 1.4 adımdan itibaren kütüphanedeki her vektör için 1 x 105 293FT hücreli bir 24-iyi tohum.
    NOT: Bir kontrol viral vektör bazı ekstra kuyular paketlenmiş ve adım 3 (aşağıya bakın) geçmeden önce virüsün titresini test etmek için kullanılması önerilir.
  3. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha önce14 olarak tanımlanan ambalaj lentivirus için genel bir protokol bu protokol için 24 kuyuya küçültülmüştür. Bu bir kat protein olarak lentiviral ambalaj ve VSVG için psPAX2 kullanır. Ektropik virüs isteniyorsa, VSVG yerine Eco'u teslim eden bir vektör kullanılabilir. Bu protokolün, hedef hücrelerin %30-70 enfeksiyon verimi veren viral bir titreyi elde etmek için optimize edilmesi önerilir (bkz. Kullanılan tüm vektörlerin listesi için Ek Tablo 1'e bakın.
  4. Aşağıda açıklandığı gibi Adım 1.4'ten her viral vektör için bir transfeksiyon karışımı ayarlayın. Her transfeksiyon 250 ng viral vektör, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1.25 μL transfeksiyon reaktifi 1 ve 23.75 μL transfeksiyon tamponu içermelidir (Bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Her lentiviral vektörü nükleaz içermeyen suyla 50 ng/μL'ye seyreltin ve ardından 5 μL'yi (250 ng) 96 kuyulu pcr plakalı bir kuyuya aktarın.
    2. Transfeksiyon süper karışımını 1,25 μL * X transfeksiyon reaktifi 1 ve 23,75 μ L * X'i önceden ısıtılmış transfeksiyon tamponunun "X" transfeksiyon larının toplam sayısı nın yanı sıra pipetleme sırasında hacim kaybını hesaba katmak için birkaç ekstra olduğu bir şekilde karıştırarak süper karışım yapın.
    3. 5 dakika oda sıcaklığında transfection süper karışımı kuluçka.
    4. Adım 2.4.3 transfeksiyon süper karışımı tüpüne psPAX2 125 ng * X psPAX2 ve 125 ng * X VSVG ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için pipet. Hızla Adım 2.4.5'e geçin.
    5. Hemen adım 2.4.4 bir PCR şerit her tüp içine karışımı aliquot ve daha sonra adım 2.4.1 viral vektör içeren her kuyuya 25 μL karışımı aktarmak için çok kanallı pipet kullanın.
    6. 20 dk oda sıcaklığında kuluçka.
    7. Adım 2.4.6'dan her 96 kuyudan 30°L'nin tümünün 2.3'ten 293 FT hücre içeren 24 kuyuluk bir kuyuya aktarın.
  5. Hücreleri 37 °C'de 24 saat için %5 CO2 ile kuluçkaya yatırın ve ardından 24 kuyulu plakanın her kuyudaki ortamı 500 μL taze tam büyüme ortamıyla değiştirin. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat daha kuluçkaya yatırın.
  6. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir kuyudan viral süpernatant toplayın ve her biri iki 96-wells içine 220 μL (Adım 3'te 1 enfeksiyon artı bazı ekstra hacim için yeterli) alın. Bunlar dizili viral süpernatant plakalar.
  7. Dizili viral supernatant plakaları -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ayrıca, Adım 3'e geçmeden önce enfekte edilecek hücrelerde paketlenmiş (yukarıya bakın) ekstra kontrol virüsünün bir kısmını test etmek önerilir. Bu titre en az% 30 enfeksiyon verimliliği elde etmek için yeterli olduğundan emin olmaktır.

3. Ekran için hücrelerin enfeksiyonu

NOT: İnsan melanom hücreleri (A375) bu yaklaşımı göstermek için kullanılmıştır, ancak bu yöntem lentivirus ile enfekte herhangi bir yapışık hücrelere uygulanabilir. Ancak, hücre kültürü ve kaplama koşulları her hücre satırı için optimize edilmelidir (Bkz. Tartışma).

  1. Hücreleri tam büyüme ortamında enfekte olacak şekilde genişletin.
  2. Tohum 24-iyi plakalar 1 x 105 hücreleri ile 0.5 ml tam büyüme ortamı başına iyi. Tohum her viral vektör için iyi test edilecek (kontroller dahil) ve Adım 3.7 ilaç seçimi için bir kontrol olarak hizmet edecek enfekte olmayacak ekstra bir kuyu içerir.
  3. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.
  4. Aşağıdaki gibi dondurulmuş dizili lentiviral supernatant farklı bir viral supernatant ile Adım 3.2 her kuyu enfekte.
    1. 20 μg/mL polibren içeren tam büyüme ortamı hazırlayın.
    2. Adım 2.7 oda sıcaklığına dizili lentiviral kütüphane supernatants çözültün.
    3. Adım 3.2'deki 24 kuyuplakadan büyüme ortamını aspire edin ve hemen her kuyuya 200 μL polibren içeren büyüme ortamı ekleyin.
    4. Çok kanallı pipet kullanarak, Adım 3.4.2'den Step 3.4.3'ten 24 kuyuya her 96 kuyudan 200 μL viral süpernatant aktarın.
  5. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 - 48 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bazı hücre hatları shRNA'ları ifade etmek ve puromisin dirençli hale gelmek için 24 saatten uzun sürebilir. Burada kullanılan viral vektör puroR 3'UTR bir miR30 tabanlı shRNA ile Turbo-GFP-IRES-puroR sunar (Şekil 1). Püromisin direnç geni ve shRNA'nın enfeksiyon etkinliği ve ekspresyonu yeşil floresan protein ile izlendi.
  6. 2,5 g/mL puromisin içeren tam büyüme ortamı hazırlayın.
    NOT: Püromisin seçim konsantrasyonu hücre çizgileri arasında değişir. Her hücre hattının ekrandan önce taranması için bir antibiyotik öldürme eğrisi yapılması önerilir.
  7. Her kuyudan ortam aspire ve puromisin içeren tam büyüme ortamı 500 μL ile değiştirin.
    NOT: Ayrıca puromisin seçimi tamamlandığından emin olmak için sonraki adımlarda kullanılabilecek bir kontrol enfekte olmayan kuyuya puromisin eklemek için emin olun.
  8. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: 48 saat için seçmek en iyisidir, bu nedenle kaplama yoğunluğu ve viral titre, hücrelerin 48 saatten önce aşırı etkili olmaması için optimize edilmelidir.
  9. Enfekte hücrelerin floresan mikroskobu altında yeşil olduğundan emin olun, ve bir kontrol olmayan enfekte olmayan püromisin ile tedavi hücrelerinin adım 4 geçmeden önce tüm ölü.

4. Çift luciferase muhabiritransfeksiyon için tohum hücreleri

NOT: Her yeni hücre hattı için en uygun tohumlama yoğunluğunu belirlemek için bir test transfeksiyonu yapılmalıdır.

  1. Adım 3.9'dan her kuyuyu deneyin ve yaklaşık 1 x 105 hücreyi aşağıdaki gibi yeni 24 kuyuplakası üzerindeki ilgili konumdaki kuyulara aktarın.
    NOT: Bu protokol, enfekte hücrelerin her kuyuyu saymak mümkün olmayacaktır bu yüzden shRNA'lar yüzlerce kütüphanelerin taranması için tasarlanmıştır. Bu nedenle, kabaca eşit kaplama yoğunluğu sağlamak için aşağıdaki adımlar her kuyuda hücre numaralarını tahmin etmek için kullanılmıştır.
    1. 3.9'dan 3'e ayrılan kuyuları gruplandırın- bir gruptaki tüm kuyuların benzer hücre yoğunluğuna sahip olduğu 4 gruba.
    2. 37 °C'de 5 dk için 200 μL trypsin-EDTA (0,5 mM EDTA ve %0,1 tripsin ile desteklenmiş 1x PBS) ile her gruptan 1 temsilci iyi bir destek elde edin. Daha sonra tam büyüme ortamı içeren 400 μL puromisin ekleyerek tripsin-EDTA'yı nötralize edin.
    3. Toplam hücre sayısını belirlemek için her temsilciyi iyi sayın ve hücre süspansiyonuna her temsilciden tam büyüme ortamını kullanarak 2 x 105 hücre/mL'ye seyreltin.
    4. Tohum 0.5 mL (1 x 105 hücreleri) Adım 4.1.3 yeni bir 24-well plaka üzerinde ilgili konuma her kuyunun ve 24 saat için% 5 CO2 ile 37 °C bu yeni 24-well plaka kuluçka.
    5. Adım 4.1.1'den her grup için, ortaya çıkan hücre süspansiyonunun 1 x 106 hücre/mL olması için her kuyuya eklemek üzere tripsin-EDTA hacmini hesaplamak için Adım 4.1.3'te belirlenen toplam hücre numarasını kullanın.
    6. Her kuyuya uygun trypsin-EDTA hacmini ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Daha büyük bir ekran için, hücrelerin canlılığını sağlamak için 24 kuyulu plakaların tek seferde değil, gruplar halinde denip edilmesi ve yenilenmesi önerilir.
    7. Yukarıdaki kuluçka sırasında, 24 kuyulu yeni bir plaka üzerindeki ilgili kuyulara 400 μL puromisin içeren tam büyüme ortamı eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
    8. Adım 4.1.7'de hazırlanan yeni 24 kuyulu plakalar üzerindeki karşılık gelen konuma her kuyudan 100 μL hücre süspansiyonu (yaklaşık 1 x 105 hücre) aktarın.
    9. Adım 4.1.1'den gruplanmış kuyuların tüm plakaları için 4.1.6'dan 4.1.8'e kadar adımları tekrarlayın.
  2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.

5. Çift luciferase muhabirinin transfeksiyonu

  1. Transfect her iyi Adım 4.2 çift luciferase muhabiri ile aşağıdaki gibi inşa eder.
    NOT: Bu taslamayı başlatmadan önce DNA'nın toplam miktarı ve ateş böceği luciferase muhabiri vektörünün Renilla luciferase vektörü kontrol etmek için optimal oranı belirlenmelidir. Burada 400 ng'lik DNA karışımında 20 parça ateş böceği luciferase muhabiri ve 1 parça kontrol renilla luciferase kullanıldı.
    1. Transfeksiyon seyreltme karışımı (Tüp A) ve muhabir seyreltme karışımını (Tüp B) her reaktifin belirtilen hacimlerini(Tablo 1)karıştırılarak toplam transfeksiyon sayısıyla (artı birkaç ekstra) karıştırın.
      NOT: Bu protokol transfeksiyon reaktifi 2 için optimize edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Farklı bir transfeksiyon reaktifi kullanılırsa, transfeksiyon bu adımdan önce optimize edilmelidir.
    2. Transfeksiyon seyreltme karışımını (Tüp A) muhabiri seyreltme karışımı (Tüp B) ile karıştırın ve transfeksiyon karışımı üretmek için 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    3. Yukarıdaki kuluçka sırasında, 0,25 mL fosfat tampon salini (PBS) ile Step 4.2'den her 24-iyi durulayın ve her kuyuya 447 μL tam büyüme ortamı ekleyin.
    4. 15 dk kuluçkadan sonra, 24 kuyulu plakaların her bir kuyuya 53°L transfeksiyon karışımı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
  2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.

6. Çift luciferase aktivitesinin nicelleştirilmesi

  1. Aşağıda açıklandığı gibi bir plaka okuyucu ve çift luciferase muhabir işeyme kiti kullanarak luciferase aktivitesini ölçün.
    NOT: Bu protokol belirtilen muhabir test kiti için optimize edilmiştir (bkz. Malzemeler Tablosu)ve üreticinin önerdiği protokolü izler.
    1. Deiyonize su ile 5x pasif lysis tampon (kit te ve sağlanan) 1-5 seyreltme tarafından tüm kuyular için yeterli 1x pasif lysis tampon artı birkaç ekstra (75 μL kuyu başına gereklidir) hazırlayın. Ayrıca çözülme reaktifi A ve reaktif B Arabellek (kit, her kuyu için 100 μL gereklidir) sağlanır.
    2. Adım 5.2'den 24 kuyulu plakanın her kuyudan medyayı aspire edin.
    3. Her kuyuya 75 μL 1x pasif lisis tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika ara sıra sallayarak kuluçkaya yatırın.
    4. 50x reaktif B substratı (kitte sağlanan) 1:50 çözülmüş reaktif B tamponu ile seyrelterek Reaktif B hazırlayın.
    5. Boşalmak için 4 kuyuya 30 μL 1x pasif lisis tamponu ekleyin (Bkz. Ek Tablo 2).
    6. Adım 6.1.3'ten 30 μL'lik lysate'yi 96 kuyulu düz alt beyaz bir deneme plakasının yinelenen kuyularına aktarın.
    7. Her kuyuya 50 μL reaktif A eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve bir plaka okuyucu ile firefly luciferase sinyalini okuyun.
    8. Her kuyuya Adım 6.1.4'ten 50 μL reaktif B eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve Renilla luciferase sinyalini bir plaka okuyucuyla okuyun.
  2. Ham verileri aşağıdaki gibi işleme (ayrıntılı bir açıklama için Ek Tablo 2'yebakın).
    1. Düşük değerler viral yapının toksik olduğunu veya çok az transfected hücrenin test edildiğini gösterdiğinden, çok düşük Renilla luciferase sinyaline sahip örnekleri hariç tilebilir.
      NOT: Tartışmada açıklandığı gibi, önemli ölçüde "düşük" Renilla luciferase sinyala anormal sonuçlar neden olabilir. Burada, Renilla luciferase sinyalinin ortalamanın altında 1 standart sapmanın olduğu kuyular hariç tutulmuştu (Bkz. Ek Tablo 2). Bu hücrelerde bu muhabir sistemi kullanılarak yapılan önceki çalışmalara dayanıyordu14, ancak diğer hücre hatları farklı olabilir.
    2. Ateş böceği /Renilla oranı elde etmek için aynı kuyunun ham Renilla luciferase değeri her kuyunun ham firefly luciferase değerini normalleştirin.
    3. Tüm çoğaltmak kontrol kuyularının firefly /Renilla oranları ortalama ve daha sonra bir kat değişikliği elde etmek için bu sayıya her kuyunun firefly /Renilla oranı bölmek.
    4. Kontrol örneğini atayın ve firefly/Renilla oranı değerini 1'e ayarlayın.
    5. Yinelenen kuyuların ateş böceği/Renilla oranlarını ve standart sapmaile çizimi ortalama.
      NOT: Standart sapma istatistiksel analiz için değil, bunun yerine çoğaltmaların önemli ölçüde farklı olduğu kuyuları tanımlamak için bir araç olarak kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bizim YAP / TAZ-TEAD muhabir yapısı (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) kanonik TEAD bağlayıcı elemanı (MCAT)15 ateşböceği luciferase gen sürüş 5 tekrarları ile minimal Bir SV-49 organizatörü içerir ( Şekil1). Constitutively aktif HSV TK organizatörü renilla luciferase ifade PRL-TK kontrol vektörü (Promega) ile birlikte hücrelere transfeced (Şekil 1). YAP/TAZ-TEAD muhabir yapısının test edilen hücre hattında beklendiği gibi davranmasını sağlamak çok önemlidir. Bu nedenle, ilk olarak PRL-TK ve pGL3-5xMCAT (SV)-49'u, bir kontrol vektörü, YAP'ın son derece aktif LATS duyarsız mutantı (YAP2SA)veya YAP2SA'nın çaylarını bağlayamayan bir mutantı (YAP2SA,S94A)ifade eden A375 hücrelerine ortak hale getirdik. Beklendiği gibi, firefly luciferase aktivitesi YAP2SAtarafından önemli ölçüde artırıldı, ancak kontrol vektörü veya YAP2SA, S94A (Şekil 2A)tarafından değil. Bu da YAP/TAZ-TEAD muhabirinin çaya bağlı bir şekilde faaliyetini artırdığını göstermektedir. Daha da önemlisi, YAP2SA önemli ölçüde Renilla luciferase düzeylerini değiştirmedi. Ek bir kontrol olarak, YAP2SA'nın MCAT TEAD bağlama elemanlarından yoksun minimal bir promotör yapısının etkinliğini değiştirmediğini de doğruladık(Şekil 2B).

İkinci bir kontrol deneyi de, A375 hücrelerinin viral yapılarla enfekte olduğu ve bu yapılara bulaşmamış, hedefsiz bir kontrol shRNA (shNTC) veya tandem YAP ve TAZ shRNA'lı bir yapı da yapılmıştır. Kararlı seçimden sonra, hücreler PRL-TK yapısı ve YAP/TAZ-TEAD muhabir yapısı veya minimal promotör yapısı ile birlikte transfeced edildi. YAP/TAZ-TEAD muhabir yapısı ile transfected hücrelerde, YAP /TAZ shRNA firefly luciferase seviyelerini önemli ölçüde azalttı, ancak kontrol shNTC vermedi (Şekil 2C). Firefly luciferase düzeyleri ya shNTC veya YAP/TAZ shRNA tarafından minimal promotör ile transfected hücrelerde değişmedi (Şekil 2C). Yukarıdaki sonuçlarla tutarlı olarak, her kuyudaki Renilla sinyali de kontrol shNTC veya YAP/TAZ shRNA(Şekil 2C)tarafından önemli ölçüde değiştirilmemiştir ve prl-TK kontrol yapısının YAP veya TAZ'a yanıt vermediğini gösterir. Topluca, bu deneyler muhabir sistemi A375 hücrelerinde beklendiği gibi davranıyor olduğunu göstermektedir, hangi bu vektörler kullanarak önceki çalışmalar ile tutarlı2,14.

Kavram deneyinin bir kanıtı olarak, A375 hücrelerinde küçük bir lentiviral shRNA kütüphanesini taradık. Test kütüphanemizde daha önce yap/TAZ işlevini düzenleyen çeşitli genleri hedef alan SHRNA'lar yer alıyordu. Ancak bu genlerden bazılarının YAP ve TAZ'ın melanomda düzenlenmesindeki rolü bilinmemektedir. Kütüphanemizde RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4, ve CCNE216,17,,1818,19,20,,21,22,23,24,25,26,27,28,29 , 30,31,32,33,34,35,36,37,38, ve csk, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR ve RB139,40,41,42,43 , 44 , gibi YAP/TAZ aktivitesini inhibe etmek için öngörülen genler ,43,44 ,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. Kontroller olarak, biz bir tandem YAP / TAZ shRNA14dahil , olmayan bir hedefleme kontrol shRNA (shNTC), ve daha önce gösterdi bir shRNA Src hedefleyen, Hangi A375 hücrelerinde maksimal YAP / TAZ aktivitesi için gerekli olduğunu gösterdi14.

Bu ekrana ait ham veri ve analizler Ek Tablo 2'degösterilmiştir. Çeşitli shRNA'lar (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 ve shMAPK8-2) renilla luciferase sinyalini tüm kuyular için ortalama Renilla sinyaline göre önemli ölçüde azaltarak, bu shRNA'ların A375 hücrelerinde sitotoksisiteye neden olduğunu düşündürdü. Nitekim bu kuyular (gösterilmez) tsurat sırasında önemli ölçüde daha az hücre vardı. Bu da YAP/TAZ'ı düzenleyen adayları hücre hayatta kalma için gerekli olan adaylardan ayırt etmeyi çok zorlaştırır. Bu nedenle, bu örneklerden elde edilen sonuçlar daha fazla veri analizi dışında tutulur. Beklendiği gibi YAP ve TAZ veya Src'yi hedef alan SHRNA'lar YAP/TAZ-TEAD aktivitesini önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 3). PIK3CA'nın YAP ve TAZ aktivitesini desteklediğini gösteren yayınlanmış çalışma ile tutarlıolarak 21,26,31, PIK3CA'yı hedefleyen SHRNA'ların normalleştirilmiş ateş böceği luciferase seviyelerini azalttığını gördük. atm, CDH1, CSK, ERBB2, GSN hedefleyen şRNA'lar her bu proteinlerIN YAP ve / veya TAZ39,41,42,,43,45,46,4747,48,50,51,53,54 bastırmak gösteren yayınlanan çalışmalar ile tutarlı dır normalleştirilmiş firefly luciferase düzeyleri, . ATR, CCNE2 ve ERBB4 diğer hücre tiplerinde kurulan rollerrağmen27,28,35,36,38,49, bu genleri hedefleyen shRNA'lar önemli ölçüde A375 hücrelerinde normalleştirilmiş ateş böceği luciferase düzeylerini değiştirmedi. EZH2 ve RB1 hedefleyen shRNA'lar diğer hücre tiplerinde çalışmalara dayalı olarak beklenenin zıt tıtamına ateş böceği luciferase düzeyleri üzerinde bir etki gösterdi32,34,40,52. Hem PTEN hem de RAF1, luciferase aktivitesi üzerinde ters etkileri olan iki farklı shRNA tarafından hedef alındı. Önceki çalışmalarla tutarsız sonuçlar, bu proteinlerin YAP/TAZ-TEAD fonksiyonu üzerindeki etkisinin hücre tipine bağlı olduğunu gösterebilir; ancak, aynı zamanda bazı shRNA'lar tarafından kötü nakavt verimliliği veya off-target etkileri nedeniyle olabilir. n = 1 "kör" ekran olarak, bazı yanlış pozitif ve yanlış negatifler de beklenebilir. Tartışma'da daha ayrıntılı olarak ele alındığı üzere, YAP ve TAZ tarafından düzenlenen genler için qPCR ve YAP/TAZ işlevini etkileyen post translational modifikasyonlar için batı lekeleri gibi diğer tahliller kullanılarak ek doğrulama deneyleri yapılması gerekmektedir. Bu doğrulama aynı zamanda hangi SHNA'ların ilgi proteinini etkili bir şekilde devirdi doğrulaması da içerir. Muhabirimiz TEAD duyarlı olduğundan, ekranımız tarafından tanımlanan genlerin DOĞRUDAN YAP ve TAZ'i değil, TEAD'leri etkileyebileceğini de unutmamak gerekir. Yap ve/veya TAZ mı yoksa tanımlanan proteinin düzenleyici sabotu mu olduğunu belirlemek için mekanistik çalışmaların takibi gerekecektir. Ancak, YAP ve TAZ TEAD aracılı transkripsiyon önemli sürücüleri, bu yüzden bu genlerin çoğu YAP ve TAZ düzenleyen olması muhtemeldir. Gerçekten de, yukarıda da belirtildiği gibi, ekrana isabet shRNA'ların çoğu YAP ve/veya TAZ'ı doğrudan düzenleyen proteinleri hedeflemiştir.

Figure 1
Şekil 1: İş akışının şematik diyagramı. Bu protokolün kritik adımları, protokoldeki sayılara karşılık gelen adım numaralarıyla özetlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: YAP/TAZ-TEAD çift luciferase transkripsiyonel muhabir sisteminin optimizasyonu. (A) Kontrol vektörü (MSCV-IRES-Hygro), LATS duyarsız YAP (YAP2SA)veya LATS duyarsız YAP'ı ifade eden A375 hücreleri (YAP2SA,S9 4A) PRL-TK(Renilla)ve pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP/TAZ-TEAD muhabiri) ile birlikte transfeced edildi ve luciferase sinyali 24 saat sonra ölçüldü. n = 7 bağımsız deney. (B) A375 hücreleri YAP2SA veya kontrol vektörü, PRL-TK yapısı ve pGL3-5xMCAT (SV)-49 yapısı veya pGL3 (SV)-49 yapısı (minimal promotör) ile birlikte transfeced ve luciferase sinyali 24 saat sonra ölçüldü. n = 1 deney dörtlü olarak transfeced. (C) A375 hücreleri, hedefsiz bir kontrol shRNA (shNTC) veya tandem YAP ve TAZ shRNA'ları (shYAP/TAZ) kodlayan retrovirüs ile enfekte edildi. Kararlı seçimden sonra, hücreler PRL-TK yapısı ile birlikte transfeced edildi ve ya pGL3-5xMCAT (SV)-49 yapı veya pGL3 (SV)-49 yapı ve luciferase sinyal 24 saat sonra ölçüldü. n = 4 bağımsız enfeksiyon; İstatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA kullanılarak belirlendi ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi; n.s. = p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Temsili ekran sonuçları. Her devir vektörün den sonucu shNTC ile karşılaştırılır ve kat farkı olarak sunulur. Çubuk grafiği ateş böceği luciferase/Renilla luciferase oranı ± standart sapmanın ortalamasını gösterir. n = 1 deneyi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tüp A – Transfeksiyon Seyreltme
Reaktif Birim
Transfection Arabellek Reaksiyon başına 25 μl
Transfeksiyon Reaktifi 2 (ikinci ekle) Reaksiyon başına 1,5 μl
Tüp B – Muhabir Seyreltme
Reaktif Birim
Transfection Arabellek Reaksiyon başına 25 μl
20:1 Firefly luciferase muhabiri: kontrol Renilla karışımı (ikinci ekle) Reaksiyon başına 400 ng
Transfeksiyon Reaktif3 (üçüncü ekle) Reaksiyon başına 1 μl
Toplam: Reaksiyon başına 26.5 l

Tablo 1: Transfeksiyon karışımının hazırlanması. 24 kuyulu plakaların her kuyusundaki transfeksiyon için, transfeksiyon reaktifi 2'nin 1,5 μL'si transfeksiyon seyreltme (tüp A) üretmek için 25°L transfeksiyon tamponuna seyreltilir; süre 400 ng 20:1 firefly luciferase muhabiri: kontrol Renilla karışımı ve transfeksiyon reaktif 3 1 μL içine seyreltilmiş 25° Transfection Tampon içine muhabir seyreltme üretmek için (tüp B).

Mevcut/Satın Alınan/Hediye Vektörleri
Vektör Kaynak
GIPZ insan shRNA lentiviral vektörler GE Sağlık
VSVG Hynes Laboratuvarı [2]
psPAX2 Addgene (#12260)
gag/pol Addgene (#14887)
pGL3-(SV)-49 Iain Farrance [15]
pGL3-5xMCAT(SV)-49 Iain Farrance [15]
PRL-TK Promega
MSCV-IRES-Higro LAMAR LAB [2]
MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro LAMAR LAB [2]
MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 LAMAR LAB [14]
Yeni Vektörler
Vektör Kaynak Omurgası
MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro MSCV-IRES-Higro

Ek Tablo 1: Vektörler tablosu. Kullanılan tüm vektörler açıklanan yeni vektörlerle listelenir. Yeni vektörler üretmek için standart moleküler biyoloji teknikleri kullanıldı.

Ek Tablo 2: Luciferase tahlil veri analizi. ShRNA kitaplığın düzenlemesi ilk tabloda gösterilmiştir. İkinci ve üçüncü tablolar sırasıyla ham ateş böceği ve Renilla luciferase sinyalleri göstermektedir. Renilla luciferase sinyalinin tüm kuyular için ortalama ve standart sapması sarı kutularda belirtilir. Renilla luciferase sinyali ortalamasının altında 1 standart sapma ile kuyular kırmızı metin le vurgulanır ve daha fazla analiz den dışlanır. Her kuyunun ateş böceği/Renilla oranı ham ateş böceği luciferase sinyalinin ham Renilla luciferase sinyali (dördüncü masa) ile bölünmesiyle elde edilmiştir. Her kuyunun ateş böceği/Renilla oranı daha sonra kontrol (shNTC) kuyularının ateş böceği/Renilla oranı ortalamasına (beşinci masa) normalleştirildi. Yinelenen kuyular her yapı için bir sonraki ortalamaya göre hesaplandı ve standart sapma (altıncı tablo) hesaplandı. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak ve test etmek için kullanılabilecek çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi ile birlikte dizili viral kütüphanelerin orta iş bölümü taraması için bir yaklaşım gösterilmiştir. Herhangi bir ekrandan önce her hücre hattı için muhabir sistemini karakterize etmek ve optimize etmek çok önemlidir. Muhabirin incelenmekte olan transkripsiyon faktörünün değiştirilmiş aktivitesine duyarlı olduğunu doğrulamak için deneyler yapılmalı ve hareketteki değişimin büyüklüğü kontrol vektörlerine göre test edilmelidir. PrL-TK yapısının muhabir yapısıyla birlikte birlikte transfeksiyonu önemlidir, çünkü muhabirle birlikte aktarılan hücre sayısının ve her ikisi de luciferase sinyalinin büyüklüğünü değiştirebilen muhabir yapının kopya sayısının kontrol altına alınır. Optimizasyon deneyleri ayrıca transkripsiyon faktörü nün, sonuçların yorumlanmasını zorlaştırabileceğinden, kurucu Renilla yapısının veya minimal bir promotör yapının etkinliğini etkilememesini de sağlamalıdır. Kitaplıkta yer alan denetimler de dikkatle değerlendirilmelidir. Bu protokol, her shRNA tarafından etkili bir nakavt onaylamak mümkün değildir shRNA, yüzlerce kütüphanelerin bir "kör ekran" için tasarlanmıştır. Bu nedenle, bazı yanlış pozitif ve negatifler olasıdır. Ekrandaki teknik ve/veya biyolojik kopyaların sayısının artırılması yanlış pozitif ve negatif lerin sayısını azaltmaya yardımcı olabilir. Ancak, bu aynı zamanda önemli ölçüde kültür kuyularının sayısını artıracak ve bu nedenle bu suboptimal kültür koşulları (aşağıya bakın) neden olmadığından emin olmak için dikkatli alınmalıdır. Yanlış pozitif ve negatifleri azaltmak için başka bir yaklaşım, aynı hücre satırı veya ek hücre hatları tüm ekran tekrarlamak veya 3 biyolojik çoğaltmalar kullanarak sadece "isabet" de dahil olmak üzere daha küçük bir kütüphane ekran olacaktır. Her durumda, herhangi bir isabet bilinen hedef genler için qPCR gibi muhabir, yanında okumalar kullanılarak doğrulanmalıdır. Hedeflenen genin etkili nakavt da bu doğrulama adımlarında teyit edilmelidir. SHRNA tarafından etkili bir nakavt onaylanmadıkça aktiviteyi değiştirmeyen SHRNA'lar hakkında sonuç verilmemelidir. Doğrulama deneyleri ayrıca incelenen transkripsiyon faktörünün hedeflenen gen(ler) tarafından düzenlenir ve bu genlerin Renilla'yı veya minimal promotör yapılarını etkilememesini sağlamalıdır.

Ayrıca, aşırı biraraya gelmesi, çok az hücre, zayıf hücre canlılığı veya değişken proliferatif kapasite gibi en uygun olmayan koşulları önlemek için her hücre hattı için hücre kültürü koşullarını optimize etmek de önemlidir. Hücre tohumlama yoğunluğu özellikle çift luciferase muhabir yapısının transfeksiyonu sırasında (Adım 5) ve muhabir aktivitesi ölçüldüğünde (Adım 6) önemlidir. Transfeksiyon verimliliği hücre yoğunluğuna göre önemli ölçüde değişebilir ve hücre popülasyonunun sadece küçük bir kısmı tahsin ediliyorsa, kötü transfeksiyon verimliliği anormal sonuçlara neden olabilir. Test edilen çoğu hücre hattı en yüksek transfeksiyon verimliliğini gösterir ken 40 - 60% birleşme, ancak transfeksiyon koşulları ve tohumlama yoğunluğu floresan protein sağlayan bir vektör kullanarak belirli bir hücre hattı için optimize önerilir. Birincil hücreler gibi enfekte edilmesi ve/veya transfect'e bulaşmasını zor olan hücre hatları bu ekran için uygun olmayabilir. Kötü muhabir transfeksiyon verimliliği veya zayıf hücre canlılığı genellikle çok düşük Renilla luciferase sinyal neden olur. Ancak, bir hücre hattı için Renilla luciferase sinyal aralığını belirlemek için bir pilot deneme yapılmalıdır. Dizili kitaplıktan üretilen virüsün titresinin, tsn'nin titreyen hücre hattında en az %30 enfeksiyon verimi verecek kadar yüksek olması önemlidir. Enfeksiyon verimliliği büyük ölçüde değişebilir ve çeşitli faktörler viral titreti etkileyebilir. Kullanılan viral supernatant miktarı her hücre hattı için optimize edilmelidir ve gerekirse, Adım 2 viral titreleri geliştirmek için daha da optimize edilebilir.

Hücre yoğunluğu ve hücre canlılığı transkripsiyon faktörlerini düzenleyen hücresel yolların aktivitesini de etkileyebilir, bu nedenle çift luciferase tsay'ın okunduğu gün benzer yoğunlukta olacak şekilde muhabir transfeksiyoniçin hücrelerin tohumlatılması önemlidir (Adım 6). Ayrıca, hücrelerin merkezde yoğun bir yamada kümelemek yerine kuyu boyunca düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak da önemlidir. Yukarıda açıklandığı gibi, Renilla luciferase sinyalinde iyiden iyiye önemli bir değişim yorumlanması zor verilerle sonuçlanabilir. Bu viral vektör hücre canlılığını azalttığını ya da bu kuyu için transfeksiyon verimliliğini azalttığını göstermektedir gibi renilla luciferase sinyal önemli bir azalma gösteren kuyuları dışlamak en iyisidir çok düşüktü. Burada ortalama Renilla luciferase sinyalinden 1 standart sapmadan daha büyük kuyuları hariç tasladık, ancak her hücre hattı için uygun kesilmeleri belirlemek için optimizasyon deneyleri yapılmalıdır. Hücre canlılığını azaltan SHRNA'ların bunu, teşreleme yapılan transkripsiyon faktörünün etkinliğini değiştirerek yapabilmesi de mümkündür. Bu bir sorun sayılsa, Renilla luciferase sinyalini azaltan shRNA'lar indüklenebilir shRNA'lar veya diğer tahliller kullanılarak yeniden test edilebilir. Ayrıca, tripsinizasyon dan sonra yapışık hücrelerin askıda olduğu süreyi sınırlamak da önemlidir. Hücrelerin tripsinizasyonu ve tohumlanması sırasında çoğu adım için çok kanallı pipet kullanın ve daha büyük ekranlar için plakalarla toplu olarak çalışın. Buna ek olarak, hücrelerin enfeksiyonu ve muhabir tsay arasındaki süreyi sınırlamak en iyisidir. Bu özellikle, tsnülasyon faktörü hücre çoğalmasını veya sağkalımını düzenliyorsa önemlidir. Bu durumda, etkili nakavt ile hücreler daha az verimli nakavt ile hücreler tarafından rekabet olacaktır.

Açıklanan protokolün çeşitli değişiklikleri uygulanabilir. Bu yaklaşım, luciferase tabanlı bir muhabir oluşturulursa ve en yaygın transkripsiyon faktörlerinin çoğu için muhabir inkistleri zaten mevcutsa, herhangi bir transkripsiyon faktörüdüzenleyicilerini belirlemek için etkili bir şekilde kullanılabilir. Bu protokol, RNAi, CRISPR/CAS9, ORF veya cDNA gibi çok çeşitli ticari veya el ile monte edilmiş kitaplıkların kullanımı için değiştirilebilir. Nitekim, daha önce YAP / TAZ düzenleyiciler14için küçük bir cDNA kütüphane test etmek için benzer bir strateji kullanılır. Kitaplıklar retrovirüs, lentivirus, adenovirüs veya geçici geçici feksiyon kullanılarak teslim edilebilir. Burada kullanılan viral kat proteini (VSVG) insan-enfeksiyöz lentivirus üretir. Kemirgen hücreleri kullanılıyorsa ve insan dışı enfeksiyöz ekotropik virüs isteniyorsa, VSVG yerine Eco kat proteini veren bir vektör kullanılabilir.

Diğer yöntemler, bir transkripsiyon faktörü düzenleyicileri için kitaplıkları taramak için kullanılabilir. Yüksek iş bölümü tarama tesisine erişim, çok daha büyük kütüphanelerin otomatik bir şekilde taranmasına olanak sağlayacaktır. Aynı şekilde, genom çapında ekranlar "isabet" tanımlamak için bir araç olarak derin sıralama ile havuzlu kütüphaneler kullanılarak yapılabilir. Ancak, bu yaklaşımların her ikisi de birçok araştırmacı tarafından erişilemeyen ekipmanlar gerektirir ve yüksek iş letimatif tarama veya derin sıralama ücretleri engelleyici derecede yüksek olabilir. Buna ek olarak, havuzlu ekranlar bir floresan muhabiri veya transkripsiyonel etkinlikte istenen değişiklikleri gösteren hücreleri zenginleştirmek için başka bir yol kullanarak hücrelerin sıralanması gerektirir. Bir çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir test kullanarak büyük dizili ifade kütüphaneleri Tarama daha önce bir tezgah robot55kullanılarak gösterilmiştir , ama bu yaygın olarak tüm araştırmacılar için mevcut değildir. Buna karşılık, burada açıklanan yöntem hızlı, orta iş letme, nispeten ucuz ve büyük olasılıkla en müfettişler için erişilebilir ekipman ve reaktifler kullanır. Bu yöntem, transkripsiyon faktörünün yukarı sınanabilecek potansiyel düzenleyici yolları keşfetmenin uygun maliyetli ve uygun bir yolu olan tek bir deneyde birden fazla düzenleyiciyi ortaya çıkarabilir.

Açıklanan yaklaşımda, aday genler ustaca yıkıldı ve seçimden sonra, muhabir yapılar geçici olarak hücrelere aktarıldı. Ancak, transfeksiyon verimliliği birçok hücre hatlarında zayıftır ve değişkenlik tanıtmak ve hücresel toksisite neden olabilir. Geliştirilmiş bir alternatif yaklaşım, muhabiri nisbeten hücre nin genomuna entegre etmek ve daha sonra muhabiri ifade eden hücrelere tarama için viral kütüphanelerle bulaştırmak olacaktır. Bu gelişme, geçici transfeksiyonun getirdiği değişkenliği azaltacak ve uzun süreli enfeksiyon sonrası kültür nedeniyle transkripsiyon faktörü aktivitesinde olası değişiklikleri önleyeceği gibi. Yukarıda belirtildiği gibi, küçük bir tezgah robot kullanımı büyük ölçüde süreci kolaylaştırmak ve taranabilir kütüphanelerin boyutunu artırmak olacaktır. Başka bir önemli değişiklik daha etkili nakavt ile hücrelere karşı seçim olasılığını azaltacak ve hücre canlılığı değişiklikleri neden değişkenliği azaltmak dizili indüklenebilir vektör kütüphaneleri kullanmaktır.

Birçok kanserin etkili tedavisini engelleyen önemli bir sorun tümör hücrelerinin en etkili hedeflenen tedavilere bile direnç kazanmasıdır. Bu terapötik direnç için gerekli olan proteinlerin belirlenmesi hasta sonucunu iyileştirmek için gereklidir. Açıklanan yaklaşım kolayca bu bileşiklere karşı artan duyarlılık veya direnç neden genleri ortaya çıkarmak için hedefli terapötik ile birlikte kullanılabilir. Bu yaklaşımın bir diğer olası gelecekteki uygulaması birlikte aday terapötik hedefleri test etmek için bu dizili tarama kullanmak olacaktır. Bunun için, hücreler transkripsiyon faktörü aktivitesi üzerinde sinerjik etkisi olan proteinleri tanımlamak amacıyla her biri iki viral vektör ile enfekte olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Emily Norton ve Mikaelan Cucciarre-Stuligross'a shRNA vektörlerinin hazırlanmasına yardımcı olan için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen J.M.L.'ye (#CCR17477184) verilen Susan G. Komen Career Catalyst Grant tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Tags

Kanser Araştırma Sayı 157 transkripsiyon faktörü dizili RNAi ekran YAP TAZ TEAD çift luciferase muhabiri transkripsiyonel muhabir testi kanser
Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, Y., Lamar, J. M.… More

Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter