Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Identifiering av transkriptionsfaktor regulatorer med hjälp av Medium-Genomströmning Screening av arrayed bibliotek och en Dual-Luciferase-Based Reporter

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582

Summary

För att identifiera nya regulatorer av transkription faktorer, utvecklade vi en metod för skärmen arrayed lentiviral eller retroviral RNAi bibliotek med hjälp av en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys. Detta tillvägagångssätt erbjuder ett snabbt och relativt billigt sätt att skärmen hundratals kandidater i ett enda experiment.

Abstract

Transkriptionsfaktorer kan förändra uttrycket av många målgener som påverkar en mängd olika nedströmsprocesser som gör dem till bra mål för cancerbehandling. Emellertid, direkt inriktning transkription faktorer är ofta svårt och kan orsaka negativa biverkningar om transkriptionsfaktorn är nödvändig i en eller flera vuxna vävnader. Identifiera uppströms tillsynsmyndigheter som aberrantly aktivera transkriptionsfaktorer i cancerceller erbjuder ett mer genomförbart alternativ, särskilt om dessa proteiner är lätta att läkemedel. Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att kombinera arrayed medelstora lentivirala bibliotek och en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys för att identifiera nya regulatorer av transkription faktorer i cancerceller. Vårt tillvägagångssätt erbjuder ett snabbt, enkelt och billigt sätt att testa hundratals gener i ett enda experiment. För att demonstrera användningen av detta tillvägagångssätt utförde vi en skärm av en arrayed lentiviral RNAi bibliotek som innehåller flera regulatorer av Ja-associerade protein (YAP) och transkriptionella co-aktivator med PDZ-bindande motiv (TAZ), två transkriptionella co-aktivatorer som är nedströms effektfaktorer av Hippo utbildningsavsnitt. Detta tillvägagångssätt kan dock ändras för att kontrollera för tillsynsmyndigheter av praktiskt taget alla transkriptionsfaktor eller medfaktorer och kan också användas för att kontrollera CRISPR/CAS9-, cDNA- eller ORF-bibliotek.

Introduction

Syftet med denna analys är att använda virala bibliotek för att identifiera regulatorer av transkriptionsfaktorer på ett relativt snabbt och billigt sätt. Avvikande transkriptionell aktivitet är associerad med cancer och metastasering1,2,3,4,5,6, så inriktning transkription faktorer i cancerceller är en lovande terapeutisk metod. Transkriptionsfaktorer är dock ofta svåra att rikta farmakologiskt7 och många krävs för normal cellulär funktion i vuxna vävnader8,,9,10. Inriktning på cancer-associerade vägar som aberrantly aktivera transkription faktorer för att driva sjukdom är en mer genomförbar metod med potential att ha mindre allvarliga biverkningar. Den kommersiella tillgängligheten av arrayed lentiviral och retroviral RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, eller ORF bibliotek tillåter forskare att testa vikten av många gener i ett enda experiment. En tillförlitlig avläsning för ändrad transkriptionell aktivitet krävs dock.

Här beskriver vi användningen av en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys och arrayed lentiviral bibliotek för att identifiera proteiner som reglerar transkriptionsfaktorer i cancerceller. I denna analys, shRNAs som riktar cancer-associerade gener levereras till däggdjur cancerceller via lentiviral transduktion och celler väljs för stabil integration med puromycin. Cellerna är nästa transfected med en reporter konstruktion som uttrycker firefly luciferas drivs av en promotor som är specifik för transkriptionsfaktor som undersöks och en kontroll konstruktion som uttrycker Renilla luciferas från en constitutively aktiv promotor som inte är lyhörd för transkriptionsfaktorn undersöks. Vi visar detta tillvägagångssätt med en proof-of-concept skärm för regulatorer av YAP och TAZ, de kritiska nedströms effektfaktorer av Hippo väg8,10,11. Onormal aktivitet av YAP och TAZ främjar flera steg i ögonbevarande kaskad11 och observeras i många cancerformer11,12,13. Men hur YAP och TAZ blir aberrantly aktiveras i vissa cancerceller är ännu inte helt klarlagt. YAP och TAZ binder inte DNA, utan rekryteras istället till initiativtagare av andra transkriptionsfaktorer. Medlemmar i TEA-domänens (TEAD) familj av transkriptionsfaktorer är de viktigaste bindande partnerna för YAP och TAZ, och är avgörande för de flesta YAP- och TAZ-beroende funktioner. Vår reporter konstruktion uttrycker firefly luciferas från en YAP /TAZ-TEAD-lyhörd promotor och tidigare studier har visat att det troget upptäcker förändringar i YAP-TEAD och TAZ-TEAD transkriptionell aktivitet2,14,15.

Vårt tillvägagångssätt är snabb, medelgenomströmning, och kräver inte screening anläggningar, automatiserade robotar, eller djup sekvensering av poolade bibliotek. Kostnaderna är relativt låga och det finns många kommersiellt tillgängliga bibliotek att välja mellan. Den utrustning och de reagenser som krävs är också relativt standard i de flesta laboratorier. Det kan användas för att skärmen för regulatorer av praktiskt taget alla transkriptionsfaktor om en luciferas-baserad reporter finns eller genereras. Vi använder denna metod för att skärmen shRNAs i cancerceller, men alla cellinje som kan transfected med rimlig effektivitet kan användas med någon typ av arrayed bibliotek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: En schematisk sammanfattning av detta protokoll visas i figur 1.

1. Lentiviral vektorbiblioteksberedning

Obs: Den demonstrerade skärmen används en arrayed shRNA bibliotek köpt som glycerol lager i 96-väl plattor, men bibliotek kan också monteras manuellt baserat på en lista över kandidater. Lämpliga kontroller bör övervägas och ingå i alla bibliotek. Detta inkluderar en icke-inriktning kontroll shRNA (shNTC), en kontroll shRNA inriktning transkriptionsfaktorn undersöks, och om möjligt, en shRNA inriktning firefly luciferas.

  1. Tillsätt 1,3 ml Luria Broth (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% jästextrakt, 1% NaCl, pH 7.5) som innehåller 100 μg/ml ampicillin till varje brunn av en 96-brunnsriktallrik. Inokulera varje brunn med 2 μL glycerol lager och växa vid 37 °C över natten med konstant agitation vid 225 rpm.
  2. Överför varje bakteriekultur till ett centrifugrör på 1,5 ml och pellet bakterierna genom centrifugering vid 21 000 x g vid 4 °C i 10 minuter.
  3. Rena varje vektor med hjälp av en bakteriell mini-prep kit genom att följa tillverkarens protokoll.
  4. Bestäm koncentrationen av varje vektor med hjälp av en spektrofotometer.
  5. Förvara plasmiderna vid -20 °C.
    Protokollet kan pausas här.

2. Förpackning av det arrayerade lentivirala biblioteket

OBS: Allt arbete som involverar lentivirus, inklusive förpackning, infektion och efterföljande odling av infekterade celler bör strikt följa de institutionella biosäkerhetsreglerna och föreskrifterna.

  1. Expandera 293FT-cellerna med komplett tillväxtmedia (Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 4 mM L-glutamin, 4,500 mg/L glukos och natriumpyruvat, kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 100 enheter/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin antibiotika och 2 mM L-glutamin).
  2. För varje vektor i biblioteket från steg 1.4, utsäde en 24-brunn med 1 x 105 293FT celler.
    OBS: Det rekommenderas att vissa extra brunnar av en kontroll viral vektor förpackas och användas för att testa titer av viruset innan du fortsätter till steg 3 (se nedan).
  3. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 24 timmar.
    OBS: Ett allmänt protokoll för förpackning lentivirus som beskrevs tidigare14 har skalats ner till 24 brunnar för detta protokoll. Den använder psPAX2 för lentiviral förpackning och VSVG som ett pälsprotein. Om ektropiskt virus önskas kan en vektor som levererar Eco användas istället för VSVG. Det rekommenderas starkt att detta protokoll är optimerat för att uppnå en viral titer som ger mellan 30%-70% infektionseffektivitet av målcellerna (se Diskussion). Se Tilläggstabell 1 för en lista över alla vektorer som används.
  4. Ställ in en transfection blandning för varje viral vektor från steg 1.4 enligt beskrivningen nedan. Varje transfection ska innehålla 250 ng av virusvektorn, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 μL transfinfektionsreagens 1 och 23,75 μl transfsektionsbuffert (se tabell över material).
    1. Späd varje lentiviral vektor till 50 ng/μL med nukleasfritt vatten och överför sedan 5 μL (250 ng) till en brunn av en 96-brunns PCR-platta.
    2. Gör transfection super mix genom att blanda 1,25 μL * X av transfection reagens 1 och 23,75 μL * x förvärmd transfection buffert där "X" är det totala antalet transfections plus flera extra för att ta hänsyn till volymförlust under pipettering.
    3. Inkubera transfection super mix vid rumstemperatur i 5 min.
    4. Tillsätt 125 ng * X psPAX2 och 125 ng * X VSVG till röret av transfection super mix från steg 2.4.3 och försiktigt pipet upp och ner för att blanda. Fortsätt snabbt till steg 2.4.5.
    5. Omedelbart aliquot blandningen från steg 2.4.4 i varje rör av en PCR-remsa, och sedan använda flerkanaliga pipett för att överföra 25 μL blandningen till varje brunn som innehåller viral vektor från steg 2.4.1.
    6. Inkubera i rumstemperatur i 20 min.
    7. Överför alla 30 μLs från varje 96-brunn från steg 2.4.6 till en brunn av de 24-brunnar som innehåller 293 FT-celler från steg 2.3.
  5. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 24 timmar och byt sedan ut mediet i varje brunn på 24-brunnsplattan med 500 μl färskt komplett tillväxtmedel. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för ytterligare 24 timmar.
  6. Med hjälp av en flerkanalig pipett, samla virussupernatanten från varje brunn och alikvot 220 μL (tillräckligt för 1 infektion i steg 3 plus lite extra volym) i två 96-brunnar vardera. Dessa är de arrayed virala supernatant plattor.
  7. Förvara de arrayerade virussupernatantplattorna vid -80 °C.
    Protokollet kan pausas här. Det rekommenderas också att testa några av de extra kontrollvirus som förpackades (se ovan) på de celler som ska infekteras innan du fortsätter till steg 3. Detta för att säkerställa att titern är tillräcklig för att uppnå minst 30% infektionseffektivitet.

3. Infektion i cellerna för skärmen

OBS: Humant melanom celler (A375) användes för att visa detta tillvägagångssätt, men denna metod kan tillämpas på alla vidhäftande celler som infekterar med lentivirus. Cellodlings- och pläteringsförhållanden bör dock optimeras för varje cellinje (se Diskussion).

  1. Expandera cellerna så att de är infekterade i kompletta tillväxtmedier.
  2. Frö 24-brunnsplattor med 1 x 105 celler i 0,5 ml komplett tillväxtmedia per brunn. Utsäde en brunn för varje viral vektor som ska testas (inklusive kontroller) och innehålla en extra brunn som inte kommer att smittas som kommer att fungera som en kontroll för läkemedelsval i steg 3.7.
  3. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 24 timmar.
  4. Infektera varje brunn från steg 3.2 med ett annat viralt supernatant från det frysta arrayerade lentiviraltanten enligt följande.
    1. Förbered komplett tillväxtmedia som innehåller 20 μg/ml polybryggeri.
    2. Tina de arrayerade lentivirala biblioteket supernatanter från steg 2.7 till rumstemperatur.
    3. Sug upp tillväxtmediet från de 24-brunnsplattorna från steg 3.2 och tillsätt omedelbart 200 μl polybreneinnehållande tillväxtmedia till varje brunn.
    4. Med hjälp av en flerkanalig pipett, överför 200 μL viral supernatant från varje 96-brunn från steg 3.4.2 till de 24 brunnarna från steg 3.4.3.
  5. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 24 - 48 timmar.
    OBS: Vissa cellinjer kan kräva längre tid än 24 timmar för att uttrycka shRNAs och bli puromycin resistenta. Den virala vektor som används här levererar en Turbo-GFP-IRES-puroR med en miR30-baserad shRNA i 3'UTR av puroR (figur 1). Infektion effektivitet och uttryck för puromycin resistens genen och shRNA övervakades av gröna fluorescerande protein.
  6. Förbered komplett tillväxtmedia som innehåller 2,5 μg/ml puromycin.
    OBS: Urvalskoncentrationen av puromycin varierar mellan cellinjerna. Det rekommenderas att en antibiotika döda kurva utföras för varje cellinje som skall analyseras före skärmen.
  7. Sug upp mediet från varje brunn och ersätt med 500 μL puromycininnehållande komplett tillväxtmedia.
    OBS: Var noga med att också lägga puromycin till en kontroll icke-infekterade brunn som kan användas i efterföljande steg för att säkerställa puromycin valet är klar.
  8. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 48 timmar.
    OBS: Det är bäst att välja för 48 h, så plätering densitet och viral titer bör optimeras så att cellerna inte är överkonfluenta före 48 timmar.
  9. Se till att de infekterade cellerna är gröna under fluorescerande mikroskop, och att celler på en kontroll icke-infekterade väl behandlas med puromycin är alla döda innan du fortsätter till steg 4.

4. Såddceller för transinfektion av dubbel-luciferas reporter

OBS: En testtransfsektion bör göras för att bestämma den optimala sådensiteten för varje ny cellinje.

  1. Trypsinize varje brunn från steg 3.9 och överföra ungefär 1 x 105 celler till brunnar vid motsvarande position på den nya 24-brunnsplattan enligt följande.
    OBS: Detta protokoll är utformat för screening av bibliotek med hundratals shRNAs så det är inte möjligt att räkna varje brunn av infekterade celler. Därför användes stegen nedan för att uppskatta cellnummer i varje brunn för att säkerställa ungefär lika plätering densitet.
    1. Gruppera brunnarna från steg 3.9 till 3 - 4 grupper så att alla brunnar i en grupp har en liknande celltäthet.
    2. Trypsinize 1 representativ brunn från varje grupp med 200 μL trypsin-EDTA (1x PBS kompletteras med 0,5 mM EDTA och 0,1% trypsin) för 5 min vid 37 °C. Neutralisera sedan trypsin-EDTA genom att tillsätta 400 μL puromycin som innehåller komplett tillväxtmedia.
    3. Räkna varje representant väl för att bestämma det totala cellnumret och späd cellupphängningen från varje representativ brunn till 2 x 105 celler/ml med hjälp av komplett tillväxtmedia.
    4. Utsäde 0,5 ml (1 x 105 celler) av varje brunn från steg 4.1.3 till motsvarande position på en ny 24-brunnsplatta och ruva denna nya 24-brunnsplatta vid 37 °C med 5% CO2 för 24 timmar.
    5. För varje grupp från steg 4.1.1 använder du det totala cellantalet som bestäms i steg 4.1.3 för att beräkna volymen trypsin-EDTA för att lägga till varje brunn så att den resulterande cellupphängningen blir 1 x 106 celler/ml.
    6. Tillsätt lämplig volym trypsin-EDTA till varje brunn och inkubera i 5 min vid 37 °C.
      För större skärm rekommenderas att 24-brunnsplattorna trypsiniseras ochplates igen i grupper snarare än alla på en gång för att säkerställa cellernas livskraft.
    7. Under ovanstående inkubation, använd en flerkanalig pipett för att tillsätta 400 μL puromycininnehållande kompletta tillväxtmedier till motsvarande brunnar på en ny 24-brunnsplatta.
    8. Överför 100 μl cellsuspension (ca 1 x 105 celler) från varje brunn till motsvarande position på de nya 24-brunnsplattorna som är förberedda i steg 4.1.7.
    9. Upprepa steg 4.1.6 till 4.1.8 för alla plattor med grupperade brunnar från steg 4.1.1, en platta i taget.
  2. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 24 timmar.

5. Transfection av dual-luciferase reporter

  1. Transfect varje brunn från steg 4.2 med dual-luciferase reporter konstruerar enligt följande.
    OBS: Den totala mängden DNA och det optimala förhållandet mellan firefly luciferas reporter vektor för att kontrollera Renilla luciferas vektor bör bestämmas innan denna analys. Här användes 400 ng av en DNA-blandning som innehåller 20 delar firefly luciferas reporter och 1 del kontroll Renilla luciferas.
    1. Gör utspädningsblandningen (rör A) och reporterns utspädningsblandning (rör B) genom att blanda de angivna volymerna för varje reagens (tabell 1) multiplicerat med det totala antalet transfections (plus flera extra).
      Detta protokoll är optimerat för transfsektionsreagens 2 (se Tabell över material). Om ett annat transfection reagens används, bör transfektionen optimeras före detta steg.
    2. Blanda blandning av genomskinlighet (rör A) med reporterutspädningsblandningen (rör B) och inkubera i rumstemperatur i 15 min för att producera transfsektionsblandning.
    3. Skölj varje 24-brunn från steg 4.2 med 0,25 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS) under ovanstående inkubation och tillsätt 447 μl komplett tillväxtmedia till varje brunn.
    4. Efter inkubationen på 15 minuter, använd en flerkanalig pipett för att fördela 53 μl transfection mix till varje brunn av de 24-brunnsplattorna.
  2. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 24 timmar.

6. Kvantifiering av aktivitet med dubbla klareringser

  1. Mät luciferasaktivitet med hjälp av en plattläsare och en dubbel-luciferas reporter analys kit som beskrivs nedan.
    Detta protokoll är optimerat för den angivna reporteranalyssatsen (se tabell över material)och följer tillverkarens rekommenderade protokoll.
    1. Förbered tillräckligt med 1x passivlysbuffert för alla brunnar plus flera extra (75 μL behövs per brunn) genom att späda ut 5x passivlysbuffert (tillhandahålls i sats) 1 till 5 med avjoniserat vatten. Även tina reagens A och reagens B Buffer (tillhandahålls i satsen, 100 μL av varje behövs för varje brunn).
    2. Aspirera media från varje brunn av 24-brunnsplattan från steg 5.2.
    3. Tillsätt 75 μL 1x passivlysbuffert till varje brunn och inkubera i rumstemperatur i 30 min med ibland skakningar.
    4. Förbered reagens B genom att späda ut 50x reagens B substrat (tillhandahålls i sats) 1:50 med upptinad reagens B buffert.
    5. Tillsätt 30 μl 1x passivlysbuffert till 4 brunnar för blankning (se tilläggstabell 2).
    6. Överför 30 μl lysate från steg 6.1.3 till dubbla brunnar av en 96-brunns platt bottenvit analysplatta.
    7. Använd en flerkanalig pipett för att lägga till 50 μL reagens A till varje brunn och läsa eldflugan luciferassignalen med en plattläsare.
    8. Använd en flerkanalig pipett för att lägga till 50 μl reagens B från steg 6.1.4 till varje brunn och läs Renilla luciferassignalen med en plattläsare.
  2. Bearbeta rådata enligt följande (för en detaljerad beskrivning, se tilläggstabell 2).
    1. Uteslut prover med mycket låg Renilla luciferassignal eftersom låga värden indikerar att viruskonstruktionen var giftig eller att för få transfected celler analyserades.
      OBS: Som förklaras i diskussionen, betydligt "låg" Renilla luciferas signal kan resultera i avvikande resultat. Här uteslöts brunnar där Renilla luciferassignalen var mer än 1 standardavvikelse under medelvärdet (se tilläggstabell 2). Detta baserades på tidigare studier som utförts med hjälp av detta reportersystem i dessa celler14, men kan skilja sig åt i andra cellinjer.
    2. Normalisera det råa firefly luciferasvärdet för varje brunn till det råa Renilla luciferasvärdet av samma brunn för att få firefly/Renilla-förhållandet.
    3. Beräkna alla replikatkontrollbrunnar i genomsnittoch dela sedan upp firefly/Renilla-förhållandet för varannan brunn med det antalet för att få en vikförändring.
    4. Tilldela kontrollprovet och ställRenilla in dess brandfluga/ Renilla-kvotvärde till 1.
    5. Medelvärdet av de duplicerade brunnarnas brandfluga/Renilla-förhållanden och tomt med standardavvikelsen.
      OBS: Standardavvikelsen används inte för statistisk analys, utan som ett sätt att identifiera brunnar där replikaten skiljer sig avsevärt åt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår YAP/TAZ-TEAD reporter konstruktion (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) innehåller en minimal SV-49 promotor med 5 repetitioner av kanoniska TEAD bindningselement (MCAT)15 kör firefly luciferas genen ( figur1). Den är samtransfekt i celler tillsammans med PRL-TK kontrollvektorn (Promega), som uttrycker Renilla luciferas från den konstituerande aktiva HSV TK-promotorn (figur 1). Det är viktigt att se till att YAP/TAZ-TEAD-reporterkonstruktionen beter sig som förväntat i de cellinjeer som testas. Därför var vi först med och transkterade PRL-TK och pGL3-5xMCAT (SV)-49 konstruerar i A375 celler som stabilt uttrycker antingen en kontrollvektor, en mycket aktiv LATS-okänslig mutant av YAP (YAP2SA),eller en mutant av YAP2SA som inte kan binda TEADs (YAP2SA, S94A). Som väntat ökade firefly luciferasaktiviteten signifikant med YAP2SA,men inte kontrollvektorn eller YAP2SA,S94A (figur 2A). Detta tyder på att YAP ökar aktiviteten hos YAP/TAZ-TEAD-reportern på ett TEAD-beroende sätt. Viktigt, YAP2SA inte avsevärt ändra nivåerna av Renilla luciferas. Som en ytterligare kontroll bekräftade vi också att YAP2SA inte ändrar aktiviteten hos en minimal promotorkonstruktion som saknar MCAT TEAD-bindningselement (figur 2B).

Ett andra kontrollexperiment gjordes också där A375-celler var infekterade med viruskonstruktioner som ger antingen en icke-inriktning kontroll shRNA (shNTC) eller en konstruktion med tandem YAP och TAZ shRNAs. Efter ett stabilt urval var cellerna samtransfekterade med PRL-TK-konstruktionen och antingen YAP/TAZ-TEAD-reporterkonstruktionen eller den minimala promotorns konstruktion. I celler som transfekterades med YAP/TAZ-TEAD-reporterkonstruktionen minskade YAP/TAZ shRNA signifikant nivåerna av firefly luciferas, men kontrollen shNTC gjorde det inte (figur 2C). Firefly luciferas nivåer ändrades inte av antingen shNTC eller YAP / TAZ shRNA i celler som transfected med minimal promotor (figur 2C). I enlighet med resultaten ovan ändrades Renilla-signalen i varje brunn inte heller väsentligt av kontrollen shNTC eller YAP/TAZ shRNA (figur 2C),vilket ytterligare indikerar att PRL-TK-kontrollkonstruktionen inte är responsiv för YAP eller TAZ. Sammantaget visar dessa experiment att reportersystemet beter sig som förväntat i A375-celler, vilket är förenligt med tidigare studier med hjälp av dessa vektorer2,14.

Som ett proof of concept experiment, screenade vi en liten lentiviral shRNA bibliotek i A375 celler. Vårt testbibliotek innehöll shRNAs som riktar sig till flera gener som tidigare visat sig reglera YAP/TAZ-funktionen i andra celltyper. Men rollen av flera av dessa gener i regleringen av YAP och TAZ i melanom är okänd. Vårt bibliotek inkluderade gener som krävs för YAP/TAZ-aktivitet, såsom RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4 och CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,,24,,25,26,,27,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,,37,38, och gener som förutspås hämma YAP/ TAZ aktivitet, såsom CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR och RB139,,40,,41,,42,43,,44,, 45,46,47,48,49,50,,51,,52,,53,54. Som kontroller inkluderade vi en tandem YAP/TAZ shRNA14, en icke-inriktning kontroll shRNA (shNTC), och en shRNA inriktning Src, som vi tidigare visade krävdes för maximal YAP / TAZ aktivitet i A375 celler14.

Rådata och analys för den här skärmen visas i tilläggstabell 2. Flera shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 och shMAPK8-2) avsevärt minskat Renilla luciferase signal i förhållande till den genomsnittliga Renilla signal för alla brunnar, vilket tyder på att dessa shRNAs orsakade cytotoxicitet i A375 celler. Faktum är att dessa brunnar hade betydligt färre celler vid tidpunkten för analysen (visas inte). Detta gör det mycket svårt att skilja kandidater som kan reglera YAP / TAZ från de som är viktiga för cellens överlevnad. Därför är resultaten från dessa prover undantagna från ytterligare dataanalys. Som väntat minskade shRNAs inriktning YAP och TAZ eller Src avsevärt YAP/TAZ-TEAD aktivitet (figur 3). Överensstämmer med publicerade arbete som visar att PIK3CA främjar YAP och TAZ aktivitet21,26,31, fann vi att shRNAs inriktning PIK3CA minskade normaliserade firefly luciferas nivåer. shRNAs inriktning ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN varje ökad normaliserade firefly luciferas nivåer, vilket är förenligt med publicerade studier som visar att dessa proteiner förtränga YAP och / eller TAZ39,41,42,43,45,46,47,,48,50,,51,53,54 . Trots etablerade roller för ATR, CCNE2 och ERBB4 i andra celltyper27,,28,35,36,38,49, shRNAs inriktning dessa gener inte väsentligt ändra normaliserade firefly luciferas nivåer i A375 celler. shRNAs inriktning EZH2 och RB1 visade en effekt på firefly luciferas nivåer som var motsatsen till vad som förväntades baserat på studier i andra celltyper32,,34,40,52. Både PTEN och RAF1 var föremål för två distinkta shRNAs som hade motsatt effekter på luciferas verksamhet. Resultat som är oförenliga med tidigare studier kan tyda på att dessa proteiners inverkan på YAP/TAZ-TEAD-funktionen är celltypberoende. Det kan dock också bero på dålig knockdown effektivitet eller off-target effekter av vissa shRNAs. Som en n = 1 "blind" skärm, några falska positiva och falska negativ skulle också förväntas. Som diskuteras mer i detalj i diskussionen, ytterligare validering experiment skulle behöva göras med hjälp av andra analyser såsom qPCR för gener som regleras av YAP och TAZ och västra blottor för post translationella ändringar som påverkar YAP / TAZ funktion. Denna validering skulle också omfatta bekräftelse av vilka shRNAs effektivt nedtryckta protein av intresse. Det är också viktigt att notera att eftersom vår reporter är TEAD lyhörd, alla gener som identifierats av vår skärm kan påverka TEADs men inte YAP och TAZ direkt. Uppföljande mekanistiska studier skulle krävas för att avgöra om det var YAP och/eller TAZ eller TEADs som det identifierade proteinet reglerar. Emellertid, YAP och TAZ är de viktigaste drivkrafterna för TEAD-medierad transkription, så det är troligt att de flesta av dessa gener reglerar YAP och TAZ. I själva verket, som nämnts ovan, de flesta av de shRNAs som träffar i skärmen mål proteiner som är kända för att reglera YAP och / eller TAZ direkt.

Figure 1
Bild 1: Schematiskt diagram över arbetsflödet. De kritiska stegen i det här protokollet sammanfattas med stegnummer som motsvarar numren i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Optimering av YAP/TAZ-TEAD dual-luciferase transkriptionella reportersystem. (A)A375-celler som är fast uttrycker kontrollvektor (MSCV-IRES-Hygro), LATS-okänslig YAP (YAP2SA)eller LATS-okänslig YAP som inte kan binda TEADs (YAP2S S94A)var co-transfected med PRL-TK(Renilla)och pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP/TAZ-TEAD reporter) konstruktioner och luciferas signal mättes 24 timmar senare. n = 7 oberoende experiment. (B)A375 celler var co-transfected med antingen YAP2SA eller kontroll vektor, PRL-TK konstruera, och antingen pGL3-5xMCAT (SV)-49 konstruktion eller pGL3 (SV)-49 konstruera (minimal promotor) och luciferase signal mättes 24 timmar senare. n = 1 experiment som är infekterat i fyrdubblats. (C)A375 celler var smittade med retrovirus kodning en icke-inriktning kontroll shRNA (shNTC) eller tandem YAP och TAZ shRNAs (shYAP/TAZ). Efter stabil markering var cellerna co-transfected med PRL-TK konstruera och antingen pGL3-5xMCAT (SV)-49 konstruera eller pGL3 (SV)-49 konstruera och luciferas signal mättes 24 timmar senare. n = 4 oberoende infektioner; Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av enkelriktad ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelsetest; n.s. = p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Resultat av representativ skärm. Resultatet från varje knock down vektor jämförs med shNTC och presenteras som vik skillnad. Stapeldiagrammet visar medelvärdet av firefly luciferas/Renilla luciferasförhållande ± standardavvikelse. n = 1 experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Rör A – Utspädning av transfktion
Reagens Volym
Buffert för transfection 25 μl per reaktion
Transfection Reagens 2 (lägg till andra) 1,5 μl per reaktion
Rör B – Utspädning av reporter
Reagens Volym
Buffert för transfection 25 μl per reaktion
20:1 Firefly luciferas reporter: kontroll Renilla mix (lägg till andra) 400 ng per reaktion
Transfection Reagens 3 (lägg till tredje) 1 μl per reaktion
Totalt: 26,5 μl per reaktion

Tabell 1: Beredning av transfsektionsblandning. För transfection i varje brunn av de 24-brunnsplattorna späds 1,5 μl transfsektionsreagens 2 till 25 μl genomskinlig buffert för att producera transfectionspädningen (rör A). medan 400 ng av 20:1 firefly luciferase reporter: kontroll Renilla mix och 1 μL transfection reagens 3 späds till 25 μL transfktionsbuffert för att producera reportern utspädning (rör B).

Befintliga/inköpta/presentvektorer
Vektor Källkod
GIPZ mänskliga shRNA lentivirala vektorer GE Sjukvård
VSVG (AVST) Hynes labb [2]
psPAX2 (på andra) Addgene (#12260)
gag / pol Addgene (#14887)
pGL3-(SV)-49 Iain Farrance [15]
pGL3-5xMCAT(SV)-49 Iain Farrance [15]
PRL-TK Promega (på)
MSCV-IRES-Hygro LAMAR LAB [2]
MSCV-YAP-S127A, S381A-IRES-Hygro LAMAR LAB [2]
MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 LAMAR LABB [14]
Nya vektorer
Vektor Källa Ryggrad
MSCV-YAP-S94A, S127A, S381A-IRES-Hygro MSCV-IRES-Hygro

Tilläggstabell 1: Tabell över vektorer. Alla vektorer som används visas med nya vektorer som beskrivs. Standardmolekylbiologiska tekniker användes för att generera nya vektorer.

Kompletterande tabell 2: Analysdataanalys av Luciferasanalys. Arrangemanget för shRNA-biblioteket visas i den första tabellen. Den andra och tredje tabeller visar rå firefly och Renilla luciferas signaler, respektive. Medel- och standardavvikelsen för Renilla luciferassignalen för alla brunnar anges i de gula rutorna. Brunnar med renilla luciferassignal mer än 1 standardavvikelse under medelvärdet markeras med röd text och utesluts från ytterligare analys. Firefly/Renilla förhållandet för varje brunn erhölls genom att dela den råa firefly luciferas signalen med den råa Renilla luciferas signal (fjärde bordet). Firefly /Renilla förhållandet mellan varje brunn normaliserades sedan till genomsnittet av firefly /Renilla förhållandet mellan kontroll (shNTC) brunnar (femte bordet). Dubblettbrunnarna var nästa genomsnitt för varje konstruktion och standardavvikelsen beräknades (sjätte tabellen). Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie visar vi en metod för medium-genomströmning screening av arrayed viral bibliotek i kombination med en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys som kan användas för att identifiera och testa nya regulatorer av transkription faktorer. Det är viktigt att karakterisera och optimera reportersystemet för varje cellinje före en skärm. Experiment bör göras för att bekräfta att reportern är lyhörd för förändrad aktivitet av transkriptionsfaktorn som undersöks och omfattningen av förändringen i aktivitet bör testas i förhållande till kontrollvektorer. Co-transfection av PRL-TK konstruktion tillsammans med reportern konstruktion är viktigt eftersom det hjälper till att kontrollera för antalet celler som smittats med reportern och kopieringsnumret för reportern konstruktion, som båda kan ändra omfattningen av luciferas signalen. Optimeringsexperiment bör också säkerställa att transkriptionsfaktorn Renilla inte påverkar den konstituerande Renilla-konstruktionens aktivitet eller en minimal promotorkonstruktion, eftersom detta kan komplicera tolkningen av resultaten. Kontroller som ska ingå i biblioteket bör också noga övervägas. Detta protokoll är utformat för en "blind skärm" av bibliotek med hundratals shRNAs, där det inte är möjligt att bekräfta effektiv knockdown av varje shRNA. Därför är vissa falska positiva och negativa sannolikt. Att öka antalet tekniska och/eller biologiska replikat på skärmen kan bidra till att minska antalet falska positiva och negativa. Detta kommer dock också att avsevärt öka antalet brunnar till kultur och analys så försiktighet bör iakttas för att säkerställa att detta inte leder till suboptimala kulturförhållanden (se nedan). En annan metod för att minska falska positiva och negativa skulle vara att upprepa hela skärmen i samma cellinje eller ytterligare cellinjer, eller att skärmen ett mindre bibliotek inklusive endast "träffar" med hjälp av 3 biologiska replikerar. I samtliga fall bör alla träffar valideras med hjälp av avläsningar förutom reportern, till exempel qPCR för kända målgener. Effektiv nedslagning av den riktade genen bör också bekräftas i dessa valideringssteg. Slutsatser bör inte dras om shRNAs som inte ändrar aktivitet om inte effektiv knockdown av shRNA bekräftas. Valideringsexperiment bör också säkerställa att den transkriptionsfaktor som undersöks är det som regleras av den eller de riktade generna och att dessa gener inte påverkar Renilla- eller minimala promotorkonstruktioner.

Det är också viktigt att optimera cellodlingsförhållandena för varje cellinje för att undvika suboptimala tillstånd som överkonfluens, för få celler, dålig cellkraft eller variabel proliferativ kapacitet. Cellsådditeten är särskilt viktig vid transfection av dual-luciferase reporter konstruktion (Steg 5) och när reportern aktivitet mäts (Steg 6). Transfection effektivitet kan variera avsevärt med celltäthet och dålig transfection effektivitet kan resultera i avvikande resultat om endast en liten del av cellpopulationen analyseras. De flesta testade cellinjer visar den högsta transfktionseffektiviteten vid 40 - 60% sammanflödet, men det rekommenderas att transfktionsförhållanden och såddensitet optimeras för en viss cellinje med hjälp av en vektor som ger ett fluorescerande protein. Cellinjer som är svåra att infektera och/eller transfekt, till exempel primära celler kanske inte är lämpliga för den här skärmen. Dålig reporter transfection effektivitet eller dålig cell livsduglighet resulterar vanligtvis i mycket låg Renilla luciferas signal. Ett pilotexperiment bör dock utföras för att bestämma intervallet för Renilla luciferassignal för en cellinje. Det är viktigt att titer av viruset som produceras från arrayed biblioteket är tillräckligt hög för att ge en infektion effektivitet på minst 30% i cellinjen som analyseras. Infektionseffektivitet kan variera kraftigt och flera faktorer kan påverka viral titer. Mängden viral supernatant som används bör optimeras för varje cellinje och vid behov kan steg 2 optimeras ytterligare för att förbättra viral titrar.

Celltäthet och cellens livskraft kan också påverka aktiviteten hos cellulära vägar som reglerar transkriptionsfaktorer, så det är viktigt att så cellerna för reportertransfekten så att de alla har en liknande densitet den dag som den dubbla luciferasanalysen läses (steg 6). Det är också viktigt att se till att cellerna fastnar jämnt över brunnen i stället för att samla in en tät patch i mitten. Som beskrivits ovan kan betydande variationer i Renilla luciferassignalen från brunn till brunn resultera i data som är svåra att tolka. Det är bäst att utesluta brunnar som visar en betydande minskning av Renilla luciferas signal jämfört med alla andra brunnar eftersom detta tyder på att antingen den virala vektorn minskar cellens livskraft eller transfection effektivitet för att väl var mycket låg. Här uteslöt vi brunnar större än 1 standardavvikelse från medelvärdet Renilla luciferassignal, men optimeringsexperiment bör göras för att bestämma lämpliga cutoffs för varje cellinje. Det är också möjligt att shRNAs som minskar cellens livskraft skulle kunna göra det genom att ändra aktiviteten hos transkriptionsfaktorn som analyseras. Om detta är ett problem, shRNAs som minskar Renilla luciferas signal kan testas på nytt med hjälp av inducible shRNAs eller andra analyser. Det är också viktigt att begränsa den tid som vidhäftade celler är i suspension efter trypsinization. Använd en flerkanalig pipett för de flesta steg under trypsinisering och sådd av celler, och för större skärmar, arbeta med plattorna i omgångar. Dessutom är det bäst att begränsa tiden mellan infektionen i cellerna och reporteranalysen. Detta är särskilt viktigt om den transkriptionsfaktor som analyseras reglerar cellproliferation eller överlevnad. I detta fall, celler med effektiv knockdown skulle konkurreras ut av celler med mindre effektiv knockdown.

Flera ändringar av det beskrivna protokollet är genomförbara. Detta tillvägagångssätt kan användas effektivt för att identifiera tillsynsmyndigheter av någon transkriptionsfaktor om en luciferas-baserad reporter genereras, och för många av de vanligaste transkriptionsfaktorer reporter konstruktioner redan finns. Detta protokoll kan ändras för användning av ett brett utbud kommersiellt tillgängliga eller manuellt monterade bibliotek, inklusive RNAi, CRISPR/CAS9, ORF eller cDNA. Faktum är att vi tidigare använt en liknande strategi för att testa ett litet cDNA-bibliotek för YAP /TAZ regulatorer14. Bibliotek kan levereras med retrovirus, lentivirus, adenovirus eller övergående transfection. Det virala pälsprotein som används här (VSVG) genererar lentivirus som är infektiöst. Om gnagare celler används och icke-mänskliga infektiösa ecotropic virus önskas, en vektor som levererar Eco coat protein kan användas i stället för VSVG.

Andra metoder kan användas för att kontrollera bibliotek för regulatorer av en transkriptionsfaktor. Tillgång till en hög genomströmningskontroll skulle möjliggöra screening av mycket större bibliotek på ett automatiserat sätt. På samma sätt kan genom-breda skärmar göras med hjälp av poolade bibliotek med djup sekvensering som ett sätt att identifiera "träffar". Båda dessa metoder kräver dock utrustning som inte är tillgänglig för många forskare, och avgifterna för screening med hög genomströmning eller djupsekvensering kan vara oöverkomligt höga. Dessutom skulle poolade skärmar kräver sortering av celler med hjälp av en fluorescerande reporter eller annat sätt att berika de celler som visar de önskade förändringarna i transkriptionell aktivitet. Screening av stora arrayed uttryck bibliotek med hjälp av en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys har visats tidigare med hjälp av en bänkskiva robot55, men detta är inte allmänt tillgänglig för alla forskare. Däremot är den metod som beskrivs här snabb, medelgenomströmning, relativt billig, och använder utrustning och reagenser som sannolikt är tillgängliga för de flesta utredare. Denna metod kan avslöja flera tillsynsmyndigheter i ett enda experiment, vilket är ett kostnadseffektivt och bekvämt sätt att upptäcka potentiella regleringsvägar uppströms en transkriptionsfaktor.

I det beskrivna tillvägagångssättet, kandidat gener var stabilt knackade ner och sedan efter urval, var reportern konstruktioner transiently transfected i cellerna. Emellertid, transfection effektivitet är dålig i många cellinjer och kan införa variationer och orsaka cellulär toxicitet. Ett förbättrat alternativt tillvägagångssätt skulle vara att stabilt integrera reporterkonstruktionen i arvsmassan i celllinjen av intresse och sedan infektera de reporter-uttrycka cellerna med virala bibliotek för screening. Denna förbättring skulle minska den variation som införts genom transienta transfection och förhindra eventuella förändringar i transkriptionsfaktor aktivitet på grund av långvarig post-infektion kultur. Som nämnts ovan skulle användningen av en liten bänkskiva robot kraftigt effektivisera processen och öka storleken på de bibliotek som kan kontrolleras. En annan betydande förändring är att använda arrayed inducible vektor bibliotek, vilket skulle minska sannolikheten för urval mot celler med effektivare knockdown och minska variationer som orsakas av förändringar i cellens livskraft.

En betydande utmaning som förhindrar effektiv behandling av många cancerformer är att tumörceller förvärva resistens mot även de mest effektiva riktade terapier. Identifiering av proteiner som krävs för denna terapeutiska resistens är nödvändig för att förbättra patientens resultat. Den beskrivna metoden kan lätt användas i kombination med riktade therapeutics för att avslöja gener som orsakar ökad känslighet eller resistens mot dessa föreningar. En annan potentiell framtida tillämpning av detta tillvägagångssätt skulle vara att använda denna arrayed screening för att testa kandidat terapeutiska mål i kombination. För detta skulle celler vara infekterade med två virusvektorer vardera med målet att identifiera proteiner som har en synergistisk effekt på transkriptionsfaktoraktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Emily Norton och Mikaelan Cucciarre-Stuligross för att de hjälper till vid beredningen av shRNA-vektorer. Detta arbete stöddes delvis av en Susan G. Komen Career Catalyst Grant som tilldelas J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Tags

Cancerforskning transkriptionsfaktor arrayed RNAi skärm YAP TAZ TEAD dual-luciferase reporter transcriptional reporter analys cancer
Identifiering av transkriptionsfaktor regulatorer med hjälp av Medium-Genomströmning Screening av arrayed bibliotek och en Dual-Luciferase-Based Reporter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, Y., Lamar, J. M.More

Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter