Summary
For å identifisere nye regulatorer av transkripsjonsfaktorer utviklet vi en tilnærming til skjermarrayed lentivirale eller retrovirale RNAi-biblioteker ved hjelp av en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporteranalyse. Denne tilnærmingen tilbyr en rask og relativt billig måte å screene hundrevis av kandidater i et enkelt eksperiment.
Abstract
Transkripsjonsfaktorer kan endre uttrykket for en rekke målgener som påvirker en rekke nedstrømsprosesser, noe som gjør dem gode mål for anti-kreftterapi. Direkte målretting av transkripsjonsfaktorer er imidlertid ofte vanskelig og kan forårsake uønskede bivirkninger hvis transkripsjonsfaktoren er nødvendig i ett eller flere voksne vev. Identifisere oppstrøms regulatorer som avvikende aktivere transkripsjon faktorer i kreftceller tilbyr et mer gjennomførbart alternativ, spesielt hvis disse proteinene er lett å narkotika. Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å kombinere arrayed medium-scale lentiviral biblioteker og en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporter analyse for å identifisere nye regulatorer av transkripsjonsfaktorer i kreftceller. Vår tilnærming tilbyr en rask, enkel og rimelig måte å teste hundrevis av gener i et enkelt eksperiment. For å demonstrere bruken av denne tilnærmingen utførte vi en skjerm av et arrayed lentiviral RNAi-bibliotek som inneholder flere regulatorer av Ja-assosiert protein (YAP) og transkripsjonskoaktivator med PDZ-bindende motiv (TAZ), to transkripsjonelle koaktivatorer som er de nedstrøms effektorene på Hippo-banen. Denne tilnærmingen kan imidlertid endres til skjerm for regulatorer av nesten alle transkripsjonsfaktorer eller medfaktor, og kan også brukes til å screene CRISPR/CAS9,cDNA eller ORF-biblioteker.
Introduction
Formålet med denne analysen er å bruke virale biblioteker for å identifisere regulatorer av transkripsjonsfaktorer på en relativt rask og rimelig måte. Avvikende transkripsjonsaktivitet er forbundet med kreft og metastase1,2,3,4,5,6, så målretting transkripsjonfaktorer i kreftceller er en lovende terapeutisk tilnærming. Transkripsjonsfaktorer er imidlertid ofte vanskelige å målrette farmakologisk7, og mange er nødvendige for normal cellulær funksjon i voksenvev8,9,10. Målretting mot kreftrelaterte veier som avvikende aktiverer transkripsjonsfaktorer for å drive sykdom, er en mer mulig tilnærming med potensial til å ha mindre alvorlige bivirkninger. Den kommersielle tilgjengeligheten av arrayed lentiviral og retroviral RNAi, CRISPR/ CAS9, cDNA eller ORF biblioteker gjør det mulig for forskere å teste viktigheten av mange gener i et enkelt eksperiment. En pålitelig avlesning for endret transkripsjonsaktivitet er imidlertid nødvendig.
Her beskriver vi bruken av en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporteranalyse og arrayed lentivirale biblioteker for å identifisere proteiner som regulerer transkripsjonsfaktorer i kreftceller. I denne analysen er shRNAs som retter seg mot kreftrelaterte gener levert til pattedyrkreftceller via lentiviral transduksjon og celler valgt for stabil integrasjon ved hjelp av puromycin. Cellene er neste transfected med en reporter konstruksjon som uttrykker firefly luciferase drevet av en arrangør som er spesifikk for transkripsjonsfaktoren som undersøkes og en kontrollkonstruksjon som uttrykker Renilla luciferase fra en konstitutivt aktiv arrangør som ikke reagerer på transkripsjonsfaktoren som undersøkes. Vi demonstrerer denne tilnærmingen med en konseptbevisskjerm for regulatorer av YAP og TAZ, de kritiske nedstrømseffektorene av Hippo-banen8,,10,11. Unormal aktivitet av YAP og TAZ fremmer flere trinn av metastatisk kaskade11 og observeres i mange kreftformer11,12,13. Men hvordan YAP og TAZ blir avvikende aktivert i noen kreftceller er ennå ikke fullt ut forstått. YAP og TAZ binder ikke DNA, men rekrutteres i stedet til arrangører av andre transkripsjonsfaktorer. Medlemmer av TEA-domenet (TEAD) familie av transkripsjonsfaktorer er de viktigste bindende partnerne for YAP og TAZ, og er kritiske for de fleste YAP- og TAZ-avhengige funksjoner. Vår reporter konstruere uttrykker firefly luciferase fra en YAP / TAZ-TEAD-responsive arrangør og tidligere studier har vist at det trofast oppdager endringer i YAP-TEAD og TAZ-TEAD transkripsjonsaktivitet2,14,15.
Vår tilnærming er rask, middels gjennomstrømning, og krever ikke screeningfasiliteter, automatiserte roboter eller dyp sekvensering av samlede biblioteker. Kostnadene er relativt lave og det er mange kommersielt tilgjengelige biblioteker å velge mellom. Nødvendig utstyr og reagenser er også relativt standard i de fleste laboratorier. Den kan brukes til å screene for regulatorer av nesten enhver transkripsjonsfaktor hvis en luciferase-basert reporter eksisterer eller genereres. Vi bruker denne tilnærmingen til å screene shRNAs i kreftceller, men enhver cellelinje som kan transfected med rimelig effektivitet kan brukes med alle typer arrayed bibliotek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Et skjematisk sammendrag av denne protokollen vises i figur 1.
1. Forberedelse av fastafysiviralvektorbibliotek
MERK: Den demonstrerte skjermen brukte et arrayed shRNA-bibliotek kjøpt som glyserolaksjer i 96-brønnplater, men biblioteker kan også monteres manuelt basert på en liste over kandidater. Passende kontroller bør vurderes og inkluderes i et hvilket som helst bibliotek. Dette inkluderer en ikke-målretting kontroll shRNA (shNTC), en kontroll shRNA rettet mot transkripsjon serutt, og om mulig, en shRNA rettet mot firefly luciferase.
- Tilsett 1,3 ml Luria Broth (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% gjærekstrakt, 1% NaCl, pH 7.5) som inneholder 100 μg/ml ampicillin til hver brønn av en 96-brønn dyp brønnplate. Inokuler hver brønn med 2 μL glyserollager og vokse ved 37 °C over natten med konstant agitasjon ved 225 rpm.
- Overfør hver bakterielle kultur til et 1,5 ml sentrifugerør og pellet bakteriene ved sentrifugering ved 21.000 x g ved 4 °C i 10 min.
- Rens hver vektor ved hjelp av et bakteriell mini-prep-sett ved å følge produsentens protokoll.
- Bestem konsentrasjonen av hver vektor ved hjelp av et spektrotometer.
- Oppbevar plasmidene ved -20 °C.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
2. Emballasje av det oppkledde lentivirale biblioteket
MERK: Alt arbeid som involverer lentivirus, inkludert emballasje, infeksjon og påfølgende kuling av infiserte celler, bør følge de institusjonelle biosikkerhetsreglene og forskriftene nøye.
- Utvid 293FT-cellene ved hjelp av komplette vekstmedier (Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) som inneholder 4 mM L-glutamin, 4500 mg/l glukose og natriumpyruvat, supplert med 10% føtal storfeserum (FBS), 100 enheter/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin antibiotika og 2 m L-glutminea).
- For hver vektor i biblioteket fra trinn 1.4, frø en 24-brønn med 1 x 105 293FT celler.
MERK: Det anbefales at noen ekstra brønner av en kontroll viral vektor pakkes og brukes til å teste titer av viruset før du går videre til trinn 3 (se nedenfor). - Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
MERK: En generell protokoll for emballasjelentivirus som tidligere ble beskrevet14, er skalert ned til 24 brønner for denne protokollen. Den bruker psPAX2 for lentiviral emballasje og VSVG som et pelsprotein. Hvis ektropisk virus er ønsket, kan en vektor som leverer Eco brukes i stedet for VSVG. Det anbefales sterkt at denne protokollen er optimalisert for å oppnå en viral titer som gir mellom 30%-70% infeksjonseffektivitet av målcellene (se Diskusjon). Se Tilleggstabell 1 for en liste over alle vektorer som brukes. - Sett opp en transfection blanding for hver viral vektor fra trinn 1.4 som beskrevet nedenfor. Hver transfection bør inneholde 250 ng av virusvektoren, 125 ng av psPAX2, 125 ng av VSVG, 1,25 μL transfection reagens 1 og 23,75 μL transfection buffer (se Materialbrev).
- Fortynn hver lentiviral vektor til 50 ng/μL med nukleoskefritt vann, og overfør deretter 5 μL (250 ng) til en brønn på en 96-brønn PCR-plate.
- Lag transfection super mix ved å blande 1,25 μL * X transfection reagens 1 og 23,75 μL * X av pre-varmet transfection buffer der "X" er det totale antall transfections pluss flere ekstra for å ta hensyn til volumtap under pipettering.
- Inkuber transfection super mix ved romtemperatur i 5 min.
- Tilsett 125 ng * X psPAX2 og 125 ng * X av VSVG til røret av transfection super mix fra trinn 2.4.3 og forsiktig rør opp og ned for å blande. Fortsett raskt til trinn 2.4.5.
- Umiddelbart aliquot blandingen fra trinn 2.4.4 inn i hvert rør av en PCR stripe, og deretter bruke flerkanals pipette for å overføre 25 μL blandingen til hver brønn som inneholder viral vektor fra trinn 2.4.1.
- Inkuber ved romtemperatur i 20 min.
- Overfør alle 30 μLs fra hver 96-brønn fra trinn 2.4.6 til en brønn av 24-brønnen som inneholder 293 FT-celler fra trinn 2.3.
- Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer og skift deretter ut mediet i hver brønn på 24-brønnplaten med 500 μL friske komplette vekstmedier. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i ytterligere 24 timer.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, samle viral supernatant fra hver brønn og aliquot 220 μL (nok for 1 infeksjon i trinn 3 pluss litt ekstra volum) i to 96-brønner hver. Dette er de opprekkede virale supernatantplatene.
- Oppbevar de oppsvulmede virale supernatantplatene ved -80 °C.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Det anbefales også å teste noen av de ekstra kontrollvirussom ble pakket (se ovenfor) på cellene som skal være infisert før du går videre til trinn 3. Dette er for å sikre at titer er tilstrekkelig til å oppnå minst 30% infeksjoneffektivitet.
3. Infeksjon av cellene for skjermen
MERK: Humane melanomceller (A375) ble brukt til å demonstrere denne tilnærmingen, men denne metoden kan brukes på eventuelle tilhengerceller som infiserer med lentivirus. Cellekultur og platingsforhold bør imidlertid optimaliseres for hver cellelinje (se Diskusjon).
- Utvid cellene som skal infisert i fullstendige vekstmedier.
- Frø 24-brønnplater med 1 x 105 celler i 0,5 ml komplett vekstmedier per brønn. Frø en brønn for hver viral vektor som skal testes (inkludert kontroller) og inkluderer en ekstra brønn som ikke vil bli smittet som vil tjene som en kontroll for narkotikavalg i trinn 3.7.
- Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- Infisere hver brønn fra trinn 3.2 med en annen viral supernatant fra den frosne arrayed lentiviral supernatant som følger.
- Forbered komplette vekstmedier som inneholder 20 μg/ml polybren.
- Tin de arrayed lentiviralbibliotek supernatants fra trinn 2.7 til romtemperatur.
- Aspirer vekstmediene fra de 24-brønnplatene fra trinn 3.2 og tilsett umiddelbart 200 μL polybrenholdige vekstmedier til hver brønn.
- Bruk en flerkanals pipette til å overføre 200 μL virussupernatant fra hver 96-brønn fra trinn 3.4.2 til de 24 brønnene fra trinn 3.4.3.
- Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 for 24 -48 timer.
MERK: Noen cellelinjer kan kreve mer enn 24 timer for å uttrykke shRNAs og bli puromycin resistente. Den virale vektoren som brukes her, gir en Turbo-GFP-IRES-puroR med en miR30-basert shRNA i 3'UTR av puroR (figur 1). Infeksjonseffektivitet og uttrykk for puromycinresistensgenet og shRNA ble overvåket av grønt fluorescerende protein. - Forbered komplette vekstmedier som inneholder 2,5 μg/ml puromycin.
MERK: Utvalgskonsentrasjonen av puromycin varierer mellom cellelinjer. Det anbefales at en antibiotikakillkurve utføres for hver cellelinje som skal assibles før skjermen. - Aspirer mediene fra hver brønn og erstatt med 500 μL puromycinholdige komplette vekstmedier.
MERK: Sørg for å også legge puromycin til en kontroll ikke-infisert brønn som kan brukes i etterfølgende trinn for å sikre at puromycin-valget er fullført. - Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer.
MERK: Det er best å velge for 48 timer, så plating tetthet og viral titer bør optimaliseres slik at cellene ikke er overconfluent før 48 timer. - Sørg for at de infiserte cellene er grønne under fluorescerende mikroskop, og at celler på en kontroll ikke-infisert godt behandlet med puromycin er alle døde før de går videre til trinn 4.
4. Seeding celler for transfection av dual-luciferase reporter
MERK: En testtransfection bør gjøres for å bestemme den optimale seeding tettheten for hver ny cellelinje.
- Prøv hver brønn fra trinn 3.9 og overfør omtrent 1 x 105 celler til brønner i tilsvarende posisjon på den nye 24-brønnplaten som følger.
MERK: Denne protokollen er utformet for screening av biblioteker med hundrevis av shRNAs, så det er ikke mulig å telle alle brønnene av infiserte celler. Derfor ble trinnene nedenfor brukt til å estimere celletall i hver brønn for å sikre omtrent lik plating tetthet.- Grupper brønnene fra trinn 3,9 til 3 - 4 grupper slik at alle brønner i en gruppe har en lignende celletetthet.
- Trypsinize 1 representant godt fra hver gruppe med 200 μL trypsin-EDTA (1x PBS supplert med 0,5 mM EDTA og 0,1% trypsin) i 5 min ved 37 °C. Nøytraliser deretter trypsin-EDTA ved å legge til 400 μL puromycin som inneholder komplette vekstmedier.
- Tell hver representant godt for å bestemme det totale cellenummeret og fortynn cellesuspensjonen fra hver representant godt til 2 x 105 celler / ml for å bruke komplette vekstmedier.
- Frø 0,5 ml (1 x 105 celler) av hver brønn fra trinn 4.1.3 til tilsvarende posisjon på en ny 24-brønnplate og inkuber denne nye 24-brønnplaten ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- For hver gruppe fra trinn 4.1.1 bruker du det totale cellenummeret som er bestemt i trinn 4.1.3 til å beregne volumet av trypsin-EDTA for å legge til hver brønn, slik at den resulterende cellesuspensjonen vil være 1 x 106 celler/ml.
- Tilsett riktig volum av trypsin-EDTA til hver brønn og inkuber i 5 min ved 37 °C.
MERK: For større skjerm anbefales det at de 24-brønnplatene prøves og reprises i grupper i stedet for alt på en gang for å sikre levedyktigheten til cellene. - Under den ovennevnte inkubasjonen, bruk en flerkanals pipette til å legge til 400 μL puromycinholdige komplette vekstmedier til de tilsvarende brønnene på en ny 24-brønnplate.
- Overfør 100 μL cellesuspensjon (ca. 1 x 105 celler) fra hver brønn til tilsvarende posisjon på de nye 24-brønnplatene som er tilberedt i trinn 4.1.7.
- Gjenta trinn 4.1.6 til 4.1.8 for alle plater av grupperte brønner fra trinn 4.1.1, en tallerken om gangen.
- Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
5. Transfection av dual-luciferase reporter
- Transfect hver brønn fra trinn 4.2 med dual-luciferase reporter konstruerer som følger.
MERK: Den totale mengden DNA og det optimale forholdet mellom firefly luciferase reporter vektor for å kontrollere Renilla luciferase vektor bør bestemmes før du starter denne analysen. Her ble 400 ng av en DNA-blanding som inneholder 20 deler firefly luciferase reporter og 1 del kontroll Renilla luciferase brukt.- Lag transfection fortynningblanding (Rør A) og reporterfortynning blanding (Rør B) ved å blande de angitte volumene av hver reagens (Tabell 1) multiplisert med totalt antall transfections (pluss flere ekstra).
MERK: Denne protokollen er optimalisert for senderea 2 (se Materialtabellen). Hvis en annen transfection reagens brukes, bør transfection optimaliseres før dette trinnet. - Bland transfection fortynningblandingen (Rør A) med reporterfortynningsblanding (Rør B) og inkuber ved romtemperatur i 15 min for å produsere transfection blanding.
- Under ovennevnte inkubasjon, skyll hver 24-brønn fra trinn 4.2 med 0,25 ml fosfatbuffersaltvann (PBS), og tilsett 447 μL av komplette vekstmedier til hver brønn.
- Etter 15 min inkubasjon, bruk en flerkanals pipette til å distribuere 53 μL transfection mix til hver brønn av de 24-brønnplatene.
- Lag transfection fortynningblanding (Rør A) og reporterfortynning blanding (Rør B) ved å blande de angitte volumene av hver reagens (Tabell 1) multiplisert med totalt antall transfections (pluss flere ekstra).
- Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
6. Kvantifisering av dual-luciferase aktivitet
- Mål luciferase aktivitet ved hjelp av en plateleser og en dual-luciferase reporter analyse kit som beskrevet nedenfor.
MERK: Denne protokollen er optimalisert for det angitte reporteranalysesettet (se Materialtabellen) og følger produsentens anbefalte protokoll.- Forbered nok 1x passiv lysisbuffer for alle brønner pluss flere ekstra (75 μL er nødvendig per brønn) ved å fortynne 5x passiv lysisbuffer (leveres i sett) 1 til 5 med deionisert vann. Tin også reagens A og reagens B Buffer (følger med i settet, 100 μL av hver brønn).
- Aspirer mediene fra hver brønn av 24-brønnplaten fra trinn 5.2.
- Tilsett 75 μL 1x passiv lysisbuffer til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 30 min med av og til risting.
- Forbered reagens B ved å fortynne 50x reagens B-substratet (følger med i settet) 1:50 med tint reagens B-buffer.
- Tilsett 30 μL 1x passiv lysisbuffer til 4 brønner for blanking (se Tilleggstabell 2).
- Overfør 30 μL lysat fra trinn 6.1.3 til dupliserte brønner av en 96-brønn flat bunn hvit analyseplate.
- Bruk en flerkanals pipette til å legge til 50 μL reagens A til hver brønn og les firefly luciferase-signalet med en plateleser.
- Bruk en flerkanals pipette til å legge til 50 μL reagens B fra trinn 6.1.4 til hver brønn og les Renilla luciferase-signalet med en plateleser.
- Behandle rådata som følger (for en detaljert beskrivelse, se Tilleggstabell 2).
- Ekskluder prøver med svært lavt Renilla luciferase signal som lave verdier indikerer at viruskonstruksjonen var giftig eller at for få transinfiserte celler ble analysen.
MERK: Som forklart i diskusjonen, kan betydelig "lavt" Renilla luciferase signal resultere i uregelmessige resultater. Her ble brønner der Renilla luciferase-signalet var mer enn 1 standardavvik under gjennomsnittet ekskludert (se tilleggstabell 2). Dette var basert på tidligere studier utført ved hjelp av dette reportersystemet i disse cellene14, men kan variere i andre cellelinjer. - Normaliser den rå firefly luciferase verdien av hver brønn til rå Renilla luciferase verdien av samme brønn for å få firefly /Renilla forholdet.
- Gjennomsnittlig firefly /Renilla prosenter av alle replikere kontroll brønner og deretter dele firefly /Renilla forholdet mellom alle andre godt med det tallet for å få en fold endring.
- Tilordne kontrollprøven og sett verdien for firefly/Renilla-forhold til 1.
- Gjennomsnittlig firefly /Renilla prosenter av de dupliserte brønnene og plott med standardavviket.
MERK: Standardavviket brukes ikke til statistisk analyse, men i stedet som et middel for å identifisere brønner der replikaene varierer betydelig.
- Ekskluder prøver med svært lavt Renilla luciferase signal som lave verdier indikerer at viruskonstruksjonen var giftig eller at for få transinfiserte celler ble analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår YAP/TAZ-TEAD reporter konstruksjon (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) inneholder en minimal SV-49 arrangør med 5 repetisjoner av den kanoniske TEAD binding element (MCAT)15 kjører firefly luciferase genet ( Figur1). Det er co-transfected i celler sammen med PRL-TK kontroll vektor (Promega), som uttrykker Renilla luciferase fra den konstitutivt aktive HSV TK arrangør (Figur 1). Det er avgjørende å sikre at YAP/TAZ-TEAD-reporterkonstruksjonen oppfører seg som forventet i cellelinjen(e) som testes. Derfor, vi først co-transfected PRL-TK og pGL3-5xMCAT (SV)-49 konstruerer i A375 celler stabilt uttrykke enten en kontroll vektor, en svært aktiv LATS-ufølsom mutant av YAP (YAP2SA), eller en mutant av YAP2SA ikke i stand til å binde TEADs (YAP2SA,S94A). Som forventet ble firefly luciferase aktiviteten betydelig økt med YAP2SA, men ikke kontrollvektoren eller YAP2SA,S94A (Figur 2A). Dette tyder på at YAP øker aktiviteten til YAP / TAZ-TEAD reporter på en TEAD-avhengig måte. Viktigere, YAP2SA endret ikke signifikant nivåene av Renilla luciferase. Som en ekstra kontroll bekreftet vi også at YAP2SA ikke endrer aktiviteten til en minimal promotorkonstruksjon som mangler MCAT TEAD-bindingselementene (Figur 2B).
Et annet kontrolleksperiment ble også gjort der A375-celler ble infisert med virale konstruksjoner som leverer enten en ikke-målrettingskontroll shRNA (shNTC) eller en konstruksjon med tandem YAP og TAZ shRNAs. Etter stabilt utvalg ble cellene co-transfected med PRL-TK-konstruksjonen og enten YAP / TAZ-TEAD reporter konstruere eller minimal promotor konstruksjon. I celler transfected med YAP / TAZ-TEAD reporter konstruere, YAP / TAZ shRNA betydelig redusert firefly luciferase nivåer, men kontrollen shNTC gjorde ikke (Figur 2C). Firefly luciferase nivåer ble ikke endret av verken shNTC eller YAP / TAZ shRNA i celler transfected med minimal arrangør (Figur 2C). I samsvar med resultatene ovenfor, renilla signalet i hver brønn ble heller ikke signifikant endret av kontrollen shNTC eller YAP / TAZ shRNA (Figur 2C), ytterligere indikerer at PRL-TK kontroll konstruksjonen ikke reagerer på YAP eller TAZ. Samlet viser disse eksperimentene at reportersystemet oppfører seg som forventet i A375-celler, noe som er i samsvar med tidligere studier ved hjelp av disse vektorene2,14.
Som et konsepteksperiment screenet vi et lite lentiviral shRNA-bibliotek i A375-celler. Vårt testbibliotek inneholdt shRNAs rettet mot flere gener som tidligere ble vist å regulere YAP / TAZ-funksjonen i andre celletyper. Imidlertid er rollen til flere av disse genene i reguleringen av YAP og TAZ i melanom ukjent. Vårt bibliotek inkluderte gener som kreves for YAP/TAZ-aktivitet, for eksempel RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4 og CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27, 28,,,2928, 30,31,32,33,34,35,36,37,38, og gener spådd å hemme YAP / TAZ aktivitet, for eksempel CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR, og RB139,40,41,42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. Som kontroller inkluderte vi en tandem YAP/TAZ shRNA14,en ikke-målrettingskontroll shRNA (shNTC), og en shRNA målretting Src, som vi tidligere viste var nødvendig for maksimal YAP / TAZ aktivitet i A375 celler14.
Rådata og analyse for dette skjermbildet vises i tilleggstabell 2. Flere shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 og shMAPK8-2) betydelig redusert Renilla luciferase signal i forhold til gjennomsnittlig Renilla signal for alle brønner, noe som tyder på at disse shRNAs forårsaket cytotoksisitet i A375 celler. Faktisk hadde disse brønnene betydelig færre celler på tidspunktet for analysen (ikke vist). Dette gjør det svært vanskelig å skille kandidater som kan regulere YAP / TAZ fra de som er avgjørende for celleoverlevelse. Resultatene fra disse prøvene er derfor utelukket fra videre dataanalyse. Som forventet reduserte shRNAs rettet mot YAP og TAZ eller Src betydelig YAP/TAZ-TEAD-aktivitet (figur 3). I samsvar med publisert arbeid som viser at PIK3CA fremmer YAP og TAZ aktivitet21,26,31, fant vi at shRNAs rettet mot PIK3CA redusert normalisert firefly luciferase nivåer. shRNAs rettet mot ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN hver økt normalisert firefly luciferase nivåer, som er i samsvar med publiserte studier som viser at disse proteinene undertrykke YAP og / eller TAZ39,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54 . Til tross for etablerte roller for ATR, CCNE2, og ERBB4 i andre celletyper27,28,35,36,38,49, shRNAs rettet mot disse genene ikke signifikant endre normalisert firefly luciferase nivåer i A375 celler. shRNAs rettet mot EZH2 og RB1 viste en effekt på firefly luciferase nivåer som var motsatt av hva som var forventet basert på studier i andre celletyper32,34,40,52. Både PTEN og RAF1 var målrettet av to forskjellige shRNAer som hadde motsatteffekt på luciferase aktivitet. Resultater som er uforenlige med tidligere studier kan indikere at påvirkningen av disse proteinene på YAP/TAZ-TEAD-funksjonen er celletypeavhengig; Det kan imidlertid også skyldes dårlig knockdown effektivitet eller off-target effekter av noen shRNAs. Som en n = 1 "blind" skjerm, noen falske positive og falske negativer ville også forventes. Som diskutert i mer detalj i diskusjonen, må ytterligere valideringseksperimenter gjøres ved hjelp av andre analyser som qPCR for gener som er regulert av YAP og TAZ og vestlige blots for etteroversettelsesendringer som påvirker YAP / TAZ-funksjonen. Denne valideringen vil også omfatte å bekrefte hvilke shRNAs effektivt slo ned proteinav interesse. Det er også viktig å merke seg at siden vår reporter er TEAD responsive, kan eventuelle gener identifisert av skjermen vår påvirke TEADs, men ikke YAP og TAZ direkte. Oppfølging mekanistiske studier ville være nødvendig for å avgjøre om det var YAP og / eller TAZ eller TEADs at det identifiserte proteinet regulerer. YAP og TAZ er imidlertid de viktigste driverne for TEAD-mediert transkripsjon, så det er sannsynlig at de fleste av disse genene regulerer YAP og TAZ. Faktisk, som nevnt ovenfor, de fleste av shRNAs som treffer i skjermen mål proteiner som er kjent for å regulere YAP og / eller TAZ direkte.
Figur 1: Skjematisk diagram for arbeidsflyten. De kritiske trinnene i denne protokollen summeres med trinnnumre som tilsvarer tallene i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Optimalisering av YAP/TAZ-TEAD dual-luciferase transkripsjonssystem. (A) A375 celler stabilt uttrykker kontrollvektor (MSCV-IRES-Hygro), LATS-ufølsom YAP (YAP2SA),eller LATS-ufølsom YAP kan ikke binde TEADs (YAP2SA,S94A) ble co-transfected med PRL-TK (Renilla) og pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP / TAZ-TEAD reporter) konstruksjoner og luciferase signal ble målt 24 timer senere. n = 7 uavhengige eksperimenter. (B) A375-celler ble co-transfected med enten YAP2SA eller kontroll vektor, PRL-TK konstruksjon, og enten pGL3-5xMCAT (SV)-49 konstruksjon eller pGL3 (SV)-49 konstruere (minimal arrangør) og luciferase signalble målt 24 timer senere. n = 1 eksperiment transfected i quadruplicate. (C) A375 celler ble infisert med retrovirus koding en ikke-målretting kontroll shRNA (shNTC) eller tandem YAP og TAZ shRNAs (shYAP/TAZ). Etter stabilt utvalg ble cellene samtidig transinfisert med PRL-TK-konstruksjonen, og enten pGL3-5xMCAT (SV)-49-konstruksjonen eller pGL3 (SV)-49-konstruksjonen og luciferasesignalet ble målt 24 timer senere. n = 4 uavhengige infeksjoner; Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys flere sammenligninger test; n.s. = p>0,05, * p<0,05, ** p<0,01, **** p<0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Resultater av representativskjerm. Resultatet fra hver nedslåingsvektor sammenlignes med shNTC og presenteres som foldforskjell. Søylegrafen viser gjennomsnittet av firefly luciferase/Renilla luciferase ratio ± standardavvik. n = 1 eksperiment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tube A – Transfection Fortynning | |
| Reagens | Volum |
| Transfection Buffer | 25 μl per reaksjon |
| Transfection Reagens 2 (legg til andre) | 1,5 μl per reaksjon |
| Tube B – Reporter Fortynning | |
| Reagens | Volum |
| Transfection Buffer | 25 μl per reaksjon |
| 20:1 Firefly luciferase reporter: kontroll Renilla mix (legg til andre) | 400 ng per reaksjon |
| Transfection Reagent 3 (legg til tredje) | 1 μl per reaksjon |
| Totalt: 26,5 μl per reaksjon | |
Tabell 1: Tilberedning av transfection mix. For transfection i hver brønn av de 24-brønnplatene fortynnes 1,5 μL transfection reagens 2 til 25 μL transfection buffer for å produsere transfection fortynning (rør A); mens 400 ng av 20:1 firefly luciferase reporter: kontroll Renilla blanding og 1 μL transfection reagens 3 fortynnes i 25 μL transfection Buffer for å produsere reporterfortynning (rør B).
| Eksisterende/kjøpte/gavevektorer | |
| Vektor | Kilde |
| GIPZ humane shRNA lentivirale vektorer | GE Helsetjenester |
| VSVG (andre) | Hynes Lab [2] |
| PsPAX2 (andre) | Addgene (#12260) |
| kneble/pol | Addgene (#14887) |
| PGL3-(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| PGL3-5xMCAT(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| Prl-TK (andre er i seg selv) | Promega |
| MSCV-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 | LAMAR LAB [14] |
| Nye vektorer | |
| Vektor | Kilde Ryggrad |
| MSCV-YAP-S94A, S127A, S381A-IRES-Hygro | MSCV-IRES-Hygro |
Tilleggstabell 1: Vektortabeller. Alle vektorer som brukes, er oppført med nye vektorer som er beskrevet. Standard molekylærbiologi teknikker ble brukt til å generere nye vektorer.
Tilleggstabell 2: Dataanalyse av Luciferase analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse av analyse Arrangementet av shRNA-biblioteket vises i den første tabellen. De andre og tredje tabellene viser de rå firefly og Renilla luciferase signaler, henholdsvis. Gjennomsnittlig og standardavvik for Renilla luciferase-signalet for alle brønner er angitt i de gule boksene. Brønner med et Renilla luciferase signal mer enn 1 standardavvik under gjennomsnittet er uthevet med rød tekst og ekskludert fra videre analyse. Firefly /Renilla forholdet mellom hver brønn ble oppnådd ved å dele den rå firefly luciferase signal et renilla luciferase signal (fjerde tabell). Firefly /Renilla forholdet mellom hver brønn ble deretter normalisert til gjennomsnittet av firefly /Renilla forholdet mellom kontroll (shNTC) brønner (femte tabell). De dupliserte brønnene ble neste gjennomsnitt for hver konstruksjon, og standardavviket ble beregnet (sjette tabell). Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien viser vi en tilnærming til middels gjennomstrømning screening av arrayed viral biblioteker i kombinasjon med en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporter analyse som kan brukes til å identifisere og teste nye regulatorer av transkripsjonsfaktorer. Det er avgjørende å karakterisere og optimalisere reportersystemet for hver cellelinje før en skjerm. Eksperimenter bør gjøres for å bekrefte at reporteren reagerer på endret aktivitet av transkripsjonsfaktoren som undersøkes, og omfanget av endring i aktivitet bør testes i forhold til kontrollvektorer. Co-transfection av PRL-TK konstruere sammen med reporter konstruksjonen er viktig fordi det bidrar til kontroll for antall celler transfected med reporter og kopinummeret til reporterkonstruere, som begge kan endre omfanget av luciferase signalet. Optimaliseringseksperimenter bør også sikre at transkripsjonsfaktoren ikke påvirker aktiviteten til den konstituerende Renilla-konstruksjonen eller en minimal promotorkonstruksjon, da dette kan komplisere tolkningen av resultatene. Kontroller som skal inkluderes i biblioteket bør også vurderes nøye. Denne protokollen er designet for en "blind skjerm" av biblioteker med hundrevis av shRNAs, hvor det ikke er mulig å bekrefte effektiv knockdown av hver shRNA. Derfor er noen falske positive og negative sannsynligvis. Øke antall tekniske og / eller biologiske replikerer i skjermen kan bidra til å redusere antall falske positive og negativer. Dette vil imidlertid også øke antall brønner til kultur og analyse betydelig for å sikre at dette ikke fører til suboptimale kulturforhold (se nedenfor). En annen tilnærming for å redusere falske positiver og negativer ville være å gjenta hele skjermen i samme cellelinje eller flere cellelinjer, eller å screene et mindre bibliotek, inkludert bare "treff" ved hjelp av 3 biologiske replikater. I alle tilfeller bør eventuelle treff valideres ved hjelp av avlesninger i tillegg til reporteren, for eksempel qPCR for kjente målgener. Effektiv knockdown av det målrettede genet bør også bekreftes i disse valideringstrinnene. Konklusjoner bør ikke gjøres om shRNAs som ikke endrer aktivitet med mindre effektiv knockdown av shRNA er bekreftet. Valideringseksperimenter bør også sikre at transkripsjonsfaktoren som undersøkes, er det som reguleres av de målrettede genene, og at disse genene ikke påvirker Renilla eller minimale promoterkonstruksjoner.
Det er også viktig å optimalisere cellekulturforholdene for hver cellelinje for å unngå suboptimale forhold som over-samløpet, for få celler, dårlig cellelevedyktighet eller variabel proliferativ kapasitet. Celleseeding tetthet er spesielt viktig på tidspunktet for transfection av dual-luciferase reporter konstruere (Trinn 5) og når reporteraktiviteten måles (Trinn 6). Transfection effektivitet kan variere betydelig med celletetthet og dårlig transfection effektivitet kan resultere i uregelmessige resultater hvis bare en liten brøkdel av cellepopulasjonen blir analyset. De fleste cellelinjer testet viser den høyeste transfection effektivitet når på 40 - 60% samløpet, men det anbefales at transfection forhold og seeding tetthet er optimalisert for en gitt cellelinje ved hjelp av en vektor som gir et fluorescerende protein. Cellelinjer som er vanskelige å infisere og/eller transfect, for eksempel primærceller, kan ikke være egnet for denne skjermen. Dårlig reporter transfection effektivitet eller dårlig celle levedyktighet resulterer vanligvis i svært lavt Renilla luciferase signal. Et piloteksperiment bør imidlertid utføres for å bestemme rekkevidden av Renilla luciferase signal for en cellelinje. Det er viktig at titer av viruset produsert fra det arrayed biblioteket er høy nok til å gi en infeksjon effektivitet på minst 30% i cellelinjen blir analysen. Infeksjonseffektiviteten kan variere sterkt, og flere faktorer kan påvirke viral titer. Mengden viral supernatant som brukes bør optimaliseres for hver cellelinje, og om nødvendig kan trinn 2 optimaliseres ytterligere for å forbedre virale titers.
Celletetthet og cellelevedyktighet kan også påvirke aktiviteten til cellulære veier som regulerer transkripsjonsfaktorer, så det er avgjørende å så cellene for reportertransfeksjonen slik at de alle er på en lignende tetthet den dagen dual-luciferase analysen leses (Trinn 6). Det er også viktig å sikre at cellene holder seg jevnt over brønnen i stedet for å klynge seg i et tett plaster i midten. Som beskrevet ovenfor kan betydelig variasjon i Renilla luciferase-signalet fra brønn til brønn føre til data som er vanskelig å tolke. Det er best å utelukke brønner som viser en betydelig reduksjon i Renilla luciferase signal sammenlignet med alle andre brønner som dette tyder på at enten viral vektor reduserer celle levedyktighet eller transfection effektivitet for at brønnen var svært lav. Her utelukket vi brønner større enn 1 standardavvik fra gjennomsnittlig Renilla luciferase signal, men optimaliseringseksperimenter bør gjøres for å bestemme passende cutoffs for hver cellelinje. Det er også mulig at shRNAs som reduserer cellelevedyktighet kan gjøre det ved å endre aktiviteten til transkripsjonsfaktoren som blir analyset. Hvis dette er en bekymring, shRNAs som reduserer Renilla luciferase signal kan testes på nytt ved hjelp av inducible shRNAs eller andre analyser. Det er også avgjørende å begrense hvor lang tid det er å henge opp etter trypsinisering. Bruk en flerkanals pipette for de fleste trinn under trypsinisering og seeding av celler, og for større skjermer, arbeid med platene i grupper. I tillegg er det best å begrense tiden mellom infeksjonen av cellene og reporteranalysen. Dette er spesielt viktig hvis transkripsjonsfaktoren som assayed regulerer cellespredning eller overlevelse. I dette tilfellet, celler med effektiv knockdown ville bli outcompeted av celler med mindre effektiv knockdown.
Flere endringer i den beskrevne protokollen er mulig. Denne tilnærmingen kan brukes effektivt for å identifisere regulatorer av enhver transkripsjonsfaktor hvis en luciferase-basert reporter genereres, og for mange av de vanligste transkripsjonsfaktorene eksisterer reporterkonstruksjoner allerede. Denne protokollen kan endres for bruk av et bredt utvalg kommersielt tilgjengelige eller manuelt monterte biblioteker, inkludert RNAi, CRISPR/CAS9, ORF eller cDNA. Faktisk har vi tidligere brukt en lignende strategi for å teste et lite cDNA-bibliotek for YAP / TAZ regulatorer14. Biblioteker kan leveres ved hjelp av retrovirus, lentivirus, adenovirus eller forbigående transfection. Viruspelsproteinet som brukes her (VSVG) genererer lentivirus som er human-smittsomt. Hvis gnagerceller brukes og ikke-menneskelig smittsomt økotropisk virus er ønsket, kan en vektor som leverer Eco coat-proteinet brukes i stedet for VSVG.
Andre metoder kan brukes til å screene biblioteker for regulatorer av en transkripsjonsfaktor. Tilgang til et høyt gjennomstrømningsscreeningsanlegg vil gi rom for screening av mye større biblioteker på en automatisert måte. På samme måte kan genom-brede skjermer gjøres ved hjelp av samlede biblioteker med dyp sekvensering som et middel for å identifisere "treff". Imidlertid krever begge disse tilnærmingene utstyr som ikke er tilgjengelig for mange forskere, og avgiftene for høy gjennomstrømningsscreening eller dyp sekvensering kan være uoverkommelig høy. I tillegg vil samlede skjermer kreve sortering av celler ved hjelp av en fluorescerende reporter eller en annen måte å berike cellene som viser de ønskede endringene i transkripsjonsaktivitet. Screening av store arrayed uttrykk biblioteker ved hjelp av en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporter analyse har blitt demonstrert tidligere ved hjelp av en benkeplate robot55, men dette er ikke vanlig tilgjengelig for alle forskere. I motsetning er metoden som er beskrevet her rask, middels gjennomstrømning, relativt billig, og bruker utstyr og reagenser som sannsynligvis er tilgjengelige for de fleste etterforskere. Denne metoden kan avsløre flere regulatorer i et enkelt eksperiment, som er en kostnadseffektiv og praktisk måte å oppdage potensielle regulatoriske veier oppstrøms av en transkripsjonsfaktor.
I den beskrevne tilnærmingen ble kandidatgener stabilt slått ned, og etter valget ble reporterkonstruksjonene forbigående transinfisert i cellene. Imidlertid er transfection effektivitet dårlig i mange cellelinjer og kan introdusere variasjon og forårsake cellulær toksisitet. En forbedret alternativ tilnærming ville være å stabilt integrere reporterkonstruksjonen i genomet til cellelinjen av interesse og deretter infisere reporter-uttrykkende celler med viralbibliotekene for screening. Denne forbedringen vil redusere variabiliteten introdusert av forbigående transfection og forhindre eventuelle endringer i transkripsjonfaktoraktivitet på grunn av langvarig postinfeksjonskultur. Som nevnt ovenfor, bruk av en liten benkeplate robot ville sterkt effektivisere prosessen og øke størrelsen på bibliotekene som kan bli screenet. En annen betydelig endring er å bruke arrayed udukbare vektorbiblioteker, noe som vil redusere sannsynligheten for valg mot celler med mer effektiv knockdown og redusere variasjon forårsaket av endringer i cellelevedyktighet.
En betydelig utfordring som forhindrer effektiv behandling av mange kreftformer er at tumorceller får motstand mot selv de mest effektive målrettede terapier. Identifisering av proteiner som kreves for denne terapeutiske resistensen er nødvendig for å forbedre pasientens utfall. Den beskrevne tilnærmingen kan lett brukes i kombinasjon med målrettede terapeutiske midler for å avsløre gener som forårsaker økt følsomhet eller motstand mot disse forbindelsene. En annen potensiell fremtidig anvendelse av denne tilnærmingen ville være å bruke denne arrayed screening for å teste kandidat terapeutiske mål i kombinasjon. For dette vil cellene bli smittet med to virale vektorer hver med mål om å identifisere proteiner som har en synergistisk effekt på transkripsjonsfaktoraktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Emily Norton og Mikaelan Cucciarre-Stuligross for å ha hjulpet til med utarbeidelsen av shRNA-vektorer. Dette arbeidet ble delvis støttet av en Susan G. Komen Career Catalyst Grant som tildeles J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
