Summary
Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.
Abstract
Transkriptionsfaktoren können die Expression zahlreicher Zielgene verändern, die eine Vielzahl von nachgelagerten Prozessen beeinflussen und sie zu guten Zielen für Krebstherapien machen. Jedoch, direkt auf Transkriptionsfaktoren ist oft schwierig und kann Nebenwirkungen verursachen, wenn der Transkriptionsfaktor in einem oder mehreren erwachsenen Geweben notwendig ist. Die Identifizierung vorgelagerter Regulatoren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen abnorm aktivieren, bietet eine praktikablere Alternative, insbesondere wenn diese Proteine leicht zu medikamentieren sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um arrayed mittelgroße lentivirale Bibliotheken und eine dual-luciferase-basierte Transkriptionsreporter-Assay zu kombinieren, um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Unser Ansatz bietet eine schnelle, einfache und kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Genen in einem einzigen Experiment zu testen. Um die Verwendung dieses Ansatzes zu demonstrieren, führten wir einen Bildschirm einer arrayed lentiviralEN RNAi-Bibliothek durch, die mehrere Regulatoren von Yes-associated protein (YAP) und transkriptionskoaktivator mit PDZ-Bindungsmotiv (TAZ) enthält, zwei transkriptionelle Co-Aktivatoren, die die nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs sind. Dieser Ansatz könnte jedoch geändert werden, um regler für praktisch jeden Transkriptionsfaktor oder Co-Faktor zu überprüfen und könnte auch zum Screenen von CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken verwendet werden.
Introduction
Der Zweck dieses Assays ist es, virale Bibliotheken zu verwenden, um Regulatoren von Transkriptionsfaktoren relativ schnell und kostengünstig zu identifizieren. Aberrante Transkriptionsaktivität ist mit Krebs und Metastasen1,2,3,4,5,6, so Targeting Transkriptionsfaktoren in Krebszellen ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz verbunden. Jedoch, Transkriptionsfaktoren sind oft schwierig, pharmakologisch7 und viele sind für die normale zelluläre Funktion in erwachsenen Geweben8,9,10erforderlich. Die Krebswege, die Abschreibfaktoren zur Krankheitsantrieb aktivieren, ist ein praktikablerer Ansatz mit dem Potenzial, weniger schwere Nebenwirkungen zu haben. Die kommerzielle Verfügbarkeit von arrayierten lentiviralen und retroviralen RNAi-, CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken ermöglicht es Forschern, die Bedeutung zahlreicher Gene in einem einzigen Experiment zu testen. Es ist jedoch eine zuverlässige Auslesung für geänderte Transkriptionsaktivitäten erforderlich.
Hier beschreiben wir die Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays und arrayed lentiviralen Bibliotheken, um Proteine zu identifizieren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen regulieren. In diesem Test werden shRNAs, die auf krebsassoziierte Gene abzielen, über lentivirale Transduktion an Säugetierkrebszellen abgegeben und Zellen für eine stabile Integration mit Puromycin ausgewählt. Die Zellen werden als nächstes mit einem Reporterkonstrukt transfiziert, das gnädige Luziferase ausdrückt, die von einem Promotor angetrieben wird, der spezifisch für den Transkriptionsfaktor ist, der untersucht wird, und einem Kontrollkonstrukt, das Renilla luziferase von einem konstitutiven aktiven Promotor ausdrückt, der nicht auf den untersuchten Transkriptionsfaktor reagiert. Wir demonstrieren diesen Ansatz mit einem Proof-of-Concept-Bildschirm für Diebesregler von YAP und TAZ, den kritischen Nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs8,10,11. Abnormale Aktivität von YAP und TAZ fördert mehrere Schritte der metastasierenden Kaskade11 und wird bei vielen Krebsarten beobachtet11,12,13. Wie YAP und TAZ in einigen Krebszellen abwegig aktiviert werden, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. YAP und TAZ binden keine DNA, sondern werden durch andere Transkriptionsfaktoren an Promoter rekrutiert. Mitglieder der TEA-Domain-Familie (TEAD) der Transkriptionsfaktoren sind die wichtigsten Bindungspartner für YAP und TAZ und für die meisten YAP- und TAZ-abhängigen Funktionen von entscheidender Bedeutung. Unser Reporterkonstrukt drückt Gofagifuifase aus einem YAP/TAZ-TEAD-responsiven Promotor aus und frühere Studien haben gezeigt, dass es Veränderungen in YAP-TEAD und TAZ-TEAD Transkriptionsaktivitätgetreuerkennt 2,14,15.
Unser Ansatz ist schnell, mittlerer Durchsatz und erfordert keine Screening-Einrichtungen, automatisierte Roboter oder eine tiefe Sequenzierung von gepoolten Bibliotheken. Die Kosten sind relativ gering und es gibt zahlreiche kommerziell verfügbare Bibliotheken zur Auswahl. Die erforderlichen Geräte und Reagenzien sind auch in den meisten Laboratorien relativ Standard. Es kann verwendet werden, um für Regulatoren von praktisch jedem Transkriptionsfaktor zu überprüfen, wenn ein luziferase-basierter Reporter existiert oder generiert wird. Wir verwenden diesen Ansatz, um shRNAs in Krebszellen zu überprüfen, aber jede Zelllinie, die mit angemessener Effizienz transfiziert werden kann, könnte mit jeder Art von arrayed Bibliothek verwendet werden.
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Protocol
HINWEIS: Eine schematische Zusammenfassung dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Lentivirale Vektorbibliotheksvorbereitung
HINWEIS: Der demonstrierte Bildschirm verwendete eine angeordnete shRNA-Bibliothek, die als Glycerinbestände in 96-Well-Platten gekauft wurde, aber Bibliotheken können auch manuell basierend auf einer Kandidatenliste zusammengestellt werden. Entsprechende Kontrollen sollten in Betracht gezogen und in jede Bibliothek aufgenommen werden. Dazu gehören eine nicht zielgerichtete Kontroll-shRNA (shNTC), eine Kontroll-shRNA, die auf den untersuchten Transkriptionsfaktor abzielt, und, wenn möglich, eine shRNA, die auf Galleife zielt.
- Fügen Sie 1,3 ml Luria Broth (LB) (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl, pH 7,5) mit 100 g/ml Ampicillin zu jedem Brunnen einer 96-Well-Tiefenbohrung hinzu. Impfen Sie jeden Brunnen mit 2 l Glyzerinbestand und wachsen bei 37 °C über Nacht bei konstanter Rührung bei 225 U/min.
- Jede Bakterienkultur in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen und die Bakterien durch Zentrifugation bei 21.000 x g bei 4 °C 10 min pellet.
- Reinigen Sie jeden Vektor mit einem bakteriellen Mini-Prep-Kit, indem Sie dem Herstellerprotokoll folgen.
- Bestimmen Sie die Konzentration jedes Vektors mit einem Spektralphotometer.
- Die Plasmide bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
2. Verpackung der arrayierten lentiviralen Bibliothek
HINWEIS: Alle Arbeiten mit Lentivirus, einschließlich Verpackung, Infektion und anschließender Kultivierung infizierter Zellen, sollten sich strikt an die institutionellen Vorschriften und Vorschriften für die biologische Sicherheit halten.
- Erweitern Sie die 293FT-Zellen mit vollständigen Wachstumsmedien (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 4 mM L-Glutamin, 4.500 mg/L Glucose und Natriumpyruvat, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin-Antibiotikum und 2 mM L-Glutamin).
- Für jeden Vektor in der Bibliothek ab Schritt 1.4, Samen eine 24-Well mit 1 x 105 293FT Zellen.
HINWEIS: Es wird empfohlen, einige zusätzliche Brunnen eines Kontrollvirusvektors zu verpacken und zu verwenden, um den Titer des Virus zu testen, bevor Sie mit Schritt 3 fortfahren (siehe unten). - Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.
HINWEIS: Ein allgemeines Protokoll für die Verpackung von Lentivirus, das zuvor14 beschrieben wurde, wurde für dieses Protokoll auf 24 Brunnen skaliert. Es verwendet psPAX2 für lentivirale Verpackungen und VSVG als Mantelprotein. Wenn ektropes Virus gewünscht wird, kann ein Vektor, der Eco liefert, anstelle von VSVG verwendet werden. Es wird dringend empfohlen, dass dieses Protokoll optimiert wird, um einen viralen Titer zu erreichen, der zwischen 30% -70% Infektionseffizienz der Zielzellen ergibt (siehe Diskussion). Eine Liste aller verwendeten Vektoren finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. - Richten Sie für jeden viralen Vektor aus Schritt 1.4 eine Transfektionsmischung ein, wie unten beschrieben. Jede Transfektion sollte 250 ng des viralen Vektors, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 l Transfektionsreagenz 1 und 23,75 l Transfektionspuffer enthalten (siehe Tabelle der Materialien).
- Verdünnen Sie jeden lentiviralen Vektor mit nukleasefreiem Wasser auf 50 ng/l, und übertragen Sie dann 5 l (250 ng) in einen Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.
- Machen Sie die Transfektion super mischen, indem Sie 1,25 l * X des Transfektionsreagenz 1 und 23,75 L * X des vorgewärmten Transfektionspuffers, wobei "X" die Gesamtzahl der Transfektionen plus mehrere zusätzliche Volumenverluste während des Pipetierens zu berücksichtigen ist.
- Inkubieren Sie die Transfektion Super-Mix bei Raumtemperatur für 5 min.
- Fügen Sie 125 ng * X von psPAX2 und 125 ng * X von VSVG auf das Rohr der Transfektion Super-Mix aus Schritt 2.4.3 und sanft Pipetten nach oben und unten zu mischen. Fahren Sie schnell mit Schritt 2.4.5 fort.
- Sofort aliquot die Mischung aus Schritt 2.4.4 in jedes Rohr eines PCR-Streifens, und dann verwenden Sie Mehrkanal-Pipette, um 25 l das Gemisch in jeden Brunnen enthaltenden viralen Vektor aus Schritt 2.4.1 zu übertragen.
- Bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.
- Übertragen Sie alle 30 L aus jedem 96-Well aus Schritt 2.4.6 in einen Brunnen der 24-Well-haltigen 293 FT-Zellen aus Schritt 2.3.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h und ersetzen Sie dann die Medien in jedem Brunnen der 24-Well-Platte durch 500 l frische komplette Wachstumsmedien. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für weitere 24 h.
- Mit einer Mehrkanal-Pipette, sammeln Sie den viralen Überstand aus jedem Brunnen und aliquot 220 l (genug für 1 Infektion in Schritt 3 plus etwas zusätzliches Volumen) in zwei 96-Wells jeweils. Dies sind die angeordneten viralen Überstandplatten.
- Bewahren Sie die angeordneten viralen Überstandplatten bei -80 °C auf.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Es wird auch empfohlen, einige der zusätzlichen Kontrollvirus zu testen, die verpackt wurde (siehe oben) auf den Zellen infiziert werden, bevor Sie mit Schritt 3 fortfahren. Dadurch soll sichergestellt werden, dass der Titer ausreicht, um eine Infektionseffizienz von mindestens 30 % zu erreichen.
3. Infektion der Zellen für den Bildschirm
HINWEIS: Menschliche Melanomzellen (A375) wurden verwendet, um diesen Ansatz zu demonstrieren, aber diese Methode kann auf alle anhaftenden Zellen angewendet werden, die mit Lentivirus infizieren. Die Zellkultur und die Beschichtungsbedingungen sollten jedoch für jede Zelllinie optimiert werden (siehe Diskussion).
- Erweitern Sie die Zellen, die in vollständigen Wachstumsmedien infiziert werden sollen.
- Samen 24-Well-Platten mit 1 x 105 Zellen in 0,5 ml komplettem Wachstumsmedium pro Brunnen. Seed ein Gut für jeden viralen Vektor getestet werden (einschließlich Kontrollen) und enthalten einen zusätzlichen Brunnen, der nicht infiziert werden, die als Kontrolle für die Arzneimittelauswahl in Schritt 3.7 dienen wird.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.
- Infizieren Sie jeden Brunnen aus Schritt 3.2 mit einem anderen viralen Überstand aus dem gefrorenen arrayed lentiviral überstand wie folgt.
- Bereiten Sie vollständige Wachstumsmedien vor, die 20 g/ml Polybren enthalten.
- Tauen Sie die arrayed lentiviral Bibliothek Überräube von Schritt 2.7 auf Raumtemperatur.
- Saugen Sie die Wachstumsmedien aus den 24-Well-Platten aus Schritt 3.2 und fügen Sie sofort 200 L Polybren-haltige Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu.
- Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 L virusischen Überstand von schritt 3.4.2 aus Schritt 3.4.2 auf die 24 Brunnen aus Schritt 3.4.3.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 - 48 h.
HINWEIS: Einige Zelllinien benötigen möglicherweise länger als 24 h, um die shRNAs auszudrücken und puromycinresistent zu werden. Der hier verwendete virale Vektor liefert einen Turbo-GFP-IRES-puroR mit einer miR30-basierten shRNA in der 3'UTR von puroR (Abbildung 1). Die Infektionseffizienz und Expression des Puromycinresistenzgens und der shRNA wurden durch grünes fluoreszierendes Protein überwacht. - Bereiten Sie komplette Wachstumsmedien vor, die 2,5 g/ml Puromycin enthalten.
HINWEIS: Die Selektionskonzentration von Puromycin variiert zwischen den Zelllinien. Es wird empfohlen, dass eine Antibiotika-Kill-Kurve für jede Zelllinie durchgeführt werden, um vor dem Bildschirm untersucht werden. - Saugen Sie die Medien aus jedem Brunnen und ersetzen Sie durch 500 l Puromycin-haltige komplette Wachstumsmedien.
HINWEIS: Achten Sie darauf, auch Puromycin zu einem Kontroll-Nicht-infizierten Brunnen hinzuzufügen, der in den nachfolgenden Schritten verwendet werden kann, um sicherzustellen, dass die Puromycin-Auswahl abgeschlossen ist. - Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 48 h.
HINWEIS: Es ist am besten, für 48 h zu wählen, so Beschichtungsdichte und viralen Titer sollte optimiert werden, so dass die Zellen nicht überkonfluent vor 48 h sind. - Stellen Sie sicher, dass die infizierten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop grün sind und dass Zellen, die nicht infiziert sind, gut mit Puromycin behandelt sind, alle tot sind, bevor Sie mit Schritt 4 fortfahren.
4. Seeding-Zellen für die Transfektion von Dual-Luciferase-Reporter
HINWEIS: Es sollte eine Testtransfektion durchgeführt werden, um die optimale Sädichte für jede neue Zelllinie zu bestimmen.
- Versuchen Sie jeden Brunnen aus Schritt 3.9 und übertragen Sie etwa 1 x 105 Zellen in Brunnen an der entsprechenden Position auf der neuen 24-Well-Platte wie folgt.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für das Screening von Bibliotheken mit Hunderten von shRNAs konzipiert, so dass es nicht möglich ist, jeden Brunnen infizierter Zellen zu zählen. Daher wurden die folgenden Schritte verwendet, um die Zellzahlen in jedem Brunnen zu schätzen, um eine annähernd gleiche Beschichtungsdichte zu gewährleisten.- Gruppieren Sie die Brunnen von Schritt 3.9 in 3 - 4 Gruppen, so dass alle Brunnen in einer Gruppe eine ähnliche Zelldichte haben.
- Trypsinize 1 repräsentativ gut aus jeder Gruppe mit 200 l Trypsin-EDTA (1x PBS ergänzt mit 0,5 mM EDTA und 0,1% Trypsin) für 5 min bei 37 °C. Dann neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA durch Zugabe von 400 l Puromycin mit vollständigen Wachstumsmedien.
- Zählen Sie jeden Vertreter gut, um die Gesamtzellzahl zu bestimmen und verdünnen Sie die Zellsuspension von jedem Repräsentativen gut auf 2 x 105 Zellen/ml der Verwendung vollständiger Wachstumsmedien.
- Saat 0,5 ml (1 x 105 Zellen) von Schritt 4.1.3 in die entsprechende Position auf einer neuen 24-Well-Platte und bebrüte diese neue 24-Well-Platte bei 37 °C mit 5% CO2 für 24 h.
- Verwenden Sie für jede Gruppe aus Schritt 4.1.1 die in Schritt 4.1.3 ermittelte Gesamtzellenzahl, um das Volumen von Trypsin-EDTA zu berechnen, das jedem Bohrkörper hinzugefügt werden soll, sodass die resultierende Zellsuspension 1 x 106 Zellen/ml beträgt.
- Fügen Sie jedem Brunnen das entsprechende Volumen trypsin-EDTA hinzu und brüten Sie 5 min bei 37 °C.
HINWEIS: Für größere Bildschirme wird empfohlen, die 24-Well-Platten zu versuchen und in Gruppen anstatt alle auf einmal neu zu verladen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. - Verwenden Sie während der obigen Inkubation eine Mehrkanalpipette, um 400 L puromycinhaltige komplette Wachstumsmedien zu den entsprechenden Brunnen auf einer neuen 24-Well-Platte hinzuzufügen.
- Übertragen Sie 100 l Zellsuspension (ca. 1 x 105 Zellen) von jedem Brunnen auf die entsprechende Position auf den neuen 24-Well-Platten, die in Schritt 4.1.7 vorbereitet sind.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1.6 bis 4.1.8 für alle Platten gruppierter Brunnen ab Schritt 4.1.1, jeweils eine Platte.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.
5. Transfektion von Dual-Luciferase-Reporter
- Transfezieren Sie jeden Brunnen aus Schritt 4.2 mit dem Dual-Luciferase-Reporter wie folgt.
HINWEIS: Die Gesamtmenge der DNA und das optimale Verhältnis des Renilla Gallegife-Reportervektors zur Kontrolle des Renilla-Luziferase-Vektors sollten vor Beginn dieses Tests bestimmt werden. Hier, 400 ng einer DNA-Mischung, die 20 Teile Gelfe Luziferase Reporter und 1 Teil Kontrolle Renilla Luciferase enthält verwendet.- Machen Sie das Verdünnungsgemisch (Tube A) und das Verdünnungsgemisch des Reporters (Tube B) durch Mischen der angegebenen Volumina jedes Reagenzes (Tabelle 1) multipliziert mit der Gesamtzahl der Transfektionen (plus mehrere Extras).
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für transfektionsreagenz 2 optimiert (siehe Materialtabelle). Wenn ein anderes Transfektionsreagenz verwendet wird, sollte die Transfektion vor diesem Schritt optimiert werden. - Mischen Sie das Transfektionsverdünnungsgemisch (Tube A) mit Reporterverdünnungsgemisch (Tube B) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 15 min, um Transfektionsgemische herzustellen.
- Während der obigen Inkubation spülen Sie jeden 24-Well aus Schritt 4.2 mit 0,25 ml Phosphatpufferkochin (PBS) ab und fügen Sie jedem Bohrwert 447 L vollständige Wachstumsmedien hinzu.
- Verwenden Sie nach der 15 min Inkubation eine Mehrkanalpipette, um 53 L Transfektionsmischung auf jeden Brunnen der 24-Well-Platten zu verteilen.
- Machen Sie das Verdünnungsgemisch (Tube A) und das Verdünnungsgemisch des Reporters (Tube B) durch Mischen der angegebenen Volumina jedes Reagenzes (Tabelle 1) multipliziert mit der Gesamtzahl der Transfektionen (plus mehrere Extras).
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.
6. Quantifizierung der Dual-Luziferase-Aktivität
- Messen Sie die Aktivität der Luziferase mit einem Plattenleser und einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit, wie unten beschrieben.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für das angegebene Reporter-Assay-Kit optimiert (siehe Tabelle der Materialien) und folgt dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll.- Bereiten Sie genügend 1x passive Lysepuffer für alle Brunnen plus mehrere zusätzliche (75 l wird pro Brunnen benötigt) durch Verdünnung 5x passive Lyse Puffer (im Kit) 1 bis 5 mit entionisiertem Wasser. Auch Taureagenz A und Reagenz B Puffer (im Kit zur Verfügung gestellt, 100 L von jedem wird für jeden Brunnen benötigt).
- Aspirieren Sie die Medien aus jedem Brunnen der 24-Well-Platte aus Schritt 5.2.
- Fügen Sie jedem Brunnen 75 l 1x passive Lysepuffer hinzu und brüten bei Raumtemperatur 30 min mit gelegentlichem Schütteln.
- Reagenz B durch Verdünnung von 50x Reagenz B Substrat (im Kit) 1:50 mit aufgetautem Reagenz B Puffer zubereiten.
- Fügen Sie 30 L des 1x passiven Lysepuffers zu 4 Bohrungen zum Ausblenden hinzu (siehe Zusatztabelle 2).
- Übertragen Sie 30 l Lysat aus Schritt 6.1.3 in doppelte Bohrungen einer 96-well flachen weißen Assayplatte.
- Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um jedem Brunnen 50 l Reagenz A hinzuzufügen und das Gahnlien-Luziferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 L Reagenz B aus Schritt 6.1.4 zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Renilla-Luziferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Renilla
- Verarbeiten Sie die Rohdaten wie folgt (eine ausführliche Beschreibung finden Sie unter Ergänzende Tabelle 2).
- Schließen Sie Proben mit sehr niedrigen Renilla-Luziferase-Signal aus, da niedrige Werte darauf hindeuten, dass das virale Konstrukt toxisch war oder dass zu wenige transfizierte Zellen untersucht wurden.
HINWEIS: Wie in der Diskussion erläutert, kann deutlich "niedriges" Renilla-Luziferase-Signal zu anomalen Ergebnissen führen. Renilla Hier bei denen das Renilla-Luziferase-Signal mehr als 1 Standardabweichung unter dem Mittelwert lag, wurden Brunnen ausgeschlossen (siehe Zusatztabelle 2). Renilla Dies basierte auf früheren Studien, die mit diesem Reportersystem in diesen Zellen14durchgeführt wurden, kann sich aber in anderen Zelllinien unterscheiden. - Normalisieren Sie den rohen Gallegifewert Renilla jedes Brunnens auf den rohen Renilla-Luziferase-Wert des gleichen Brunnens, um das Galle/Renilla-Verhältnis zu erhalten.Renilla
- Durchschnittlich die Firefly /Renilla Verhältnisse aller replizieren Kontrollbrunnen und dann teilen Sie das Firefly /Renilla Verhältnis von jedem anderen Brunnen durch diese Zahl, um eine Falte ändern zu erhalten.
- Weisen Sie die Kontrollprobe zuRenilla und setzen Sie ihren Firefly/Renilla-Verhältniswert auf 1.
- Durchschnittlich die Gupf-/Renilla-Verhältnisse der doppelten Brunnen und Plot mit der Standardabweichung.Renilla
HINWEIS: Die Standardabweichung wird nicht für statistische Analysen verwendet, sondern als Mittel zur Identifizierung von Brunnen, in denen sich die Replikationen erheblich unterscheiden.
- Schließen Sie Proben mit sehr niedrigen Renilla-Luziferase-Signal aus, da niedrige Werte darauf hindeuten, dass das virale Konstrukt toxisch war oder dass zu wenige transfizierte Zellen untersucht wurden.
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Representative Results
Unser YAP/TAZ-TEAD Reporterkonstrukt (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) enthält einen minimalen SV-49 Promoter mit 5 Wiederholungen des kanonischen TEAD-Bindungselements (MCAT)15, das das Gahngluciferase-Gen antreibt ( Abbildung1). Es wird zusammen mit dem PRL-TK-Kontrollvektor (Promega), der Renilla luziferase aus dem konstitutiv aktiven HSV TK Promoter ausdrückt (Abbildung 1), in Zellen umgewandelt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich das YAP/TAZ-TEAD-Reporterkonstrukt in der getesteten Zellzeile(n) wie erwartet verhält. Daher haben wir zunächst die PRL-TK- und pGL3-5xMCAT (SV)-49-Konstrukte in A375-Zellen kotransfiziert, die entweder einen Kontrollvektor, einen hochaktiven LATS-unempfindlichen Mutant von YAP (YAP 2SA ) oder eine Mutante von YAP 2SA stabil exemiten, die entweder einen Kontrollvektor, einen hochaktiven LATS-unempfindlichen Mutant von YAP (YAP2SA) oder eine Mutante von YAP2SA stabil ausdrückt, die nicht in der Lage ist, TEADs (YAP2SA,S94A) zu binden. Wie erwartet wurde die Galleifginaseaktivität durch YAP2SAsignifikant erhöht, nicht jedoch durch den Kontrollvektor oder den YAP2SA,S94A (Abbildung 2A). Dies deutet darauf hin, dass YAP die Aktivität des YAP/TAZ-TEAD-Reporters in einer TEAD-abhängigen Weise erhöht. Wichtig ist, YAP2SA nicht signifikant ändern die Ebenen der Renilla Luziferase. Als zusätzliches Steuerelement haben wir auch bestätigt, dass der YAP2SA die Aktivität eines minimalen Promotorkonstrukts, dem die MCAT TEAD-Bindungselemente fehlen, nicht ändert (Abbildung 2B).
Ein zweites Kontrollexperiment wurde ebenfalls durchgeführt, bei dem A375-Zellen mit viralen Konstrukten infiziert wurden, die entweder eine nicht zielgerichtete Kontroll-shRNA (shNTC) oder ein Konstrukt mit Tandem-YAP und TAZ shRNAs liefern. Nach stabiler Auswahl wurden die Zellen mit dem PRL-TK-Konstrukt und entweder dem YAP/TAZ-TEAD-Reporterkonstrukt oder dem minimalen Promotorkonstrukt kotransfiziert. In Zellen, die mit dem YAP/TAZ-TEAD-Reporterkonstrukt transfiziert wurden, reduzierte die YAP/TAZ shRNA die Galgen-Luziferase-Spiegel signifikant, aber die Kontrolle shNTC nicht (Abbildung 2C). Die Galgengifenginase-Spiegel wurden weder durch den shNTC noch durch die YAP/TAZ shRNA in Zellen, die mit dem minimalen Promotor transfiziert wurden, verändert (Abbildung 2C). In Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen wurde das Renilla-Signal in jedem Brunnen auch nicht signifikant durch die Steuerung shNTC oder die YAP/TAZ shRNA (Abbildung 2C)verändert, was wiederum darauf hindeutet, dass das PRL-TK-Steuerkonstrukt nicht auf YAP oder TAZ reagiert. Zusammenzeigen diese Experimente, dass sich das Reportersystem wie erwartet in A375-Zellen verhält, was mit früheren Studien mit diesen Vektorenübereinstimmt 2,14.
Als Proof-of-Concept-Experiment haben wir eine kleine lentivirale shRNA-Bibliothek in A375-Zellen untersucht. Unsere Testbibliothek enthielt shRNAs, die auf mehrere Gene abzielten, die zuvor gezeigt wurden, dass sie die YAP/TAZ-Funktion in anderen Zelltypen regulieren. Die Rolle mehrerer dieser Gene bei der Regulierung von YAP und TAZ bei Melanomen ist jedoch unbekannt. Unsere Bibliothek enthielt Gene, die für YAP/TAZ-Aktivitäten benötigt werden, wie RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4 und CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38, und Gene, die yAP/TAZ-Aktivität hemmen sollen, wie CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR und RB139,40,41,42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. Als Steuerungen haben wir ein Tandem YAP/TAZ shRNA14, eine nicht zielgerichtete Kontroll-shRNA (shNTC) und eine shRNA-Targeting Src, die wir zuvor gezeigt haben, dass sie für die maximale YAP/TAZ-Aktivität in A375-Zellen14erforderlich war.
Die Rohdaten und Analysen für diesen Bildschirm sind in der ergänzenden Tabelle 2dargestellt. Mehrere shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 und shMAPK8-2) reduzierten das Renilla-Luziferase-Signal signifikant relativ zum mittleren Renilla-Signal für alle Brunnen, was darauf hindeutet, dass diese shRNAs Zytotoxizität in A375-Zellen verursachten. Renilla Tatsächlich hatten diese Brunnen zum Zeitpunkt des Assays deutlich weniger Zellen (nicht gezeigt). Dies macht es sehr schwierig, Kandidaten, die YAP/TAZ regulieren können, von denen zu unterscheiden, die für das Überleben der Zelle unerlässlich sind. Daher sind die Ergebnisse dieser Stichproben von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen. Wie erwartet reduzierten shRNAs, die auf YAP und TAZ oder Src abzielten, die YAP/TAZ-TEAD-Aktivität deutlich (Abbildung 3). In Übereinstimmung mit veröffentlichten Arbeiten, die zeigen, dass PIK3CA die YAP- und TAZ-Aktivität21,26,31fördert, fanden wir heraus, dass shRNAs, die auf PIK3CA abzielen, den normalisierten Glühwürmchen-Luziferasespiegel reduzierten. shRNAs targeting ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN each erhöhte normalisierte Glühwürmchen-Luziferase-Spiegel, was mit veröffentlichten Studien übereinstimmt, die zeigen, dass diese Proteine YAP und/oder TAZ39,,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54 . Trotz etablierter Rollen für ATR, CCNE2 und ERBB4 in anderen Zelltypen27,28,35,36,38,49, änderten shRNAs, die auf diese Gene abzielten, nicht signifikant die normalisierten Galleifginase-Spiegel in A375-Zellen signifikant. shRNAs targeting EZH2 und RB1 showed a effect on firefly luciferase levels that was opposite of what was expected based on studies in other cell types32,34,40,52. Sowohl PTEN als auch RAF1 wurden von zwei unterschiedlichen shRNAs ins Visier genommen, die entgegengesetzte Auswirkungen auf die Luziferase-Aktivität hatten. Ergebnisse, die mit früheren Studien unvereinbar sind, könnten darauf hindeuten, dass der Einfluss dieser Proteine auf die YAP/TAZ-TEAD-Funktion zelltypabhängig ist; jedoch, Es kann auch aufgrund einer schlechten Knockdown-Effizienz oder Off-Target-Effekte von einigen shRNAs. Als n = 1 "blinder" Bildschirm wären auch einige falsche Positivmeldungen und falsche Negative zu erwarten. Wie in der Diskussion ausführlicher erläutert, müssten zusätzliche Validierungsexperimente mit anderen Assays wie qPCR für Gene durchgeführt werden, die von YAP und TAZ reguliert werden, und Western Blots für posttranslationale Modifikationen, die die YAP/TAZ-Funktion beeinflussen. Diese Validierung würde auch die Bestätigung beinhalten, welche shRNAs das Protein von Interesse effektiv niederschlugen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass, da unser Reporter TEAD ansprechbar ist, alle Gene, die von unserem Bildschirm identifiziert werden, TEADs beeinflussen könnten, aber nicht YAP und TAZ direkt. Follow-up mechanistischen Studien wären erforderlich, um festzustellen, ob es YAP und/oder TAZ oder die TEADs waren, die das identifizierte Protein reguliert. Jedoch, YAP und TAZ sind die wichtigsten Treiber der TEAD-vermittelten Transkription, so ist es wahrscheinlich, dass die meisten dieser Gene YAP und TAZ regulieren. In der Tat, wie oben erwähnt, die meisten der shRNAs, die im Bildschirm treffen, Zielen Proteine, die bekannt sind, yAP und/oder TAZ direkt zu regulieren.
Abbildung 1: Schemadiagramm des Workflows. Die kritischen Schritte dieses Protokolls werden mit Schrittnummern zusammengefasst, die den Zahlen im Protokoll entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Optimierung des YAP/TAZ-TEAD Dual-Luciferase-Transkriptions-Reportersystems. (A) A375-Zellen stabil exemittierenKontrollvektor (MSCV-IRES-Hygro), LATS-unsensitive YAP (YAP2SA) oder LATS-unsensitive YAP nicht binden TEADs (YAP2SA,S94 A) wurden mit den Constructs PRL-TK (Renilla) und pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP/TAZ-TEAD Reporter) kotransfiziert und das Luziferasesignal 24 Stunden später gemessen. n = 7 unabhängige Experimente. (B) A375-Zellen wurden entweder mit YAP2SA oder Steuervektor, dem PRL-TK-Konstrukt, kotransfiziert, und entweder das pGL3-5xMCAT (SV)-49-Konstrukt oder das pGL3 (SV)-49-Konstrukt (Minimal Promoter) und das Luziferase-Signal wurden 24 Stunden später gemessen. n = 1 Experiment in Quadruplikat transfiziert. (C) A375-Zellen wurden mit Retrovirus-Codierung einer nicht zielgerichteten Kontroll-shRNA (shNTC) oder Tandem YAP und TAZ shRNAs (shYAP/TAZ) infiziert. Nach stabiler Auswahl wurden die Zellen mit dem PRL-TK-Konstrukt kotransfiziert und entweder das pGL3-5xMCAT (SV)-49-Konstrukt oder das pGL3 (SV)-49-Konstrukt und das Luziferase-Signal 24 Stunden später gemessen. n = 4 unabhängige Infektionen; Die statistische Signifikanz wurde anhand von einseitiger ANOVA ermittelt, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest; n.s. = p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ergebnisse des repräsentativen Bildschirms. Das Ergebnis jedes Knock-Down-Vektors wird mit shNTC verglichen und als Faltendifferenz dargestellt. Die Balkengrafik zeigt den Durchschnitt der Galleife/ Renilla-Luziferase-Verhältnis - Standardabweichung.Renilla n = 1 Experiment. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Rohr A – Transfektionsverdünnung | |
| Reagenz | Volumen |
| Transfektionspuffer | 25 l pro Reaktion |
| Transfektionsreagenz 2 (Zweite hinzufügen) | 1,5 l pro Reaktion |
| Tube B – Reporter-Verdünnung | |
| Reagenz | Volumen |
| Transfektionspuffer | 25 l pro Reaktion |
| 20:1 Firefly luziferase Reporter: Kontrolle Renilla Mix (zweite hinzufügen) | 400 ng pro Reaktion |
| Transfektionsreagenz 3 (dritte hinzufügen) | 1 l pro Reaktion |
| Gesamt: 26,5 l pro Reaktion | |
Tabelle 1: Vorbereitung des Transfektionsmixes. Für die Transfektion in jeder Bohrung der 24-Well-Platten werden 1,5 l Transfektionsreagenz 2 in 25 l Transfektionspuffer verdünnt, um die Transfektionsverdünnung zu erzeugen (Rohr A); während 400 ng von 20:1 Firefly luciferase Reporter: Kontrolle Renilla-Mix und 1 l Transfektionreagenz 3 wird in 25 l Transfektionspuffer verdünnt, um die Reporter Verdünnung zu produzieren (Rohr B).
| Vorhandene/Gekaufte/Geschenkvektoren | |
| Vektor | Quelle |
| GIPZ human shRNA lentivirale Vektoren | GE Healthcare |
| VSVG | Hynes Lab [2] |
| psPAX2 | Addgen (#12260) |
| gag/pol | Addgen (#14887) |
| pGL3-(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| pGL3-5xMCAT(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| PRL-TK | Promega |
| MSCV-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 | LAMAR LAB [14] |
| Neue Vektoren | |
| Vektor | Quell-Backbone |
| MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro | MSCV-IRES-Hygro |
Ergänzende Tabelle 1: Tabelle der Vektoren. Alle verwendeten Vektoren werden mit neuen Vektoren aufgelistet. Standard-Molekularbiologie-Techniken wurden verwendet, um neue Vektoren zu erzeugen.
Ergänzende Tabelle 2: Luziferase-Assay-Datenanalyse. Die Anordnung der shRNA-Bibliothek ist in der ersten Tabelle dargestellt. Die zweite und dritte Tabelle zeigen die rohen Galle und Renilla luziferase Signale, beziehungsweise. Der Mittelwert und Renilla die Standardabweichung für das Renilla-Luziferase-Signal für alle Brunnen sind in den gelben Kästchen angegeben. Brunnen mit Renilla einem Renilla-Luziferase-Signal mehr als 1 Standardabweichung unterhalb des Mittelwerts werden mit rotem Text hervorgehoben und von der weiteren Analyse ausgeschlossen. DasGalle/Renilla-Verhältnis jedes Brunnens wurde durch Division des rohen Gallegifegauchsignals durch das rohe Renilla-Luziferase-Signal (vierte Tabelle) ermittelt. Renilla DasGalle/Renilla-Verhältnis jedes Brunnens wurde dann auf das durchschnittliche Gunen-/Renilla-Verhältnis der Kontrollbrunnen (shNTC) (fünfte Tabelle) normalisiert.Renilla Die doppelten Brunnen wurden als nächstes für jedes Konstrukt gemittelt und die Standardabweichung wurde berechnet (sechste Tabelle). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
In dieser Studie zeigen wir einen Ansatz für das Medium-Throughput-Screening von arrayed viralen Bibliotheken in Kombination mit einem auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptionsreporter-Assay, der verwendet werden kann, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren und zu testen. Es ist wichtig, das Reportersystem für jede Zelllinie vor jedem Bildschirm zu charakterisieren und zu optimieren. Es sollten Experimente durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass der Reporter auf die veränderte Aktivität des untersuchten Transkriptionsfaktors reagiert und das Ausmaß der Aktivitätsänderung im Verhältnis zu Kontrollvektoren getestet werden sollte. Die Kotransfektion des PRL-TK-Konstrukts zusammen mit dem Reporterkonstrukt ist wichtig, da es hilft, die Anzahl der mit dem Reporter transfizierten Zellen und die Kopiernummer des Reporterkonstrukts zu kontrollieren, die beide die Größe des Luziferase-Signals verändern können. Optimierungsexperimente sollten auch sicherstellen, dass der Transkriptionsfaktor die Aktivität des konstitutiven Renilla-Konstrukts oder eines minimalen Promotorkonstrukts nicht beeinflusst, da dies die Interpretation der Ergebnisse erschweren könnte. Steuerelemente, die in die Bibliothek aufgenommen werden sollen, sollten ebenfalls sorgfältig geprüft werden. Dieses Protokoll ist für einen "blinden Bildschirm" von Bibliotheken mit Hunderten von shRNAs konzipiert, wo es nicht möglich ist, den effektiven Knockdown durch jede shRNA zu bestätigen. Daher sind einige falsche Positiv- und Negative wahrscheinlich. Die Erhöhung der Anzahl technischer und/oder biologischer Repliken auf dem Bildschirm könnte dazu beitragen, die Anzahl falscher Positiv- und Negativwerte zu reduzieren. Dies wird jedoch auch die Anzahl der Brunnen zur Kultur und zum Test erheblich erhöhen, so dass darauf geachtet werden sollte, dass dies nicht zu suboptimalen Kulturbedingungen führt (siehe unten). Ein anderer Ansatz zur Reduzierung falscher Positiv- und Negativwerte wäre, den gesamten Bildschirm in derselben Zelllinie oder zusätzlichen Zelllinien zu wiederholen oder eine kleinere Bibliothek zu überprüfen, die nur die "Treffer" mit 3 biologischen Replikationen einschließt. In allen Fällen sollten alle Treffer mit Auslesungen außer dem Reporter validiert werden, wie z. B. qPCR für bekannte Zielgene. Auch der effektive Knockdown des Zielgens sollte in diesen Validierungsschritten bestätigt werden. Schlussfolgerungen sollten nicht über shRNAs gezogen werden, die die Aktivität nicht verändern, es sei denn, ein wirksamer Knockdown durch die shRNA wird bestätigt. Validierungsexperimente sollten auch sicherstellen, dass der untersuchte Transkriptionsfaktor das ist, was durch die Zielgene reguliert wird und dass diese Gene die Renilla- oder minimalen Promotorkonstrukte nicht beeinflussen.
Es ist auch wichtig, die Zellkulturbedingungen für jede Zelllinie zu optimieren, um suboptimale Bedingungen wie Überkonfluss, zu wenige Zellen, schlechte Zelllebensfähigkeit oder variable proliferative Kapazität zu vermeiden. Die Zellsädichte ist besonders wichtig zum Zeitpunkt der Transfektion des Dual-Luziferase-Reporterkonstrukts (Schritt 5) und bei der Messung der Reporteraktivität (Schritt 6). Die Transfektionseffizienz kann mit der Zelldichte erheblich variieren und eine schlechte Transfektionseffizienz kann zu anomalen Ergebnissen führen, wenn nur ein kleiner Teil der Zellpopulation untersucht wird. Die meisten getesteten Zelllinien zeigen die höchste Transfektionseffizienz bei 40 - 60 % Zusammenfluss, aber es wird empfohlen, dass Transfektionsbedingungen und Saatdichte für eine bestimmte Zelllinie mit einem Vektor optimiert werden, der ein fluoreszierendes Protein liefert. Zelllinien, die schwer zu infizieren und/oder transfekt, z. B. Primärzellen, sind für diesen Bildschirm möglicherweise nicht geeignet. Schlechte Reporter-Transfektion Effizienz oder schlechte Zelllebensfähigkeit führen in der Regel in sehr niedrigen Renilla luziferase Signal. Jedoch sollte ein Pilotexperiment durchgeführt werden, Renilla um den Bereich des Renilla-Luziferase-Signals für eine Zelllinie zu bestimmen. Es ist wichtig, dass der Titer des Virus, das aus der arrayierten Bibliothek produziert wird, hoch genug ist, um eine Infektionseffizienz von mindestens 30% in der Zelllinie zu geben, die untersucht wird. Die Infektionseffizienz kann stark variieren und mehrere Faktoren können viralen Titer beeinflussen. Die Menge an viralem Überstand sollte für jede Zelllinie optimiert werden und bei Bedarf kann Schritt 2 weiter optimiert werden, um virale Titer zu verbessern.
Zelldichte und Zelllebensfähigkeit können auch die Aktivität von zellulären Bahnen beeinflussen, die Transkriptionsfaktoren regulieren, so dass es wichtig ist, die Zellen für die Reportertransfektion auszusäen, so dass sie alle an dem Tag, an dem der Dual-Luziferase-Assay gelesen wird, alle eine ähnliche Dichte aufweisen (Schritt 6). Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über den Brunnen haften, anstatt sich in einem dichten Patch in der Mitte zu gruppieren. Wie oben beschrieben, signifikante Variation in der Renilla luziferase Signal von gut bis gut kann in Daten führen, die schwer zu interpretieren ist. Es ist am besten, Brunnen auszuschließen, die eine signifikante Verringerung der Renilla Luziferase Signal im Vergleich zu allen anderen Brunnen zeigen, da dies darauf hindeutet, dass entweder der virale Vektor die Zelllebensfähigkeit reduziert oder die Transfektionseffizienz für diesen Brunnen war sehr niedrig. Hier schlossen wir Brunnen von mehr als Renilla 1 Standardabweichung vom mittleren Renilla-Luziferase-Signal aus, aber Optimierungsexperimente sollten durchgeführt werden, um geeignete Cutoffs für jede Zelllinie zu bestimmen. Es ist auch möglich, dass shRNAs, die die Zelllebensfähigkeit reduzieren, dies tun könnten, indem sie die Aktivität des zu überprüfenden Transkriptionsfaktors verändern. Wenn dies ein Problem ist, shRNAs, die Renilla Luziferase Signal reduzieren könnte mit induzierbaren shRNAs oder anderen Assays erneut getestet werden. Es ist auch wichtig, die Zeit zu begrenzen, die anhaftende Zellen nach der Trypsinisierung in Suspension sind. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette für die meisten Schritte während der Trypsinisierung und Aussaat von Zellen, und für größere Bildschirme, arbeiten Sie mit den Platten in Chargen. Darüber hinaus ist es am besten, die Zeit zwischen der Infektion der Zellen und dem Reporter-Assay zu begrenzen. Dies ist besonders wichtig, wenn der zu assayierte Transkriptionsfaktor die Zellproliferation oder das Überleben reguliert. In diesem Fall würden Zellen mit effektivem Knockdown von Zellen mit weniger effizientem Knockdown übertroffen.
Mehrere Änderungen des beschriebenen Protokolls sind möglich. Dieser Ansatz kann effektiv verwendet werden, um Regulatoren eines beliebigen Transkriptionsfaktors zu identifizieren, wenn ein luziferase-basierter Reporter generiert wird, und für viele der häufigsten Transkriptionsfaktoren gibt es bereits Reporterkonstrukte. Dieses Protokoll kann für die Verwendung einer Vielzahl kommerziell erhältlicher oder manuell montierter Bibliotheken, einschließlich RNAi, CRISPR/CAS9, ORF oder cDNA, geändert werden. Tatsächlich haben wir zuvor eine ähnliche Strategie verwendet, um eine kleine cDNA-Bibliothek für YAP/TAZ-Regler14zu testen. Bibliotheken können mit Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus oder transienter Transfektion geliefert werden. Das hier verwendete virale Fellprotein (VSVG) erzeugt Lentivirus, das human-infektiös ist. Wenn Nagetierzellen verwendet werden und nicht-menschliche infektiöse Ökotropenviren gewünscht werden, kann anstelle von VSVG ein Vektor verwendet werden, der das Eco-Coat-Protein liefert.
Andere Methoden können verwendet werden, um Bibliotheken für Regulatoren eines Transkriptionsfaktors zu überprüfen. Der Zugang zu einer Durchsatz-Screening-Einrichtung würde es ermöglichen, viel größere Bibliotheken automatisiert zu durchforsen. Ebenso können genomweite Bildschirme mit gepoolten Bibliotheken mit tiefer Sequenzierung als Mittel zur Identifizierung der "Treffer" durchgeführt werden. Beide Ansätze erfordern jedoch Geräte, die vielen Forschern nicht zugänglich sind, und die Gebühren für Einführ-Screening oder tiefe Sequenzierung können unerschwinglich hoch sein. Darüber hinaus erfordern gepoolte Bildschirme die Sortierung von Zellen mit einem fluoreszierenden Reporter oder eine andere Möglichkeit, die Zellen zu bereichern, die die gewünschten Änderungen der Transkriptionsaktivität anzeigen. Screening von großen arrayed Expression Bibliotheken mit einem Dual-Luciferase-basierten Transkriptionsreporter-Assay wurde zuvor mit einem Tischroboter55gezeigt, aber dies ist nicht allgemein für alle Forscher verfügbar. Im Gegensatz dazu ist die hier beschriebene Methode schnell, mitteldurchsatz, relativ kostengünstig und verwendet Geräte und Reagenzien, die den meisten Forschern wahrscheinlich zugänglich sind. Diese Methode kann mehrere Regulierungsbehörden in einem einzigen Experiment aufdecken, was eine kostengünstige und bequeme Möglichkeit ist, potenzielle regulatorische Wege vor einem Transkriptionsfaktor zu entdecken.
Im beschriebenen Ansatz wurden Kandidatengene stabil niedergeschlagen und dann nach der Selektion die Reporterkonstrukte vorübergehend in die Zellen transfiziert. Jedoch, Transfektioneffizienz ist schlecht in vielen Zelllinien und kann Variabilität einführen und zelluläre Toxizität verursachen. Ein verbesserter alternativer Ansatz wäre es, das Reporterkonstrukt stabil in das Genom der Zelllinie von Interesse zu integrieren und dann die Reporter-exezierenden Zellen mit den viralen Bibliotheken zum Screening zu infizieren. Diese Verbesserung würde die durch die transiente Transfektion eingeführte Variabilität verringern und mögliche Veränderungen der Transkriptionsfaktoraktivität aufgrund einer längeren Kultur nach der Infektion verhindern. Wie oben erwähnt, würde die Verwendung eines kleinen Tischroboters den Prozess stark rationalisieren und die Größe der Bibliotheken erhöhen, die überprüft werden könnten. Eine weitere wesentliche Änderung ist die Verwendung von arrayierten induzierbaren Vektorbibliotheken, die die Wahrscheinlichkeit einer Auswahl gegen Zellen mit effektiverem Knockdown verringern und die Variabilität verringern würden, die durch Änderungen der Zelllebensfähigkeit verursacht wird.
Eine bedeutende Herausforderung, die die effektive Behandlung vieler Krebsarten verhindert, ist, dass Tumorzellen Resistenzen auch gegen die effektivsten zielgerichteten Therapien erhalten. Die Identifizierung von Proteinen, die für diese therapeutische Resistenz erforderlich sind, ist notwendig, um das Patientenergebnis zu verbessern. Der beschriebene Ansatz könnte leicht in Kombination mit gezielten Therapeutika verwendet werden, um Gene zu offenbaren, die eine erhöhte Empfindlichkeit oder Resistenz gegen diese Verbindungen verursachen. Eine weitere mögliche zukünftige Anwendung dieses Ansatzes wäre, dieses Arrayed Screening zu nutzen, um die therapeutischen Ziele der Kandidaten in Kombination zu testen. Dazu würden Zellen mit jeweils zwei viralen Vektoren infiziert, mit dem Ziel, Proteine zu identifizieren, die eine synergistische Wirkung auf die Transkriptionsfaktoraktivität haben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Emily Norton und Mikaelan Cucciarre-Stuligross für die Unterstützung bei der Herstellung von shRNA-Vektoren. Diese Arbeit wurde teilweise von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
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