Summary
Il microbilanciamento a cristalli di quarzo può fornire accurate proprietà di massa e viscoelastica per le pellicole nella gamma micron o submicron, che è rilevante per le indagini in biomedica e ambientale rilevamento, rivestimenti e scienza dei polimeri. Lo spessore del campione influenza quali informazioni possono essere ottenute dal materiale a contatto con il sensore.
Abstract
In questo studio, presentiamo vari esempi di come la sottile preparazione della pellicola per gli esperimenti di microbilanciamento del cristallo di quarzo informa la modellazione appropriata dei dati e determina quali proprietà della pellicola possono essere quantificate. Il microbilanciamento a cristalli di quarzo offre una piattaforma particolarmente sensibile per misurare i cambiamenti fini nelle proprietà di massa e/o meccaniche di una pellicola applicata osservando i cambiamenti nella risonanza meccanica di un cristallo di quarzo che oscilla ad alta frequenza. I vantaggi di questo approccio includono la sua versatilità sperimentale, la capacità di studiare i cambiamenti nelle proprietà su una vasta gamma di lunghezze di tempo sperimentali e l'uso di campioni di piccole dimensioni. Dimostriamo che, in base allo spessore e al modulo di taglio dello strato depositato sul sensore, possiamo acquisire informazioni diverse dal materiale. Qui, questo concetto è specificamente sfruttato per visualizzare parametri sperimentali con conseguente calcoli di massa e viscoelastico del collagene adsorbito su complessi oro e poliglitolitico durante il gonfiore in funzione della concentrazione del sale.
Introduction
Il microequilibrio di cristallo di quarzo (QCM) sfrutta l'effetto piezoelettrico di un cristallo di quarzo per monitorare la sua frequenza risonante, che dipende dalla massa aderita alla superficie. La tecnica confronta la frequenza di risonanza e la larghezza di banda di un sensore di cristallo al quarzo taglio AT (tipicamente nell'intervallo di 5 MHz)1 in aria o un fluido alla frequenza e alla larghezza di banda del sensore dopo la deposizione di una pellicola. Ci sono diversi vantaggi per l'utilizzo del QCM per studiare le proprietà e le interfacce della pellicola sottile, tra cui l'elevata sensibilità alla massa e potenzialmente ai cambiamenti delle proprietà viscoelastice (a seconda dell'uniformità e dello spessore del campione), la capacità di eseguire studi in situ2e la capacità di sondare una scala reologica molto più breve rispetto alla tradizionale reologia di taglio o analisi meccanica dinamica (DMA). Sondare una breve scala temporale reologica permette l'osservazione di come la risposta in questa scala temporale cambia sia su durate estremamente brevi (ms)3 e lunghe (anni)4. Questa capacità è utile per lo studio di una varietà di processi cinetici ed è anche un'utile estensione delle tecniche reometriche tradizionali5,6.
L'elevata sensibilità del QCM ha anche portato al suo uso pesante in applicazioni biologiche studiando le interazioni fondamentali di biomolecole estremamente piccole. Una superficie del sensore non rivestita o funzionalizzata può essere utilizzata per studiare l'adsorbiente delle proteine; ancora più lontano, il biosensing attraverso complessi eventi di legame tra enzimi, anticorpi e aptamers può essere esaminato sulla base di cambiamenti di massa7,8,9. Per esempio, la tecnica è stata utilizzata per comprendere la trasformazione delle vesciche in un bistrato lipidico planare come un processo in due fasi di adsorbizione di vesciboli contenenti liquidi a una struttura rigida osservando i cambiamenti di frequenza e viscoelasticità10. Negli ultimi anni, il QCM ha inoltre offerto una solida piattaforma per monitorare la somministrazione di farmaci tramite vescicoli o nanoparticelle11. All'intersezione tra ingegneria dei materiali e biologia molecolare e cellulare, possiamo usare il QCM per chiarire le interazioni chiave tra materiali e componenti bioattivi come proteine, acidi nucleici, liposomi e cellule. Ad esempio, l'adsortionte delle proteine a un biomateriale media le risposte cellulari a valle come l'infiammazione ed è spesso usato come indicatore positivo di biocompatibilità, mentre in altri casi l'attaccamento extracellulare delle proteine ai rivestimenti che si interfacciano con il sangue potrebbe indurre la coagulazione pericolosa nei vasi12,13. Il QCM può quindi essere utilizzato come strumento per selezionare i candidati ottimali per esigenze diverse.
Due approcci comuni per l'esecuzione di esperimenti QCM raccolgono dati analoghi dall'esperimento: il primo approccio registra lo spostamento di frequenza e la metà della larghezza di banda ()del picco di conduttanza. Il secondo approccio, QCM con dissipazione (QCM-D), registra lo spostamento di frequenza e il fattore di dissipazione, che è direttamente proporzionale alla
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dove D è il fattore di dissipazione e è la frequenza. Sia D che - sono legati all'effetto di smorzamento che la pellicola ha sul sensore, che fornisce un'indicazione della rigidità della pellicola. Il pedice n denota la variazione di frequenza o armonica, che sono le frequenze di risonanza dispari del sensore al quarzo (n : 1, 3, 5, 7...). Ulteriori discussioni su modelli che utilizzano molteplici armoniche per ottenere le proprietà di massa e viscoelastica di un film possono essere trovate in una recensione di Johannsmann14 e documenti precedenti del gruppo Shull15,16,17,18.
Una considerazione fondamentale per la preparazione dei campioni QCM è come applicare la pellicola sottile sulla superficie del sensore. Alcuni metodi comuni includono il rivestimento a spin, il rivestimento a tuffo, il rivestimento a goccia o l'adsorption del film sulla superficie del sensore durante l'esperimento19,20. Ci sono quattro regioni per i campioni QCM: il limite di Sauerbrey, il regime viscoelastico, il regime di massa e il regime sovrasmordito. Per i film sufficientemente sottili, si applica il limite di Sauerbrey, dove lo spostamento di frequenzaèquello di una maggiore frequenza. Entro il limite di Sauerbrey, lo spostamento di frequenza si adatta linearmente con l'armonica risonante, n, e le variazioni nel fattore di smorzamento (D o z) sono generalmente piccole. In questo regime non sono disponibili informazioni sufficienti per determinare in modo univoco le proprietà reologiche del layer senza fare ipotesi aggiuntive. I dati di questo regime vengono utilizzati per calcolare la densità di massa della superficie (o spessore se la densità è nota a priori) della pellicola. Nel regime di massa in cui il mezzo a contatto con il cristallo è sufficientemente spesso, l'onda di taglio evanescente si propaga nel mezzo prima di essere completamente smorzata. Qui, nessuna informazione di massa può essere ottenuta utilizzando . Tuttavia, in questa regione, le proprietà viscoelastice sono determinate in modo affidabile utilizzando la combinazione di z -e 15 , 18. Nel regime di massa, se il mezzo è troppo rigido, il film smorza la risonanza del sensore, impedendo la raccolta di dati affidabili dal QCM. Il regime viscoelastico è il regime intermedio in cui la pellicola è abbastanza sottile da avere l'onda di taglio completamente propagata attraverso la pellicola e hanno valori affidabili per il fattore di smorzamento. Il fattore di smorzamento e il fattore di smorzamento e lasbarramento possono quindi essere usati per determinare le proprietà viscoelastiche del film e la sua massa. Qui, le proprietà viscoelastiche sono date dal prodotto della densità e della grandezza del complesso modulo di taglio . G p e l'angolo di fase dato da : arctan(G / G'). Quando i film sono preparati al limite di Sauerbrey, la massa per unità di superficie può essere calcolata direttamente in base all'equazione di Sauerbrey mostrata sotto21,
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dove nè il cambiamento nella frequenza di risonanza, n è il tono di interesse,è la frequenza risonante del sensore, zm / A è la massa per area del film, e q è l'impedimento acustico del quarzo, che per il quarzo tagliato AT è :q , 8,84 x 10 6 kg / m2 s. Il regime viscoelastico è più appropriato per lo studio delle pellicole polimeriche, e il limite di massa è utile per studiare polimeri viscosi22 o soluzioni proteiche16. I diversi regimi dipendono dalle proprietà del materiale di interesse, con lo spessore ottimale per la piena caratterizzazione viscoelastica e di massa generalmente aumentando con la rigidità della pellicola. La figura 1 descrive le quattro regioni per quanto riguarda la densità areale della pellicola, il modulo di taglio complesso e l'angolo di fase, in cui abbiamo assunto una relazione specifica tra l'angolo di fase e la rigidità della pellicola che è stata dimostrata rilevante per i materiali di questo tipo. Molti film di interesse pratico sono troppo spessi per studiare le proprietà viscoelastiche con QCM, come alcuni biofilm, dove gli spessori sono dell'ordine di decine a centinaia di micron23. Tali pellicole spesse non sono generalmente adatte per lo studio utilizzando il QCM, ma possono essere misurate utilizzando risonatori a frequenza molto più bassi (come i risonatori torsionali)23, permettendo all'onda di taglio di propagarsi ulteriormente nella pellicola.
Per determinare quale regime è rilevante per un dato campione QCM, è importante comprendere il parametro d /n, che è il rapporto tra lo spessore della pellicola (d) e la lunghezza d'onda di taglio dell'oscillazione meccanica del sensore di cristallo di quarzo(n)15,16,18. Il regime viscoelastico ideale è d /n - 0,05 - 0,218, dove valori inferiori a 0,05 sono all'interno del limite di Sauerbrey e valori superiori a 0,2 si avvicinano al regime di massa. Una descrizione più rigorosa di d /n è fornita altrove15,18, ma è un parametro quantitativo che delinea il limite di Sauerbrey e il limite viscoelastico. I programmi di analisi utilizzati di seguito forniscono direttamente questo parametro.
Ci sono alcune limitazioni aggiuntive per l'analisi di pellicole sottili con il QCM. I calcoli Sauerbrey e viscoelastico presumono che la pellicola sia omogenea sia per lo spessore della pellicola che lateralmente sulla superficie dell'elettrodo del QCM. Mentre questa ipotesi rende difficile studiare i film che hanno vuoti o riempitivi presenti, ci sono state alcune indagini QCM su film costituiti da nanoparticelle innestate6. Se le eterogeneità sono piccole rispetto allo spessore complessivo della pellicola, è ancora possibile ottenere proprietà viscoelastiche affidabili del sistema composito. Per sistemi più eterogenei, i valori ottenuti da un'analisi viscoelastica devono sempre essere visti con grande cautela. Idealmente, i risultati ottenuti da sistemi con eterogeneità sconosciuta dovrebbero essere convalidati rispetto a sistemi che sono noti per essere omogenei. Questo è l'approccio che abbiamo adottato nel sistema di esempio descritto in questo documento.
Un punto importante che illustriamo in questo documento è l'esatta corrispondenza tra le misurazioni QCM effettuate nel dominio della frequenza (dove viene riportato il dominio di z) e gli esperimenti sul dominio temporale (dove viene riportato D). Vengono descritti i risultati di due diversi esperimenti QCM, un dominio temporale e un dominio di frequenza, ognuno dei quali coinvolge un sistema di modelli diverso ma concettualmente correlato. Il primo sistema è un semplice esempio di attaccamento del collagene al sensore per illustrare la cinetica di legame rappresentativa e l'equilibratura dell'adsorto nel tempo durante una misurazione del dominio temporale (QCM-D). Il collagene è la proteina più abbondante nel corpo, nota per la sua versatilità di comportamenti vincolanti e morfologia. La soluzione di collagene qui utilizzata non richiede un'ulteriore funzionalizzazione della superficie dorata del sensore per indurre l'adsorto9. Il secondo sistema sperimentale è un complesso di polielettroliti (PEC) composto da solfato di polistirolo anionico (PSS) e policazionale cationico (diallyldimethylammonium) (PDADMA) preparato allo stesso modo di Sadman et al.22. Questi materiali si gonfiano e diventano morbidi nelle soluzioni di sale (KBr in questo caso), offrendo una semplice piattaforma per studiare la meccanica dei polimeri utilizzando un approccio di dominio di frequenza (QCM-z). Per ogni protocollo, il processo di preparazione, assunzione e analisi di una misurazione è illustrato nella Figura 2. Lo schema mostra che la differenza principale tra gli approcci QCM- e QCM-D è nella fase di raccolta dei dati e la strumentazione utilizzata nell'esperimento. Tutte le tecniche di preparazione dei campioni menzionate sono compatibili con entrambi gli approcci e ogni approccio può analizzare gli esempi nelle tre aree illustrate nella Figura 1.
I nostri dati dimostrano che la preparazione di campioni, sia mediante rivestimento del sensore prima o durante una misurazione, determina la capacità di estrarre le proprietà viscoelastiche di un sistema. Progettando le prime fasi di un esperimento in modo appropriato, possiamo determinare quali informazioni possiamo raccogliere con precisione durante la fase di analisi.
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Protocol
Annuncio collagene QCM-D
1. Preparazione del campione e pre-pulizia del sensore
- Preparare 20 mL di buffer in acetato da 0,1 M, regolando il pH con HCl e NaOH in base alle esigenze per ottenere il pH 5,6.
- Aggiungere la soluzione di collagene coda di ratto al buffer di 20 mL di acetato in condizioni sterili ad una concentrazione finale di 10 g/mL.
- Pulire il sensore al quarzo rivestito in oro per rimuovere materiale organico e biologico25,26.
- Posizionare il lato attivo del sensore in una camera UV/Ozone e trattare la superficie per circa 10 min.
- Riscaldare una miscela di acqua deionizzata 5:1:1 (dH2O), ammoniaca (25%) e perossido di idrogeno (30%) a 75 gradi centigradi. Posizionare il sensore nella soluzione per 5 min.
- Sciacquare il sensore con dH2O e asciugare con un flusso di gas di azoto.
- Posizionare il lato attivo del sensore in una camera UV/Ozone e trattare la superficie per 10 min.
NOTA: la procedura di pulizia deve essere eseguita immediatamente prima di una misurazione per ridurre al minimo la contaminazione ambientale sulla superficie del sensore.
2. Acquisizione dei dati di misurazione QCM-D
- Accendere tutte le apparecchiature necessarie per prendere una misura tra cui la pompa, l'unità elettronica e il software del computer.
- Rimuovere il modulo di flusso dalla piattaforma della camera e svitare le grandi viti del pollice per aprire il modulo.
- Se il sensore è stato omesso dopo la pulizia iniziale (passaggi 1.3.1-1.3.4), sciacquare il sensore con acqua deionizzata (dH2O) e asciugare con un flusso di gas di azoto per garantire che non vi siano contaminanti sulla superficie.
- Montare il sensore nel modulo di flusso sull'anello O esposto, asciugando prima l'area con un flusso di gas di azoto e controllando che l'anello O sia disteso. Il sensore deve essere posizionato con il lato della superficie attiva verso il basso e l'elettrodo a forma di ancora orientato verso il marcatore nel modulo di flusso.
- Ruotare le viti del pollice per sigillare il modulo di flusso e sostituirlo sulla piattaforma della camera. Collegare tutti i tubi di pompa PTFE necessari al modulo di flusso e alla pompa esterna.
- Utilizzando il software del computer appropriato, impostare la temperatura del modulo di flusso su 37 . Monitorare la temperatura di variazione per 10-15 min per assicurarsi che sia equilibrato al valore desiderato.
- Trovare le frequenze di risonanza iniziali del sensore. Se il software non rileva frequenze di risonanza, verificare che il modulo di flusso sia posizionato correttamente sulla piattaforma della camera o rimontare il sensore nel modulo di flusso per assicurarsi che sia centrato e che sia collegato correttamente.
- Posizionare il tubo della pompa di inseridiazione nella soluzione salina 1x con buffer fosfato (PBS). Avviare il flusso della pompa esterna a 25 l/min e ispezionare visivamente il tubo per essere sicuri che il fluido scorra attraverso il tubo.
NOTA: Il flusso del fluido può essere più facile da vedere aumentando momentaneamente la portata del fluido a 100 l/min o superiore. Se il fluido non sembra muoversi attraverso il tubo, è molto probabile che le due parti del modulo di flusso non stiano creando una guarizione adeguata. Provare a stringere le viti del pollice, stringere i connettori del tubo per l'entrata e la presa, o rimontare il sensore per essere sicuri che l'anello O sia piatto e centrato. - Consentire il flusso fluido dell'1x PBS attraverso il modulo di flusso per almeno 15 min per l'equilibrato corretto.
- Avviare la misurazione nel software del computer per iniziare l'acquisizione dei dati. Monitorare i valori di frequenza e dissipazione per almeno 5 min per garantire una linea di base stabile.
- Fermare la pompa e spostare il tubo di ingresso alla soluzione buffer collagene-acetato, e riprendere il flusso di liquido. Prendere nota dell'ora di questo evento per un'analisi successiva.
- Lasciare che i nuovi valori di frequenza e dissipazione siano equilibrati a un valore stabile. Qui, ci aspettiamo che questa stabilizzazione avvenga dopo 8-12 h.
- Fermare la pompa, spostare il tubo di ingresso di nuovo alla soluzione 1x PBS, e riprendere il flusso di liquido. Prendere nota dell'ora di questo evento per un'analisi successiva.
- Lasciare che i nuovi valori di frequenza e dissipazione siano equilibrati a un valore stabile. Qui, questa stabilizzazione avviene dopo 30 min.
NOTA: i passi 2.13 e 2.14 possono essere ripetuti per ogni nuovo periodo di flusso di fluido in esperimenti più rigorosi con un maggior numero di fasi. - Terminare l'acquisizione dei dati della misurazione e salvare i dati.
- Pulire e smontare l'apparecchiatura QCM.
- Aumentare la portata del fluido della pompa esterna a 500 l/min o superiore e posizionare il tubo di ingresso in una soluzione di 2% Hellmanex soluzione di pulizia per almeno 20 min.
NOTA: per altri esperimenti, se si desidera un'ulteriore analisi del sensore, rimuovere il sensore prima del passaggio 2.16.1 e posizionare un altro sensore di pulizia nel modulo. - Fermare la pompa e spostare il tubo di ingresso a dH2O, e riprendere il flusso di liquido per lavare ulteriormente il sistema per almeno 20 min.
- Interrompere il flusso del fluido e rimuovere il sensore dal modulo di flusso. Asciugare il sensore e all'interno del modulo di flusso con un flusso di gas di azoto. Spegnere il software del computer, l'unità elettronica e la pompa peritaltica.
NOTA: i sensori rivestiti d'oro possono essere puliti correttamente, come descritto nei passaggi da 1.3.1-1.3.4 e riutilizzati per diverse misurazioni. Le indicazioni che un sensore non può più essere riutilizzato per misurazioni affidabili possono includere, ma non si limitano alla grande variabilità delle frequenze di risonanza iniziale e alle derive significative nelle misurazioni di base con flusso di buffer. I dati possono essere aperti e analizzati nel software preferito, compresi quelli forniti da aziende specializzate in apparecchiature QCM-D.
- Aumentare la portata del fluido della pompa esterna a 500 l/min o superiore e posizionare il tubo di ingresso in una soluzione di 2% Hellmanex soluzione di pulizia per almeno 20 min.
Gonfiore complesso di polielettroliti QCM
3. Preparazione dei campioni
NOTA: Questo esperimento è stato eseguito utilizzando un programma MATLAB sviluppato all'interno del gruppo di ricerca Shull per la raccolta e l'analisi dei dati.
- In primo luogo, posizionare un sensore di cristallo di quarzo nudo in un supporto campione collegato all'analizzatore di rete vettoriale e al computer. Accendere l'analizzatore per applicare una tensione oscillante al sensore e raccogliere uno spettro di conduttanza di riferimento per il sensore nell'aria.
- Immergere il supporto del campione in un becher da 100 mL senza labbra riempito con acqua distillata e raccogliere uno spettro di conduttanza di riferimento per il sensore nudo in acqua.
- Preparare una soluzione di 0,5 M di bromuro di potassio (KBr).
- Sciogliere 1,79 g di KBr in 30 mL di acqua distillata. Agitare fino a sciogliere.
- Inserire un piccolo wafer di silicio nella soluzione KBr ad angolo per creare una diapositiva per il sensore di quarzo durante la fase di annessione per evitare che la pellicola eschi dal sensore.
- Preparare il sensore per il rivestimento di spin.
- Impostare i parametri del mantello di rotazione su 10.000 rpm, 8.000 accelerazione e 5 s.
- Inserire il sensore sull'identificatore di spin e accendere il vuoto.
- Coprire la superficie del sensore con etanolo ed eseguire il rivestimento di spin per pulire la superficie del sensore.
- Aggiungere il PEC (PSS:PDADMA preparato nello stesso modo in cui dettagliato in Sadman et al. 22) alla superficie del sensore.
- Se il complesso si trova in due fasi (polimero ricco e polimerico povero), inserire lentamente il tubo nella soluzione. Evacuare il tubo soffiando bolle mentre si sposta il tubo nella fase più densa di polimeri.
- Dopo aver rilasciato un paio di bolle nella fase ricca di polimeri, distrutre 0,5-0,75 mL della soluzione ricca di polimeri nel pipet. Mantenere la pressione sul bulbo del tubo per non consentire alla fase povera di polimeri di entrare nel tubo, estrarre il tubo dalla soluzione.
- Pulire l'esterno del pipet utilizzando un Kimwipe. Aggiungere una soluzione sufficiente dropwise sulla superficie del sensore al quarzo per coprire completamente la superficie. Assicurarsi che non vi siano bolle visibili nella soluzione sulla superficie del sensore.
- Ruotare il campione PEC e immergere immediatamente il sensore nella soluzione KBr da 0,5 M per evitare la cristallizzazione del sale sulla pellicola.
NOTA: questo passaggio è talvolta difficile da coordinare. Rilasciare il sensore appena sopra la soluzione KBr per ottenere i migliori risultati. - Lasciare che il film sia ad anneal per almeno 12 h.
NOTA: Per facilitare l'esecuzione dell'esperimento, preparare il passaggio 4 la sera e lasciare che il film si anneal durante la notte.
4. Misurazione della pellicola in aria e in acqua
- Trasferire il sensore su un becher riempito con acqua distillata per rimuovere il KBr in eccesso dalla pellicola e sul lato posteriore del sensore. Lasciare il sensore nella soluzione per 30-60 min.
- Prendere una misura del film in aria. Riferimento al sensore nudo in aria. Consentire l'eclicazione dei dati della pellicola.
- Inserire il solfato di calcio essiccato in un becher senza labbra da 100 mL e misurare lo spessore della pellicola completamente asciutta. Rimuovere il solfato di calcio dal becher e sciacquare il becher con acqua distillata.
- Riempire il becher senza labbra da 100 mL con 30 mL di acqua distillata. Inserire una barra di agitazione per assicurarsi che l'acqua circoli intorno alla pellicola. Misurare la pellicola in acqua per circa 30-45 min o fino a quando i dati della pellicola sono equilibrati. Riferimento al sensore nudo in acqua.
- Preparare una soluzione da 15 mL di 3 M KBr in acqua distillata. Misurare 5,35 g di KBr in un cilindro graduato e riempire a 15 mL con acqua distillata. Swirl fino a dissoluzione.
- Aggiungere la soluzione KBr al becher con acqua distillata con incrementi di 0,1 M. La tabella 1 descrive gli incrementi di 0,1 M in mL della soluzione KBr da 3 M. Affrontare la pellicola lontano da dove la soluzione KBr viene aggiunto all'acqua in modo che il film non si dissolva. Assicurarsi che il sistema sia equilibrato prima di aggiungere un'altra soluzione KBr.
- Dopo che tutti i dati sono stati acquisiti, rimuovere il film dal supporto e mettere in un bicchiere di acqua distillata. Lasciare il sale per lasciare il film (30-60 min) e asciugare all'aria la pellicola.
- Per pulire la pellicola PEC dal sensore, aggiungere KBr al becher e ruotare delicatamente la soluzione. Lasciare soffermato per 5-10 min. Ripetere questo processo 2-3 volte, quindi risciacquare il sensore con acqua distillata.
NOTA: il sensore può essere pulito e riutilizzato se la risposta dal sensore è ancora valida. Questo può essere controllato dal sensore con piccole letture assolute della larghezza di banda per le armoniche di interesse (<100 Hz).
5. Analisi dei dati
- Aprire la GUI MATLAB di analisi dei dati QCM-D creata da Sadman (https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Aprire il file di dati della pellicola in un file di dati aria selezionando "Carica QCM".
NOTA: il gruppo Shull ha sviluppato una GUI Python simile per la raccolta e l'analisi dei dati per QCM (https://github.com/shullgroup/rheoQCM). Una parte del codice di analisi viene fornita nelle informazioni supplementari sia per l'analisi dei dati che per la generazione delle cifre contenute in questo documento. - Selezionare il calcolo desiderato (3,5,3 o 3,5,5), gammae pellicola in icone dell'aria. Fare clic su Stampa QCM.
- Determinare lo spessore della pellicola secca utilizzando il punto dati più equilibrato (in genere l'ultimo punto dati) dall'esperimento. Registrare questo valore.
- Aprire la pellicola in un file di dati acqua. Selezionare gli stessi parametri del punto 5.2, ad eccezione della pellicola in acqua anziché della pellicola in aria.
- Dopo ogni fase di equilibratione dell'esperimento di gonfiore, determinare lo spessore della pellicola, il modulo di taglio complesso e l'angolo di fase viscoelastico. Registrare questi valori insieme alla forza ionica (che vanno da 0-1 M in incrementi di 0,1 M).
- Determinare la percentuale di gonfiore come
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dove dp è lo spessore della pellicola dalla soluzione e dpasciutto è lo spessore della pellicola secca.
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Representative Results
I cambiamenti di frequenza con il tempo durante l'adsorbizione proteica presentano una curva caratteristica e plateau mostrato Figura 3A-B. Il lavaggio iniziale del buffer di 1x PBS sulla superficie del sensore nudo induce solo cambiamenti di frequenza trascurabili, offrendo una linea di base costante che funga da riferimento per i punti dati futuri. L'introduzione della soluzione di collagene provoca l'adsorbimento delle proteine, osservato come una costante diminuzione della frequenza nel tempo, fino alla densità di aderente a platano di collagene a una linea di base stabile (Figura 3A). La frequenza esatta e i valori di massa dipenderanno fortemente dalla purezza e dall'energia superficiale del sensore. Dati questi parametri, il lavaggio tampone finale rimuove solo una piccola quantità di proteine non danneggiate dalla superficie del sensore, con conseguente lieve aumento della frequenza. Dovremmo sempre aspettarci solo una leggera diminuzione della massa durante questo periodo, dimostrando una quantità stabile di proteine legate al sensore (Figura 3B).
L'importanza di raggiungere una misurazione stabile della frequenza per ogni periodo non può essere sopravvalutata. Lievi fluttuazioni delle variabili ambientali come temperatura, umidità e concentrazione delle soluzioni possono portare a differenze osservabili nei dati grezzi. Pertanto, la modifica di queste variabili prima di almeno 5-10 min di misurazione della frequenza e del fattore di dissipazione stabili può travisare gli esatti cambiamenti nella frequenza e nella dissipazione. Un esempio di set di dati non ottimale è illustrato nella Figura 3C-D. In questo caso, gli stessi parametri di concentrazione e portata della soluzione vengono utilizzati come Figura A-B, ma l'ambiente dello strumento non è stato consentito di eclabare prima di iniziare la misurazione. L'instaurazione naturale della frequenza oscillante del sensore si verifica contemporaneamente a una concentrazione mutevole della temperatura e dei fluidi, mascherando qualsiasi potenziale linea di base che fungerà da riferimento (Figura 3C). Siamo invece costretti a scegliere una media dell'intero intervallo di frequenza dinamica nel periodo per fungere da riferimento. Infine, il flusso di collagene non è autorizzato a eclacazione a una massa stabile prima di iniziare il lavaggio finale pbS, come visto dai cambiamenti di frequenza ancora mutevoli appena prima che il PBS entri nel sistema. Questa azione non influisce sui calcoli di massa, ma non caratterizza completamente il potenziale adsortivo della proteina sul sensore (Figura 3D).
Durante le prime fasi dell'esperimento sugli adsortioni di collagene, il film è nel regime di Sauerbrey, indicato da valori di z/n che sono indipendenti da n (t < 2 h nella Figura 3). Man mano che l'esperimento procede, il film si sposta nel regime viscoelastico, indicato dai valori di z/n che non si sovrappongono più (t > 2,5 h). Riconoscendo questo cambiamento nel comportamento, i dati ottenuti dall'esperimento del collagene sono stati analizzati per osservare la massa aale e le proprietà viscoelastiche utilizzando due metodi diversi. Il primo utilizza uno script Python compilato dal gruppo Shull. Questo script ha le stesse basi matematiche del software di raccolta e analisi dei dati MATLAB utilizzato per l'esperimento PEC. Utilizza un modello di legge di potenza per tenere conto delle differenze di proprietà alle armoniche adiacenti15 ed è fornito nelle informazioni supplementari. Il secondo metodo utilizza valori determinati da un modello viscoelastico in un pacchetto software commerciale per calcolare la massa areale, il modulo di taglio complesso e l'angolo di fase della pellicola di collagene. Il modello viscoelastico di questo software riporta lo spessore (d), il modulo elastico e la viscosità (). Il modulo elastico e la viscosità sono gli elementi di un modello Kelvin-Voigt e vengono convertiti nella grandezza e nella fase del complesso modulo tramite le seguenti espressioni:
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doveè la frequenza fondamentale del sensore al quarzo (5 MHz). La figura 4 mostra le proprietà viscoelastice determinate per gli adsorbiti di collagene calcolati in base ai valori della terza e della quinta armonica. Figura 5 confronta le proprietà da Figura 4 con le proprietà convertite dai risultati software commerciali. Come si può vedere in Figura 5, i valori software commerciali riportano il film per essere più morbido rispetto alla sceneggiatura Python.
La figura 6 descrive una relazione osservata nei precedenti esperimenti QCM3,22 che mostra una relazione lineare tra l'angolo di fase viscoelastico e il logaritmo della grandezza del complesso modulo di taglio. La linea verde indica questa relazione lineare, avendo punti finali di un fluido newtoniano come l'acqua G p - 105Pa , g/cm3 e 90 a. G p : 109Pa , g/cm3 e 0 o più). Molti materiali polimerici studiati utilizzando il QCM seguono questa tendenza empirica generale, che è stata quantificata utilizzando il complesso sistema PSS:PDADMA22. Poiché il PEC è sottoposto a soluzioni con concentrazioni di sale più elevate, il campione passa dall'essere un campione rigido e vetroso all'essere più viscoso e fluido come; questo spettro di proprietà cade sulla linea verde. A scopo di confronto, le proprietà calcolate utilizzando lo script Python per la pellicola di collagene equilibrato sono tracciate anche nella Figura 6. Il rapporto tra i due G si prevede che p e - siano gli stessi per entrambi i sistemi, dato che entrambi i sistemi sono polimeri vitrei gonfi di acqua. Il contenuto d'acqua della pellicola determina il punto specifico lungo la curva. Qui, il sistema PEC con proprietà meccaniche più vicine al sistema di collagene corrisponde a una soluzione polimerica 20 wt%. Deduciamo da questo confronto che la concentrazione di polimeri nel film di collagene adsorbito è anche vicino a 20 wt.%. Questo risultato è molto utile, ottenuto nel nostro caso confrontando i risultati ottenuti da due esperimenti QCM opportunamente progettati. Uno di questi esperimenti è stato un esperimento di dominio temporale (QCM-D, collagene) e l'altro è stato un esperimento di dominio di frequenza (QCM-z, PEC), ma questi tipi di esperimenti sono completamente intercambiabili, con entrambi i protocolli sufficiti in entrambi i casi.
Figura 1: Ploting dei regimi di Sauerbrey, viscoelastico, sfuso e sovraumidito. Il grafico mostra regimi in cui diversi tipi di informazioni possono essere ottenuti dai dati QCM, in base alla massa acale del campione (relativa allo spessore) e alle proprietà viscoelastiche. Sotto la linea blu si trova il regime di Sauerbrey, dove viene calcolato solo lo spessore del campione. Per la regione centrale, è possibile calcolare le proprietà di massa e viscoelastica del campione. Nel regime sfuso in alto a sinistra del terreno, è possibile ottenere informazioni viscoelastiche, ma gli esperimenti non sono più sensibili allo spessore del campione. In alto a destra, il regime sovraumidito indica che il campione è troppo spesso per poter eseguire una misurazione QCM. Nella trama, si assume una relazione lineare tra l'angolo di fase viscoelastico alla terza armonica e il registro della grandezza del modulo di taglio complesso (linea verde in Figura 6). Il regime di massa è definito come la regione in cui lo spessore è più del doppio della lunghezza del decadimento dell'onda di taglio. Il regime di Sauerbrey è definito come la regione in cui la regione in cui la regione in cui la regione in cui laregione è diversa da meno di 10 Hz e il regime sovraumido è il regime incui5 è più grande di 20.000 Hz (D5 > 1600 ppm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma di flusso dei passaggi principali all'interno di una misurazione QCM. Schema di un esperimento QCM-'o QCM-D. Il diagramma nella prima fase è un sensore QCM (grigio) con gli elettrodi d'oro (oro) e la pellicola sopra il sensore (viola), con le diverse tecniche utilizzate per applicare una pellicola alla superficie del sensore. Viene indicato lo spessore della pellicola, d, Il secondo passaggio evidenzia i dati dei protocolli sperimentali QCM-z (in alto) e QCM-D (in basso). Il terzo passaggio è dove si determina l'area in cui il campione può essere analizzato. Il quarto passaggio mostra i dati risultanti dall'area di analisi specificata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: "Buono" e "Cattivo" dati QCM-D per l'adsorbimento collagene. Grafici della frequenza e dei fattori di smorzamento per l'esperimento di adsorbimento del collagene. (A) Turni di frequenza equilibrati, (B) Spostamenti di fattori di smorzamento bilanciati, (C) Turni di frequenza non bilanciati e (D) turni di fattori di smorzamento non bilanciati. In (B) e (D), lo spostamento del fattore di smorzamento viene tracciato come fattore di dissipazione, D, e la larghezza di banda, ,poiché lo stesso parametro viene misurato da entrambi i turni. La frequenza e gli spostamenti gamma sono normalizzati alle rispettive armoniche (n - 3 o 5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi viscoelastica del collagene utilizzando un modello di legge di potenza. La massa areale (A) (B) complesso modulo di taglio, e (C) angolo di fase viscoelastica per l'esperimento di adsorbimento collagene. I primi 10 h mostrano la fase principale di adsorbimento del collagene sulla superficie del sensore, con il periodo compreso tra 10 e 20 che mostra la fase di equilibratura prima che il lavaggio tampone venga eseguito a 20 ore. Le barre di errore rappresentano incertezze nei calcoli per le proprietà di spessore e viscoelastica, supponendo un errore nel formato " "e "" all'1% di " . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi viscoelastica del collagene utilizzando un modello di legge di potenza e un modello software commerciale. La massa areale (A) (B) complesso modulo di taglio, e (C) angolo di fase viscoelastica per l'esperimento di adsorbimento collagene. I valori di , sono determinati con lo script Python utilizzando ivaloridi X dei dati sperimentali, mentre i valori D vengono convertiti dai risultati del modello viscoelastico del software commerciale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Trama Van Gurp-Palmen modificata del collagene e dati PSS:PDADMA. Un grafico dell'angolo di fase viscoelastico e del complesso modulo di taglio sulla gamma generale di campioni misurabili utilizzando QCM. La linea verde indica la relazione lineare tra le due proprietà che è stata assunta nello sviluppo della figura 1. I dati relativi al complesso polielettroltico PSS:PDADMA (PEC) vengono ristampati con il permesso di Sadman et al. 22, copyright 2017 American Chemical Society. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Molarity della soluzione (M) | mL di 3 M KBr |
| 0.1 | 1 |
| 0.2 | 1.1 |
| 0.3 | 1.2 |
| 0.4 | 1.3 |
| 0.5 | 1.4 |
| 0.6 | 1.5 |
| 0.7 | 1.6 |
| 0.8 | 1.8 |
| 0.9 | 1.9 |
| 1 | 2 |
Tabella 1: Incrementi di molar per l'esperimento di gonfiore PEC. La quantità (in mL) di 3 M di bromuro di potassio necessaria per aumentare la molarità della soluzione dell'acqua di 0,1 M per l'esperimento di gonfiore.
File supplementari: Codice Python. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
I risultati di adsorbimenti collagene coprono i regimi di Sauerbrey e viscoelastica. Tracciando gli spostamenti di frequenza normalizzati al numero armonico corrispondente, osserviamo che il limite di Sauerbrey è valido per circa le prime 2 h della misurazione. Con l'aderente crescente di massa al sensore, tuttavia, i cambi di frequenza normalizzati per la terza e la quinta armonica iniziano a deviare l'una dall'altra(t > 2 h), indicando una capacità di determinare le proprietà viscoelastiche della pellicola adsorbitante.
Un confronto diretto tra i risultati della modellazione viscoelastica del software e la modellazione della legge di potenza del gruppo Shull indica una notevole differenza nelle proprietà calcolate del materiale. Nel corso della misurazione, i dati modellati viscoelastici provenienti da software commerciale rappresentavano uno strato più spesso e morbido con un modulo di taglio complesso inferiore (Figura 5). Le differenze nelle proprietà viscoelastiche tra questi modelli sono dovute alle ipotesi fatte nei calcoli per ogni sistema. Una differenza riguarda un presupposto che deve essere fatto circa la dipendenza di frequenza delle proprietà viscoelastiche. È necessario fare alcune ipotesi perché la risposta di frequenza in una determinata armonica (n - 3, per esempio), dipende da tre parametri (pd, Gn.3 p,n. 3) ma vengono misurate solo due quantità indipendenti (.. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A causa di questa discrepanza, è necessario ottenere almeno una quantità aggiuntiva (spostamento di frequenza o dissipazione) da un'armonica aggiuntiva senza aggiungere un'ulteriore incognita al problema. Lo spessore e la densità ovviamente non dipendono dalla frequenza, ma il complesso modulo di taglio lo fa. L'approccio della legge di potere si basa sul fatto che su un piccolo intervallo di frequenza, possiamo supporre che l'angolo di fase è costante, con una risposta reologica equivalente a un materiale con un comportamento di diritto di potere su una gamma molto più ampia di frequenze15,16,18. L'esponente della legge di potere, , non è un parametro regolabile, ma è uguale a / 90 gradi, con in gradi. Con l'ipotesi di diritto di potere, abbiamo3 -5 e 
. Per la modellazione quantitativa viscoelastica, il modello di diritto di potenza rappresenta la migliore combinazione di precisione e semplicità, dando risultati più affidabili rispetto ad altri approcci comuni, tra cui il modello Kelvin-Voigt, dove si presume che G' sia indipendente da n e G" si presume aumenti linearmente con n.
Considerando la configurazione sperimentale per i dati PSS:PDADMA, sono stati eseguiti esperimenti in regime di massa e viscoelastico per la generazione dei dati nella Figura 6. Il protocollo descrive in dettaglio la preparazione del campione per gli esperimenti sul regime viscoelastico, con gli esperimenti di massa eseguiti osservando la risposta del sensore a una soluzione con PEC, sale e acqua presenti. Al fine di preparare i campioni per gli esperimenti del regime viscoelastico, è importante comprendere la gamma di spessore bersaglio per rimanere all'interno del regime viscoelastico ed evitare di sovraumidizzare la risposta del sensore. Per il sistema PSS:PDADMA, questa gamma ideale è di 0,8 - 1,6 m. Dal momento che il PEC inizialmente aumenta di spessore del 45-50% quando si gonfia in acqua, questo comportamento doveva essere rappresentato negli spessori della pellicola iniziale, rendendo un intervallo di destinazione per lo spessore del campione iniziale di 0,45 - 0,65 m. Avere una buona conoscenza di come si comporterà il film durante l'esperimento è importante per comprendere la migliore gamma di spessore di destinazione, nonché il metodo migliore per la preparazione del campione18.
Indipendentemente dall'esatta configurazione strumentale, queste procedure dimostrano l'importanza di considerare la preparazione dei campioni prima di iniziare un esperimento QCM. Lo spessore del layer applicato determina le informazioni che possono essere estratte dai dati misurati. Prima di iniziare qualsiasi misurazione, il ricercatore deve considerare quali informazioni sono più necessarie dall'esperimento e comprendere i limiti della tecnica. Una comprensione delle proprietà viscoelastiche della pellicola è utile per determinare lo spessore del campione corretto e il metodo di preparazione. Per i campioni appropriati, sia gli strumenti QCM di dominio temporale che di dominio di frequenza possono essere utilizzati con competenza per raccogliere dati accurati per un'ampia gamma di applicazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. ed E.S. riconoscono il supporto della NSF (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
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