Summary
Микробаланс кварцевого кристалла может обеспечить точные свойства массы и вязкости для пленок в микрон или субмикроне, что актуально для исследований в области биомедицинского и экологического зондирования, покрытий и полимерной науки. Толщина образца влияет на информацию, которую можно получить из материала при контакте с датчиком.
Abstract
В этом исследовании мы представляем различные примеры того, как тонкая пленка подготовки к экспериментам микробаланса кварцевого кристалла информирует о соответствующем моделировании данных и определяет, какие свойства пленки можно количественно оценивать. Микробаланс кварцевого кристалла предлагает уникально чувствительную платформу для измерения тонких изменений массы и/или механических свойств прикладной пленки, наблюдая изменения в механическом резонансе кристалла кварца, колеблющихся на высокой частоте. Преимущества этого подхода включают его экспериментальную универсальность, способность изучать изменения свойств в широком диапазоне экспериментальных временных длин и использование небольших размеров выборки. Мы демонстрируем, что, основываясь на толщине и модуле сдвига слоя, отложенном на датчике, мы можем получить различную информацию из материала. Здесь эта концепция специально используется для отображения экспериментальных параметров, приводящих к массе и вязким вычислениям адсорбированного коллагена на золотых и полиэлектролитных комплексах во время отеков в зависимости от концентрации соли.
Introduction
Микробаланс кварцевого кристалла (ККМ) использует пьезоэлектрический эффект кварцевого кристалла для мониторинга его резонансной частоты, которая зависит от массы, прилипшой к поверхности. Техника сравнивает резонансную частоту и пропускную способность датчика кристалла кварца AT cut (обычно в диапазоне 5 МГц)1 в воздухе или жидкости с частотой и пропускной способностью датчика после осаждения пленки. Есть несколько преимуществ для использования ЦКМ для изучения тонкой пленки свойства и интерфейсы, в том числе высокая чувствительность к массе и, возможно, вязкоупругой изменения свойства (в зависимости от единообразия образца и толщины), способность выполнять исследования на situ2, и способность зондировать гораздо короче реологической шкале времени, чем традиционные сдвига реологии или динамического механического анализа (DMA). Прощупывание короткой реологической шкалы времени позволяет наблюдать, как реакция в этом временном масштабе меняется как в течение чрезвычайно коротких (мс)3 и длинных (лет) продолжительностей4. Эта возможность полезна для изучения различных кинетических процессов, а также является полезным продолжением традиционных реометрических методов5,6.
Высокая чувствительность ККМ также привела к его интенсивному использованию в биологических приложениях, изучающих фундаментальные взаимодействия крайне малых биомолекул. Поверхность датчика без покрытия или функционализированного датчика может быть использована для исследования адсорбции белка; более далее, биозондирование через сложные события связывания между ферментами, антителами и аптамерсами могут быть исследованы на основе изменений в массе7,8,9. Например, метод был использован, чтобы понять преобразование пузырьков в планарный липидный двухслойный как двухэтапный процесс адсорбции жидкостных пузырьков к жесткой структуре, наблюдая коррелирующие изменения в частоте и вязкости10. В последние годы, ККМ дополнительно предложил надежную платформу для мониторинга доставки наркотиков пузырьков или наночастиц11. На стыке материаловедения и молекулярной и клеточной биологии, мы можем использовать ККМ для выяснения ключевых взаимодействий между материалами и биологически активными компонентами, такими как белки, нуклеиновые кислоты, липосомы и клетки. Например, экстрассирование белка к биоматериалу опосредует вниз по течению клеточных реакций, таких как воспаление и часто используется в качестве положительного индикатора биосовместимости, в то время как в других случаях внеклеточного белка вложения к покрытиям, что интерфейс с кровью может вызвать опасные свертывания в сосудах12,13. Таким образом, ККМ может быть использован в качестве инструмента для выбора оптимальных кандидатов для различных нужд.
Два общих подхода к выполнению экспериментов «CM» собирают аналогичные данные эксперимента: первый подход записывает сдвиг частоты и половину пропускной способности (q) пика проводимости. Второй подход, ККМ с рассеиванием (КМ-Д), фиксирует сдвиг частоты и фактор рассеивания, который прямо пропорционален q через уравнение 1,14
(1)
где D является фактором рассеивания и - частотой. И D, и Q связаны с эффектом демпфирования пленки на датчик, который дает указание на жесткость пленки. В скрипте n обозначается частотный обертон или гармонический, которые являются нечетными резонансными частотами кварцевого датчика (n No 1, 3, 5, 7...). Дальнейшее обсуждение моделей с использованием нескольких гармоник для получения массы и вязкоусмотритенных свойств пленки можно найти в обзоре Johannsmann14 и предыдущие документы из группы Shull15,16,17,18.
Одним из ключевых соображений для подготовки образцов ККМ является то, как применить тонкую пленку на поверхности датчика. Некоторые распространенные методы включают спин покрытие, падение покрытия, падение покрытия, или адсорбции пленки на поверхность датчика во время эксперимента19,20. Для образцов ККМ есть четыре региона: предел ЗСМ, вязкая, режим массового отрезка и перегруженный режим. Для достаточно тонких пленок применяется ограничение Sauerbrey, где сдвиг частоты(яп.) обеспечивает плотность поверхностной массы пленки. В пределах предела Sauerbrey, шкалы сдвига частоты линейно с резонансным гармоническим, n, и изменения в факторе демпфирования (D или q) вообще малы. В этом режиме нет достаточной информации для однозначного определения реологических свойств слоя без дополнительных предположений. Данные в этом режиме используются для расчета плотности массы поверхности (или толщины, если плотность известна априори)пленки. В режиме навалом, где среда в контакте с кристаллом достаточно толстая, эвакуационная волна сдвига распространяется в среду, прежде чем полностью смоченной. В данном году никакой массовой информации не может быть получена с помощью q. Тем не менее, в этом регионе, вязкоэлаусные свойства надежно определяются с помощью комбинациииз 15,18. В режиме навалом, если среда слишком жесткая, пленка будет влажным из резонанса датчика, предотвращая сбор каких-либо достоверных данных из ККМ. Визогусть режима является промежуточным режимом, где пленка достаточно тонкая, чтобы сдвига волна полностью распространяться через пленку, а также иметь надежные значения для демпфирующего фактора. Затем демпфирующий фактор и qмогут быть использованы для определения вязкоэластовых свойств пленки, а также ее массы. Здесь вязкоуэлная свойства дается продуктом плотности и величины сложного модуля сдвига Г. р и угол фазы, данный арктаном(G" / G'). Когда пленки подготовлены в пределе Sauerbrey, масса в зоне блока можно сразу вычислить на основе уравнения Sauerbrey показанного под21,
(2)
где qn является изменение резонансной частоты, n является подтекстом интереса,1 является резонансной частотой датчика, м/ А является массой на область пленки, и q является акустическим импедансом кварца, который для AT сократить кварц составляет 8,84 х 10кг / м2с. Визогусть режима наиболее подходит для изучения полимерных пленок, а предел навалом полезен для изучения вязких полимерных22 или белковых растворов16. Различные режимы зависят от свойств материала, представляющих интерес, с оптимальной толщиной для полной вязкости и массовой характеристики обычно увеличивается с жесткостью пленки. На рисунке 1 описаны четыре региона в отношении плотности пленки, сложных модуля сдвига и угла фазы, где мы взяли на себя определенную связь между углом фазы и жесткостью пленки, которая, как было показано, имеет отношение к материалам этого типа. Многие пленки, представляющие практический интерес, слишком толстые для изучения вязких свойств с ККМ, таких как некоторые биопленки, где толщины находятся на порядок от десятков до сотен микрон23. Такие толстые пленки, как правило, не подходят для изучения с помощью ККМ, но могут быть измерены с помощью гораздо более низкой частоты резонансов (таких, как торсионные резонансы)23, что позволяет сдвига волна распространяться дальше в фильм.
Чтобы определить, какой режим имеет отношение к данной выборке , важно пониматьпараметр d / n, который представляет собой отношение толщины пленки(d) к длине волны сдвига механического колебания кристаллического датчика кварца(No n)15,16,18. Идеальный вязкивый режим d /n n 0.05 - 0.218, где значения ниже 0.05 находятся в пределах предела Sauerbrey и значения выше 0.2 приближаются к режиму навалом. Более строгое описание d /n предоставляется в другом месте15,18, но это количественный параметр, очерчивающих предел Sauerbrey и вязкоупругой предел. Программы анализа, используемые ниже, обеспечивают этот параметр напрямую.
Есть некоторые дополнительные ограничения для анализа тонких пленок с ККМ. Расчеты Sauerbrey и вязкости предполагают, что пленка однородна как по всей толщине пленки, так и боковой по всей поверхности электрода ККМ. Хотя это предположение делает его сложным для изучения фильмов, которые имеют пустоты или наполнители настоящее время, там были некоторые исследования ККМ в пленки, состоящие из привитых наночастиц6. Если неоднородности невелики по сравнению с общей толщиной пленки, надежные вязкоэласные свойства композитной системы все еще могут быть получены. Для более неоднородных систем значения, полученные в результате вискоупругового анализа, всегда следует рассматривать с большой осторожностью. В идеале результаты, полученные от систем с неизвестной неоднородностью, должны быть проверены против систем, которые, как известно, однородны. Таков подход, который мы взяли в примере системы, описанной в настоящем документе.
Важным моментом, который мы иллюстрируем в настоящем документе, является точное соответствие между измерениями, выполненными в области частоты (где сообщается о Х) и экспериментами домена времени (где сообщается D). Описаны результаты двух различных экспериментов, один тайм и один домен частоты, каждый из которых связан с другой, но концептуально связанной модельной системой. Первая система является простым примером прикрепления коллагена к датчику, чтобы проиллюстрировать репрезентативной связывающей кинетики и уравновешчастия адсорбции с течением времени во время измерения домена времени . Коллаген является наиболее распространенным белком в организме, известный своей универсальностью связывающего поведения и морфологии. Коллагенный раствор, используемый здесь, не требует дополнительной функционализации золотой поверхности датчика, чтобы вызвать адсорбцию9. Вторая экспериментальная система представляет собой полиэлектролитный комплекс (ПЭК), состоящий из анионического полистирола сульфоната (PSS) и катионного поли (diallyldimethylammonium) (PDADMA), подготовленного таким же образом, как Sadman et al.22. Эти материалы набухают и становятся мягкими в соли (KBr в данном случае) решений, предлагая простую платформу для изучения полимерной механики с использованием подхода домена частоты (КМЗ-З). Для каждого протокола процесс подготовки, взятия и анализа измерения показан на рисунке 2. Схема показывает, что основное различие между подходами «CM-» и «CM-D» заключается в этапе сбора данных и приборах, используемых в эксперименте. Все упомянутые методы подготовки выборки совместимы с обоими подходами, и каждый подход может анализировать образцы в трех регионах, изображенных на рисунке 1.
Наши данные показывают, что подготовка образцов, будь то сенсорное покрытие до или во время измерения, диктует способность извлекать вязкоэласные свойства системы. Правильно спроектируя ранние этапы эксперимента, мы можем определить, какую информацию мы можем точно собрать на этапе анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Адсорпция коллагена «CM-D»
1. Подготовка образца и предварительная очистка датчиков
- Приготовьте 20 мл ацетатного буфера 0,1 М, регулируя рН с HCl и NaOH по мере необходимости для достижения рН 5,6.
- Добавьте раствор коллагена хвоста крысы к 20 mL буфера ацетата под стерильные условия к окончательной концентрации 10 мкг/мл.
- Очистите датчик кварца с золотым покрытием, чтобы удалить органический и биологический материал25,26.
- Поместите активную сторону датчика вверх в УФ/Озон камеру и обработайте поверхность в течение примерно 10 минут.
- Тепло 5:1:1 смесь деионированной воды (дГ2O), аммиака (25%) и перекись водорода (30%) до 75 градусов по Цельсию. Поместите датчик в раствор на 5 мин.
- Промыть датчик dH2O и высушить потоком азотного газа.
- Поместите активную сторону датчика вверх в УФ/Озон камеру и обработайте поверхность в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура очистки должна быть немедленно выполнена перед измерением, чтобы свести к минимуму загрязнение окружающей среды на поверхности датчика.
2. Приобретение данных по измерению CM-D
- Включите все необходимое оборудование для измерения, включая насос, блок электроники и компьютерное программное обеспечение.
- Удалите модуль потока с камерной платформы и отвинтите большие винты большого пальца, чтобы открыть модуль.
- Если датчик был оставлен после первоначальной очистки (шаги 1.3.1-1.3.4), промыть датчик деионизированной водой (dH2O) и высушить потоком азотного газа, чтобы не было загрязняющих веществ на поверхности.
- Установите датчик в модуле потока на открытом O-кольцо, сначала высыхая область потоком азотного газа и проверяя, что O-кольцо лежит плоско. Датчик должен быть помещен с активной стороной поверхности вниз и якорно-образным электродом, ориентированным на маркер в модуле потока.
- Поверните винты большого пальца, чтобы запечатать модуль потока и заменить его на камерной платформе. Прикрепите любые необходимые трубки насоса PTFE к модулю потока и внешнему насосу.
- Используя соответствующее программное обеспечение компьютера, установите температуру модуля потока до 37 градусов по Цельсию. Мониторинг изменяющейся температуры в течение 10-15 мин, чтобы убедиться, что она уравновешивает сяпоните при желаемом значении.
- Найдите начальные резонансные частоты датчика. Если какие-либо резонансные частоты не найдены программным обеспечением, убедитесь, что модуль потока правильно расположен на платформе камеры или повторно смонтировать датчик в модуле потока, чтобы убедиться, что он центрирован и делает надлежащий электрический контакт.
- Поместите трубку в входе насоса в 1x фосфат-буфера соливого раствора (PBS) раствор. Запустите поток внешнего насоса на уровне 25 л/мин и визуально осмотрите трубку, чтобы убедиться, что жидкость течет через трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поток жидкости может быть легче увидеть, на мгновение увеличивая скорость потока жидкости до 100 л/мин или больше. Если жидкость, как представляется, не движется через трубку, это, скорее всего, что две части потока модуль не создает надлежащего уплотнения. Попробуйте затянуть винты большого пальца, затягивая разъемы труб к входе и розетке, или повторномонтаж датчика, чтобы убедиться, что O-кольцо является плоским и по центру. - Разрешить поток жидкости 1x PBS через модуль потока, по крайней мере 15 мин, чтобы правильно уравновесить.
- Начало измерения в компьютерном программном обеспечении, чтобы начать сбор данных. Мониторинг частоты и значений рассеивания в течение по крайней мере 5 минут, чтобы обеспечить стабильный базовый участок.
- Остановите насос и переместите впускные трубки в буферный раствор коллаген-ацетат ацетат ацетата и возобновите поток жидкости. Обратите внимание на время этого события для последующего анализа.
- Разрешить новым значениям частоты и рассеивания уравновесить к стабильному значению. Здесь мы ожидаем, что эта стабилизация произойдет после 8-12 ч.
- Остановите насос, переместите впускные трубки обратно в раствор 1x PBS и возобновите поток жидкости. Обратите внимание на время этого события для последующего анализа.
- Разрешить новым значениям частоты и рассеивания уравновесить к стабильному значению. Здесь эта стабилизация происходит через 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.13 и 2.14 могут быть повторены для каждого нового периода потока жидкости в более строгих экспериментах с большим количеством этапов. - Прекратите сбор данных измерения и сохраните данные.
- Очистите и разобрать оборудование ККМ.
- Увеличьте скорость потока жидкости внешнего насоса до 500 л/мин или больше и поместите впускные трубки в раствор 2% раствора очистки Hellmanex в течение по крайней мере 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для других экспериментов, если дальнейший анализ датчика желательно, удалить датчик до шага 2.16.1 и поместить другой датчик очистки в модуле. - Остановите насос и переместите входе труб на dH2O, и возобновить поток жидкости для дальнейшего промывки системы, по крайней мере 20 мин.
- Остановите поток жидкости и удалите датчик из модуля потока. Сухие датчик и внутри потока модуля с потоком азотного газа. Выключите компьютерное программное обеспечение, блок электроники и перистальтический насос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Датчики с золотым покрытием могут быть правильно очищены, как подробно описано в шагах 1.3.1-1.3.4, и повторно использованы для нескольких измерений. Показания о том, что датчик больше не может быть использован для надежных измерений, могут включать, но не ограничиваются большой изменчивостью первоначальных резонансных частот и значительными заносами в базовых измерениях с буферным потоком. Данные могут быть открыты и проанализированы в предпочтительном программном обеспечении, в том числе предоставленных компаниями, которые специализируются на оборудовании «CM-D».
- Увеличьте скорость потока жидкости внешнего насоса до 500 л/мин или больше и поместите впускные трубки в раствор 2% раствора очистки Hellmanex в течение по крайней мере 20 мин.
Полиэлектролитный комплекс ЗКМ
3. Подготовка образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент был проведен с использованием программы MATLAB, разработанной в рамках исследовательской группы Shull для сбора и анализа данных.
- Во-первых, положение голого кристаллического датчика кварца в держатель образца подключен к векторной сети анализатор и компьютер. Включите анализатор, чтобы применить колебационное напряжение к датчику, и собрать спектр эталонной проводимости для датчика в воздухе.
- Погрузите держатель образца в безгубый стакан 100 мл, наполненный дистиллированной водой, и соберите эталонный спектр проводимости для голого датчика в воде.
- Подготовьте раствор бромистого калия 0,5 М (KBr).
- Растворите 1,79 г KBr в 30 мл дистиллированной воды. Встряхните до растворения.
- Вставьте небольшую кремниевую пластину в раствор KBr под углом, чтобы создать слайд для кварцевого датчика во время шага аннулирования, чтобы пленка не сходит с датчика.
- Подготовьте датчик для спинового покрытия.
- Установите параметры спин-шерсти до 10 000 об/мин, 8000 ускорения и 5 с.
- Вставьте датчик на спин-шуф и включите вакуум.
- Обложка поверхности датчика с этанолом и запустить спин пальто для очистки поверхности датчика.
- Добавьте УИК (PSS:PDADMA, подготовленный так же, как подробно описано в Sadman etal. 22) к поверхности датчика.
- Если комплекс находится в двух фазах (полимер богатых и полимерных бедных), медленно вставьте трубу в раствор. Эвакуировать трубу, дуя пузырьки при перемещении трубы в плотную фазу богатых полимерами.
- Выпустив пару пузырьков в фазе богатых полимерами, нарисуйте 0,5-0,75 мл полимерного раствора в трубу. Поддержание давления на лампу трубы, чтобы не позволить полимеру плохой фазы войти в трубу, вытащить трубу из раствора.
- Протрите внешнюю сторону трубы с помощью Кимвайпа. Добавьте достаточное количество раствора dropwise на поверхность кварцевого датчика, чтобы полностью покрыть поверхность. Убедитесь, что на поверхности датчика нет видимых пузырьков в растворе.
- Спин пальто образца УИК и сразу же погрузить датчик в раствор 0,5 М KBr для предотвращения кристаллизации соли на пленке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг иногда трудно координировать. Отпустите датчик чуть выше решения KBr для достижения наилучших результатов. - Разрешить фильм anneal, по крайней мере 12 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства выполнения эксперимента, подготовить шаг 4 вечером и позволить фильму anneal ночь.
4. Измерение пленки в воздухе и воде
- Перенесите датчик в стакан, наполненный дистиллированной водой, чтобы удалить избыток KBr из пленки и задней стороны датчика. Оставьте датчик в растворе на 30-60 мин.
- Произмерите пленку в воздухе. Ссылка на голый датчик в воздухе. Разрешить данные пленки уравновесить.
- Вставьте сушеный сульфат кальция в 100 мл безlip стакан и измерить полностью сухой толщины пленки. Удалить сульфат кальция из стакана и промыть стакан дистиллированной водой.
- Заполните 100 мл безгубый стакан с 30 мл дистиллированной воды. Вставьте перемешивание бар для обеспечения воды циркулирует вокруг пленки. Измерьте пленку в воде в течение 30-45 мин или до тех пор, пока данные пленки не будут уравновешиваются. Ссылка на голый датчик в воде.
- Приготовьте раствор 15 мл 3 М КБр в дистиллированной воде. Измерьте 5,35 г KBr в цилиндр и заполните до 15 мл дистиллированной водой. Вихрь до растворения.
- Добавьте раствор KBr в стакан с дистиллированной водой с шагом 0,1 М. В таблице 1 излагаются приращения 0,1 м в mL из 3 M KBr решения. Лицо пленки от того, где раствор KBr добавляется в воду, так что пленка не растворяется. Убедитесь, что система уравновесилась, прежде чем добавить еще одно дополнение решения KBr.
- После того, как все данные были получены, удалите пленку с держателя и поместите в стакан дистиллированной воды. Разрешить соль, чтобы оставить пленку (30-60 мин) и просушить пленку.
- Чтобы очистить пленку УИК от датчика, добавьте KBr в стакан и аккуратно закружите раствор. Дайте посидеть 5-10 мин. Повторите этот процесс 2-3 раза, затем промойте датчик дистиллированной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик может быть очищен и повторно использован, если ответ от датчика по-прежнему хорошо. Это может быть проверено датчиком, имеющим небольшие абсолютные показания пропускной способности для гармоник, представляющих интерес (100 Гц).
5. Анализ данных
- Откройте анализ данных MATLAB, созданный Sadman(https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Откройте пленку в файле данных воздуха, выбрав "Нагрузка ККМ".
ПРИМЕЧАНИЕ: Группа Shull разработала аналогичный графический интерфейс Python для сбора и анализа данных для ЦКМ(https://github.com/shullgroup/rheoQCM). Часть кода анализа содержится в дополнительной информации как для анализа данных, так и для генерации цифр в настоящем документе. - Выберите нужный расчет (или 3,5,3 или 3,5,5), гамма, и фильм в воздухе иконки. Нажмите Участок ККМ.
- Определите толщину сухой пленки, используя наиболее уравновешённые точки данных (обычно последнюю точку данных) в ходе эксперимента. Запишите это значение.
- Откройте пленку в файле данных воды. Выберите те же параметры, что и в шаге 5.2, за исключением пленки в воде вместо пленки в воздухе.
- После каждого шага равновесия отек эксперимента, определить толщину пленки, сложный модуль сдвига, и вискоэлный угол фазы. Зафиксировать эти значения вместе с ионной прочностью (от 0-1 М с шагом 0,1 м).
- Определить процент отеков как
(3)
где dp толщина пленки от разрешения и dpсухой толщина сухой пленки.
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изменения частоты со временем во время адсорбции белка демонстрируют характерную кривую и плато, показанную на рисунке 3A-B. Первоначальная буферная вымывание 1x PBS по поверхности голой сенсорной поверхности вызывает лишь незначительные изменения в частоте, предлагая устойчивый базовый план, чтобы выступать в качестве эталона для будущих точек данных. Введение коллагена раствор вызывает адсорбцию белка, чтобы начать, наблюдается как устойчивое снижение частоты с течением времени, пока плотность придерживается коллагена плато на стабильной базовой линии(рисунок 3A). Точные значения частоты и массы будут сильно зависеть от чистоты и поверхностной энергии датчика. Учитывая эти параметры, окончательная промывка буфера удаляет лишь небольшое количество несоветого белка с поверхности датчика, что приводит к небольшому увеличению частоты. Мы всегда должны ожидать лишь незначительное снижение массы в этот период, демонстрируя стабильное количество белка, привязанного к датчику(рисунок 3B).
Важность достижения стабильного измерения частоты для каждого периода невозможно переоценить. Незначительные колебания температурных переменных, таких как температура, влажность и концентрация раствора, могут привести к наблюдаемым различиям в исходных данных. Таким образом, изменение этих переменных, по крайней мере 5-10 мин стабильной частоты и измерения фактора рассеивания может исказить точные изменения в частоте и рассеивания. Пример неоптимального набора данных показан на рисунке 3C-D. Здесь же параметры концентрации раствора и скорости потока используются в качестве рисунка A-B,но среда прибора не может уравновеситься перед началом измерения. Естественное заселение колеблющейся частоты датчика происходит одновременно с изменением температуры и концентрации жидкости, маскируя любые потенциальные базовые линии, которые будут выступать в качестве эталона(рисунок 3C). Вместо этого мы вынуждены выбирать среднее значение всего динамического диапазона частот в период, чтобы выступать в качестве эталона. Наконец, поток коллагена не разрешается уравновесить на стабильной массе перед началом окончательной стирки PBS, как видно по все еще изменяющимся сдвигам частоты непосредственно перед тем, как PBS входит в систему. Это действие не влияет на расчеты массы, но не в полной мере характеризует адсорбтивный потенциал белка на датчике(рисунок 3D).
На ранних стадиях эксперимента по адсорбции коллагена, пленка находится в режиме Sauerbrey, указанном значениями q/n, которые не зависят от n (t t lt; 2 ч на рисунке 3). По ходу эксперимента пленка переходит в вязкоуластивный режим, указанный значениями q/n,которые больше не пересекаются(t sgt; 2.5 ч). Признавая это изменение в поведении, данные, полученные в результате коллагенового эксперимента, были проанализированы, чтобы посмотреть на ареальную массу и вискоэлные свойства с помощью двух различных методов. В первом используется скрипт Python, составленный группой Shull. Этот скрипт имеет те же математические основы, что и программное обеспечение для сбора и анализа данных MATLAB, используемое для эксперимента УИК. Он использует модель закона о власти для учета имущественных различий в смежных гармоник15 и предоставляется в дополнительной информации. Второй метод использует значения, определенные из вязкой модели в коммерческом пакете программного обеспечения для расчета массы ареала, сложного модуля сдвига и угла фазы коллагеновой пленки. Вискоэлная модель из этого программного обеспечения сообщает толщину (d), эластичный модуль (я) и вязкость (я). Упругий модуль и вязкость являются элементами модели Кельвина-Фойгта и преобразуются в величину и фазу сложного модуля с помощью следующих выражений:
(4)
(5)
гдеn n no2'n1, где1 является фундаментальной частотой датчика кварца (5 МГц). На рисунке 4 показаны вязкоэластные свойства, определяемые для адсорбции коллагена, рассчитанной на основе значений третьегои пятого гармоник. Рисунок 5 сравнивает свойства с рисунка 4 с свойствами, преобразованными из результатов коммерческого программного обеспечения. Как видно на рисунке 5, коммерческие значения программного обеспечения сообщают фильм, чтобы быть мягче, чем сценарий Python.
Рисунок 6 описывает связь, которая наблюдалась в предыдущих экспериментах кКм3,22, показывающие линейную связь между визоласивным углом фазы и logarithm величины сложного модуля сдвига. Зеленая линия указывает на это линейное отношение, имея конечные точки ньютоновской жидкости, такие как вода (к Г. р- 105Па г/см3 и й 90 "най 3 " 15 МГц) и эластичный твердый или стеклянный полимер (яп. Г. р - 109Па и г / см3 и - 0 евро). Многие полимерные материалы, изученные с использованием ККМ, следуют этой общей эмпирической тенденции, которая была количественно оценена с помощью комплексной системы PSS:PDADMA22. Поскольку УИК подвергается решениям с более высокой концентрацией соли, образец переходит от жесткого, стеклянного образца к более вязким и жидкому; этот спектр свойств падает на зеленую линию. Для целей сравнения свойства, рассчитанные с помощью сценария Python для уравновешванной коллагеновой пленки, также построены на рисунке 6. Взаимоотношения между Г. р и Я, как ожидается, будет одинаковым для обеих систем, учитывая, что обе системы стеклянные полимеры опухшие с водой. Содержание воды в пленке определяет конкретную точку вдоль кривой. Здесь система ПЭК с механическими свойствами, наиболее близкими к коллагеновой системе, соответствует полимеровому раствору 20 вт. Из этого сравнения можно сделать вывод, что концентрация полимера в адсорбционной коллагеновой пленке также близка к 20 вт.%. Этот результат очень полезен, полученный в нашем случае путем сравнения результатов, полученных в результате двух надлежащим образом разработанных экспериментов кСМ. Один из этих экспериментов был временным доменом (ККМ-Д, коллаген), а другой был экспериментом частотного домена (ККМ-З, УИК), но эти типы экспериментов полностью взаимозаменяемы, причем в любом случае протокол был достаточно.
Рисунок 1: Участок Sauerbrey, вязкая, объемные, и overdamped режимов. В сюжете показаны режимы, в которых различные типы информации могут быть получены на основе данных ККМ, основанных на массе ареальных образцов (связанных с толщиной) и вязкоэливных свойствах. Ниже синей линии находится режим Зауэрбрей, где рассчитывается только толщина образца. Для средней области можно рассчитать массу и вязкие свойства образца. В режиме навалом в левом верхнем углу участка можно получить вязкую информацию, но эксперименты уже не чувствительны к толщине образца. В правом верхнем углу, overdamped режим указывает на образец слишком толстый для измерения ККМ, который будет выполнен. В сюжете предполагается линейное отношение между визоласивным углом фазы на третьем гармоническом и бревном величины сложного модуля сдвига (зеленая линия на рисунке 6). Режим навалом определяется как область, где толщина более чем в два раза превышает длину распада волны сдвига. Режим Sauerbrey определяется как регион, где No/ 3 иQ /5 отличаются менее чем на 10 Гц и переутомитый режим режим, где5 больше, чем 20000 Гц(D5 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Диаграмма потока основных шагов в рамках измерения ККМ. Схема эксперимента «CM-» или «CM-D». Диаграмма на первом этапе представляет собой датчик ККМ (серый) с золотыми электродами (золото) и пленкой поверх датчика (фиолетовый), с различными методами, используемыми для нанесения пленки на поверхность датчика. Указывается толщина пленки, d,. На втором этапе освещаются данные экспериментальных протоколов «CM-» (вверху) и «CM-D» (внизу). Третий шаг — это определение региона, в котором можно анализировать образец. На четвертом этапе показаны полученные данные из данного региона анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: "Хороший" и "Плохие" данные кС-D для адсорбции коллагена. Сюжеты частоты и увлажняющих факторов для эксперимента по адсорбции коллагена. (A) Равновесные частотные сдвиги, (B) Сдвиги фактора увлажнения, (C) неравновесные частотные сдвиги и (D) неравновесные изменения фактора увлажнения. В (B) и (D), сдвиг фактора увлажнения построен как фактор рассеивания, D, и пропускная способность, Q, так как тот же параметр измеряется обоими сдвигами. Частота и гамма-сдвиги нормализуются до соответствующих гармоник(n No 3 или 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Вискоэластичный анализ коллагена с использованием модели силового права. (A) ареальная масса, (B) сложный модуля сдвига, и (C) вискозивный угол фазы для эксперимента по адсорбции коллагена. Первые 10 ч показывают основную стадию адсорбции коллагена на поверхности датчика, с периодом между 10 и 20, показывающими стадию равновесия до мытья буфера, выполненной на уровне 20 ч. Бары ошибок представляют неопределенности в расчетах толщины и вискоэляровых свойств, предполагая, что ошибка в qи », равной 1% от q. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Вискоэластичный анализ коллагена с использованием модели силового права и коммерческой модели программного обеспечения. (A) ареальная масса, (B) сложный модуля сдвига, и (C) вискозивный угол фазы для эксперимента по адсорбции коллагена. Значения значения, определяемые со скриптом Python, используютсяиз экспериментальных данных значения «к»и D,в то время как значения D преобразуются из результатов вискоупругой модели из коммерческого программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Модифицированный участок Ван Гурп-Палмен коллагена и данных PSS:PDADMA. Участок визоупругой фазы угол и сложный модуль сдвига над общим диапазоном образцов измеримых с помощью ККМ. Зеленая линия указывает на линейное отношение между двумя свойствами, которое было принято при разработке рисунка 1. Данные полиэлектролитного комплекса PSS:PDADMA (ПЭК) перепечатываются с разрешения Sadman et al. 22, авторское право 2017 Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Молярность решения (M) | мЛ 3 M KBr |
| 0.1 | 1 |
| 0.2 | 1.1 |
| 0.3 | 1.2 |
| 0.4 | 1.3 |
| 0.5 | 1.4 |
| 0.6 | 1.5 |
| 0.7 | 1.6 |
| 0.8 | 1.8 |
| 0.9 | 1.9 |
| 1 | 2 |
Таблица 1: Молярные приращения для эксперимента по отеку УК. Количество (в мЛ) 3 М раствора бромистого калия необходимо для увеличения молярности водного раствора на 0,1 М для отеков эксперимента.
Дополнительные файлы: Python код. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Результаты адсорбции коллагена охватывают режимы Sauerbrey и viscoelastic. Позамыв, что сдвиги частоты нормализуются до соответствующего гармонического числа, мы наблюдаем, что предел Sauerbrey соответствует примерно первым 2 ч измерения. С увеличением массы примыкания к датчику, однако, нормализованные сдвиги частоты для третьего и пятого гармоник начинают отклоняться друг от друга(т йgt; 2 ч), что свидетельствует о способности определять вискоэляровые свойства адсорбированной пленки.
Прямое сравнение результатов вязкоупруго моделирования программного обеспечения и моделирования закона власти из группы Shull указывает на заметную разницу в рассчитанных свойствах материала. В ходе измерения, вязкоупругие моделируемые данные из коммерческого программного обеспечения представляли собой более толстый, более мягче слой с более низким сложным модулем сдвига(рисунок 5). Различия в вязкоэлястичных свойствах между этими моделями обусловлены предположениями, сделанными в расчетах для каждой системы. Одно из различий касается предположения, которое необходимо сделать о частотной зависимости вязкоупругих свойств. Некоторое предположение должно быть сделано, потому что частота реакции на данный гармонический (n No 3, например), зависит от трех параметров(pd, Gno3 р,No 3), но только два независимых количествах(No3 и NoN n n) измеряются. Из-за этого несоответствия, мы должны получить по крайней мере одно дополнительное количество (либо частотное смещение или рассеивание) от дополнительного гармонического без добавления дополнительных неизвестных к проблеме. Толщина и плотность, очевидно, не зависит от частоты, но сложный модуль сдвига делает. Подход закона силы основан на факте что над малым диапазоном частот, мы можем предположить что угол фазы постоянн, с rheological реакцией эквивалентной к материалу с поведением power-law над очень более большим рядом частот15,16,18. Экспонент закона власти, q, не является регулируемым параметром, но равен q / 90 ", с й в градусах. С предположением закона власти, мы имеем 
3 и5 и . Для количественного вязкого моделирования, модель силового права представляет собой наилучшее сочетание точности и простоты, давая более надежные результаты, чем другие общие подходы, в том числе модели Кельвина-Фойгта, где G' предполагается, что она будет независимой от n и G "предполагается увеличить линейно с n.
С учетом экспериментальной настройки данных PSS:PDADMA были проведены эксперименты в объеме и вязкоэлевых режимах для генерации данных на рисунке 6. Протокол подробно образца подготовки к viscoelastic regime экспериментов, с объемных экспериментов, проводимых, глядя на датчик ответ на решение с УИК, соль, и вода настоящее время. Для того, чтобы подготовить образцы для экспериментов вязкости режима, важно понять диапазон толщины цели для пребывания в вязкоэле режима и избежать overdamping ответ датчика. Для системы PSS:PDADMA этот идеальный диапазон составляет 0,8 - 1,6 мкм. Так как УИК первоначально увеличиваеттолоть на 45-50%, когда набухает в воде, это поведение должно было быть учтено в начальной толщине пленки, что делает целевой диапазон для первоначального образца толщины 0,45 - 0,65 мкм. Имея хорошее представление о том, как фильм будет вести себя во время эксперимента важно для понимания лучших целевой диапазон толщины, а также лучший метод для подготовки образца18.
Независимо от точной инструментальной настройки, эти процедуры демонстрируют важность рассмотрения подготовки образцов перед началом эксперимента кКМ. Толщина прикладного слоя определяет информацию, которую можно извлечь из измеренных данных. Перед началом какого-либо измерения исследователь должен рассмотреть, какая информация больше всего необходима в ходе эксперимента, и понять ограничения метода. Понимание вязких свойств пленки полезно при определении правильной толщины образца и метода подготовки. Для соответствующих образцов, как время домена и частоты домена qCM инструменты могут быть умело использованы для сбора точных данных для широкого спектра приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. и E.S. признают поддержку со стороны NSF (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
References
- Marx, K. A. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution - Surface interface. Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).
- Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces. Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).
- Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance. Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).
- Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance. Polymer. 103, 387-396 (2016).
- Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).
- Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs. ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).
- Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance. ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).
- Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
- Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces. ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).
- Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).
- Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices. Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).
- Johannsmann, D. Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).
- Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance. Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).
- Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes. Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).
- Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists' paints. Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).
- Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).
- Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase. Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).
- Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).
- Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
- Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation. Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).
- Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms. Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).
- Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2017).
- Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2015).
- Kern, W. The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology. Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887 (1990).
- Sadman, K. sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze. , (2018).
