Summary
Den Quartz Crystal Microbalance kan ge noggrann massa och viskoelastiska egenskaper för filmer i micron eller submicron sortiment, som är relevant för utredningar inom biomedicinsk och miljö-avkänning, beläggningar och polymer vetenskap. Prov tjockleken påverkar vilken information som kan erhållas från materialet i kontakt med sensorn.
Abstract
I denna studie presenterar vi olika exempel på hur tunn film förberedelse för kvartskristall Microbalance experiment informerar lämplig modellering av data och avgör vilka egenskaper av filmen kan kvantifieras. Den Quartz Crystal Microbalance erbjuder en unikt känslig plattform för att mäta fina förändringar i massa och/eller mekaniska egenskaper hos en tillämpad film genom att observera förändringarna i mekanisk resonans av en kvartskristall oscillerande på hög frekvens. Fördelarna med detta tillvägagångssätt inkluderar dess experimentella mångsidighet, förmåga att studera förändringar i egenskaper över ett brett spektrum av experimentella tidslängder, och användningen av små urvalsstorlekar. Vi visar att, baserat på tjocklek och skjuvning Modulus av skiktet deponeras på sensorn, kan vi få olika information från materialet. Här är detta begrepp speciellt utnyttjas för att Visa experimentella parametrar som resulterar i massa och viskoelastiska beräkningar av adsorberat kollagen på guld och polyelektrolyt komplex under svullnad som en funktion av salt koncentration.
Introduction
Kvartskristall Microbalance (QCM) utnyttjar den piezoelektriska effekten av en kvartskristall för att övervaka dess resonant frekvens, som är beroende av massan anslutit sig till ytan. Tekniken jämför resonant frekvens och bandbredd av en vid cut Quartz Crystal sensor (typiskt i intervallet 5 MHz)1 i luft eller en vätska till frekvens och bandbredd av sensorn efter nedfall av en film. Det finns flera fördelar med att använda QCM för att studera tunnfilms egenskaper och gränssnitt, inklusive hög känslighet för massa och potentiellt till viskoelastiska egenskaps förändringar (beroende på prov enhetlighet och tjocklek), förmågan att utföra studier på plats2, och förmågan att söka en mycket kortare reologiska tidsperiod än traditionell skjuvning reologi eller dynamisk mekanisk analys (DMA). Genom att sondera en kort relogisk tidsskala kan observationen av hur responsen i denna tidsskala förändras både under extremt korta (MS)3 och långa (år) varaktigheter4. Denna förmåga är fördelaktigt för studiet av en mängd olika kinetiska processer och är också en användbar förlängning av traditionella rheometriska tekniker5,6.
Den höga känsligheten hos QCM har också lett till dess tunga användning i biologiska tillämpningar som studerar de grundläggande interaktionerna hos extremt små biomolekyler. En obelagd eller funktionaliserad sensoryta kan användas för att undersöka proteinadsorption; Ytterligare, Avkännings genom komplexa bindande händelser mellan enzymer, antikroppar, och aptamers kan undersökas baserat på förändringar i massan7,8,9. Till exempel har tekniken använts för att förstå omvandlingen av vesikler till en planar lipidbilayer som en två-fas process av adsorption av vätska som innehåller blåsor till en styv struktur genom att observera korrelera förändringar i frekvens och viskoelasticiteten10. Under de senaste åren har QCM dessutom erbjudit en robust plattform för att övervaka läkemedelsleverans genom vesikler eller nanopartiklar11. I skärningspunkten mellan materialteknik och molekylär och cellulär biologi kan vi använda QCM för att belysa viktiga interaktioner mellan material och bioaktiva komponenter som proteiner, nukleinsyror, liposomer och celler. Till exempel, protein adsorption till ett biomaterial förmedlar nedströms cellulära svar såsom inflammation och används ofta som en positiv indikator på biokompatibilitet, medan i andra fall extracellulära protein fastsättning att beläggningar som gränssnitt med blod kan framkalla farlig koagulering i fartyg12,13. QCM kan därför användas som ett verktyg för att välja kandidater som är optimala för olika behov.
Två vanliga metoder för att utföra QCM experiment samla in analoga data från experimentet: den första metoden registrerar frekvens skiftet och halva bandbredden (Γ) av värmeledningsförmåga Peak. Den andra metoden, QCM med försvinnande (QCM-D), registrerar frekvens förskjutningen och avledning faktorn, som är direkt proportionell mot Γ genom ekvation 1,14
1
där D är avledning faktorn och ƒ är frekvensen. Både D och Γ är relaterade till dämpnings effekten som filmen har på sensorn, vilket ger en indikation på styvheten i filmen. Nedsänkt n betecknar frekvens övertonen eller övertoningen, som är kvarts sensorns udda resonansfrekvenser (n = 1, 3, 5, 7...). Vidare diskussion av modeller med hjälp av flera övertoner för att få massa och viskoelastiska egenskaper hos en film kan hittas i en recension av johannsmann14 och tidigare artiklar från Shull Group15,16,17,18.
En viktig faktor för att förbereda QCM-prover är hur man applicerar den tunna filmen på sensorns yta. Några vanliga metoder inkluderar spinn beläggning, DIP beläggning, droppe beläggning, eller adsorption av filmen på sensorn ytan under experimentet19,20. Det finns fyra regioner för QCM-prover: Sauerbrey-gränsen, viskoelastiska regimen, bulksystemet och den överansträngda regimen. För tillräckligt tunt filmar, Sauerbrey begränsar applicerar, var frekvens förskjutningen (Δƒ) ger ytbehandla samlas täthet av filma. Inom Sauerbrey gräns skalor frekvens Skift linjärt med resonant Harmonic, n, och förändringar i Dämpfaktor (D eller Γ) är i allmänhet små. I detta system är tillräcklig information inte tillgänglig för att unikt bestämma de reologiska egenskaperna hos skiktet utan att göra ytterligare antaganden. Data i denna regim används för att beräkna ytan massa densitet (eller tjocklek om densiteten är känd a priori) av filmen. I bulk regim där mediet i kontakt med kristallen är tillräckligt tjock, den försvinnande skjuvning vågen sprider sig till mediet innan de helt dämpas. Här kan ingen massinformation erhållas med Δƒ. Men i denna region bestäms de viskoelastiska egenskaperna tillförlitligt med kombinationen av Δƒ och δγ 15,18. I bulk regimen, om mediet är för stel, kommer filmen att dämpa resonans av sensorn, vilket förhindrar insamling av tillförlitliga data från QCM. Den viskoelastiska regimen är den mellanliggande regim där filmen är tunn nog att ha skjuvvågen fullt propagera genom filmen samt ha pålitliga värden för Dämpningsfaktorn. Dämpningsfaktorn och Δƒ kan sedan användas för att bestämma de viskoelastiska egenskaperna hos filmen samt dess massa. Här ges viskoelastiska egenskaper av produkten av densiteten och omfattningen av komplexa skjuvning modulus | G* | p och fasvinkeln som ges av Φ = ARCTAN (g " / g"). När filmer bereds i Sauerbrey-gränsen kan massan per ytenhet beräknas direkt baserat på den Sauerbrey-ekvation som visas under21.
2
var Δƒn är ändringen i resonanten frekvens, n är övertonen av intresserar, ƒ1 är den resonant frekvensen av avkännaren, Δm / A är samlas per område av filma, och Zq är den akustiska impedansen av kvartar, som för på snittet kvartar är Zq = 8,84 x 106kg / m2s. Den viskoelastiska regimen är lämpligast för studiet av polymerfilmer, och bulkgränsen är användbar för att studera trögflytande polymer22 eller proteinlösningar16. De olika regimerna beror på egenskaperna hos det material av intresse, med optimal tjocklek för full viskoelastiska och massa karakterisering allmänhet ökar med filmen styvhet. Figur 1 beskriver de fyra regionerna med avseende på filtrets ytdensitet, komplexa skjuvmodulus och fasvinkel, där vi har antagit ett specifikt förhållande mellan fasvinkeln och den film styvhet som har visats vara relevant för material av denna typ. Många filmer av praktiskt intresse är för tjocka för att studera viskoelastiska egenskaper med QCM, såsom vissa biofilmer, där tjocklekar är på order av tiotals till hundratals mikrometer23. Sådana tjocka filmer är i allmänhet inte lämpliga för att studera med hjälp av QCM, men kan mätas med hjälp av mycket lägre frekvens resonatorer (såsom vridresonatorer)23, vilket gör att skjuvvågen att propagera längre in i filmen.
För att avgöra vilken regim som är relevant för ett givet QCM-prov är det viktigt att förstå d /λn -parametern, som är förhållandet mellan filmtjockleken (d) och skjuvvåglängden för den mekaniska svängningen i kvartskristall sensorn (λn)15,16,18. Den ideala viskoelastiska regimen är d /λn = 0,05-0,218, där värden under 0,05 ligger inom sauerbrey-gränsen och värdena över 0,2 närmar sig bulksystemet. En mer rigorös Beskrivning av d /λn ges på andra ställen15,18, men det är en kvantitativ parameter som avgränsningen av Sauerbrey-gränsen och viskoelastiska gränsen. De analysprogram som används nedan ger den här parametern direkt.
Det finns några ytterligare begränsningar för att analysera tunna filmer med QCM. Den Sauerbrey och viskoelastiska beräkningar förutsätter att filmen är homogen både under hela filmtjockleken och sidled över elektrod ytan av QCM. Även om detta antagande gör det svårt att studera filmer som har tomrum eller fyllmedel närvarande, har det förekommit några QCM utredningar i filmer som består av ympade nanopartiklar6. Om heterolikteterna är små jämfört med den totala filmtjockleken, kan tillförlitliga viskoelastiska egenskaper hos det sammansatta systemet fortfarande erhållas. För mer heterogena system, värden som erhålls från en viskoelastiska analys bör alltid ses med stor försiktighet. De resultat som erhålls från system med okänd heterogenitet bör helst valideras mot system som är kända för att vara homogena. Detta är den strategi som vi har tagit i det exempel system som beskrivs i detta dokument.
En viktig punkt som vi illustrerar i detta dokument är den exakta överensstämmelsen mellan QCM mätningar görs i frekvensdomänen (där Γ rapporteras) och tidsdomän experiment (där D rapporteras). Resultaten från två olika QCM-experiment, en tidsdomän och en frekvens domän, beskrivs, var och en med ett annat men begreppsmässigt relaterat modellsystem. Det första systemet är ett enkelt exempel på kollagen infästning till sensorn för att illustrera representativ bindningskinetik och jämvikt av adsorption över tiden under en tidsdomän (QCM-D) mätning. Kollagen är det mest förekommande proteinet i kroppen, känd för sin mångsidighet av bindande beteenden och morfologi. Den kollagen lösning som används här kräver inte ytterligare funktionalisering av sensorns guld yta för att inducera adsorption9. Det andra experimentella systemet är ett polyelektrolytkomplex (PEC) som består av anjoniskt polystyrensulfonat (PSS) och katjoniska poly (diallyldimetylammonium) (PDADMA) som bereds på samma sätt som Sadman m.22. Dessa material sväller och blir mjuka i salt (KBr i detta fall) lösningar, som erbjuder en enkel plattform för att studera polymermekanik med hjälp av en frekvens domän strategi (QCM-Z). För varje protokoll visas processen att förbereda, ta och analysera en mätning i figur 2. Den schematiska visar att den största skillnaden mellan QCM-Z och QCM-D-metoder är i datainsamlings steget och instrumenteringen som används i experimentet. Alla de nämnda prov berednings teknikerna är förenliga med båda metoderna, och varje metod kan analysera prover i de tre regioner som avbildas i figur 1.
Våra data visar att beredningen av prover, vare sig genom sensor beläggning före eller under en mätning, dikterar förmågan att extrahera viskoelastiska egenskaper hos ett system. Genom att utforma de tidiga stadierna i ett experiment på lämpligt sätt kan vi avgöra vilken information vi kan samla in exakt under analys steget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
QCM-D kollagen adsorption
1. provberedning och sensor för rengöring
- Förbered 20 mL 0,1 M acetatbuffert, justera pH med HCl och NaOH som behövs för att uppnå pH = 5,6.
- Tillsätt rått svans kollagen lösning till 20 mL acetatbuffert under sterila förhållanden till en slutlig koncentration av 10 μg/mL.
- Rengör den guldbelagda kvarts sensorn för att avlägsna organiskt och biologiskt material25,26.
- Placera sensorn aktiv sida upp i en UV/ozon kammare och behandla ytan i ca 10 min.
- Värm en 5:1:1 blandning av avjoniserat vatten (dH2O), ammoniak (25%) och väteperoxid (30%) till 75 ° c. Placera sensorn i lösningen i 5 minuter.
- Skölj sensorn med dH2O och torka med en ström av kvävgas.
- Placera sensorn aktiv sida upp i en UV/ozon kammare och behandla ytan i 10 min.
Anmärkning: rengöringsproceduren bör omedelbart utföras före en mätning för att minimera miljöförorening på sensorns yta.
2. QCM-D mätning data insamling
- Slå på all nödvändig utrustning för att ta en mätning inklusive pump, elektronik enhet och datorprogram.
- Ta bort flödesmodulen från kammar plattformen och skruva loss de stora tumskruvarna för att öppna modulen.
- Om sensorn har utelämnats efter initial rengöring (steg 1.3.1-1.3.4), skölj sensorn med avjoniserat vatten (dH2O) och torka med en ström av kvävgas för att säkerställa att det inte finns några föroreningar på ytan.
- Montera sensorn i flödesmodulen på den exponerade O-ringen, först torka området med en ström av kvävgas och kontrollera att O-ringen ligger plant. Sensorn ska placeras med den aktiva ytan nedåt och ankar-formad elektrod riktad mot markören i flödesmodulen.
- Vrid tumskruvarna för att försegla flödesmodulen och Byt ut den på kammar plattformen. Bifoga alla nödvändiga PTFE pump slangar till flödesmodulen och extern pump.
- Använd lämplig datorprogramvara, Ställ in temperaturen på flödesmodulen till 37 ° c. Övervaka den förändrade temperaturen för 10-15 min för att säkerställa att den jämvikt på önskat värde.
- Hitta sensorns initiala resonansfrekvenser. Om någon resonansfrekvenser inte hittas av programvaran, kontrollera att flödesmodulen är korrekt placerad på kammarens plattform eller montera sensorn i flödesmodulen för att säkerställa att den är centrerad och gör ordentlig elektrisk kontakt.
- Placera inlopps pumpens slangar i lösningen med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Starta det externa pumpflödet vid 25 μL/min och inspektera slangen visuellt för att vara säker på att vätskan rinner genom röret.
Obs: vätskeflödet kan vara lättare att se genom att tillfälligt öka vätskeflödet till 100 μL/min eller högre. Om vätskan inte verkar röra sig genom röret, är det mest troligt att de två delarna av flödesmodulen inte skapar en ordentlig tätning. Försök att dra åt tumskruvarna, åtdragning av slangarna på slangen till inloppet och utloppet, eller återmontera sensorn för att vara säker på att O-ringen är platt och centrerad. - Tillåt vätskeflödet av 1x PBS genom flödesmodulen i minst 15 min för att korrekt jämbrera.
- Starta mätningen i datorprogramvaran för att påbörja datainhämtningen. Övervaka frekvensen och avledning svärdet i minst 5 minuter för att säkerställa en stabil baslinje.
- Stoppa pumpen och flytta inloppsslangen till kollagen-acetat buffertlösning, och återuppta vätskeflödet. Anteckna tiden för den här händelsen för senare analys.
- Låt de nya frekvens-och avledande värdena jämbrera till ett stabilt värde. Här, vi förväntar oss att denna stabilisering sker efter 8-12 h.
- Stoppa pumpen, flytta inloppsslangen tillbaka till 1x PBS lösning, och återuppta vätskeflödet. Anteckna tiden för den här händelsen för senare analys.
- Låt de nya frekvens-och avledande värdena jämbrera till ett stabilt värde. Här, denna stabilisering sker efter 30 min.
Anmärkning: steg 2,13 och 2,14 kan upprepas för varje ny period av vätskeflödet i mer rigorösa experiment med ett större antal stadier. - Avsluta datainhämtningen av mätningen och spara data.
- Rengör och demontera QCM-utrustningen.
- Öka vätskeflödet för den externa pumpen till 500 μL/min eller högre och placera inloppsslangen i en lösning av 2% Hellmanex rengöringslösning i minst 20 min.
Anmärkning: för andra experiment, om ytterligare analys av sensorn önskas, ta bort sensorn före steg 2.16.1 och placera en annan rengörings sensor i modulen. - Stoppa pumpen och flytta inloppsslangen till dH2O, och återuppta vätskeflödet för att ytterligare spola systemet i minst 20 min.
- Stoppa vätskeflödet och ta bort sensorn från flödesmodulen. Torka sensorn och insidan av flödesmodulen med en ström av kvävgas. Stäng av datorprogramvara, elektronik enhet och Peristaltisk pump.
Obs: de guldbelagda sensorerna kan rengöras på rätt sätt, enligt beskrivningen i steg 1.3.1-1.3.4, och återanvändas för flera mätningar. Indikationer på att en sensor inte längre kan återanvändas för tillförlitliga mätningar kan innefatta men är inte begränsade till stora variationer i initiala resonansfrekvenser och betydande drivor i baslinje mätningar med buffertflöde. Data kan öppnas och analyseras i önskad programvara, inklusive de som tillhandahålls av företag som specialiserat sig på QCM-D-utrustning.
- Öka vätskeflödet för den externa pumpen till 500 μL/min eller högre och placera inloppsslangen i en lösning av 2% Hellmanex rengöringslösning i minst 20 min.
QCM polyelektrolyt komplex svullnad
3. provberedning
Obs: detta experiment utfördes med hjälp av ett MATLAB-program som utvecklats inom Shull Research Group för datainsamling och analys.
- Placera först en kal kvartskristall sensor i en provhållare som är ansluten till Vector Network Analyzer och datorn. Slå på analysatorn för att tillämpa en oscillerande spänning till sensorn, och samla en referenconductance spektrum för sensorn i luft.
- Sänk provhållaren i en lipless 100 mL-bägare fylld med destillerat vatten och samla in ett referensconductance-spektrum för den kala sensorn i vatten.
- Bered en 0,5 M lösning av kaliumbromid (KBr).
- Lös upp 1,79 g KBr i 30 mL destillerat vatten. Skaka tills det är upplöst.
- Sätt in en liten kiselskiva i KBr-lösningen i en vinkel för att skapa en bild för kvarts sensorn under glödgningsteckningen för att förhindra att filmen lossnar från sensorn.
- Förbered sensorn för spinn beläggning.
- Ställ in parametrarna för spin coat på 10 000 rpm, 8 000 acceleration och 5 s.
- Sätt in sensorn på spinn bestrykare och slå på dammsugaren.
- Täck ytan på sensorn med etanol och kör spinn bestrykare för att rengöra sensorns yta.
- Lägg till PEC-värdet (PSS: PDADMA som utarbetats på samma sätt som beskrivs i Sadman et al. 22) till sensorns yta.
- Om komplexet är i två faser (polymer rika och polymer fattiga), sakta in Pipettera i lösningen. Evakuera Pipettera genom att blåsa bubblor medan du flyttar Pipettera i tätare polymer rik fas.
- Efter att ha släppt ett par bubblor i polymerrik fas, dra upp 0,5-0,75 mL av polymeren rik lösning i pipet. Bibehålla trycket på Pipettera glödlampa för att inte tillåta polymeren dålig fas för att komma in i Pipettera, dra Pipettera ur lösningen.
- Torka av utsidan av Pipettera med en Kimwipe. Tillsätt tillräckligt med lösning droppvis på ytan av kvarts sensorn för att helt täcka ytan. Se till att det inte finns några synliga bubblor i lösningen på sensorns yta.
- Spin Coat PEC provet och sänk genast sensorn i 0,5 M KBr lösning för att förhindra salt kristallisation på filmen.
Obs: det här steget är ibland svårt att samordna. Släpp sensorn precis ovanför KBr-lösningen för bästa resultat. - Låt filmen glödga i minst 12 h.
Obs: för att underlätta utförandet av experimentet, Förbered steg 4 på kvällen och låt filmen till glödga över natten.
4. mätning av filmen i luft och vatten
- Överför sensorn till en bägare fylld med destillerat vatten för att ta bort överflödigt KBr från filmens och baksidan av sensorn. Lämna sensorn i lösningen för 30-60 min.
- Ta en mätning av filmen i luften. Referens till den kala sensorn i luft. Låt film data att equilibrate.
- Sätt in torkat kalciumsulfat i en 100 mL lipless bägare och mät den helt torra skikttjockleken. Ta bort kalciumsulfat från bägaren och Skölj bägaren med destillerat vatten.
- Fyll den 100 mL lipless bägaren med 30 mL destillerat vatten. Sätt i en rör bar för att säkerställa att vattnet cirkulerar runt filmen. Mät filmen i vatten i ca 30-45 min eller tills filmens data är jämkade. Referens till den kala sensorn i vatten.
- Bered en 15 mL lösning av 3 M KBr i destillerat vatten. Mät 5,35 g KBr i en graderad cylinder och fyll till 15 mL med destillerat vatten. Snurra tills den är upplöst.
- Tillsätt KBr-lösningen till bägaren med destillerat vatten i steg om 0,1 M. I tabell 1 beskrivs 0,1 M-steg i ml 3 M KBR-lösning. Vänd filmen bort från där KBr-lösningen läggs till vattnet så att filmen inte löses upp. Kontrollera att systemet har skakad innan du lägger till ytterligare en tillsats av KBR-lösningen.
- När alla data har erhållits, ta bort filmen från hållaren och placera i en bägare av destillerat vatten. Låt saltet lämna filmen (30-60 min) och lufttorka filmen.
- För att rengöra PEC-filmen från sensorn, tillsätt KBr till bägaren och snurra försiktigt lösningen. Låt sitta i 5-10 min. Upprepa denna process 2-3 gånger, skölj sedan sensorn med destillerat vatten.
Obs: sensorn kan rengöras och återanvändas om responsen från sensorn fortfarande är god. Detta kan kontrolleras av sensorn med små absoluta bandbredd avläsningar för övertoner av intresse (< 100 Hz).
5. analys av data
- Öppna QCM-D dataanalys MATLAB GUI skapad av Sadman (https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Öppna filmen i Air Data File genom att välja "Load QCM".
Obs: den Shull Group har utvecklat ett liknande python GUI för datainsamling och analys för QCM (https://github.com/shullgroup/rheoQCM). En del av analys koden finns i tilläggsinformationen för att både analysera data och generera siffrorna i detta dokument. - Välj önskad beräkning (antingen 3, 5, 3 eller 3, 5, 5), gammaoch film i luft ikoner. Klicka på Rita QCM.
- Bestäm tjockleken på den torra filmen med den mest jämkade datapunkten (vanligtvis den sista datapunkten) från experimentet. Registrera det här värdet.
- Öppna filmen i vatten datafilen. Välj samma parametrar som i steg 5,2, förutom film i vatten istället för film i luft.
- Efter varje jämvikt steg av svullnad experiment, bestämma filmtjockleken, komplexa skjuvning Modulus, och viskoelastiska fasvinkel. Anteckna dessa värden tillsammans med Jon styrkan (från 0-1 M i steg om 0,1 M).
- Bestäm den procentuella svullnad som
3
där DP är filmtjockleken från lösningen och DPDry är den torra filmtjockleken.
3Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förändringarna i frekvens med tiden under proteinadsorption uppvisar en karakteristisk kurva och platå som visas i figur 3a-B. Den initiala bufferttvätten på 1x PBS över den kala sensorns yta inducerar endast försumbara förändringar i frekvens, vilket ger en stadig baslinje för att fungera som referens för framtida datapunkter. Införandet av kollagen lösning orsakar proteinadsorption att börja, observeras som en stadig minskning av frekvensen över tiden, tills tätheten av klibbat kollagen platåer vid en stabil baslinje (figur 3a). Den exakta frekvensen och massan värden kommer att vara mycket beroende av renhet och ytan energi av sensorn. Med tanke på dessa parametrar avlägsnar den slutliga bufferttvätten endast en liten mängd oanslutit protein från sensorns yta, vilket resulterar i en liten ökning av frekvensen. Vi bör alltid förvänta oss en liten minskning av massan under denna period, vilket visar en stabil mängd proteinbundet till sensorn (figur 3B).
Vikten av att uppnå en stabil frekvens mätning för varje period kan inte överskattas. Smärre variationer i miljövariabler som temperatur, fuktighet och lösnings koncentration kan leda till observerbara skillnader i rådata. Därför, ändra dessa variabler innan minst 5-10 min av stabila frekvens och avledning faktor mätningar kan förvränga de exakta förändringarna i frekvens och skingrande. Ett exempel på en suboptimala datauppsättning visas i figur 3C-D. Här används samma lösnings koncentration och flödes parametrar som figur A-B, men instrument miljön tilläts inte att jämvikt innan mätningen påbörjas. Den naturliga sedimentering av sensorns oscillerande frekvens sker samtidigt som en förändrad temperatur-och vätske koncentration, vilket döljer eventuella potentiella basvärden som kommer att fungera som referens (figur 3C). I stället tvingas vi välja ett genomsnitt av hela det dynamiska frekvensområdet under perioden för att fungera som referens. Slutligen är kollagen flödet inte tillåtet att jämvikt på en stabil massa innan du börjar den sista PBS tvätta, som ses av de fortfarande föränderliga frekvens Skift precis innan PBS kommer in i systemet. Denna åtgärd påverkar inte beräkningarna av massan, men inte till fullo karakterisera proteiners adsorptiva potential på sensorn (figur 3D).
Under de tidiga stadierna av kollagen adsorptionsexperimentet, är filmen i Sauerbrey regim, som anges med värden av Δƒ/n som är oberoende av n (t < 2 h i figur 3). Som experiment fortskrider filma flyttningar in i det viskoelastiska styret som indikeras by, värderar av Δƒ/n som inte längre överlappar (t > 2,5 h). Erkänner denna förändring i beteende, de data som erhållits från kollagen experimentet analyserades för att titta på areal massan och viskoelastiska egenskaper med hjälp av två olika metoder. Den första använder ett Python-skript som sammanställts av Shull-gruppen. Det här skriptet har samma matematiska underbyggnad som MATLAB-programmet för datainsamling och analys som används för PEC-experimentet. Den använder en Power Law-modell för att redogöra för egenskaps skillnader vid intilliggande övertoner15 och ges i kompletterande information. Den andra metoden använder värden som bestäms från en viskoelastiska modell i en kommersiell programpaket för att beräkna areal massan, komplexa skjuvning Modulus, och fasvinkel av kollagen filmen. Den viskoelastiska modellen från denna programvara rapporterar tjocklek (d), elastisk modulus (μ), och viskositet (η). Elasticitetsmodulus och viskositet är elementen i en Kelvin-Voigt modell, och omvandlas till omfattningen och fasen av den komplexa Modulus via följande uttryck:
4
5
där ωn = 2 πnƒ1 där ƒ1 är den grundläggande frekvensen för kvarts sensorn (5 MHz). Figur 4 visar viskoelastiska egenskaper bestäms för kollagen adsorption beräknas från δƒn och δDn värden för den tredje och femte harmonisk. Figur 5 jämför egenskaperna från figur 4 med de egenskaper som konverterats från de kommersiella programvaru resultaten. Som framgår i figur 5, den kommersiella programvara värden rapport filmen att vara mjukare än Python-skript.
Figur 6 beskriver en relation som har observerats i tidigare QCM-experiment3,22 som visar ett linjärt förhållande mellan viskoelastiska fasvinkeln och logaritmen av omfattningen av den komplexa skjuvmodulusen. Den gröna linjen indikerar detta linjära förhållande, med ändpunkter av en Newtonsk vätska som vatten (| G* | p = 105pa • g/cm3 och Φ = 90 ° vid ƒ3 = 15 MHz) och en elastisk fast eller glasartad polymer (| G* | p = 109pa • g/cm3 och Φ = 0 °). Många polymermaterial som studeras med QCM följer denna generella empiriska trend, som kvantifierades med hjälp av PSS: PDADMA Complex system22. Eftersom PEC är utsatt för lösningar med högre saltkoncentrationer, provet övergångar från att vara en styv, glasartad prov till att vara mer trögflytande och vätska som; Detta spektrum av egenskaper faller på den gröna linjen. I jämförelsesyfte ritas också de egenskaper som beräknats med hjälp av python-skriptet för den jämställda kollagen filmen i figur 6. Förhållandet mellan | G* | p och Φ förväntas vara densamma för båda systemen, med tanke på att båda systemen är glasartad polymerer svullna med vatten. Vatteninnehållet i filmen bestämmer den specifika punkten längs kurvan. Här motsvarar PEC-systemet med mekaniska egenskaper närmast kollagen systemet en 20 WT% polymerlösning. Vi drar slutsatsen av denna jämförelse att polymerkoncentrationen i adsorberat kollagen filmen är också nära 20 WT .%. Detta resultat är en mycket användbar en, som erhållits i vårt fall genom jämförelse av resultat som erhållits från två lämpligt utformade QCM experiment. Ett av dessa experiment var en tidsdomän (QCM-D, kollagen) experiment och den andra var en frekvens domän (QCM-Z, PEC) experiment, men dessa typer av experiment är helt utbytbara, med antingen protokoll självförsörjande i båda fallen.
Figur 1: Plot av Sauerbrey, viskoelastiska, bulk, och överspända regimer. Handlingen visar regimer där olika typer av information kan erhållas från QCM-data, baserat på provets areal massa (relaterat till tjocklek) och viskoelastiska egenskaper. Under den blå linjen finns Sauerbrey-regimen, där endast provets tjocklek beräknas. För mittregionen kan provets massa-och viskoelastiska egenskaper beräknas. I bulksystemet i övre vänstra delen av observationsområdet kan viskoelastiska uppgifter erhållas, men experimenten är inte längre känsliga för prov tjockleken. I det övre högra, den överansträngda regimen indikerar provet är för tjockt för en QCM-mätning som ska utföras. I handlingen antas ett linjärt förhållande mellan viskoelastiska fasvinkeln vid den tredje övertoningen och stocken av omfattningen av komplexa skjuvmodulus (grön linje i figur 6). Bulksystemet definieras som den region där tjockleken är mer än dubbelt så lång som skjuvvågen. Sauerbrey-regimen definieras som den region där δƒ/3 och δƒ/5 avviker med mindre än 10 Hz och den överdämpade regimen är den regim där Γ5 är större än 20 000 Hz (D5 > 1600 ppm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: flödesdiagram över viktiga steg inom en QCM-mätning. Schematiskt för ett QCM-Z-eller QCM-D-experiment. Diagrammet i det första steget är en QCM-sensor (grå) med guld elektroder (guld) och film ovanpå sensorn (lila), med de olika teknikerna som används för att applicera en film på sensorns yta. Tjockleken av filma, d, indikeras. Det andra steget belyser data från de experimentella protokollen QCM-Z (Top) och QCM-D (Bottom). Det tredje steget är där man bestämmer den region där provet kan analyseras. Det fjärde steget visar resulterande data från den givna analys regionen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: "bra" och "dåliga" QCM-D-data för kollagen adsorption. Diagram över frekvens och dämpande faktorer för kollagen adsorptionsexperiment. A) jämkade frekvens skiften, (B) jämkade dämpande faktor förskjutningar, (C) icke-jämkade frekvens växlingar och (D) icke-jämkade dämpande faktor förskjutningar. I (B) och (d), är Dämpningsfaktorn förskjutning plottas som avledning faktorn, D, och bandbredden, Γ, eftersom samma parameter mäts av båda förskjutningarna. Frekvens-och gamma förskjutningarna normaliseras till deras respektive övertoner (n = 3 eller 5). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: viskoelastiska analys av kollagen med hjälp av en effekt lag modell. (A) areal massan, (B) komplexa skjuvmodulus, och (C) viskoelastiska fasvinkel för kollagen adsorptionsexperiment. De första 10 h visar det huvudsakliga adsorptionsstadiet av kollagenet till sensorns yta, med tiden mellan 10 och 20 som visar jämnings stadiet innan bufferttvätten utförs vid 20 timmar. Felstaplar representerar osäkerheter i beräkningarna för tjocklek och viskoelastiska egenskaper, förutsatt ett fel i Δƒ och δγ motsvarar 1% av Γ. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: viskoelastiska analys av kollagen med hjälp av en Power Law modell och kommersiell programvara modell. (A) areal massan, (B) komplexa skjuvmodulus, och (C) viskoelastiska fasvinkel för kollagen adsorptionsexperiment. Γ -värdena bestäms med python-skriptet med hjälp av δƒ och δD -värden från experimentella data medan D -värdena konverteras från resultaten från den viskoelastiska modellen från den kommersiella programvaran. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: modifierad van GURP-palmen Plot av kollagen och PSS: PDADMA data. En tomt i viskoelastiska fasvinkel och komplexa skjuvning Modulus över det allmänna utbudet av prover mätbara med QCM. Den gröna linjen indikerar det linjära sambandet mellan de två egenskaper som antogs i utvecklingen av figur 1. Data för programmet PSS: PDADMA polyelektrolytkomplex (PEC) har skrivits om med tillstånd från Sadman et al. 22, copyright 2017 amerikanska kemiska samhället. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Molaritet av lösningen (M) | mL 3 M KBr |
| 0,1 | 1 |
| 0,2 | 1,1 |
| 0,3 | 1,2 |
| 0,4 | 1,3 |
| 0,5 | 1,4 |
| 0,6 | 1,5 |
| 0,7 | 1,6 |
| 0,8 | 1,8 |
| 0,9 | 1,9 |
| 1 | 2 |
Tabell 1: molar-ökningar för PEC-svullnadsexperimentet. Mängden (i mL) av 3 M kaliumbromid lösning som krävs för att öka molaritet av vatten lösningen med 0,1 M för svullnadsexperiment.
Kompletterande filer: python-kod. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kollagen adsorptionsresultaten spänner över Sauerbrey och viskoelastiska regimer. Genom att plotta frekvens Skift normaliserade till motsvarande harmoniska tal, vi Observera att Sauerbrey gränsen gäller för ungefär de första 2 h av mätningen. Med ökande massa ansluter sig till sensorn, dock normaliserade frekvens SKIFT för den tredje och femte övertoner börjar avvika från varandra (t > 2 h), vilket indikerar en förmåga att bestämma viskoelastiska egenskaper av adsorberad film.
En direkt jämförelse mellan viskoelastiska modellering resultat från programvaran och Power Law modellering från Shull gruppen indikerar en märkbar skillnad i beräknade materialegenskaper. Under mätningen utgjorde viskoelastiska modellerade data från kommersiell programvara ett tjockare, mjukare skikt med en lägre komplex skjuvning modulus (figur 5). Skillnaderna i viskoelastiska egenskaper mellan dessa modeller beror på de antaganden som gjorts i beräkningarna för varje system. En skillnad gäller ett antagande som måste göras om frekvens beroendet av viskoelastiska egenskaper. Vissa antagande måste göras eftersom frekvensrespons vid en given harmonisk (n = 3, till exempel), beror på tre parametrar (PD, | G*3| p, Φ3) men endast två oberoende kvantiteter (Δƒ3 och δγn ~ ΔDn) mäts. På grund av denna avvikelse, måste vi få minst en ytterligare kvantitet (antingen frekvens förskjutning eller avledning) från en extra harmonisk utan att lägga till en ytterligare okänd för problemet. Tjocklek och densitet uppenbarligen inte beror på frekvensen, men den komplexa skjuvning Modulus gör. Den makt lag strategi bygger på det faktum att över ett litet frekvensområde, kan vi anta att fasvinkeln är konstant, med en reologiska svar motsvarande ett material med ett makt-lag beteende över ett mycket större utbud av frekvenser15,16,18. Den kraft lag exponent, Λ, är inte en justerbar parameter men är lika med Φ/90 °, med Φ i grader. Med Power Law antagande har vi Φ3 = φ5 och 
. För kvantitativ viskoelastiska modellering, Power Law modellen representerar den bästa kombinationen av noggrannhet och enkelhet, vilket ger mer tillförlitliga resultat än andra vanliga metoder, inklusive Kelvin-Voigt-modellen, där G antas vara oberoende av n och g antas öka linjärt med n.
Med tanke på den experimentella installationen för PSS: PDADMA-data utfördes experiment i bulk och viskoelastiska regimer för att generera data i figur 6. Protokollet specificerar prov preparationen för de viskoelastiska regim experiment, med bulk experiment som utförs genom att titta på sensorn svar på en lösning med PEC, salt och vatten närvarande. För att förbereda proverna för viskoelastiska regimen experiment, är det viktigt att förstå mål tjockleken intervallet för återstående inom viskoelastiska regimen och undvika överdämpning svaret från sensorn. För PSS: PDADMA-systemet är detta ideal område ~ 0,8-1,6 μm. Eftersom PEC initialt ökar i tjocklek med 45-50% när svällde i vatten, måste detta beteende redovisas i den initiala filmtjocklekar, vilket gör ett målintervall för den ursprungliga prov tjockleken på ~ 0,45-0,65 μm. Att ha ett bra grepp om hur filmen kommer att bete sig under experimentet är viktigt för att förstå det bästa målet tjocklek sortiment samt den bästa metoden för provberedning18.
Oavsett den exakta instrumentella set-up, dessa förfaranden visar vikten av att överväga provberedning innan du påbörjar ett QCM experiment. Tjockleken på det applicerade skiktet avgör vilken information som kan extraheras från uppmätta data. Innan någon mätning påbörjas måste forskaren överväga vilken information som behövs mest från experimentet och förstå begränsningarna i tekniken. En förståelse av de viskoelastiska egenskaperna hos filmen är till hjälp vid bestämning av rätt prov tjock lek och beredningsmetod. För lämpliga prover, både tidsdomän och frekvens domän QCM instrument kan användas sakkunnigt för att samla in korrekta data för en mängd olika applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). Jr och E.S. erkänner stöd från NSF (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
References
- Marx, K. A. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution - Surface interface. Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).
- Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces. Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).
- Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance. Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).
- Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance. Polymer. 103, 387-396 (2016).
- Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).
- Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs. ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).
- Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance. ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).
- Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
- Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces. ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).
- Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).
- Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices. Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).
- Johannsmann, D. Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).
- Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance. Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).
- Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes. Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).
- Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists' paints. Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).
- Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).
- Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase. Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).
- Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).
- Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
- Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation. Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).
- Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms. Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).
- Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2017).
- Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2015).
- Kern, W. The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology. Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887 (1990).
- Sadman, K. sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze. , (2018).
