Summary
Kvartskrystall mikrovekt kan gi nøyaktige masse og viskoelastiske egenskaper for filmer i mikron eller submikron rekkevidde, som er relevant for undersøkelser i biomedisinsk og miljømessig sensing, belegg, og polymer vitenskap. Prøve tykkelsen påvirker hvilken informasjon som kan fås fra materialet som er i kontakt med sensoren.
Abstract
I denne studien presenterer vi ulike eksempler på hvordan tynn film forberedelse for kvartskrystall mikrovekt eksperimenter informerer riktig modellering av data og bestemmer hvilke egenskaper av filmen kan være kvantifisert. Den kvartskrystall mikrovekt tilbyr en unikt følsom plattform for måling av fine endringer i masse og/eller mekaniske egenskaper av en anvendt film ved å observere endringene i mekanisk resonans av en kvartskrystall svingte på høy frekvens. Fordelene med denne tilnærmingen inkluderer sin eksperimentelle allsidighet, evne til å studere endringer i egenskaper over et bredt spekter av eksperimentelle tids lengder, og bruk av små utvalgsstørrelser. Vi viser at, basert på tykkelsen og skjær modul av laget avsatt på sensoren, kan vi tilegne seg forskjellig informasjon fra materialet. Her er dette konseptet spesielt utnyttet til å vise eksperimentelle parametre som resulterer i masse og viskoelastiske beregninger av adsorberes kollagen på gull og polyelectrolyte komplekser under hevelse som en funksjon av saltkonsentrasjon.
Introduction
Kvartskrystall mikrovekt (QCM) utnytter den Piezoelektriske effekten av en kvartskrystall for å overvåke dens resonans frekvens, som er avhengig av massen levd opp til overflaten. Teknikken sammenligner resonans frekvens og båndbredde på en AT cut kvartskrystall sensor (vanligvis i størrelsesklasse av 5 MHz)1 i luft eller en væske til frekvens og båndbredde på sensoren etter deponering av en film. Det er flere fordeler for å bruke QCM å studere tynne filmegenskaper og grensesnitt, inkludert høy følsomhet for masse og potensielt til viskoelastiske eiendom endringer (avhengig av prøve ensartethet og tykkelse), evnen til å utføre studier in situ2, og evnen til å granske en mye kortere reologiske tidsskala enn tradisjonell skjær Reologi eller dynamisk mekanisk analyse (DMA). Hvis du undersøker en kort reologiske tidsskala, kan du observere hvordan responsen på denne tidsskalaen endres både over ekstremt korte (MS)3 og lange (år) varigheter4. Denne evnen er gunstig for studiet av en rekke kinetisk prosesser og er også en nyttig forlengelse av tradisjonelle rheometric teknikker5,6.
Den høye følsomheten til QCM har også ført til utstrakt bruk i biologiske anvendelser som studerer de grunnleggende interaksjoner av ekstremt små biomolekyler. En ubehandlede eller funksjonalisert sensor overflate kan brukes til å undersøke protein absorpsjon. ytterligere, biosensing gjennom komplekse bindende hendelser mellom enzymer, antistoffer og aptamers kan undersøkes basert på endringer i masse7,8,9. For eksempel har teknikken blitt brukt til å forstå transformasjonen av blemmer til en Planar lipid bilayer som en to-fase prosess med absorpsjon av væske som inneholder blemmer til en stiv struktur ved å observere samkjøre endringer i frekvens og viscoelasticity10. I de senere årene har QCM i tillegg tilbudt en robust plattform for å overvåke narkotika levering med blemmer eller nanopartikler11. I skjæringspunktet mellom materialer engineering og molekylær og cellulær biologi, kan vi bruke QCM å belyse viktige interaksjoner mellom materialer og bioaktive komponenter som proteiner, nukleinsyre syrer, liposomer, og celler. For eksempel, protein absorpsjon til en biomaterialet formidler nedstrøms cellulære reaksjoner som betennelse og brukes ofte som en positiv indikator på biokompatibilitet, mens i andre tilfeller ekstracellulære protein vedlegg til belegg som grensesnitt med blod kan indusere farlig blodpropp i fartøy12,13. QCM kan derfor brukes som et verktøy for å velge kandidater som er optimale for ulike behov.
To vanlige tilnærminger for utføring av QCM-eksperimenter samler inn analoge data fra eksperimentet: den første tilnærmingen registrerer frekvens forskyvningen og halv båndbredden (Γ) for konduktans topp. Den andre tilnærmingen, QCM med spredning (QCM-D), registrerer frekvensen Skift og spredning faktor, som er direkte proporsjonal med Γ gjennom ligningen 1,14
1
der D er sprednings faktoren og ƒ er frekvensen. Både D og Γ er relatert til dempingen effekten filmen har på sensoren, som gir en indikasjon på stivhet av filmen. Den senket n betegner frekvensen overtone eller harmonisk, som er odde resonans frekvenser av kvarts sensor (n = 1, 3, 5, 7...). Videre drøfting av modeller som bruker flere harmoniske for å oppnå masse og viskoelastiske egenskaper av en film kan bli funnet i en gjennomgang av Johannsmann14 og tidligere papirer fra Shull Group15,16,17,18.
En viktig faktor for å forberede QCM prøvene er hvordan man bruker den tynne filmen på sensoren overflaten. Noen vanlige metoder omfatter spin-belegg, dip-belegg, dråpe belegg eller absorpsjon av filmen på sensor overflaten under eksperimentet19,20. Det er fire regioner for QCM prøver: Sauerbrey grense, viskoelastiske regime, bulk regimet, og overdamped regime. For tilstrekkelig tynne filmer, Sauerbrey grensen gjelder, hvor frekvensen Skift (Δƒ) gir overflaten masse tetthet av filmen. Innenfor Sauerbrey grensen skalerer frekvens skiftet lineært med den resonans harmoniske, n, og endringer i demping faktor (D eller Γ) er generelt små. I dette regimet er tilstrekkelig informasjon ikke er tilgjengelig for å entydig bestemme reologiske egenskaper av laget uten å gjøre flere forutsetninger. Data i dette regimet brukes til å beregne overflaten masse tetthet (eller tykkelse hvis tettheten er kjent a priori) av filmen. I bulk regime der mediet i kontakt med krystallen er tilstrekkelig tykk, evanescent skjær bølgen sprer seg inn i mediet før de blir helt dempet. Her kan ingen masse informasjon fås ved hjelp av Δƒ. Men i denne regionen, viskoelastiske egenskaper er pålitelig bestemmes ved hjelp av kombinasjonen av Δƒ og ΔΓ 15,18. I bulk regime, hvis mediet er for rigid, vil filmen fuktig ut resonans av sensoren, hindrer innsamling av eventuelle pålitelige data fra QCM. Viskoelastiske regime er det mellomliggende regimet hvor filmen er tynn nok til å ha skjær bølgen fullt spredd gjennom filmen, samt har pålitelige verdier for demping faktor. Den demping faktor og Δƒ kan deretter brukes til å bestemme viskoelastiske egenskapene til filmen så vel som sin masse. Her er viskoelastiske egenskaper gitt av produktet av tettheten og omfanget av den komplekse skjær modul | G* | p og fasevinkelen gitt av Φ = ARCTAN (g " / G"). Når filmer er utarbeidet i Sauerbrey grensen, kan massen per enhet området beregnes direkte basert på Sauerbrey ligningen vist under21,
2
hvor Δƒn er endringen i resonans frekvens, n er overtone av interesse, ƒ1 er resonans frekvensen av sensoren, Δm / A er massen per område av filmen, og Zq er akustisk impedans i kvarts, som for kutte kvarts er Zq = 8,84 x 106kg / m2s. Den viskoelastiske regimet er mest hensiktsmessig for studiet av polymer filmer, og bulk grensen er nyttig for å studere viskøs polymer22 eller protein løsninger16. De ulike regimer avhenger av egenskapene til materialet av interesse, med optimal tykkelse for full viskoelastiske og masse karakterisering generelt øker med film stivhet. Figur 1 beskriver de fire regionene med hensyn til areal tettheten i filmen, kompleks skjær-modul og fase vinkel, der vi har antatt en bestemt sammenheng mellom fasevinkelen og film stivheten som er vist å være relevant for materialer av denne typen. Mange filmer av praktisk interesse er for tykke for å studere viskoelastiske egenskaper med QCM, slik som visse biofilm, hvor tykkelser er på rekkefølgen av titalls til hundrevis av mikron23. Slike tykke filmer er vanligvis ikke hensiktsmessig for å studere ved hjelp av QCM, men kan måles ved hjelp av mye lavere frekvens resonatorer (som vridnings resonatorer)23, slik at skjær bølgen til videreføres videre inn i filmen.
For å finne ut hvilket regime som er relevant for en gitt QCM prøve, er det viktig å forstå d /λn -parameteren, som er forholdet mellom filmtykkelsen (d) og skjær bølgelengden til den mekaniske bevegelse av kvartskrystall sensoren (λn)15,16,18. Det ideelle viskoelastiske-regimet er d /λn = 0,05-0,218, der verdier under 0,05 er innenfor Sauerbrey grense og verdier over 0,2 nærmer seg bulk regimet. En mer grundig beskrivelse av d /λn er gitt andre steder15,18, men det er en kvantitativ parameter opptegning Sauerbrey grensen og viskoelastiske grensen. Analyse programmene som brukes nedenfor, gir denne parameteren direkte.
Det er noen flere begrensninger for å analysere tynne filmer med QCM. Sauerbrey-og viskoelastiske-beregningene forutsetter at filmen er homogen både gjennom hele filmtykkelsen og sideveis over elektrode overflaten på QCM. Mens denne antakelsen gjør det utfordrende å studere filmer som har hulrom eller fyllstoffer stede, har det vært noen QCM undersøkelser i filmer bestående av podet nanopartikler6. Hvis heterogeniteter er små i forhold til den totale filmtykkelsen, kan pålitelig viskoelastiske egenskapene til det sammensatte systemet fortsatt fås. For mer heterogene systemer, verdier innhentet fra en viskoelastiske analyse bør alltid sees med stor forsiktighet. Ideelt sett bør resultater fra systemer med ukjente heterogenitet valideres mot systemer som er kjent for å være homogene. Dette er den tilnærmingen vi har tatt i eksempelet systemet beskrevet i denne utredningen.
Et viktig poeng som vi illustrerer i denne utredningen er nøyaktig korrespondanse mellom QCM målinger gjort i frekvens domene (der Γ er rapportert) og tids domene eksperimenter (der D er rapportert). Resultater fra to forskjellige QCM-eksperimenter, en gangs domene og ett frekvens domene, er beskrevet, som hver involverer et annet, men konseptuelt relatert modell system. Det første systemet er et enkelt eksempel på kollagen vedlegg til sensoren for å illustrere representative bindende Kinetics og likevekts av absorpsjon over tid under en tids domene (QCM-D) måling. Kollagen er den mest tallrike protein i kroppen, kjent for sin allsidighet av bindende atferd og morfologi. Kollagen løsningen som brukes her, krever ikke ytterligere funksjonalisering av sensorens gull overflate for å indusere absorpsjon9. Den andre eksperimentelle systemet er en polyelectrolyte kompleks (PEC) består av anioniske polystyren kalsiumalkarylsulfonat (PSS) og kationiske Poly (diallyldimethylammonium) (PDADMA) utarbeidet på samme måte som Sadman et al.22. Disse materialene hovne opp og bli myk i salt (KBr i dette tilfellet) løsninger, og tilbyr en enkel plattform for å studere polymer mekanikk ved hjelp av en frekvens domene tilnærming (QCM-Z). For hver protokoll vises prosessen med å klargjøre, ta og analysere et mål i figur 2. Den Skjematisk viser at den største forskjellen mellom QCM-Z og QCM-D tilnærminger er i datainnsamling trinn og instrumentering som brukes i eksperimentet. Alle de nevnte prøve Forberedelses teknikkene er kompatible med begge tilnærminger, og hver tilnærming kan analysere prøvene i de tre regionene avbildet i figur 1.
Våre data viser at utarbeidelse av prøver, enten ved sensor belegg før eller under en måling, dikterer evnen til å trekke ut de viskoelastiske egenskapene til et system. Ved å utforme de tidlige stadiene av et eksperiment på riktig måte, kan vi finne ut hvilken informasjon vi kan samle inn nøyaktig i løpet av analyse trinnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
QCM-D kollagen absorpsjon
1. prøveklargjøring og sensor forhånds rensing
- Forbered 20 mL av 0,1 M acetate buffer, justere pH med HCl og NaOH som nødvendig for å oppnå pH = 5,6.
- Legg Rat tail kollagen løsning til 20 mL av acetate buffer under sterile forhold til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL.
- Rengjør den gull belagte kvarts sensoren for å fjerne organisk og biologisk materiale25,26.
- Plasser sensoren aktiv side opp i et UV/ozon kammer og behandle overflaten i ca 10 min.
- Varm opp en 5:1:1 blanding av deionisert vann (dH2O), ammoniakk (25%) og hydrogen peroxide (30%) til 75 ° c. Plasser sensoren i oppløsningen i 5 min.
- Skyll sensoren med dH2O og tørk med en strøm av nitrogen gass.
- Plasser sensoren i en aktiv side opp i et UV/ozon kammer og behandle overflaten i 10 min.
Merk: rengjøringsprosedyren skal umiddelbart utføres før en måling for å redusere miljøforurensning på sensor overflaten.
2. QCM måle data innhenting
- Slå på alt nødvendig utstyr for å ta en måling inkludert pumpen, elektronikk enhet, og dataprogramvare.
- Fjern strømnings modulen fra kammer plattformen og skru ut de store tommelskruene for å åpne modulen.
- Hvis sensoren har blitt utelatt etter første rengjøring (trinn 1.3.1-1.3.4), skyll sensoren med deionisert vann (dH2O) og tørk med en strøm av nitrogen gass for å sikre at det ikke er noen forurensninger på overflaten.
- Monter sensoren i strømnings modulen på den eksponerte O-ringen, tørk først området med en strøm av nitrogen gass og kontroller at O-ringen ligger flatt. Sensoren skal plasseres med den aktive overflate side ned og anker-formet elektrode orientert mot markøren i strømnings modulen.
- Drei tommelskruene for å forsegle strømnings modulen og erstatte den på kammer plattformen. Fest eventuelle nødvendige PTFE pumpe slanger til strømnings modulen og ekstern pumpe.
- Bruk riktig dataprogram, Still temperaturen på strømnings modulen til 37 ° c. Overvåk den endrede temperaturen i 10-15 minutter for å sikre at den equilibrates til ønsket verdi.
- Finn de første resonans frekvensene til sensoren. Hvis noen resonans frekvenser ikke blir funnet av programvaren, kontroller at strømnings modulen er riktig plassert på kammer plattformen eller re-montere sensoren i strømnings modulen for å sikre at den er sentrert og gjøre riktig elektrisk kontakt.
- Plasser innløps pumpeslangen i den 1x fosfat-bufrede saltvanns løsningen (PBS). Start den eksterne pumpe strømmen ved 25 μL/min og Inspiser slangen visuelt for å være sikker på at væsken strømmer gjennom røret.
Merk: Fluid Flow kan være lettere å se ved et øyeblikk øke væske strømningshastigheten til 100 μL/min eller høyere. Hvis væsken ikke ser ut til å bevege seg gjennom røret, er det mest sannsynlig at de to delene av strømnings modulen ikke skaper en skikkelig forsegling. Prøv å stramme tommelskruene, stram kontaktene på slangen til innløpet og utløpet, eller Monter sensoren på nytt for å være sikker på at O-ringen er flat og sentrert. - La 1x PBS flyte gjennom strømnings modulen i minst 15 min til riktig likevekt.
- Start målingen i dataprogramvaren for å starte datainnsamlingen. Overvåk frekvens-og sprednings verdiene i minst 5 minutter for å sikre en stabil grunnlinje.
- Stopp pumpen og flytte innløps slangen til den kollagen-acetate buffer løsning, og gjenoppta væskestrømmen. Legg merke til tidspunktet for denne hendelsen for senere analyse.
- Tillat at de nye frekvens-og sprednings verdiene likevekt til en stabil verdi. Her forventer vi at denne stabilisering oppstår etter 8-12 h.
- Stopp pumpen, Flytt innløps slangen tilbake til 1x PBS-løsningen, og gjenoppta væskestrømmen. Legg merke til tidspunktet for denne hendelsen for senere analyse.
- Tillat at de nye frekvens-og sprednings verdiene likevekt til en stabil verdi. Her oppstår denne stabilisering etter 30 min.
Merk: trinn 2,13 og 2,14 kan gjentas for hver nye periode med væske strømning i strengere eksperimenter med et større antall etapper. - Avslutt datainnsamlingen av målingen, og lagre dataene.
- Rengjør og Demonter QCM-utstyret.
- Øk væske strømningshastigheten på den eksterne pumpen til 500 μL/min eller høyere og plasser innløps slangen i en løsning på 2% Hellmanex rengjøringsmiddel i minst 20 min.
Merk: for andre eksperimenter, hvis du ønsker ytterligere analyse av sensoren, fjernsensoren før trinn 2.16.1 og Plasser en annen rengjørings sensor i modulen. - Stopp pumpen og Flytt innløps slangen til dH2O, og gjenoppta væskestrømmen til ytterligere skylle systemet i minst 20 min.
- Stopp væskestrømmen og fjernsensoren fra strømnings modulen. Tørk sensoren og innsiden av strømnings modulen med en strøm av nitrogen gass. Slå av datamaskinen programvare, elektronikk enhet, og peristaltisk pumpe.
Merk: de gull belagte sensorene kan rengjøres skikkelig, som beskrevet i trinn 1.3.1-1.3.4, og gjenbrukes for flere målinger. Indikasjoner på at en sensor ikke lenger kan brukes på nytt for pålitelige målinger, kan omfatte, men er ikke begrenset til, stor variasjon i innledende resonans frekvenser og betydelige driftsverdier i utgangspunktet målinger med buffer flyt. Data kan åpnes og analyseres i den foretrukne programvaren, inkludert de som leveres av selskaper som spesialiserer seg på QCM-D-utstyr.
- Øk væske strømningshastigheten på den eksterne pumpen til 500 μL/min eller høyere og plasser innløps slangen i en løsning på 2% Hellmanex rengjøringsmiddel i minst 20 min.
QCM Polyelectrolyte kompleks hevelse
3. prøveforberedelse
Merk: dette eksperimentet ble utført ved hjelp av en MATLAB program utviklet innenfor Shull forskningsgruppe for datainnsamling og analyse.
- Først posisjon en bare kvartskrystall sensor i en prøve holderen koblet til vektoren nettverk analysator og datamaskin. Slå på analysator for å bruke en pendel spenning til sensoren, og samle en referanse konduktans spektrum for sensoren i luft.
- Senk prøveholderen i et lipless 100 mL beger fylt med destillert vann og samle et referanse konduktans spektrum for den nakne sensoren i vann.
- Forbered en 0,5 M løsning av kalium bromide (KBr).
- Løs opp 1,79 g KBr i 30 mL destillert vann. Rist til det er oppløst.
- Sett inn en liten silisium wafer i KBr-løsningen i en vinkel for å lage et lysbilde for kvarts sensoren under det annealing trinnet for å hindre at filmen kommer av sensoren.
- Klargjør sensoren for spin-belegg.
- Sett spin coat parametre til 10 000 RPM, 8 000 akselerasjon, og 5 s.
- Sett sensoren på spin elektrostatisk og slå på vakuumet.
- Dekk overflaten på sensoren med etanol og Kjør spin-elektrostatisk for å rengjøre sensor overflaten.
- Legg til PEC (PSS: PDADMA forberedt på samme måte som beskrevet i Sadman et al. 22) til overflaten av sensoren.
- Hvis komplekset er i to faser (polymer rik og polymer dårlig), sakte sette inn Pipet i løsningen. Evakuere Pipet ved å blåse bobler mens du flytter Pipet inn i tettere polymer rike fase.
- Etter å ha sluppet et par bobler i polymer rike fasen, utarbeide 0,5-0,75 mL av polymer rik løsning i Pipet. Opprettholde press på Pipet pære å ikke la polymer fattige fase å gå inn i Pipet, trekke Pipet ut av løsningen.
- Tørk av utsiden av Pipet med en Kimwipe. Legg nok løsning dråpevis på overflaten av kvarts sensor for å fullstendig dekke overflaten. Kontroller at det ikke er synlige bobler i løsningen på sensor overflaten.
- Snurr pelsen i PEC-prøven og senk umiddelbart sensoren i 0,5 M KBr-løsningen for å forhindre salt krystallisering på filmen.
Merk: dette trinnet er noen ganger vanskelig å koordinere. Løsne sensoren like over KBr-løsningen for best mulig resultat. - La filmen anneal i minst 12 timer.
Merk: for å gjøre det enkelt å utføre eksperimentet, klargjør du trinn 4 om kvelden og lar filmen anneal over natten.
4. måling av filmen i luft og vann
- Overfør sensoren til et beger fylt med destillert vann for å fjerne overflødig KBr fra filmen og baksiden av sensoren. La sensoren være i oppløsning i 30-60 min.
- Ta en måling av filmen i luften. Henvisning til den nakne sensoren i luft. La film data til likevekt.
- Sett inn tørket kalsium sulfat i et 100 mL lipless beger og mål den helt tørre filmtykkelsen. Fjern kalsium sulfat fra begeret og skyll begeret med destillert vann.
- Fyll 100 mL lipless beger med 30 mL destillert vann. Sett inn en røre bar for å sikre at vannet sirkulerer rundt filmen. Mål filmen i vann i ca 30-45 min eller til filmen data er equilibrated. Henvisning til den nakne sensoren i vann.
- Klargjør en 15 mL oppløsning på 3 M KBr i destillert vann. Mål 5,35 g KBr inn i en gradert sylinder og fyll til 15 mL med destillert vann. Virvel til oppløst.
- Legg til KBr-løsningen i begeret med destillert vann i trinn på 0,1 M. Tabell 1 skisserer 0,1 m trinn i ml 3 m KBr oppløsning. Face filmen bort fra der KBr løsningen blir lagt til vannet slik at filmen ikke oppløses. Kontroller at systemet har equilibrated før du legger til en ny tilføyelse av KBr-løsningen.
- Etter at alle data er anskaffet, Fjern filmen fra holderen og plasser den i et beger med destillert vann. La saltet forlate filmen (30-60 min) og lufttørke filmen.
- Hvis du vil rengjøre PEC-filmen fra sensoren, legger du til KBr i begeret og roter oppløsningen forsiktig. Tillat å sitte i 5-10 min. Gjenta denne prosessen 2-3 ganger, og skyll deretter sensoren med destillert vann.
Merk: sensoren kan rengjøres og gjenbrukes hvis responsen fra sensoren fortsatt er god. Dette kan kontrolleres av sensoren har liten absolutt båndbredde avlesninger for harmoniske av interesse (< 100 Hz).
5. data analyse
- Åpne QCM-D dataanalyse MATLAB GUI opprettet av Sadman (https://GitHub.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Åpne filmen i luft datafilen ved å velge "Load QCM."
Merk: Shull gruppen har utviklet et lignende Python GUI for datainnsamling og analyse for QCM (https://GitHub.com/shullgroup/rheoQCM). En del av Analysekoden gis i tilleggsinformasjonen for både analyse av dataene og generering av tallene i dette dokumentet. - Velg ønsket beregning (enten 3, 5, 3 eller 3, 5, 5), gammaog film i luft ikoner. Klikk plott QCM.
- Bestem tykkelsen på tørr filmen ved hjelp av det mest equilibrated datapunktet (vanligvis det siste datapunktet) fra eksperimentet. Registrer denne verdien.
- Åpne filmen i vann datafilen. Velg de samme parametrene som i trinn 5,2, med unntak av film i vann i stedet for film i luft.
- Etter hvert likevekts trinn i hevelse eksperimentet, bestemme filmtykkelse, kompleks skjær modul, og viskoelastiske fase vinkel. Record disse verdiene sammen med den joniske styrke (fra 0-1 M i 0,1 M trinn).
- Bestem prosenten hevelse som
3
hvor DP er filmen tykkelse fra løsningen og DPtørr er tørr filmtykkelse.
3Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endringer i hyppighet med tid under absorpsjon av protein viser en karakteristisk kurve og et platå som er vist i Figur 3a-B. Den innledende buffer vask av 1x PBS over den nakne sensoren overflaten induserer bare ubetydelige endringer i frekvens, og tilbyr en jevn baseline å fungere som en referanse for fremtidige datapunkter. Innføringen av kollagen løsning fører til at protein absorpsjon begynner, observert som en jevn nedgang i frekvens over tid, inntil tettheten av overholdt kollagen vidder på en stabil Baseline (Figur 3a). Den nøyaktige frekvens og masse verdier vil være svært avhengig av renheten og overflaten energi av sensoren. Gitt disse parametrene, fjerner den endelige buffer vask bare en liten mengde unadhered protein fra sensoren overflaten, noe som resulterer i en svak økning i frekvens. Vi bør alltid forvente en liten nedgang i massen i denne perioden, viser en stabil mengde protein bundet til sensoren (Figur 3B).
Viktigheten av å nå en stabil frekvens måling for hver periode kan ikke være overdrevet. Små svingninger i miljøvariabler som temperatur, fuktighet og løsnings konsentrasjon kan føre til merkbare forskjeller i rådata. Derfor, endre disse variablene før minst 5-10 min av stabil frekvens og spredning faktor målinger kan uriktige opplysninger om de nøyaktige endringer i frekvens og spredning. Et eksempel på et suboptimal datasett vises i Figur 3C-D. Her brukes samme løsnings parametere for konsentrasjon og strømningshastighet som Figur A-B, men instrument miljøet var ikke tillatt å likevekt før målingen ble startet. Den naturlige bosetting av sensorens pendel frekvens forekommer samtidig som en skiftende temperatur og væske konsentrasjon, skjule eventuelle potensielle Baseline som vil fungere som en referanse (Figur 3C). Vi er i stedet tvunget til å velge et gjennomsnitt av hele dynamisk frekvensområdet i perioden til å fungere som en referanse. Til slutt, kollagen flyt er ikke tillatt å likevekt på en stabil masse før du starter den endelige PBS vask, sett av fortsatt skiftende frekvens Skift like før PBS kommer inn i systemet. Denne handlingen påvirker ikke beregningene av massen, men ikke fullt ut karakteriserer adsorptive potensialet av proteinet på sensoren (Figur 3D).
Under de tidlige stadiene av collagen absorpsjons eksperiment, er filmen i Sauerbrey regime, indikert av verdier av Δƒ/n som er uavhengig av n (t < 2 h i Figur 3). Som eksperimentet utvikler filmen flytter inn i viskoelastiske regime, indikert av verdier av Δƒ/n som ikke lenger overlapper (t > 2,5 h). Erkjennelsen av denne endringen i atferd, data innhentet fra kollagen eksperimentet ble analysert for å se på areal massen og viskoelastiske egenskaper ved hjelp av to forskjellige metoder. Den første bruker et Python-skript som er kompilert av Shull-gruppen. Dette skriptet har samme matematiske grunnlaget som MATLAB datainnsamling og analyseprogramvare som brukes for PEC eksperimentet. Den bruker en makt lov modell for å gjøre rede for eiendom forskjeller på tilstøtende harmoniske15 og er gitt i tilleggsinformasjon. Den andre metoden bruker verdier bestemmes fra en viskoelastiske modell i en kommersiell programvarepakke for å beregne areal massen, komplekse skjær modul, og fase vinkel av kollagen filmen. Den viskoelastiske modellen fra denne programvaren rapporterer tykkelsen (d), elastisk modul (μ), og viskositet (η). Den elastiske modulen og viskositet er elementene i en Kelvin-Voigt-modell, og konverteres til størrelsen og fasen av den komplekse modulen via følgende uttrykk:
4
5
der ωn = 2 πnƒ1 der ƒ1 er den grunnleggende frekvensen til kvarts sensoren (5 MHz). Figur 4 viser viskoelastiske egenskaper som er fastsatt for absorpsjon av kollagen beregnet ut fra de Δƒn og ΔDn -verdiene til den tredje og femte harmoniske. Figur 5 sammenligner egenskapene fra Figur 4 med egenskapene konvertert fra de kommersielle programvare resultatene. Som kan sees i figur 5, den kommersielle programvaren verdier rapporten filmen å være mykere enn Python skriptet.
Figur 6 beskriver et forhold som er observert i tidligere QCM eksperimenter3,22 som viser en lineær sammenheng mellom viskoelastiske fase vinkel og logaritmen av størrelsen på den komplekse skjær koeffisienten. Den grønne linjen indikerer denne lineære forholdet, har endepunkter av en newtonsk væske som vann (| G* | p = 105pa • g/cm3 og Φ = 90 ° ved ƒ3 = 15 MHz) og en elastisk fast eller glassaktig polymer (| G* | p = 109pa • g/cm3 og Φ = 0 °). Mange polymer materialer som ble studert ved hjelp av QCM, følger denne generelle empiriske trenden, som ble kvantifisert ved hjelp av PSS: PDADMA komplekse system22. Ettersom PEC er utsatt for løsninger med høyere salt konsentrasjoner, kan prøve overgangene fra å være en stiv, glassaktig prøve til å være mer tyktflytende og flytende; Dette spekteret av eiendommer faller på den grønne linjen. Til sammenligning er egenskapene som beregnes ved hjelp av Python-skriptet for den equilibrated kollagen-filmen, også plottet i figur 6. Forholdet mellom | G* | p og Φ er forventet å være den samme for begge systemer, gitt at begge systemene er glassaktig polymerer hovne med vann. Vanninnholdet i filmen bestemmer det spesifikke punktet langs kurven. Her tilsvarer PEC-systemet med mekaniske egenskaper nærmest kollagen systemet en 20 vekt% polymer løsning. Vi antyde fra denne sammenligningen at polymer konsentrasjonen i adsorberes kollagen filmen er også nær 20 WT .%. Dette resultatet er en svært nyttig en, innhentet i vårt tilfelle ved sammenligning av resultater Hentet fra to hensiktsmessig utformet QCM eksperimenter. En av disse eksperimentene var en tid domene (QCM-D, kollagen) eksperiment og den andre var en frekvens domene (QCM-Z, PEC) eksperiment, men disse typer eksperiment er helt utskiftbare, med enten protokollen sufficing i begge tilfeller.
Figur 1: plott av Sauerbrey, viskoelastiske, bulk, og overdamped regimer. Plottet viser regimer der ulike typer informasjon kan fås fra QCM data, basert på utvalget areal massen (relatert til tykkelse) og viskoelastiske egenskaper. Under den blå linjen er Sauerbrey-regimet, der bare tykkelsen på prøven beregnes. For den midterste regionen kan masse-og viskoelastiske egenskapene til prøven beregnes. I bulk regimet øverst til venstre i plottet, viskoelastiske informasjon kan fås men eksperimentene er ikke lenger følsomme for prøven tykkelse. Øverst til høyre angir overdamped regime at prøven er for tykk for at en QCM-måling skal utføres. I plottet er en lineær sammenheng antas mellom viskoelastiske fase vinkel ved den tredje harmoniske og Logg av omfanget av komplekse skjær modul (grønn linje i figur 6). Bulk regime er definert som regionen der tykkelsen er mer enn dobbelt så forfall lengden på skjær bølgen. Sauerbrey-regimet er definert som regionen der Δƒ/3 og Δƒ/5 varierer med mindre enn 10 Hz, og overdamped-regimet er regimet der Γ5 er større enn 20 000 Hz (D5 > 1600 ppm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Flow diagram over viktige trinn innenfor en QCM måling. Skjematisk av en QCM-Z eller QCM-D eksperiment. Diagrammet i det første trinnet er en QCM sensor (grå) med gull elektroder (gull) og film på toppen av sensoren (lilla), med de ulike teknikkene som brukes til å bruke en film til sensoren overflaten. Tykkelsen av filmen, d, er indikert. Det andre trinnet fremhever dataene fra QCM-Z (øverst) og QCM-D (bunn) eksperimentelle protokoller. Det tredje trinnet er hvor man bestemmer regionen der prøven kan analyseres. Det fjerde trinnet viser resultatdataene fra det gitte analyseområdet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: "gode" og "dårlige" QCM-D-data for absorpsjon av kollagen. Plott av frekvens og dempende faktorer for den kollagen absorpsjon eksperimentet. (A) equilibrated frekvens SKIFT, (B) equilibrated dempende faktor SKIFT, (C) ikke-equilibrated frekvens SKIFT, og (D) ikke-equilibrated dempende faktor SKIFT. I (B) og (D), er dempende faktor skiftet plottet som spredning faktor, D, og båndbredde, Γ, siden den samme parameteren måles av begge Skift. Frekvens-og gamma skiftene blir normalisert til sine respektive harmoniske (n = 3 eller 5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: viskoelastiske analyse av kollagen ved hjelp av en strøm lov modell. (A) areal massen, (B) kompleks skjær-modul, og (C) viskoelastiske fase vinkel for absorpsjon av kollagen-eksperimentet. De første 10 h viser de viktigste absorpsjons fasen av kollagen til sensoren overflaten, med perioden mellom 10 og 20 viser likevekts scenen før buffer vask utført ved 20 timer. Feilfeltene representerer usikkerhet i beregningene for tykkelsen og viskoelastiske egenskaper, forutsatt en feil i Δƒ og ΔΓ lik 1% av Γ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: viskoelastiske analyse av kollagen ved hjelp av en strøm lov modell og kommersiell programvare modell. (A) areal massen, (B) kompleks skjær-modul, og (C) viskoelastiske fase vinkel for absorpsjon av kollagen-eksperimentet. Γ -verdiene fastsettes med Python-skriptet ved hjelp av Δ-ƒ og Δd -verdier fra de eksperimentelle dataene mens D -verdiene konverteres fra resultatene av viskoelastiske-modellen fra den kommersielle programvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: modifisert van Gurp-palmen plot av kollagen og PSS: PDADMA data. Et plott av den viskoelastiske fasevinkelen og den komplekse skjær modulen over det generelle utvalget av prøver som er målbare ved hjelp av QCM. Den grønne linjen indikerer lineær sammenheng mellom de to egenskapene som ble antatt i utviklingen av figur 1. Data for PSS: PDADMA polyelectrolyte Complex (PEC) er gjengitt med tillatelse fra Sadman et al. 22, copyright 2017 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Molaritet av Solution (M) | mL 3 M KBr |
| 0,1 | 1 |
| 0,2 | 1,1 |
| 0,3 | 1,2 |
| 0,4 | 1,3 |
| 0,5 | 1,4 |
| 0,6 | 1,5 |
| 0,7 | 1,6 |
| 0,8 | 1,8 |
| 0,9 | 1,9 |
| 1 | 2 |
Tabell 1: molar trinn for hevelse i PEC-eksperimentet. Mengden (i mL) av 3 M kalium bromide løsning er nødvendig for å øke molaritet av vann løsningen ved 0,1 M for hevelse eksperimentet.
Tilleggsfiler: Python-kode. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Absorpsjons resultatene for kollagen spenner over Sauerbrey-og viskoelastiske-regimer. Ved å plotte frekvensen Skift normalisert til tilsvarende harmonisk tall, observerer vi at Sauerbrey grensen gjelder for omtrent de første 2 h av målingen. Med økende masse å følge sensoren, men den normalisert frekvens Skift for tredje og femte harmoniske begynner å avvike fra hverandre (t > 2 h), som indikerer en evne til å bestemme viskoelastiske egenskaper av adsorberes film.
En direkte sammenligning mellom de viskoelastiske modellerings resultatene fra programvaren og strømforsynings modellen fra Shull-gruppen indikerer en merkbar forskjell i beregnede materialegenskaper. I løpet av målingen, representerte viskoelastiske modellerte data fra kommersiell programvare et tykkere, mykere lag med en lavere kompleks skjær modul (figur 5). Forskjellene i viskoelastiske egenskaper mellom disse modellene er på grunn av forutsetningene som er gjort i beregningene for hvert system. En forskjell gjelder en forutsetning som må gjøres om hyppigheten avhengighet av viskoelastiske egenskaper. Noen forutsetning må gjøres fordi frekvensen respons på en gitt harmonisk (n = 3, for eksempel), avhenger av tre parametre (PD, | G*3| p, Φ3), men bare to uavhengige mengder (Δƒ3 og ΔΓn ~ ΔDn) måles. På grunn av dette avviket må vi skaffe minst ett ekstra antall (enten frekvens forskyvningen eller-spredningen) fra en ekstra harmonisk, uten å legge til en ekstra ukjent for problemet. Tykkelsen og tettheten åpenbart ikke er avhengig av frekvensen, men den komplekse skjær modulen gjør. Kraft loven tilnærmingen er basert på det faktum at over et lite frekvensområde, kan vi anta at fasevinkelen er konstant, med en reologiske respons tilsvarende et materiale med en makt-loven atferd over et mye større utvalg av frekvenser15,16,18. Makt loven eksponent, λ, er ikke en justerbar parameter, men er lik Φ/90 °, med Φ i grader. Med strøm loven forutsetning, har vi Φ3 = Φ5 og 
. For kvantitative viskoelastiske modellering representerer strøm lov modellen den beste kombinasjonen av nøyaktighet og enkelhet, noe som gir mer pålitelige resultater enn andre vanlige tilnærminger, inkludert Kelvin-Voigt-modellen, der G ' antas å være uavhengig av n og G " antas å øke lineært med n.
Tatt i betraktning det eksperimentelle oppsettet for PSS: PDADMA-data, ble eksperimenter i bulk-og viskoelastiske-regimer utført for å generere dataene i figur 6. Protokollen beskriver prøve forberedelsene for de viskoelastiske regime eksperimentene, der masse eksperimentene utføres ved å se på sensorens respons på en løsning med PEC-, salt-og vann til stede. For å forberede prøvene for viskoelastiske regime eksperimenter, er det viktig å forstå mål tykkelsen området for gjenværende innenfor viskoelastiske regime og unngå overdamping responsen på sensoren. For PSS: PDADMA-systemet er dette ideelle området ~ 0,8-1,6 μm. Siden PEC først øker i tykkelse med 45-50% når svulmet i vann, denne oppførselen måtte regnskapsføres i den første filmen tykkelser, lage et målområde for den første prøven tykkelse på ~ 0,45-0,65 μm. Å ha en god forståelse av hvordan filmen vil oppføre seg under eksperimentet er viktig for å forstå det beste målet tykkelse området samt den beste metoden for prøven forberedelse18.
Uavhengig av nøyaktig instrumental oppsett, disse prosedyrene viser viktigheten av å vurdere prøve forberedelser før du starter et QCM eksperiment. Tykkelsen på det brukte laget bestemmer informasjonen som kan trekkes ut fra de målte dataene. Før du begynner noen måling, må forskeren vurdere hvilken informasjon som er mest nødvendig fra eksperimentet og forstå begrensningene i teknikken. En forståelse av de viskoelastiske egenskapene til filmen er nyttig når man skal bestemme riktig prøve tykkelse og Forberedelses metode. For egnede prøver kan både tids domene-og frekvens domene QCM-instrumenter brukes til fagmessig bruk for å samle inn nøyaktige data for en rekke bruksområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). Jr og E.S. erkjenner støtte fra NSF (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
References
- Marx, K. A. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution - Surface interface. Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).
- Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces. Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).
- Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance. Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).
- Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance. Polymer. 103, 387-396 (2016).
- Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).
- Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs. ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).
- Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance. ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).
- Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
- Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces. ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).
- Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).
- Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices. Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).
- Johannsmann, D. Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).
- Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance. Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).
- Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes. Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).
- Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists' paints. Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).
- Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).
- Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase. Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).
- Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).
- Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
- Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation. Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).
- Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms. Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).
- Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2017).
- Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2015).
- Kern, W. The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology. Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887 (1990).
- Sadman, K. sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze. , (2018).
