Summary
El microbalance de cristal de cuarzo puede proporcionar propiedades precisas de masa y viscoelástica para películas en el rango de micras o submicrones, lo que es relevante para investigaciones en detección biomédica y ambiental, recubrimientos y ciencia de polímeros. El espesor de la muestra influye en qué información se puede obtener del material en contacto con el sensor.
Abstract
En este estudio, presentamos varios ejemplos de cómo la preparación de película delgada para experimentos de microbalanza de cristal de cuarzo informa el modelado adecuado de los datos y determina qué propiedades de la película se pueden cuantificar. El microbalance de cristal de cuarzo ofrece una plataforma únicamente sensible para medir los cambios finos en las propiedades mecánicas y/o de masa de una película aplicada observando los cambios en la resonancia mecánica de un cristal de cuarzo que oscila a alta frecuencia. Las ventajas de este enfoque incluyen su versatilidad experimental, la capacidad de estudiar los cambios en las propiedades en una amplia gama de longitudes de tiempo experimentales y el uso de pequeños tamaños de muestra. Demostramos que, en base al espesor y el módulo de cizallamiento de la capa depositada en el sensor, podemos adquirir información diferente del material. Aquí, este concepto se explota específicamente para mostrar parámetros experimentales que resultan en cálculos de masa y viscoelástica de colágeno adsorbida en complejos de oro y polielectrolitos durante la hinchazón en función de la concentración de sal.
Introduction
El microbalance de cristal de cuarzo (QCM) aprovecha el efecto piezoeléctrico de un cristal de cuarzo para controlar su frecuencia resonante, que depende de la masa adherida a la superficie. La técnica compara la frecuencia resonante y el ancho de banda de un sensor de cristal de cuarzo cortado AT (normalmente en el rango de 5 MHz)1 en aire o un fluido con la frecuencia y el ancho de banda del sensor después de la deposición de una película. Hay varios beneficios para el uso del QCM para estudiar las propiedades e interfaces de película delgada, incluyendo la alta sensibilidad a la masa y potencialmente a los cambios de propiedad viscoelástica (dependiendo de la uniformidad y el grosor de la muestra), la capacidad de realizar estudios en el lugar2,y la capacidad de sondear una escala de tiempo reológica mucho más corta que la reología de cizallamiento tradicional o el análisis mecánico dinámico (DMA). Sondear una escala temporal reológica corta permite la observación de cómo la respuesta en este intervalo de tiempo cambia tanto en tiempos extremadamente cortos (ms)3 y largas (años) duraciones4. Esta capacidad es beneficiosa para el estudio de una variedad de procesos cinéticos y también es una extensión útil de las técnicas reométricas tradicionales5,6.
La alta sensibilidad del QCM también ha llevado a su uso intensivo en aplicaciones biológicas que estudian las interacciones fundamentales de biomoléculas extremadamente pequeñas. Una superficie de sensor no recubierta o funcionalizada se puede utilizar para investigar la adsorción de proteínas; aún más, el bioensión a través de eventos de unión complejos entre enzimas, anticuerpos y aptámeros se puede examinar en función de los cambios en la masa7,8,9. Por ejemplo, la técnica se ha utilizado para entender la transformación de las vesículas a una bicapa lipídica plana como un proceso bifásico bifásico de adsorción de vesículas que contienen líquidos a una estructura rígida observando cambios correlacionados en la frecuencia y la viscoelasticidad10. En los últimos años, el QCM ha ofrecido además una plataforma robusta para monitorear la administración de fármacos por vesículas o nanopartículas11. En la intersección de la ingeniería de materiales y la biología molecular y celular, podemos utilizar el QCM para dilucidar interacciones clave entre materiales y componentes bioactivos como proteínas, ácidos nucleicos, liposomas y células. Por ejemplo, la adsorción de proteínas a un biomaterial media respuestas celulares aguas abajo como la inflamación y a menudo se utiliza como un indicador positivo de biocompatibilidad, mientras que en otros casos la unión de proteína extracelular a recubrimientos que interactúan con la sangre podría inducir coagulación peligrosa en los vasos12,13. Por lo tanto, el QCM se puede utilizar como una herramienta para seleccionar candidatos óptimos para diferentes necesidades.
Dos enfoques comunes para realizar experimentos qCM recopilan datos análogos del experimento: el primer enfoque registra el cambio de frecuencia y la mitad del ancho de banda() del pico de conductividad. El segundo enfoque, QCM con disipación (QCM-D), registra el cambio de frecuencia y el factor de disipación, que es directamente proporcional a la ecuación 1,14
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donde D es el factor de disipación y es la frecuencia. Tanto D como é están relacionados con el efecto de amortiguación que la película tiene en el sensor, lo que indica la rigidez de la película. El subíndice n denota el armónico o armónico de frecuencia, que son las frecuencias resonantes impares del sensor de cuarzo (n a 1, 3, 5, 7...). Más discusión de modelos utilizando múltiples armónicos para obtener la masa y las propiedades viscoelásticas de una película se puede encontrar en una revisión de Johannsmann14 y documentos anteriores del grupo Shull15,16,17,18.
Una consideración clave para preparar muestras QCM es cómo aplicar la película delgada en la superficie del sensor. Algunos métodos comunes incluyen recubrimiento de espín, recubrimiento por inmersión, recubrimiento de gotas o adsorción de la película en la superficie del sensor durante el experimento19,20. Hay cuatro regiones para las muestras qCM: el límite de Sauerbrey, el régimen viscoelástico, el régimen a granel y el régimen sobreamplificado. Para películas suficientemente delgadas, se aplica el límite de Sauerbrey, donde el cambio de frecuencia(o)proporciona la densidad de masa de la superficie de la película. Dentro del límite de Sauerbrey, las escalas de cambio de frecuencia linealmente con el armónico resonante, n, y los cambios en el factor de amortiguación (D o )son generalmente pequeños. En este régimen no se dispone de suficiente información para determinar de forma exclusiva las propiedades reológicas de la capa sin hacer suposiciones adicionales. Los datos de este régimen se utilizan para calcular la densidad de masa superficial (o el grosor si la densidad se conoce a priori)de la película. En el régimen a granel en el que el medio en contacto con el cristal es lo suficientemente grueso, la onda cortante evanescente se propaga en el medio antes de ser completamente amortiguada. Aquí, no se puede obtener ninguna información de masa utilizando. Sin embargo, en esta región, las propiedades de viscoelástica se determinan de forma fiable utilizando la combinación delos números 15,18. En el régimen a granel, si el medio es demasiado rígido, la película amortiguará la resonancia del sensor, evitando la recopilación de datos fiables del QCM. El régimen viscoelástico es el régimen intermedio donde la película es lo suficientemente delgada como para que la onda cortante se propague completamente a través de la película, así como para tener valores fiables para el factor de amortiguación. A continuación, se puede utilizar el factor de amortiguación yel factor de amortiguación para determinar las propiedades viscoelásticas de la película, así como su masa. Aquí, las propiedades viscoelásticas son dadas por el producto de la densidad y la magnitud del módulo de cizallamiento complejo . G* p y el ángulo de fase dado por el valor de arctan(G" / G'). Cuando las películas se preparan en el límite de Sauerbrey, la masa por unidad de área se puede calcular directamente sobre la base de la ecuación de Sauerbrey que se muestra a continuación21,
(2)
Donde el n es el cambio en la frecuencia resonante, n es el tono de interés, 1es la frecuencia resonante del sensor,m / A es la masa por área de la película, y Zq es la impedancia acústica del cuarzo, que para el cuarzo cortado AT es Zq a 8,84 x 106kg / m2s. El régimen viscoelástico es más adecuado para el estudio de películas poliméricas, y el límite a granel es útil para el estudio de polímero viscoso22 o soluciones proteicas16. Los diferentes regímenes dependen de las propiedades del material de interés, con el espesor óptimo para la caracterización viscoelástica completa y de masa sin aumentar generalmente con la rigidez de la película. La Figura 1 describe las cuatro regiones con respecto a la densidad areal de la película, el módulo de cizallamiento complejo y el ángulo de fase, donde hemos asumido una relación específica entre el ángulo de fase y la rigidez de la película que se ha demostrado que es relevante para los materiales de este tipo. Muchas películas de interés práctico son demasiado gruesas para estudiar las propiedades viscoelásticas con QCM, como ciertas biopelículas, donde los espesores están en el orden de decenas a cientos de micras23. Estas películas gruesas generalmente no son apropiadas para estudiar usando el QCM, pero pueden medirse usando resonadores de frecuencia mucho más baja (como resonadores torsionales)23,permitiendo que la onda cortante se propague aún más en la película.
Para determinar qué régimen es relevante para una muestra QCM determinada, es importante entender el parámetro d /n, que es la relación entre el espesor de la película (d) y la longitud de onda de cizallamiento de la oscilación mecánica del sensor de cristal de cuarzo(n)15,16,18. El régimen viscoelástico ideal es d /n á 0,05 - 0,218, donde los valores por debajo de 0,05 están dentro del límite de Sauerbrey y los valores por encima de 0,2 se acercan al régimen a granel. En otros lugaresseproporciona una descripción más rigurosa de d /n, pero es un parámetro cuantitativo que desentraña el límite de Sauerbrey y el límite viscoelástico. Los programas de análisis utilizados a continuación proporcionan este parámetro directamente.
Hay algunas limitaciones adicionales para analizar películas delgadas con el QCM. Los cálculos Sauerbrey y viscoelástico suponen que la película es homogénea tanto en todo el espesor de la película como lateralmente a través de la superficie del electrodo del QCM. Si bien esta suposición hace difícil estudiar películas que tienen vacíos o rellenos presentes, ha habido algunas investigaciones de QCM sobre películas consistentes en nanopartículas injertadas6. Si las heterogeneidades son pequeñas en comparación con el espesor total de la película, todavía se pueden obtener propiedades viscoelásticas fiables del sistema compuesto. Para sistemas más heterogéneos, los valores obtenidos a partir de un análisis viscoelástico siempre deben ser vistos con mucha precaución. Idealmente, los resultados obtenidos de sistemas con heterogeneidad desconocida deben validarse contra sistemas que se sabe que son homogéneos. Este es el enfoque que hemos adoptado en el sistema de ejemplo descrito en este documento.
Un punto importante que ilustramos en este documento es la correspondencia exacta entre las mediciones de QCM realizadas en el dominio de frecuencia (donde se informa de la palabra ) y los experimentos de dominio de tiempo (donde se informa D). Se describen los resultados de dos experimentos QCM diferentes, un dominio de tiempo y un dominio de frecuencia, cada uno de los que implica un sistema de modelo diferente pero conceptualmente relacionado. El primer sistema es un ejemplo simple de fijación de colágeno al sensor para ilustrar la cinética de unión representativa y el equilibrio de adsorción a lo largo del tiempo durante una medición de dominio de tiempo (QCM-D). El colágeno es la proteína más abundante en el cuerpo, conocida por su versatilidad de comportamientos de unión y morfología. La solución de colágeno utilizada aquí no requiere funcionalización adicional de la superficie de oro del sensor para inducir la adsorción9. El segundo sistema experimental es un complejo de polielectrolitos (PEC) compuesto por sulfonato de poliestireno aniónico (PSS) y policatiónico catiónico (diallyldimethylammonium) (PDADMA) preparado de la misma manera que Sadman et al.22. Estos materiales se hinchan y se vuelven suaves en soluciones de sal (KBr en este caso), ofreciendo una plataforma simple para el estudio de la mecánica de polímeros utilizando un enfoque de dominio de frecuencia (QCM-Z). Para cada protocolo, el proceso de preparación, toma y análisis de una medición se muestra en la Figura 2. El esquema muestra que la principal diferencia entre los enfoques QCM-Z y QCM-D está en el paso de recopilación de datos y la instrumentación utilizada en el experimento. Todas las técnicas de preparación de muestras mencionadas son compatibles con ambos enfoques, y cada enfoque puede analizar muestras en las tres regiones representadas en la Figura 1.
Nuestros datos demuestran que la preparación de muestras, ya sea mediante recubrimiento de sensor antes o durante una medición, dicta la capacidad de extraer las propiedades viscoelásticas de un sistema. Al diseñar las primeras etapas de un experimento adecuadamente, podemos determinar qué información podemos recopilar con precisión durante el paso de análisis.
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Protocol
Adsorción de colágeno QCM-D
1. Preparación de muestras y prelimpieza del sensor
- Preparar 20 ml de tampón de acetato de 0,1 M, ajustando el pH con HCl y NaOH según sea necesario para lograr el pH a 5,6.
- Añadir la solución de colágeno de cola de rata a los 20 ml de tampón de acetato en condiciones estériles a una concentración final de 10 g/ml.
- Limpie el sensor de cuarzo recubierto de oro para eliminar el material orgánico y biológico25,26.
- Coloque el lado activo del sensor hacia arriba en una cámara UV/Ozono y trate la superficie durante aproximadamente 10 minutos.
- Calentar una mezcla de agua desionizada 5:1:1 (dH2O), amoníaco (25%) y peróxido de hidrógeno (30%) a 75 oC. Coloque el sensor en la solución durante 5 min.
- Enjuague el sensor con dH2O y séquelo con una corriente de gas nitrógeno.
- Coloque el lado activo del sensor hacia arriba en una cámara UV/Ozono y trate la superficie durante 10 minutos.
NOTA: El procedimiento de limpieza debe realizarse inmediatamente antes de una medición para minimizar la contaminación ambiental en la superficie del sensor.
2. Adquisición de datos de medición QCM-D
- Encienda todo el equipo necesario para realizar una medición, incluida la bomba, la unidad electrónica y el software informático.
- Retire el módulo de flujo de la plataforma de la cámara y desenrosque los tornillos grandes del pulgar para abrir el módulo.
- Si el sensor se ha dejado fuera después de la limpieza inicial (pasos 1.3.1-1.3.4), enjuague el sensor con agua desionizada (dH2O) y seque con una corriente de gas nitrógeno para asegurarse de que no haya contaminantes en la superficie.
- Monte el sensor en el módulo de flujo en la placa tórica expuesta, primero secando el área con una corriente de gas nitrógeno y comprobando que la placa tórica está acostada. El sensor debe colocarse con el lado de la superficie activa hacia abajo y el electrodo en forma de anclaje orientado hacia el marcador en el módulo de flujo.
- Gire los tornillos del pulgar para sellar el módulo de flujo y reemplácelo en la plataforma de la cámara. Conecte cualquier tubo de bomba de PTFE necesario al módulo de flujo y a la bomba externa.
- Usando el software informático adecuado, ajuste la temperatura del módulo de flujo a 37 oC. Supervise la temperatura cambiante durante 10-15 minutos para asegurarse de que se equilibra al valor deseado.
- Encuentre las frecuencias de resonancia iniciales del sensor. Si el software no encuentra ninguna frecuencia de resonancia, compruebe que el módulo de flujo esté correctamente colocado en la plataforma de la cámara o vuelva a montar el sensor en el módulo de flujo para asegurarse de que está centrado y haciendo el contacto eléctrico adecuado.
- Coloque el tubo de la bomba de entrada en la solución salina 1x con búfer de fosfato (PBS). Encienda el flujo de la bomba externa a 25 l/min e inspeccione visualmente el tubo para asegurarse de que el fluido fluye a través del tubo.
NOTA: El flujo de fluidos puede ser más fácil de ver aumentando momentáneamente el caudal de fluido a 100 l/min o más. Si el fluido no parece moverse a través del tubo, lo más probable es que las dos partes del módulo de flujo no estén creando un sello adecuado. Intente apretar los tornillos del pulgar, apretando los conectores del tubo a la entrada y la salida, o vuelva a montar el sensor para asegurarse de que la placa tórica está plana y centrada. - Permita el flujo de fluido del 1x PBS a través del módulo de flujo durante al menos 15 minutos para equilibrar correctamente.
- Inicie la medición en el software informático para iniciar la adquisición de datos. Supervise los valores de frecuencia y disipación durante al menos 5 minutos para garantizar una línea de base estable.
- Detenga la bomba y mueva el tubo de entrada a la solución tampón de colágeno y acetato y reanude el flujo de fluidos. Observe la hora de este evento para su análisis posterior.
- Permita que los nuevos valores de frecuencia y disipación se equilibren en un valor estable. Aquí, esperamos que esta estabilización ocurra después de 8-12 h.
- Detenga la bomba, vuelva a mover el tubo de entrada a la solución 1x PBS y reanude el flujo de fluidos. Observe la hora de este evento para su análisis posterior.
- Permita que los nuevos valores de frecuencia y disipación se equilibren en un valor estable. Aquí, esta estabilización se produce después de 30 min.
NOTA: Los pasos 2.13 y 2.14 se pueden repetir para cada nuevo período de flujo de fluido en experimentos más rigurosos con un mayor número de etapas. - Finalice la adquisición de datos de la medición y guarde los datos.
- Limpie y desmonte el equipo QCM.
- Aumente el caudal de fluido de la bomba externa a 500 ml/min o superior y coloque el tubo de entrada en una solución de 2% de solución de limpieza Hellmanex durante al menos 20 minutos.
NOTA: Para otros experimentos, si desea realizar un análisis adicional del sensor, retire el sensor antes del paso 2.16.1 y coloque otro sensor de limpieza en el módulo. - Detenga la bomba y mueva el tubo de entrada a dH2O, y reanude el flujo de fluido para vaciar aún más el sistema durante al menos 20 minutos.
- Detenga el flujo de fluidos y retire el sensor del módulo de flujo. Seque el sensor y el interior del módulo de flujo con una corriente de gas nitrógeno. Apague el software de la computadora, la unidad electrónica y la bomba peristáltica.
NOTA: Los sensores recubiertos de oro se pueden limpiar correctamente, como se detalla en los pasos 1.3.1-1.3.4, y reutilizarse para varias mediciones. Las indicaciones de que un sensor ya no se puede reutilizar para mediciones fiables pueden incluir, entre otros, una gran variabilidad en las frecuencias de resonancia iniciales y derivas significativas en las mediciones de línea de base con flujo de búfer. Los datos se pueden abrir y analizar en el software preferido, incluidos los proporcionados por empresas especializadas en equipos QCM-D.
- Aumente el caudal de fluido de la bomba externa a 500 ml/min o superior y coloque el tubo de entrada en una solución de 2% de solución de limpieza Hellmanex durante al menos 20 minutos.
QCM Polielectrolito Complejo Hinchazón
3. Preparación de muestras
NOTA: Este experimento se realizó utilizando un programa MATLAB desarrollado dentro del grupo de investigación Shull para la recopilación y análisis de datos.
- En primer lugar, coloque un sensor de cristal de cuarzo desnudo en un soporte de muestra conectado al analizador de red vectorial y al ordenador. Encienda el analizador para aplicar un voltaje oscilante al sensor y recopile un espectro de conductancia de referencia para el sensor en el aire.
- Sumerja el soporte de muestra en un vaso de precipitados sin labios de 100 ml lleno de agua destilada y recoja un espectro de conductancia de referencia para el sensor desnudo en agua.
- Preparar una solución de 0,5 M de bromuro de potasio (KBr).
- Disolver 1,79 g de KBr en 30 ml de agua destilada. Agitar hasta que se disuelva.
- Inserte una pequeña oblea de silicio en la solución KBr en un ángulo para crear una corredera para el sensor de cuarzo durante el paso de recocido para evitar que la película salga del sensor.
- Prepare el sensor para el recubrimiento de giro.
- Establezca los parámetros de la capa de giro en 10.000 rpm, 8.000 de aceleración y 5 s.
- Inserte el sensor en la capa de giro y encienda el vacío.
- Cubra la superficie del sensor con etanol y ejecute la capa de giro para limpiar la superficie del sensor.
- Agregue el PEC (PSS:PDADMA preparado de la misma manera que se detalla en Sadman et al. 22) a la superficie del sensor.
- Si el complejo se encuentra en dos fases (ricaen en polímeros y pobres en polímeros), inserte lentamente el pipeteo en la solución. Evacuar el pipeta soplando burbujas mientras mueve la tubería en la fase rica en polímeros más densos.
- Después de liberar un par de burbujas en la fase rica en polímeros, dibuje 0.5-0.75 ml de la solución rica en polímeros en el pipeteo. Mantener la presión sobre la bombilla de tubería para no permitir que la fase deficiente del polímero entre en la tubería, extraiga el pipeteo de la solución.
- Limpie el exterior de la tubería con un Kimwipe. Agregue suficiente solución con gota a la superficie del sensor de cuarzo para cubrir completamente la superficie. Asegúrese de que no haya burbujas visibles en la solución en la superficie del sensor.
- Gire la capa de la muestra PEC y sumerja inmediatamente el sensor en la solución KBr de 0,5 M para evitar la cristalización de sal en la película.
NOTA: Este paso a veces es difícil de coordinar. Suelte el sensor justo encima de la solución KBr para obtener los mejores resultados. - Deje que la película se retrase durante al menos 12 h.
NOTA: Para facilitar la realización del experimento, prepare el paso 4 por la noche y permita que la película se retrase durante la noche.
4. Medición de la película en el aire y el agua
- Transfiera el sensor a un vaso de precipitados lleno de agua destilada para eliminar el exceso de KBr de la película y la parte posterior del sensor. Deje el sensor en la solución durante 30-60 min.
- Tome una medida de la película en el aire. Referencia al sensor desnudo en el aire. Permita que los datos de la película se equilibren.
- Inserte el sulfato de calcio seco en un vaso de precipitados sin labios de 100 ml y mida el espesor de la película completamente seca. Retire el sulfato de calcio del vaso de precipitados y enjuague el vaso con agua destilada.
- Llene el vaso de precipitados sin labios de 100 ml con 30 ml de agua destilada. Inserte una barra de agitación para asegurarse de que el agua está circulando alrededor de la película. Mida la película en agua durante unos 30-45 minutos o hasta que los datos de la película estén equilibrados. Referencia al sensor desnudo en agua.
- Preparar una solución de 15 ml de 3 M KBr en agua destilada. Mida 5,35 g de KBr en un cilindro graduado y llene a 15 ml con agua destilada. Gire hasta que se disuelva.
- Agregue la solución KBr al vaso de precipitados con agua destilada en incrementos de 0,1 M. La Tabla 1 describe los incrementos de 0,1 M en ml de solución KBr de 3 M. Frente a la película lejos de donde la solución KBr se está añadiendo al agua para que la película no se disuelva. Asegúrese de que el sistema se ha equilibrado antes de agregar otra adición de la solución KBr.
- Una vez adquiridos todos los datos, retire la película del soporte y colóquela en un vaso de agua destilada. Deje que la sal deje la película (30-60 min) y seque al aire la película.
- Para limpiar la película PEC del sensor, añada KBr al vaso de precipitados y gire suavemente la solución. Dejar sentar sea durante 5-10 min. Repita este proceso 2-3 veces, luego enjuague el sensor con agua destilada.
NOTA: El sensor se puede limpiar y reutilizar si la respuesta del sensor sigue siendo buena. Esto puede ser comprobado por el sensor que tiene pequeñas lecturas de ancho de banda absoluto para los armónicos de interés (<100 Hz).
5. Análisis de datos
- Abra el análisis de datos QCM-D MATLAB GUI creado por Sadman (https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Abra la película en el archivo de datos de aire seleccionando "Cargar QCM."
NOTA: El grupo Shull ha desarrollado una GUI de Python similar para la recopilación y análisis de datos para QCM (https://github.com/shullgroup/rheoQCM). Una parte del código de análisis se proporciona en la información complementaria tanto para analizar los datos como para generar las cifras de este documento. - Seleccione el cálculo deseado (3,5,3 o 3,5,5), gammay película en iconos de aire. Haga clic en Trazar QCM.
- Determine el grosor de la película seca utilizando el punto de datos más equilibrado (normalmente el último punto de datos) del experimento. Registre este valor.
- Abra la película en el archivo de datos de agua. Seleccione los mismos parámetros que en el paso 5.2, excepto para la película en agua en lugar de la película en el aire.
- Después de cada paso de equilibrio del experimento de hinchazón, determine el grosor de la película, el módulo de cizallamiento complejo y el ángulo de fase viscoelástico. Registre estos valores junto con la fuerza iónica (que van desde 0-1 M en incrementos de 0,1 M).
- Determinar el porcentaje de hinchazón como
(3)
donde dp es el espesor de la película de la solución y dpseco es el espesor de la película seca.
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Representative Results
Los cambios en la frecuencia con el tiempo durante la adsorción de proteínas muestran una curva y meseta característica que se muestran en la Figura 3A-B. El lavado tampón inicial de 1pbS a través de la superficie del sensor desnudo induce sólo cambios insignificantes en la frecuencia, ofreciendo una línea de base constante para actuar como referencia para los puntos de datos futuros. La introducción de la solución de colágeno hace que comience la adsorción de proteínas, observada como una disminución constante de la frecuencia con el tiempo, hasta la densidad de las mesetas de colágeno adheridas en una línea de base estable(Figura 3A). Los valores exactos de frecuencia y masa dependerán en gran medida de la pureza y la energía superficial del sensor. Dados estos parámetros, el lavado final del tampón elimina sólo una pequeña cantidad de proteína no adherida de la superficie del sensor, lo que resulta en un ligero aumento en la frecuencia. Siempre debemos esperar sólo una ligera disminución de la masa durante este período, demostrando una cantidad estable de proteína unida al sensor(Figura 3B).
La importancia de alcanzar una medición de frecuencia estable para cada período no puede ser exagerada. Las ligeras fluctuaciones en las variables ambientales como la temperatura, la humedad y la concentración de la solución pueden conducir a diferencias observables en los datos sin procesar. Por lo tanto, alterar estas variables antes de al menos 5-10 minutos de frecuencia estable y mediciones del factor de disipación puede tergiversar los cambios exactos en la frecuencia y la disipación. En la Figura 3C-Dse muestra un ejemplo de un conjunto de datos subóptimo. Aquí, los mismos parámetros de concentración y caudal de la solución se utilizan como la Figura A-B,pero el entorno del instrumento no se permitió equilibrar antes de comenzar la medición. La sedimentación natural de la frecuencia oscilante del sensor se produce al mismo tiempo que una temperatura cambiante y concentración de fluidos, disfrazando cualquier línea de base potencial que actúe como referencia(Figura 3C). En su lugar, nos vemos obligados a elegir un promedio de todo el rango de frecuencia dinámica en el período para actuar como referencia. Finalmente, el flujo de colágeno no se permite equilibrar en una masa estable antes de iniciar el lavado final de PBS, como se ve por los cambios de frecuencia todavía cambiantes justo antes de que el PBS entre en el sistema. Esta acción no afecta a los cálculos de masa, pero no caracteriza completamente el potencial adsortivo de la proteína en el sensor(Figura 3D).
Durante las primeras etapas del experimento de adsorción de colágeno, la película se encuentra en el régimen de Sauerbrey, indicado por valores des/n que son independientes de n (t < 2 h en la Figura 3). A medida que el experimento avanza, la película pasa al régimen viscoelástico, indicado por valores de á/nque ya no se superponen(t > 2,5 h). Reconociendo este cambio en el comportamiento, los datos obtenidos del experimento de colágeno se analizaron para examinar la masa areal y las propiedades viscoelásticas utilizando dos métodos diferentes. El primero utiliza una secuencia de comandos de Python compilada por el grupo Shull. Este script tiene los mismos fundamentos matemáticos que el software de recopilación y análisis de datos MATLAB utilizado para el experimento PEC. Utiliza un modelo de ley de energía para tener en cuenta las diferencias de propiedad en los armónicos adyacentes15 y se proporciona en la información complementaria. El segundo método utiliza valores determinados a partir de un modelo viscoelástico en un paquete de software comercial para calcular la masa areal, el módulo de cizallamiento complejo y el ángulo de fase de la película de colágeno. El modelo viscoelástico de este software informa del grosor (d), el módulo elástico y la viscosidad (o). El módulo elástico y la viscosidad son los elementos de un modelo Kelvin-Voigt, y se convierten en la magnitud y fase del módulo complejo a través de las siguientes expresiones:
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dondeel n á 2 on1 dondeel 1 es la frecuencia fundamental del sensor de cuarzo (5 MHz). La Figura 4 muestra las propiedades viscoelásticas determinadas para la adsorción de colágeno calculada a partir de losvalores den yDn del tercer y quinto armónico. La Figura 5 compara las propiedades de la Figura 4 con las propiedades convertidas a partir de los resultados del software comercial. Como se puede ver en la Figura 5, los valores del software comercial informan que la película es más suave que la secuencia de comandos de Python.
La Figura 6 describe una relación que se ha observado en experimentos anteriores de QCM3,22 mostrando una relación lineal entre el ángulo de fase viscoelástica y el lagarithm de la magnitud del módulo de cizallamiento complejo. La línea verde indica esta relación lineal, teniendo puntos finales de un fluido newtoniano como el agua ( G* p a 105Pa • g/cm3 y a 90o a3 x 15 mHz)y un polímero sólido o vidrioso elástico (o G* p a 109Pa • g/cm3 y a 0o). Muchos materiales poliméricos estudiados utilizando el QCM siguen esta tendencia empírica general, que se cuantificó utilizando el sistema complejo PSS:PDADMA22. A medida que el PEC se somete a soluciones con mayores concentraciones de sal, la muestra pasa de ser una muestra rígida y vidriosa a ser más viscosa y fluida como; este espectro de propiedades cae en la línea verde. A efectos de comparación, las propiedades calculadas utilizando la secuencia de comandos de Python para la película de colágeno equilibrada también se trazan en la Figura 6. La relación entre el s. G* se espera que p y o sean los mismos para ambos sistemas, dado que ambos sistemas son polímeros vidriosos hinchados con agua. El contenido de agua de la película determina el punto específico a lo largo de la curva. Aquí, el sistema PEC con propiedades mecánicas más cercanas al sistema de colágeno corresponde a una solución de polímero del 20 wt%. De esta comparación deducimos que la concentración de polímeros en la película de colágeno adsorbida también es cercana al 20 wt.%. Este resultado es muy útil, obtenido en nuestro caso por la comparación de resultados obtenidos de dos experimentos QCM adecuadamente diseñados. Uno de estos experimentos fue un experimento de dominio del tiempo (QCM-D, colágeno) y el otro fue un experimento de dominio de frecuencia (QCM-Z, PEC), pero estos tipos de experimentos son completamente intercambiables, con cualquiera de los siguientes tipos de sufficing de protocolo en cualquier caso.
Figura 1: Parcela de los regímenes Sauerbrey, viscoelástico, a granel y sobreamplificado. La gráfica muestra regímenes en los que se pueden obtener diferentes tipos de información a partir de datos QCM, basados en la masa areal de la muestra (relacionada con el grosor) y las propiedades viscoelásticas. Por debajo de la línea azul se encuentra el régimen de Sauerbrey, donde sólo se calcula el grosor de la muestra. Para la región media, se pueden calcular las propiedades de masa y viscoelástica de la muestra. En el régimen a granel en la parte superior izquierda de la parcela, se puede obtener información viscoelástica, pero los experimentos ya no son sensibles al grosor de la muestra. En la parte superior derecha, el régimen sobreamplificado indica que la muestra es demasiado gruesa para realizar una medición qCM. En la gráfica, se asume una relación lineal entre el ángulo de fase viscoelástica en el tercer armónico y el registro de la magnitud del módulo de cizallamiento complejo (línea verde en la Figura 6). El régimen a granel se define como la región donde el espesor es más del doble de la longitud de descomposición de la onda cortante. El régimen de Sauerbrey se define como la región en la que los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores en los que los valores son inferiores a los 10 Hz y el régimen sobreamplificado es el régimen en el que5 es mayor que 20.000 Hz(D5 > 1600 ppm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de pasos principales dentro de una medición QCM. Esquema de un experimento QCM-Z o QCM-D. El diagrama en el primer paso es un sensor QCM (gris) con los electrodos de oro (oro) y película en la parte superior del sensor (púrpura), con las diferentes técnicas utilizadas para aplicar una película a la superficie del sensor. Se indica el grosor de la película, d. El segundo paso resalta los datos de los protocolos experimentales QCM-Z (arriba) y QCM-D (abajo). El tercer paso es donde se determina la región donde se puede analizar la muestra. El cuarto paso muestra los datos resultantes de la región de análisis dada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: "Buenos" y "malos" datos QCM-D para la adsorción de colágeno. Parcelas de la frecuencia y factores de amortiguación para el experimento de adsorción de colágeno. (A) Cambios de frecuencia equilibrados, (B) Cambios de factor de amortiguación equilibrados, (C) Cambios de frecuencia no equilibrados y (D) Cambios de factor de amortiguación no equilibrados. En (B) y (D),el desplazamiento del factor de amortiguación se traza como el factor de disipación, D, y el ancho de banda,, ya que el mismo parámetro se mide por ambos turnos. Los cambios de frecuencia y gamma se normalizan a sus respectivos armónicos (n x 3 o 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis viscoelástico del colágeno utilizando un modelo de ley de potencia. El módulo de fase de cizal la masa areal (A), (B) y (C) ángulo de fase viscoelástico para el experimento de adsorción de colágeno. Las primeras 10 h muestran la etapa principal de adsorción del colágeno a la superficie del sensor, con el período entre 10 y 20 mostrando la etapa de equilibrio antes de que el lavado tampón se realice a 20 h. Las barras de error representan incertidumbres en los cálculos de las propiedades de espesor y viscoelástica, suponiendo un error enlos valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis viscoelástico del colágeno utilizando un modelo de ley de potencia y un modelo de software comercial. El módulo de fase de cizal la masa areal (A), (B) y (C) ángulo de fase viscoelástico para el experimento de adsorción de colágeno. Los valores de la secuencia de comandos de Python se determinan con la secuencia de comandos de Python utilizando losvalores de los valores de los datos experimentales, mientras que los valores D se convierten a partir de los resultados del modelo viscoelástico del software comercial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Gráfica modificada de Van Gurp-Palmen de los datos de colágeno y PSS:PDADMA. Una gráfica del ángulo de fase viscoelástica y el módulo de cizallamiento complejo sobre el rango general de muestras medibles mediante QCM. La línea verde indica la relación lineal entre las dos propiedades que se asumió en el desarrollo de la Figura 1. Los datos del complejo de polielectrolitos PSS:PDADMA (PEC) se reimprimen con el permiso de Sadman et al. 22, copyright 2017 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Molaridad de la solución (M) | mL de 3 M KBr |
| 0.1 | 1 |
| 0.2 | 1.1 |
| 0.3 | 1.2 |
| 0.4 | 1.3 |
| 0.5 | 1.4 |
| 0.6 | 1.5 |
| 0.7 | 1.6 |
| 0.8 | 1.8 |
| 0.9 | 1.9 |
| 1 | 2 |
Tabla 1: Incrementos molares para el experimento de hinchazón de PEC. La cantidad (en ml) de solución de bromuro de potasio de 3 M necesaria para aumentar la molaridad de la solución de agua en 0,1 M para el experimento de hinchazón.
Archivos complementarios: Código Python. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Los resultados de la adsorción de colágeno abarcan los regímenes de Sauerbrey y viscoelástico. Al trazar los cambios de frecuencia normalizados al número armónico correspondiente, observamos que el límite de Sauerbrey se mantiene fiel para aproximadamente las primeras 2 h de la medición. Con el aumento de la masa de adcejo al sensor, sin embargo, los cambios de frecuencia normalizados para el tercer y quinto armónicos comienzan a desviarse unos de otros(t > 2 h), lo que indica una capacidad para determinar las propiedades viscoelásticas de la película adsorbida.
Una comparación directa entre los resultados de modelado viscoelástico del software y el modelado de la ley de potencia del grupo Shull indican una diferencia notable en las propiedades calculadas del material. En el transcurso de la medición, los datos modelados viscoelásticos de software comercial representaban una capa más gruesa y suave con un módulo de cizallamiento complejo inferior(Figura 5). Las diferencias en las propiedades viscoelásticas entre estos modelos se deben a las suposiciones realizadas en los cálculos para cada sistema. Una diferencia se refiere a una suposición que debe hacerse sobre la dependencia de frecuencia de las propiedades viscoelásticas. Es necesario hacer alguna suposición porque la respuesta de frecuencia en un armónico dado (n a 3, por ejemplo), depende de tres parámetros (pd, ? G*3? p,3) pero sólo se miden dos cantidades independientes(. Debido a esta discrepancia, necesitamos obtener al menos una cantidad adicional (ya sea el desplazamiento de frecuencia o disipación) de un armónico adicional sin agregar un desconocido adicional al problema. El grosor y la densidad obviamente no dependen de la frecuencia, pero el módulo de cizallamiento complejo sí. El enfoque de la ley de potencia se basa en el hecho de que en un pequeño rango de frecuencias, podemos suponer que el ángulo de fase es constante, con una respuesta reológica equivalente a un material con un comportamiento de ley de potencia en un rango mucho mayor de frecuencias15,16,18. El exponente de la ley de potencia, el valor de la ley de potencia, el valor de la ley de potencia, no es un parámetro ajustable, pero es igual a 90o, con un valor de grado. Con la suposición de la ley de 
poder, tenemos3 x5 y . Para el modelado viscoelástico cuantitativo, el modelo de ley de potencia representa la mejor combinación de precisión y simplicidad, dando resultados más fiables que otros enfoques comunes, incluido el modelo Kelvin-Voigt, donde se supone que G' es independiente de n y G" aumenta linealmente con n.
Teniendo en cuenta la configuración experimental de los datos PSS:PDADMA, se realizaron experimentos a granel y los regímenes viscoelásticos para generar los datos en la Figura 6. El protocolo detalla la preparación de la muestra para los experimentos del régimen viscoelástico, con los experimentos a granel que se realizan mirando la respuesta del sensor a una solución con el PEC, la sal y el agua presentes. Con el fin de preparar las muestras para los experimentos del régimen viscoelástico, es importante entender el rango de espesor objetivo para permanecer dentro del régimen viscoelástico y evitar sobreamortiguar la respuesta del sensor. Para el sistema PSS:PDADMA, este rango ideal es de 0,8 a 1,6 m. Dado que el PEC inicialmente aumenta de espesor en un 45-50% cuando se hincha en agua, este comportamiento tuvo que ser contabilizado en los espesores iniciales de la película, haciendo un rango objetivo para el espesor inicial de la muestra de 0,45 - 0,65 m. Tener una buena comprensión de cómo se comportará la película durante el experimento es importante para entender el mejor rango de espesor objetivo, así como el mejor método para la preparación de muestras18.
Independientemente de la configuración instrumental exacta, estos procedimientos demuestran la importancia de considerar la preparación de muestras antes de comenzar un experimento qCM. El grosor de la capa aplicada determina la información que se puede extraer de los datos medidos. Antes de comenzar cualquier medición, el investigador debe considerar qué información es más necesaria del experimento y entender las limitaciones de la técnica. Una comprensión de las propiedades viscoelásticas de la película es útil a la hora de determinar el espesor correcto de la muestra y el método de preparación. Para muestras apropiadas, tanto los instrumentos QCM de dominio de tiempo como de dominio de frecuencia se pueden utilizar de forma experta para recopilar datos precisos para una amplia gama de aplicaciones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. y E.S. reconocen el apoyo de la NSF (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
References
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