Summary
在这里，我们提出了一个方案，在体内扩增的肠道-细胞调节T细胞诱导。在此协议中，树突状细胞被设计成局部产生高浓度活性维生素D（1，25-二羟基维生素D或1，25[OH]2 D）和活性维生素A（视黄酸或RA）的活性。
Abstract
炎症性肠病 （IBD） 是胃肠道 （GUT） 中的炎症性慢性疾病。在美国，大约有140万IBD患者。人们普遍认为，对肠道细菌的免疫反应失调会引发疾病并破坏粘膜上皮屏障。我们最近表明，肠道调节T（Treg）细胞是IBD的一种有前途的治疗方法。因此，本文提出了一种在体内扩增肠道Treg细胞诱导的协议。在此协议中，树突状细胞被设计成产生局部高浓度的两种分子，活性维生素D（1，25-二羟基维生素D或1，25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸或RA）。我们根据先前的发现选择1，25（OH）2 D和RA，表明1，25（OH）2 D可以诱导调节分子的表达（例如，叉头盒P3和白细胞介素-10），RA可以刺激T细胞中肠道宿主受体的表达。为了产生这种工程树突状细胞，我们使用慢病毒载体来转导树突状细胞来过度表达两个基因。一个基因是细胞色素P450家族27亚家族B成员1，编码25-羟基维生素D1+羟基酶，这在生理上催化1，25（OH）2 D的合成。另一个基因是甲醛脱氢酶1家族成员A2，编码视网膜醛脱氢酶2，这在生理上催化RA的合成。该协议可用于今后对体内肠道细胞的考察。
Introduction
炎症性肠病 （IBD） 是胃肠道 （GUT） 中的炎症性慢性疾病。在美国，大约有140万IBD患者。人们普遍认为，对肠道细菌的免疫反应失调会引发疾病，并破坏粘膜上皮屏障1，2。因此，目前美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物可以抑制炎症中介的作用，或阻止免疫细胞进入肠道。然而，被攻击的炎症介质和免疫细胞也是免疫防御所必需的。因此，炎症中介抑制剂损害全身免疫防御和免疫细胞阻滞剂削弱肠道免疫防御，两者都可能导致严重后果3，4。此外，免疫细胞阻滞剂还可以阻止调节性T（Treg）细胞进入肠道，从而恶化IBD患者已经受损的肠道免疫耐受性。此外，由于Treg细胞在血液中的积累5，阻断Treg细胞进入肠道也可能导致全身免疫抑制。最后，抑制剂和阻滞剂在瞬时作用下发挥作用，因此需要频繁的管理。频繁使用这些抑制剂和阻滞剂可能会进一步加剧不良的副作用。
最近，我们提出了一个新的策略，可以潜在地减轻甚至消除与当前药物IBD治疗6相关的副作用。这种策略增加了周围淋巴组织6的肠道细胞的诱导。这种策略的原理是，肠道细胞专门归于肠道，因此不会损害全身免疫防御。此外，由于Treg细胞可能形成记忆7，8，肠道细胞可能提供一个稳定的控制慢性肠道炎症在IBD患者，因此，治疗不应该经常进行。此外，由于这种策略增强了体内肠道培养Treg细胞的诱导，因此在高度促进炎的环境中，它与体外产生的Treg细胞的收养转移有关，它不存在体内不稳定的问题。在这方面，体外产生的Treg细胞是治疗自身免疫性疾病11、12、13和移植排斥14、15的拟议策略之一。最后，在此策略中，树突状细胞 （DC） 被设计成产生局部高浓度的两种分子：活性维生素 D（1，25-二羟基维生素 D 或 1，25[OH]2D）和活性维生素 A（视黄酸或 RA）。我们选择了1，25（OH）2 D和RA，因为1，25（OH）2 D可以诱导调节分子的表达（例如，叉头盒P3[foxp3]和白细胞介素-10[IL-10]）16，17，并且RA可以刺激T细胞18的肠道宿主受体的表达。因为1，25（OH）2D和RA也可以容忍DC28，29，我们有理由认为，工程DC将稳定地维持在体内的耐原状态，从而规避与体外产生的耐性DC（TolDC）19、20、21相关的体内不稳定问题。在这方面，TolDCs也是建议在体内增强Treg细胞功能19，20，21的策略之一。为了支持我们的推理，我们已经表明，工程的DC，在体内分娩时，可以增强周围淋巴组织6的肠道胃肠道Treg细胞的诱导。
我们提议的战略的另一个优点是 1，25（OH）2D 还具有其他功能，可能有益于 IBD 患者。这些其他功能包括1，25（OH）2 D的能力，刺激抗菌素22的分泌和抑制致癌23。感染和癌症经常与IBD24，25相关。
为了生成能够产生本地高浓度的1，25（OH）2 D和RA denovo的DC，我们使用慢病毒载体来设计DC，以过度表达两个基因。一个基因是细胞色素P450家族27亚家族B成员1（CYP27B1），编码25-羟基维生素D1+羟基酶（1+-羟基酶），这在生理上催化1，25（OH）2 D的合成。另一个基因是甲醛脱氢酶1家族成员A2（ALDH1a2），编码视网膜醛脱氢酶2（RALDH2），这在生理上催化RA6的合成。
由于在体内扩增肠道Treg细胞诱导在IBD的治疗中可能很重要，在以下协议中，我们将详细说明1+-羟基酶-RALDH2过度表达DC（DC-CYP-ALDH细胞）的生成程序，可用于将来对体内肠道细胞的考察。
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Protocol
所有体内动物研究协议都经过洛马琳达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及美国陆军医学研究与物资司令部动物护理和使用审查办公室（ACURO）的审查和批准。国防部
1. 制备同时表达1-羟基酶和RALDH2（拉比-CYP-ALDH病毒）的Lenti病毒
- 第0天：在清晨，在CM-10-D细胞培养基中制备5 x 105细胞/mL的293T细胞。
- 种子 20 mL/板在 150 毫米 x 25 毫米培养皿。在37°C和5%CO2培养细胞24小时，24小时后，汇合率将达到+80-90%。
- 第 1 天：制作 2x HBS（50 mM HEPES、280 mM NaCl 和 1.5 mM Na2HPO4，pH 7.1）。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 制作 2 M CaCl2，在室温下储存。
- 对于每个 150 mm x 25 mm 培养皿，在无菌 50 mL 培养管中制备 DNA 沉淀混合物。首先，加入1，620 μL的2xHBS，9.5 μg的PMD2G（VSVG），17.5 μg的pCMVR8.74（辣椒），27μg的Lenti-CYP-ALDH质粒（一种同时携带CYP27B1和ALDH1a2的慢病毒载体）。其次，将 H2O 添加到 3，037.5 μL 的最终体积中。
- 在最后一个，加入202.5 μL的2MCaCl2滴，同时混合溶液到最终浓度1xHBS和125 mM CaCl2。CaCl2必须是最后要添加的。将转染混合物在室温下保持20分钟，偶尔混合。对于多个 150 mm x 25 mm 培养皿，可相应地放大。
- 将 3，240 μL 的 DNA 沉淀混合物滴滴添加到包含 293T 细胞的 1 个 150 mm x 25 mm 培养盘中。在加入DNA沉淀混合物的同时，轻轻旋转培养皿一侧。在37°C和5%CO2孵育24小时。
- 第2天：去除磷酸钙转染溶液，用1x PBS轻轻清洗，用CM-4-D细胞培养基重新喂养细胞培养基。在37°C和5%CO2孵育细胞24小时。
- 第3天：在无菌储存瓶中收获上生子，储存在4~8°C。用新鲜的CM-4-D细胞培养基补充细胞培养。在37°C和5%CO2培养细胞，再持续24小时。
- 第4天：将上生菌收获无菌储存瓶。通过 0.45 μm 过滤器过滤第 3 天和第 4 天的超生物。要浓缩VSVG伪型病毒，将上生子转移到离心管中，在4°C下以4，780 x g旋转24小时。
- 第5天：将上生物从颗粒中倒出（颗粒通常可见），让管子在无菌生物安全柜中用纸巾排干几分钟。
- 通过用含有5%甘油的无菌PBS移液来重新悬浮颗粒。重新悬浮的体积为每 150 mm x 25 mm 培养盘 33.3 μL。
- 等分 200 μL/管，储存在 -80°C。为滴定目的，制作单独的 50 μL/vial 等分。钳位应在 108~109个传感器单元 （TUs）/mL 的范围内。
- 在培养皿中加入漂白剂并丢弃。
注：这些转染细胞是协议中最大的安全问题，因为所有慢病毒元素都表达在细胞中。
2. 骨髓衍生DC的生成
- 从4⁄5 Balb/c小鼠将tibias和股骨收获到含有培养基6的50mL无菌聚丙烯管中。
- 将 tibias 和股骨转移到包含培养基的 100 mm x 20 mm 培养盘中。使用解剖剪刀和钳子从肌肉和股骨中取出肌肉等组织。
- 切断骨和股骨的两端，露出骨髓腔。
- 在连接到 30 G 针头的 10 mL 注射器中绘制 10 mL 培养基。
- 小心地将针头插入骨髓腔，将骨髓冲洗到干净的 50 mL 无菌聚丙烯管中。如有必要，请重复此过程，以确保骨髓已完全冲洗。
- 在2~8°C下通过离心（400 x g）将骨髓细胞压岁5分钟，将上清液吸气。
- 用5 mL的1x红细胞赖沙缓冲液重新悬浮颗粒。
- 在室温下孵育细胞4~5分钟，偶尔摇动。
- 加入30 mL培养基，停止反应。
- 在2~8°C下离心（400 x g）将细胞压一起5分钟，在10mL的CM-10-R细胞培养基中重新悬浮细胞。如果需要，细胞可以通过40μm细胞过滤器来清除碎屑。
- 使用 CM-10-R 细胞培养基，执行细胞计数并将细胞调整到 1 x 106细胞/mL。
- 加入重组的鼠粒细胞/巨噬细胞菌群刺激因子（GM-CSF，最终浓度=100 U/mL）和鼠白细胞介素-4（IL-4，最终浓度=10 U/mL）。
注：GM-CSF 和 IL-4 的库存溶液分别存储在 -80°C 的 100，000 U/mL （1，000x） 和 10，000 U/mL （1，000x） 下。 - 以4mL/孔将细胞分配到6孔培养板中，在37°C和5%CO2培养细胞48小时。
- 用温和的移液去除非粘附细胞。
- 添加含有GM-CSF（100 U/mL）和IL-4（10 U/mL）的新鲜CM-10-R细胞培养基。将细胞再培养 48 小时。
- 收获非粘附细胞（BMDC），用于通过慢透-CYP-ALDH病毒转导。
3. 转用慢透-CYP-ALDH病毒的DC-CYP-ALDH细胞，以生成DC-CYP-ALDH细胞
- 在总体积为 0.5 mL 的 CM-10-R 细胞培养培养基中制备 1 x 106 DC/孔，在 6 孔培养板中含有 50 μL 病毒和 8 μg/mL 蛋白酶胺。
- 在37°C和5%CO2培养细胞24小时。
- 用新鲜的CM-10-R细胞培养基替换培养基，在37°C和5%CO2培养细胞2再24小时。此时，可以评估 1μ-羟基酶和 RALDH2 的酶活性（参见步骤 4）。如有必要，重复步骤 3.1_3.3 进行第二次转导。
- 加入脂多糖（100纳克/mL），将细胞培养24小时。
- 收获细胞（DC-CYP-ALDH细胞）进行实验。
4. DC-CYP-ALDH细胞中过度表达的1-羟基酶和RALDH2的评价
- DC-CYP-ALDH细胞中过度表达的1-羟基酶的评价
- 种子 1.0 x 106 DC-CYP-ALDH 细胞/孔在 2 mL 的 CM-10-R 细胞培养培养基进入 12 孔培养板。
- 将25（OH）D添加到2.5μM的最终浓度。孵育DC-CYP-ALDH细胞24小时。
- 收获上生子，储存在-20°C。
- 使用市售的放射性免疫测定（RIA）测定上生物中1，25（OH）2D浓度（见材料表）。
- 使用抗CYP27B1抗体，通过荧光活性细胞分拣（FACS）确定DC-CYP-ALDH细胞中1-羟基酶的表达。
- DC-CYP-ALDH细胞中过度表达的RALDH2的评价
注：过度表达的RALDH2的表达和活性是使用商业醛脱氢酶（ALDH）检测试剂盒（见材料表）确定的。- 在两个 5 mL 管中，每个管（一个标记为"控制"，另一个标记为"测试"），每个管中种子 1 mL 的 DC-CYP-ALDH 或控制细胞（1 x 105细胞/mL 在检测缓冲液中）。
- 在每个控制管中加入10μL二甲氨基甲醛（DEAB）溶液（95%乙醇中的1.5 mM），并立即混合。DEAB是一种RALDH2抑制剂。
- 在控制和试管中加入5μL的活性RALDH荧光基板（300μM），并立即混合。
- 孵育管45分钟。
- 在2~8°C下以400 x g离心将细胞压离5分钟。吸气上生子。
- 在200μL的测定缓冲液中重组细胞。
- 将细胞保存在冰上，然后由FACS进行分析。
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Representative Results
DC-CYP-ALDH细胞表达的1-羟基酶的量显著增加。为了确定BMDC产生的DC-CYP-ALDH细胞是否表示1-羟基酶的含量显著增加，BMDC与慢透-CYP-ALDH病毒一起转导，以产生骨髓衍生的DC-CYP-ALDH细胞（BMDC-CYP-ALDH细胞）。随后，FACS对BMDC-CYP-ALDH细胞的1-羟基酶的表达进行了检查。我们的数据表明，BMDC-CYP-ALDH细胞与亲子细胞相比，显示了1°-羟基酶的增强表达（图1A）。我们还测定了BMDC-CYP-ALDH细胞中1+羟基酶的酶活性。为此，在2mL的CM-10-R细胞培养基中，将1.0 x10 6 BMDC-CYP-ALDH细胞添加到12孔培养板中。25（OH）D然后以2.5μM的最终浓度添加到细胞培养中。细胞在37°C和5%CO2培养24小时，并收集上生子，使用放射性免疫测定（RIA）测量1，25（OH）2D。我们的数据表明，BMDC-CYP细胞（用慢比-CYP-GFP病毒转导的BMDC）和BMDC-CYP-ALDH细胞的培养上生子中1，25（OH）2 D浓度分别比亲子细胞和BMDC-ALDH细胞（BMDC-ALDH病毒转导）的浓度高出约20倍（图1B）。
DC-CYP-ALDH细胞表达的RALDH2含量显著增加。为了确定BMDC-CYP-ALDH细胞是否表达出拉脱二醇的显著增加量，在存在或不存在RALDH2抑制剂二甲苯甲醛（DEAB）（15μM）的情况下，将RALDH2基质添加到细胞培养物中。FACS对细胞内保留的荧光产物进行了分析。我们的数据表明，BMDC-CYP-ALDH细胞的平均荧光强度（MMU）比父母BMDC高出约6倍，这表明BMDC-CYP-ALDH细胞与亲子细胞相比，表达的RALDH2酶活性显著增强（图2A，B）。
DC-CYP-ALDH细胞增强了foxp3+CCR9+肠道培养Treg细胞在体外的诱导。为了研究DC-CYP-ALDH细胞是否能够在体外增强肠道细胞的诱导，我们转导了DC2.4细胞（骨髓衍生的DC线路26、27、28、29），并生成了DC2.4-CYP-ALDH细胞。随后，我们确定DC2.4-CYP-ALDH细胞是否能够增强体外肠道培养Treg细胞的诱导。因此，从C57BL/6小鼠中纯化了幼稚的CD4+T细胞。纯化的幼稚CD4= T细胞在5 x 105细胞/井然后与亲子DC2.4细胞（1 x 105细胞/井）或DC2.4-CYP-ALDH细胞（1 x 在无血清培养基中，在24孔培养板中，在抗CD3单克隆抗体（5μg/mL）和重组人IL-2（50 U/mL）的情况下，在24个孔培养板中10个5个细胞/孔）。此外，在培养物中也添加了25（OH）D和不同浓度的视黄醇。细胞在37°C和5%CO2下孵育。五天后，FACS对细胞进行了Foxp3和c-c化学素受体类型9（CCR9）的表达分析。我们的数据表明，在基质存在的情况下，DC2.4细胞没有显著改变CD4+T细胞群中foxp3+CCR9+细胞的丰度（图3A，B）。相比之下，DC2.4-CYP-ALDH细胞显著增强了CD4+T细胞中foxp3+ CCR9+细胞的丰度。此外，25（OH）D添加越多，DC2.4-CYP-ALDH细胞增加CD4+T细胞中foxp3+CCR9+细胞丰度的能力就越大。因此，我们的数据支持DC-CYP-ALDH细胞可以增强体外肠道培养Treg细胞的诱导。
DC-CYP-ALDH细胞增强了foxp3+ CCR9+体内肠道培养Treg细胞的诱导。为了确定DC-CYP-ALDH细胞是否能增强体内肠道细胞的诱导，我们向Balb/c小鼠进行以下细胞之一的渗透内施用：亲子DC2.4细胞、DC2.4-CYP细胞（用慢比-CYP-GFP病毒转导的DC2.4细胞）和DC-2.4-CYP-ALDH细胞。细胞给给四天后，FACS（图4A）对淋巴结进行了检查。我们的数据表明，与对照组相比，DC2.4-CYP-ALDH细胞显著增加了FOXp3+ CCR9+CD3+T细胞中的细胞的丰度（图4B，C）。基于这些结果，我们得出结论，DC-CYP-ALDH细胞管理显著增强狐狸3+CCR9+ T细胞在周围淋巴组织中的诱导。
图1：DC-CYP-ALDH细胞表达的1-羟基酶量显著增加。（A） BMDC-CYP-ALDH细胞由FACS生成并分析.具有代表性的FACS图显示了1+-羟基酶在父母BMDC和BMDC-CYP-ALDH细胞中的表达（在活细胞上封闭）。（B） 1°-羟基板（即25（OH）D）被添加到直流培养物中。24小时后，采集了超生物，测量了1，25（OH）2 D浓度。数据显示，在父母BMDC、BMDC-CYP细胞、BMDC-ALDH细胞和BMDC-CYP-ALDH细胞的培养物中，浓度为1，25（OH）2 D。\p < 0.01.方差分析测试。n = 4。这个数字是改编自徐等人6。版权所有 2019.美国免疫学家协会，公司请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2：DC-CYP-ALDH细胞表达的RALDH2量显著增加。（A） BMDC-CYP-ALDH细胞被生成并分析，如协议所述。代表性叠加FACS图显示BMDC中的BODIP氨基乙酸荧光和BMDC-CYP-ALDH细胞在RALHD2抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）的存在（+DEAB）或不存在（-DEAB）的情况下。（B） 在缺乏DEAB的情况下，BMDC和BMDC-CYP-ALDH细胞中BODIP氨基乙酸酯的平均荧光强度（MDIP）。*p < 0.05;t 检验;n = 4。这个数字是改编自徐等人6。版权所有 2019.美国免疫学家协会，公司请点击这里查看这个数字的较大版本。
图3：DC-CYP-ALDH细胞增强了foxp3+ CCR9+体外肠道Treg细胞的诱导。 （A） CD4=幼稚的 T 细胞从 C57BL/6 小鼠脾脏中分离出来。CD4+ T细胞随后在培养基由抗CD3 mAb（5 μg/mL）在亲子DC2.4细胞或DC2.4-CYP-ALDH细胞存在的情况下激活。此外，在指示浓度为25（OH）D和视黄醇时加入培养物。五天后，FACS对细胞在CD3+CD4+T细胞群中的foxp3和CCR9的表达进行收集和分析。具有代表性的FACS图显示了CD3+CD4+ T细胞群中foxp3和CCR9的表达。（B） 来自 （A） 的累积数据.*p < 0.05;方差检测;n = 4。这个数字是改编自徐等人6。版权所有 2019.美国免疫学家协会，公司请点击这里查看这个数字的较大版本。
图4：DC-CYP-ALDH细胞增强了foxp3+ CCR9+体内肠道Treg细胞的诱导。（A） 巴布/c 小鼠在腹内（即p.）收到以下直流转移（转移）之一：无直流转移（无转移）、亲DC2.4细胞、DC2.4-CYP细胞和DC2.4-CYP-ALDH细胞。四天后，FACS对淋巴结（MLN）进行了分析。（B） 代表性FACS图显示了CD3+T细胞群中foxp3和CCR9的表达。（C） 来自 （B） 的累积数据显示了 CD3+ T 细胞群中 foxp3+CCR9+细胞的百分比。细胞在CD3和T细胞上被封闭，用于所有分析。在适用的情况下，提供的数据为：SEM._p < 0.05;方差检测;n = 4×6。这个数字是改编自徐等人6。版权所有 2019.美国免疫学家协会，公司请点击这里查看这个数字的较大版本。
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Discussion
在本文中，我们将描述DC-CYP-ALDH细胞的使用，用于增强周围淋巴组织内肠道细胞的诱导。我们的数据表明，DC-CYP-ALDH细胞可以在存在相应基质（即分别为25[OH]D和视黄醇）的情况下，在体外合成1，25（OH）2 D和RA的局部高浓度。由于在有30、31缺症的患者中，分别可以通过维生素D和A补充轻松获得足够的血液浓度，因此，当存在25（OH）D和视黄醇的正常血液浓度时，DC-CYP-ALDH细胞可以增强周围淋巴组织中肠道细胞的诱导。为了支持这一推理，我们的数据表明，在没有维生素D和维生素A缺乏症的正常健康动物中，DC-CYP-ALDH细胞增强了Treg细胞的诱导，这些细胞表达调控分子（即foxp3和IL-10）和肠道宿主受体（即CCR9）。因此，该技术可用于进一步研究肠胃Treg细胞，用于治疗IBD。
该协议的一个关键步骤是生产具有高色极的扁豆-CYP-ALDH病毒。首选的病毒定位剂应为 108+109图图/mL。对于DC的高转导效率，需要使用扁豆-CYP-ALDH病毒的高色度。
该协议的另一个关键步骤是DC中的转导效率。由于DC-CYP-ALDH细胞在这项技术中不会在体外被耐受，因此转导率必须超过90%，以确保DC-CYP-ALDH细胞能够有效地增强体内肠道结源Treg细胞的诱导。此外，DC-CYP-ALDH细胞在体内分管32之前，可由FACS进一步纯化。
该协议的一个独特优点是，DC-CYP-ALDH细胞在体内给给之前不需要在体外进行耐性。由于1，25（OH）2 D和RA的联合行动，预计DC-CYP-ALDH细胞将维持在体内的致畸状态，因为1，25（OH）2 D和RA已被证明能够容忍DC33，34。因此，我们预计DC-CYP-ALDH细胞在体内的前列腺炎环境中不会有不稳定问题。
目前，我们只证明DC-CYP-ALDH细胞可以增加周围淋巴组织和肠道6中肠道细胞的频率（数量）。因此，由于肠道中的 Treg 细胞百分比增加，肠道整体的调节功能得到了增强。图4显示，与对照治疗相比，使用DC-CYP-ALDH细胞的腹内治疗显著增加了CCR9+ foxp3+ Treg细胞在脑淋巴结中的百分比，这意味着在脑淋巴结中更多的Treg细胞能够专门进入肠道组织。图4进一步表明，在肠淋巴结中，大多数foxp3+ T细胞对CCR9呈阴性，因此没有肠道吸收能力。然而，DC-CYP-ALDH细胞是否也能增强每个Treg细胞本身的调节功能（如foxp3和/或IL-10的增强表达水平）需要进一步调查。
此处描述的试剂和材料仅用于动物研究。然而，该协议适用于人类研究，使用相应的人类试剂和材料，除了DC将产生从外周血单核细胞在人类。该协议的最终目标是生成用于IBD治疗的临床级DC-CYP-ALDH细胞。
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Disclosures
唐晓磊博士和大卫·贝林克博士是与这项研究相关的一项待决专利的发明者。
Acknowledgments
这项工作得到了负责卫生事务的助理国防部长办公室的支持，该计划通过"同行评审医学研究计划"获得第1号奖。W81XWH-15-1-0240 （XT）。意见、解释、结论和建议是作者的意见、解释、结论和建议，不一定得到国防部的认可。这项工作还部分得到了洛马琳达大学医学系的研究创新赠款（681207-2967[XT和GG]、681205-2967[XT]和325491[DJB]的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
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