Summary
Her præsenterer vi en protokol for in vivo augmentation af Gut-homing regulatoriske T-celle induktion. I denne protokol er dendritiske celler konstrueret til lokalt at producere høje koncentrationer af det aktive vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2D) og den aktive vitamin a (RETINSYRE eller RA) de Novo.
Abstract
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en inflammatorisk kronisk sygdom i mave-tarmkanalen (GUT). I USA er der ca. 1.400.000 IBD-patienter. Det er almindeligt anerkendt, at en dysreguleret immunrespons på tarm bakterier initierer sygdommen og forstyrrer slimhinde epitelial barrieren. Vi har for nylig vist, at Gut-homing regulerende T (Treg) celler er en lovende behandling for IBD. Derfor indeholder denne artikel en protokol for in vivo augmentation af tarm-homing Treg celle induktion. I denne protokol er dendritiske celler konstrueret til at producere lokalt høje koncentrationer af to molekyler de Novo, aktiv vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2D) og aktiv vitamin a (retinsyre eller RA). Vi valgte 1,25 (OH)2d og RA baseret på tidligere resultater, der viser, at 1,25 (Oh)2d kan inducere ekspression af regulerende molekyler (f. eks. Forkhead box P3 og interleukin-10), og at RA kan stimulere ekspression af tarm-homing receptorer i T-celler. For at generere sådanne konstruerede dendritiske celler bruger vi en lentiviral vektor til at transduce dendritiske celler til at over udtrykke to gener. Et gen er cytochrom P450 familie 27 familien B medlem 1, der koder 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase, som fysiologisk katalyserer syntesen af 1,25 (Oh)2D. Det andet gen er aldehyd dehydrogenase 1 familiemedlem a2, der koder retinaldehyd dehydrogenase 2, som fysiologisk katalyserer syntesen af RA. Denne protokol kan anvendes til fremtidig undersøgelse af Gut-homing Treg celler in vivo.
Introduction
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en inflammatorisk kronisk sygdom i mave-tarmkanalen (GUT). I USA er der ca. 1.400.000 IBD-patienter. Det er almindeligt anerkendt, at en dysreguleret immunrespons på tarm bakterier initierer sygdommen og forstyrrer slimhinde epitelial barrieren1,2. Af denne grund, i øjeblikket tilgængelige U.S. Food and Drug Administration (FDA)-godkendte lægemidler hæmmer funktionerne af inflammatoriske mediatorer eller blokere homing af immunceller i tarmen. Men, de inflammatoriske mediatorer og immunceller, der er målrettet er også nødvendige for immunforsvaret. Som et resultat, de inflammatoriske mediator hæmmere kompromittere systemiske immunforsvar og immuncelle homing blokkere svække tarm immunforsvar, som begge kan føre til alvorlige konsekvenser3,4. Desuden kan immuncelle homing blokkere også blokere for homing af regulerende T (Treg) celler i tarmen og dermed kan forværre den allerede kompromitterede tarm immuntolerance i IBD patienter. Desuden kan blokering af Treg-celle homing i tarmen også føre til systemisk immunsuppression på grund af ophobning af Treg celler i blodet5. Endelig virker inhibitorer og blokkere forbigående og kræver dermed hyppige administrationer. Hyppig administration af disse hæmmere og blokkere kan yderligere forværre de uheldige bivirkninger.
For nylig foreslog vi en ny strategi, der potentielt kan afbøde eller endda eliminere bivirkningerne forbundet med nuværende lægemidler til IBD behandling6. Denne strategi forstærker induktion af tarm-homing Treg celler i perifert lymfevæv6. Rationalet bag denne strategi er, at Gut-homing Treg celler specifikt hjem til tarmen og dermed ikke vil kompromittere systemiske immunforsvar. Desuden, da treg celler kan potentielt danne hukommelse7,8, Gut-homing treg celler kan potentielt give en stabil kontrol af kronisk tarmbetændelse i IBD patienter og dermed, behandling bør ikke behøver at blive administreret så hyppigt. Da denne strategi desuden forstærker induktion af tarmationstreg-celler in vivo, er der ingen bekymring for in vivo-ustabilitet i et stærkt proinflammatorisk miljø, der er forbundet med adoptiv overførsel af in vitro-genererede treg-celler9,10. I denne henseende, in vitro genereret treg celler er en af de foreslåede strategier for behandling af autoimmune sygdomme11,12,13 og transplantation afvisning14,15. Endelig, i denne strategi, dendritiske celler (DCs) er konstrueret til at producere lokalt høje koncentrationer af to molekyler de Novo: aktiv vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2D) og aktive vitamin a (retinsyre eller RA). Vi valgte 1,25 (Oh)2d og RA fordi 1,25 (Oh)2d kan inducere ekspression af regulerende molekyler (f. eks, forkhead box P3 [foxp3] og interleukin-10 [Il-10])16,17 og at RA kan stimulere ekspression af Gut-homing receptorer i T-celler18. Fordi både 1,25 (Oh)2D og RA også kan tolerize DCS28,29, vi grunden til, at de konstruerede DCS vil være stabilt vedligeholdt i en tolerogenic status in vivo og dermed omgå in vivo ustabilitet bekymringer, der er forbundet med in vitro genereret tolerogenic DCS (toldcs)19,20,21. I denne henseende er toldc'er også en af de foreslåede strategier for in vivo augmentation af treg celle funktioner19,20,21. For at støtte vores ræsonnement, har vi vist, at de konstruerede DCs, ved in vivo levering, kan forøge induktion af Gut-homing Treg celler i perifert lymfoid væv6.
En yderligere fordel ved vores foreslåede strategi er, at 1,25 (OH)2D har også andre funktioner, der potentielt kan gavne IBD patienter. Disse andre funktioner omfatter evnen af 1,25 (OH)2D at stimulere udskillelsen af antimikrobielle stoffer22 og undertrykker carcinogenese23. Infektioner og kræft er ofte forbundet med IBD24,25.
For at generere de DCs, der kan producere lokalt høje koncentrationer af både 1,25 (OH)2D og RA de Novo, bruger vi en lentiviral vektor til at ingeniør DCS til at over udtrykke to gener. Et gen er cytochrom P450 familie 27 familien B medlem 1 (CYP27B1), der koder 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase (1α-hydroxylase), som fysiologisk katalyserer syntesen af 1,25 (Oh)2D. Det andet gen er aldehyd dehydrogenase 1 familiemedlem a2 (ALDH1a2), der koder retinaldehyd dehydrogenase 2 (RALDH2), som fysiologisk katalyserer syntesen af RA6.
Fordi in vivo augmentation af Gut-homing Treg celle induktion er potentielt vigtigt i behandlingen af IBD, i den følgende protokol vil vi detaljeret de procedurer for generering af de 1α-hydroxylase-RALDH2-overudtrykker DCs (DC-CYP-ALDH celler), der kan anvendes til den fremtidige undersøgelse af Gut-homing Treg celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo dyreforsøg protokoller blev gennemgået og godkendt af Loma Linda University institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC) samt Animal Care og use Review Office (ACURO) af den amerikanske hær medicinsk forskning og materiel Command (USAMRMC) af Forsvarsministeriet.
1. klargøring af lentivirus, der udtrykker både 1α-hydroxylase og RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH-virus)
- Dag 0: i den tidlige morgen, forberede 5 x 105 celler/ml af 293T celler i cm-10-D cellekulturmedium.
- Frø 20 mL/plade i 150 mm x 25 mm kultur retter. Kultur cellerne ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h. Konfluency vil nå ~ 80 – 90% efter 24 h.
- Dag 1: lav 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl og 1,5 mM na2HPO4, pH 7,1). Opbevares ved-20 °C.
- Lav 2 M CaCl2 og opbevar ved stuetemperatur.
- For hver 150 mm x 25 mm kulturfad, Forbered en DNA-udfældnings blanding i et sterilt 50 mL kulturrør. Først tilsættes 1.620 μL 2x HBS, 9,5 μg PMD2G (VSVG), 17,5 μg pCMVR 8.74 (capsid), 27 μg Lenti-CYP-ALDH plasmid (en lentiviral vektor, der bærer både CYP27B1 og ALDH1a2). For det andet tilsættes H2O til et endeligt volumen på 3.037,5 μl.
- I det sidste, tilsættes 202,5 μl af 2 M CaCl2 dråbevis mens blande opløsningen til endelige koncentrationer af 1x HBS og 125 mm CaCl2. CaCl2 skal være den sidste, der skal tilføjes. Lad transfektering blandingerne være ved stuetemperatur i 20 minutter med lejlighedsvis blanding. For flere 150 mm x 25 mm kultur retter, skala op i overensstemmelse hermed.
- Tilsæt 3.240 μl DNA nedbør blanding dråbevis til 1 150 mm x 25 mm kultur skål indeholdende 293t celler. Hvirvl forsigtigt kultur skålen side til side, mens du tilføjer DNA-udfældnings blandingen. Ret ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Dag 2: Fjern calcium fosfat transfektering opløsningen, vask forsigtigt med 1x PBS, og genfodre cellekulturen med cm-4-D cellekulturmedium. Cellerne inkubates ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Dag 3: høst Supernatanterne i sterile opbevarings flasker, og opbevar dem ved 4 – 8 °C. Genfyld cellekulturen med frisk CM-4-D cellekulturmedium. Kultur cellerne ved 37 °C og 5% CO2 for yderligere 24 timer.
- Dag 4: høst Supernatanterne i sterile opbevarings flasker. Supernatanterne filtreres fra dag 3 og dag 4 gennem et 0,45 μm filter. For at koncentrere VSVG-pseudo typen virus skal Supernatanterne overføres til centrifugeglas og centrifugeres ved 4.780 x g i 24 timer ved 4 °c.
- Dag 5: Hæld Supernatanterne af pellets (pellet er ofte synlig) og lad rørene til at dræne på en papir håndklæde i en steril biosikkerhed kabinet i flere minutter.
- Resuspendere pellets ved pipettering med steril PBS indeholdende 5% glycerol. Volumenet til opblanding vil være 33,3 μl pr. 150 mm x 25 mm kulturfad.
- Alikvot 200 μL/rør og opbevares ved-80 °C. Lav en separat alikvot på 50 μL/hætteglas til titrerings formål. Titre skal være inden for intervallet 108– 109 transducere (TUs)/ml.
- Tilsæt blegemiddel i kultur retterne og kassér dem.
Bemærk: disse transficeret celler er den største sikkerhedsmæssige bekymring i protokollen, da alle lentiviral elementer er udtrykt i cellerne.
2. generering af knoglemarv afledt DCs (BMDCs)
- Høst forbenede og skinneben er fuldstændig fra 4 – 5 Balb/c-mus til et 50 ml sterilt polypropylenrør indeholdende kulturmediet6.
- Overfør forbenede og skinneben er fuldstændig til en 100 mm x 20 mm kultur skål, der indeholder dyrkningsmediet. Fjern væv såsom muskler fra forbenede og skinneben er fuldstændig ved hjælp dissekere saks og pincet.
- Skær begge ender af forbenede og skinneben er fuldstændig at udsætte knoglemarv hulrum.
- Tegn 10 mL dyrkningsmedium i en 10 mL sprøjte, der er fastgjort til en 30 G nål.
- Indsæt forsigtigt nålen i knoglemarvs hulen og skyl knoglemarven i et rent 50 mL sterilt polypropylenrør. Gentag denne procedure, hvis det er nødvendigt, for at sikre, at knoglemarven er blevet fuldstændig skyllet ud.
- Pellet knoglemarv celler ved centrifugering (400 x g) ved 2 – 8 °c i 5 min. aspirere supernatanten.
- Resuspendere pellet med 5 mL 1x røde blodlegemer lyse buffer.
- Cellerne inkubates ved stuetemperatur i 4 – 5 minutter med lejlighedsvis rystning.
- Stop reaktionen ved at tilsætte 30 mL dyrkningsmedium.
- Pellet cellerne ved centrifugering (400 x g) ved 2 – 8 °c i 5 min. resuspension cellerne i 10 ml cm-10-R cellekulturmedium. Hvis det er nødvendigt, kan cellerne ledes gennem et 40 μm cellefilter for at fjerne snavs.
- Udfør en celletal og justere cellerne til 1 x 106 celler/ml ved hjælp af cm-10-R cellekulturmedium.
- Tilsæt rekombinant murin granulocyt/macrophage Colony-stimulerende faktor (GM-CSF, Final koncentration = 100 U/mL) og murine interleukin-4 (IL-4, endelig koncentration = 10 U/mL).
Bemærk: stamopløsninger af GM-CSF og IL-4 opbevares ved-80 °C ved 100.000 U/mL (1.000 x) og 10.000 U/mL (1.000 x) hhv. - Distribuer cellerne til 6 brønd kultur plader ved 4 mL/brønd og kultur cellerne ved 37 °C og 5% CO2 for 48 h.
- Fjern ikke-vedhængende celler med blid pipettering.
- Tilsæt frisk CM-10-R cellekulturmedium, der indeholder GM-CSF (100 U/mL) og IL-4 (10 U/mL). Kultur cellerne for en anden 48 h.
- Høst ikke-vedhængende celler (Bmdc'er) til transduktion ved Lenti-CYP-ALDH-virus.
3. transduktion af DCs med Lenti-CYP-ALDH-virus til generering af DC-CYP-ALDH-celler
- Der forberedes 1 x 106 DCS/brønd i et samlet volumen på 0,5 ml cm-10-R cellekulturmedium indeholdende 50 μl virus og 8 μg/ml protamin i en 6 brønd kultur plade.
- Kultur cellerne ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h.
- Udskift mediet med frisk CM-10-R cellekulturmedium og kultur cellerne ved 37 °C og 5% CO2 for yderligere 24 h. På dette tidspunkt kan enzymatiske aktiviteter af 1α-hydroxylase og RALDH2 evalueres (Se trin 4). Gentag om nødvendigt trin 3.1-3.3 for en anden transduktion.
- Tilsæt lipopolysaccharid (100 ng/mL) og kultur cellerne i 24 timer.
- Høst cellerne (DC-CYP-ALDH celler) til eksperimenter.
4. evaluering af den over udtrykte 1α-hydroxylase og RALDH2 i DC-CYP-ALDH-celler
- Vurdering af den over udtrykte 1α-hydroxylase i DC-CYP-ALDH-celler
- Frø 1,0 x 106 DC-CYP-aldh celler/godt i 2 ml cm-10-R cellekulturmedium i 12 brønd kultur plader.
- Tilsæt 25 (OH) D til den endelige koncentration på 2,5 μM. Inkuber DC-CYP-ALDH-cellerne i 24 timer.
- Høst Supernatanterne og opbevar ved-20 °C.
- Analyse for 1,25 (OH)2D koncentrationer i Supernatanterne ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt radio immun assay (RIA) (Se tabel over materialer).
- Bestem ekspression af 1α-hydroxylase i DC-CYP-ALDH celler ved fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) ved hjælp af et anti-CYP27B1-antistof.
- Evaluering af de over udtrykte RALDH2 i DC-CYP-ALDH-celler
Bemærk: ekspression og aktivitet af de over udtrykte RALDH2 bestemmes ved hjælp af et kommercielt aldehyd dehydrogenase (ALDH) detektionssæt (Se tabel over materialer).- Frø 1 mL DC-CYP-ALDH eller kontrol celler (1 x 105 celler/ml i analyse buffer) i hver af to 5 ml rør (en mærket som "Control" og den anden mærket som "test").
- Tilsæt 10 μL diethylaminobenzaldehyd (DEAB) opløsning (1,5 mM i 95% ethanol) til hvert af kontrolrørene og bland straks. DEAB er en RALDH2-hæmmer.
- 5 μL aktiveret RALDH fluorescens substrat (300 μM) tilsættes til kontrol-og reagensglas og blandes straks.
- Rørene inkuberes i 45 min.
- Cellerne centrifugeres ved centrifugering ved 400 x g ved 2 – 8 °c i 5 min. Aspirer Supernatanterne.
- Cellerne rekonstruere i 200 μL analyse buffer.
- Opbevar cellerne på is og Fortsæt til analyse af FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DC-CYP-ALDH-celler udtrykte signifikant øget mængde af 1α-hydroxylase. For at afgøre, om DC-CYP-ALDH-celler genereret fra Bmdc'er udtrykte en signifikant forøget mængde på 1α-hydroxylase, blev Bmdc'er transduceret med Lenti-CYP-ALDH-virus til at producere knoglemarv afledte DC-CYP-ALDH-celler (BMDC-CYP-ALDH-celler). Efterfølgende blev BMDC-CYP-ALDH-cellerne undersøgt for ekspression af 1α-hydroxylase af FACS. Vores data viste, at BMDC-CYP-ALDH-cellerne, sammenlignet med forældre-Bmdc'erne, viste forbedret ekspression af 1α-hydroxylase (figur 1A). Vi fastsatte også den enzymatiske aktivitet af 1α-hydroxylase i BMDC-CYP-ALDH-cellerne. For at gøre dette, 1,0 x 106 bmdc-CYP-aldh celler i 2 ml cm-10-R cellekulturmedium blev tilføjet til 12 godt kultur plader. 25 (OH) D blev derefter føjet til cellekulturen ved den endelige koncentration på 2,5 μM. Cellerne blev dyrket ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer, og Supernatanterne blev høstet til måling af 1,25 (Oh)2D ved hjælp af et radio immun assay (RIA). Vores data viste, at 1,25 (OH)2D koncentrationer i kultur Supernatanterne i BMDC-CYP-cellerne (Bmdc'er transduceret med Lenti-CYP-gfp-virus) og BMDC-CYP-aldh-cellerne var hver ca. 20x højere end for forældre-bmdc'erne og BMDC-aldh-cellerne (bmdc'er transduceret med Lenti-aldh-virus) (figur 1B).
DC-CYP-ALDH-celler udtrykte signifikant forøget mængde RALDH2. For at fastslå, om BMDC-CYP-ALDH-celler udtrykte en signifikant forøget mængde på RALDH2, blev der tilsat et RALDH2 substrat til cellekulturer ved tilstedeværelse eller fravær af den RALDH2 inhibitor diethylaminobenzaldehyd (DEAB) (15 μM). Det fluorescerende produkt, som opbevares inde i cellerne, blev analyseret af FACS. Vores data viste, at de gennemsnitlige fluorescens intensiteter (MFI'er) af BMDC-CYP-ALDH-cellerne var ca. 6x højere end hos forældre-Bmdc'erne, hvilket tyder på, at BMDC-CYP-ALDH-cellerne sammenlignet med forældre-Bmdc'erne gavSIGNIFIKANT forøget RALDH2 enzymatisk aktivitet (figur
DC-CYP-ALDH-celler forøgede induktion af foxp3+CCR9+ Gut-homing treg-celler in vitro. For at undersøge, om DC-CYP-aldh-celler var i stand til at forstærke induktion af tarm-homing treg-celler in vitro, transducerede vi DC 2.4-celler (en knoglemarv-afledt DC-linje26,27,28,29) med Lenti-CYP-aldh-virus og genererede DC 2.4-CYP-aldh Efterfølgende besluttede vi, om DC 2.4-CYP-ALDH-cellerne var i stand til at forstærke induktion af tarm-homing Treg-celler in vitro. Derfor blev naive CD4+ T- celler RENSET fra C57BL/6 mus. Rensede naive CD4+ T-celler ved 5 x 105 celler/brønd blev derefter cokuleret med enten forældre DC 2.4 celler (1 x 105 celler/BRØND) eller DC 2.4-CYP-aldh celler (1 x 105 celler/brønd) i 24 brønd kultur plader i et serumfrit medium i nærværelse af et anti-CD3 monoklonalt antistof (5 μg/ml) og rekombinant humant Il-2 (50 U/ml). Desuden, 25 (OH) D og retinol ved forskellige koncentrationer blev også tilføjet i kulturerne. Cellerne blev inkuberet ved 37 °C og 5% CO2. Fem dage senere blev cellerne analyseret af FACS for udtrykkene foxp3 og c-c chemokine receptor type 9 (CCR9). Vores data viste, at DC 2.4-cellerne i tilstedeværelse af substrater ikke ændrede den overflod af foxp3+CCR9+ celler i CD4+ T-cellernes populationer signifikant (figur 3A, B). I modsætning hertil forbedrede DC 2,4-CYP-ALDH-cellerne markant den overflod af foxp3+CCR9+ celler blandt CD4+ T-celler. Hertil kommer, at jo mere 25 (OH) D tilføjet, jo større evne DC 2.4-CYP-ALDH celler til at øge den overflod af foxp3+CCR9+ celler blandt CD4+ T-celler. Derfor, vores data støtte, at DC-CYP-ALDH celler kan forøge induktion af Gut-homing Treg celler in vitro.
DC-CYP-ALDH-celler forøgede induktion af foxp3+CCR9+ Gut-homing treg-celler in vivo. For at afgøre, om DC-CYP-aldh-celler kan forstærke induktionen af tarm-homing-treg-celler in vivo, vi intraperitonealt administreret en af følgende celler i Balb/c mus: de forældre DC 2.4 celler, DC 2.4-CYP celler (DC 2.4 celler transduceret med Lenti-CYP-gfp virus), og DC-2,4-CYP-aldh celler. Fire dage efter celle administrationen blev mesenteriske lymfeknuder undersøgt af FACS (figur 4A). Vores data viste, at DC 2.4-CYP-ALDH celler, sammenlignet med kontrollerne, signifikant øget overflod af foxp3+CCR9+ celler blandt CD3+ T celler (figur 4B, C). På baggrund af disse resultater konkluderer vi, at DC-CYP-ALDH-celle administrationen øger induktionen af foxp3+CCR9+ T-celler i perifert lymfevæv.
Figur 1: DC-CYP-ALDH-celler udtrykte signifikant øget mængde af 1α-hydroxylase. A) bmdc-CYP-aldh-celler blev genereret og analyseret af FACS. Et repræsentativt FACS plot viser ekspression af 1α-hydroxylase i forældrenes BMDCs og BMDC-CYP-ALDH celler (gated på levende celler). B) 1α-hydroxylase substrat (dvs. 25 (Oh) D) blev tilføjet til DC-kulturerne. 24 h senere blev Supernatanterne indsamlet og 1,25 (OH)2D koncentrationer blev målt. Dataene viser koncentrationer på 1,25 (OH)2D i kulturerne i forældre-Bmdc'erne, BMDC-CYP-cellerne, BMDC-aldh-cellerne og BMDC-CYP-aldh-cellerne. * * p < 0,01. ANOVA-test. n = 4. Dette tal er tilpasset fra Xu et al.6. Copyright 2019. American Association of immunologist, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DC-CYP-ALDH-celler udtrykte signifikant forøget mængde RALDH2. A) bmdc-CYP-aldh-celler blev genereret og analyseret som beskrevet i protokollen. Repræsentative overlagte parceller viser BODIPY aminoacetat fluorescens i Bmdc'erne og BMDC-CYP-ALDH-cellerne i tilstedeværelse (+ DEAB) eller fravær (-DEAB) af RALHD2-inhibitorer diethylaminobenzaldehyd (DEAB). B) gennemsnitlige fluorescens intensiteter (MFI'er) af bodipy aminoacetat i Bmdc'erne og BMDC-CYP-aldh-cellerne i fravær af deab. * p < 0,05; t-test; n = 4. Dette tal er tilpasset fra Xu et al.6. Copyright 2019. American Association of immunologist, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: DC-CYP-ALDH-celler forøgede induktion af foxp3+CCR9+ Gut-homing treg-celler in vitro. (A) CD4+ naive T-celler blev isoleret fra C57BL/6 muse spleens. CD4+ T-cellerne blev derefter aktiveret i kulturer af en anti-CD3 Mab (5 μg/ml) i nærværelse af enten Parental DC 2.4-CELLERNE eller DC 2.4-CYP-aldh-cellerne. Desuden blev kulturerne tilsat med de angivne koncentrationer af 25 (OH) D og retinol. Fem dage senere blev cellerne indsamlet og analyseret af FACS for udtrykkene foxp3 og CCR9 i CD3+CD4+ T cellepopulation. Repræsentative FACS plots viser udtryk for foxp3 og CCR9 i CD3+CD4+ T cellepopulationer. B) kumulative data fra (A). * p < 0,05; ANOVA-prøvning n = 4. Dette tal er tilpasset fra Xu et al.6. Copyright 2019. American Association of immunologist, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: DC-CYP-ALDH-celler forøgede induktion af foxp3+CCR9+ Gut-homing treg-celler in vivo. (A) Balb/c-mus intraperitonealt (IP) modtog en af følgende DC-overførsler (overførsel): ingen DC-overførsel (ingen overførsel), forældre-DC 2.4-celler, DC 2.4-CYP-celler og DC 2.4-CYP-aldh-celler. Fire dage senere, mesenteriske lymfeknuder (MLNs) blev analyseret af FACS. B) repræsentative FACS-områder viser udtrykkene FOXP3 og CCR9 i CD3 + T- celle populationen. C) kumulative data fra (B) viser procentdelen af foxp3+CCR9+ celler i CD3+ T celle populationen. Celler blev gated på CD3+ T celler for alle analyserne. I givet fald forstås ved de forelagte data ± SEM. * p < 0,05; ANOVA-prøvning n = 4 – 6. Dette tal er tilpasset fra Xu et al.6. Copyright 2019. American Association of immunologist, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel beskriver vi brugen af DC-CYP-ALDH celler, for at forstærke induktion af Gut-homing Treg celler i perifert lymfevæv. Vores data har vist, at DC-CYP-ALDH-cellerne kan syntetisere lokalt høje koncentrationer af de Novo af både 1,25 (OH)2D og RA in vitro i nærværelse af tilsvarende substrater (dvs. 25 [Oh] d og retinol, hhv.). Da tilstrækkelige blodkoncentrationer på 25 (Oh) D og retinol let kan opnås gennem d-vitamin og et tillægsspørgsmål til henholdsvis patienter med mangler30,31, vi grunden til, at DC-CYP-aldh celler kan forøge induktion af Gut-homing treg celler i perifert lymfevæv, når normale blodkoncentrationer af 25 (Oh) D og retinol er til stede. For at understøtte dette ræsonnement viser vores data, at i normale raske dyr, der ikke har vitamin D-og vitamin A-mangler, forstærker DC-CYP-ALDH-cellerne induktion af Treg-celler, der udtrykker både regulatoriske molekyler (dvs. foxp3 og IL-10) og en Gut-homing-receptor (dvs. CCR9). Derfor kan denne teknologi anvendes til yderligere undersøgelse af Gut-homing Treg celler til behandling af IBD.
Et kritisk skridt i denne protokol er produktionen af Lenti-CYP-ALDH-virus med høje titre. De foretrukne virus titre bør være 108– 109 TUs/ml. En høj titer af Lenti-CYP-ALDH-virus er nødvendig for en høj transduktionseffektivitet i DCs.
Et andet kritisk skridt i denne protokol er transduktiviteten i DCs. Da DC-CYP-ALDH-celler ikke er toleriseret in vitro i denne teknologi, er det vigtigt, at transduktionsraten er mere end 90% for at sikre, at DC-CYP-ALDH-cellerne effektivt kan forstærke induktion af tarm-homing-Treg-celler in vivo. Desuden kan DC-CYP-ALDH-cellerne renses yderligere af FACS før in vivo-administration32.
En unik fordel ved denne protokol er, at DC-CYP-ALDH-cellerne ikke behøver at blive toleriseret in vitro før in vivo administration. Det forventes, at DC-CYP-aldh-cellerne som følge af de kombinerede handlinger på 1,25 (Oh)2d og RA vil blive bevaret i en tolerogenic status in vivo, fordi både 1,25 (Oh)2D og ra har vist sig at tolerize DCS33,34. Derfor forventer vi, at DC-CYP-ALDH-cellerne ikke vil have ustabile problemer i et in vivo proinflammatorisk miljø.
I øjeblikket har vi kun påvist, at DC-CYP-ALDH celler kan øge hyppigheden (antallet) af Gut-homing Treg celler i perifert lymfevæv og tarme6. Derfor er reguleringsfunktionen i tarmene som helhed forbedret, fordi procentdelen af Treg-celler i tarmene øges. Figur 4 viser, at sammenlignet med dem med kontrolbehandlinger, intraperitoneal behandling med DC-CYP-aldh celler signifikant øget procentdelen af CCR9+foxp3+ treg celler i mesenteriske lymfeknuder, hvilket betyder, at flere treg celler i mesenteriske lymfeknuder er i stand til specifikt hjem i tarm vævet. Figur 4 viser endvidere, at de fleste foxp3+ T-celler i mesenteriske lymfeknuder er negative for CCR9 og derfor ikke har tarm-homing kapacitet. Men, om DC-CYP-ALDH celler kan også forbedre den regulerende funktion af hver Treg celle per se (såsom forbedrede ekspression niveauer af foxp3 og/eller IL-10) kræver yderligere undersøgelse.
De her beskrevne reagenser og materialer er kun til dyreforsøg. Protokollen gælder dog for humane undersøgelser ved hjælp af tilsvarende humane reagenser og materialer, bortset fra at DCs vil blive genereret fra perifere blodmonocytter hos mennesker. Det endelige mål med denne protokol er genereringen af kliniske grade DC-CYP-ALDH-celler til behandling af IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DRs. Xiaolei tang og David J. Baylink er opfindere af en verserende patent i forbindelse med denne undersøgelse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kontoret for den assisterende forsvarsminister for Sundhedsanliggender gennem peer reviewed medicinsk forskning program under Award No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meninger, fortolkninger, konklusioner, og anbefalinger er dem af forfatteren og er ikke nødvendigvis godkendt af Department of Defense. Dette arbejde blev også delvist understøttet af forsknings innovations stipendier fra Institut for medicin på Loma Linda University (681207-2967 [XT og GG], 681205-2967 [XT] og 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
