Summary
Ici nous présentons un protocole pour l'augmentation in vivo de l'induction réglementaire de cellule T d'intestin-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et de la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA) de novo.
Abstract
La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu'une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse. Nous avons récemment montré que les cellules T (Treg) réglementaires gut-homing sont une thérapie prometteuse pour IBD. En conséquence, cet article présente un protocole pour l'augmentation in vivo de l'induction de cellules de Treg gut-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo, la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25 (OH)2D et RA basé sur des résultats précédents montrant que 1,25 (OH)2D peut induire l'expression de molécules régulatrices (par exemple, boîte de tête de fourchette P3 et interleukine-10) et que la RA peut stimuler l'expression des récepteurs gut-homing dans les cellules T. Pour générer de telles cellules dendritiques machinées, nous utilisons un vecteur lentiviral pour transduire les cellules dendritiques pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 membre de la sous-famille B 1 qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase, qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L'autre gène est le déshydrogénase aldéhyde 1 membre de la famille A2 qui code la déshydrogénase rétinienne 2, qui catalyse physiologiquement la synthèse de la PR. Ce protocole peut être utilisé pour l'étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.
Introduction
La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu'une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse1,2. Pour cette raison, actuellement disponibles U.S. Food and Drug Administration (FDA) médicaments approuvés inhibent les fonctions des médiateurs inflammatoires ou de bloquer le homing des cellules immunitaires dans l'intestin. Cependant, les médiateurs inflammatoires et les cellules immunitaires qui sont ciblées sont également nécessaires pour les défenses immunitaires. En conséquence, les inhibiteurs inflammatoires de médiateur compromettent la défense immunitaire systémique et les bloqueurs de homing de cellules immunitaires affaiblissent la défense immunisée d'intestin, qui peuvent mener aux conséquences graves3,4. En outre, les bloqueurs de homing de cellules immunitaires peuvent également bloquer le homing des cellules t (Treg) réglementaires dans l'intestin et ainsi peuvent aggraver la tolérance immunitaire d'intestin déjà compromise dans les patients d'IBD. En outre, le blocage de la cellule Treg homing dans l'intestin peut également conduire à la suppression immunitaire systémique en raison de l'accumulation de cellules Treg dans le sang5. Enfin, les inhibiteurs et les bloqueurs fonctionnent de façon transitoire et, par conséquent, nécessitent des administrations fréquentes. L'administration fréquente de ces inhibiteurs et bloqueurs peut exacerber davantage les effets secondaires fâcheux.
Récemment, nous avons proposé une nouvelle stratégie qui peut potentiellement atténuer ou même éliminer les effets secondaires associés aux médicaments actuels pour le traitement des MII6. Cette stratégie augmente l'induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6. La raison d'être de cette stratégie est que les cellules Treg gut-homing spécifiquement à la maison à l'intestin et donc ne compromettra pas les défenses immunitaires systémiques. En outre, puisque les cellules de Treg peuvent potentiellement former la mémoire7,8, cellules de Treg gut-homing peuvent potentiellement fournir un contrôle stable de l'inflammation chronique d'intestin dans les patients d'IBD et, ainsi, le traitement ne devrait pas devoir être administré aussi fréquemment. En outre, puisque cette stratégie augmente l'induction de cellules Treg gut-homing in vivo, il n'a pas le souci de l'instabilité in vivo dans un environnement hautement proinflammatoire qui est associé au transfert adoptif des cellules Treg générées in vitro9,10. À cet égard, les cellules Treg générées in vitro sont l'une des stratégies proposées pour le traitement des maladies auto-immunes11,12,13 et le rejet de transplantation14,15. Enfin, dans cette stratégie, les cellules dendritiques (DC) sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo : la vitamine D active (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25(OH)2D et RA parce que 1,25 (OH)2D peut induire l'expression de molécules régulatrices (p. ex., boîte à fourche P3 [foxp3] et interleukine-10 [IL-10])16,17 et que la RA peut stimuler l'expression des récepteurs gut-homing dans les lymphocytes T18. Parce que les deux 1,25(OH)2D et RA peut également tolériser DCs28,29, nous raison non plus que les DC machinés seront maintenus de façon stable dans un statut tolérogène in vivo et donc contourner les préoccupations d'instabilité in vivo qui sont associés à des DC tolérogènes générés in vitro (TolDCs)19,20,21. À cet égard, les TolDC sont également l'une des stratégies proposées pour l'augmentation in vivo des fonctions cellulaires Treg19,20,21. Pour soutenir notre raisonnement, nous avons montré que les DC s'est fait ingénieur, lors d'une livraison in vivo, peut augmenter l'induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6.
Un autre avantage de notre stratégie proposée est que 1,25 (OH)2D a également d'autres fonctions qui peuvent potentiellement bénéficier aux patients atteints de MII. Ces autres fonctions comprennent la capacité de 1,25 (OH)2D pour stimuler la sécrétion d'antimicrobiens22 et pour supprimer la carcinogenèse23. Les infections et les cancers sont fréquemment associés aux MII24,25.
Pour générer les DC qui peuvent produire localement des concentrations élevées de 1,25 (OH)2D et RA de novo, nous utilisons un vecteur lentiviral pour concevoir des DC pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 sous-famille B membre 1 (CYP27B1) qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase (1-hydroxylase), qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L'autre gène est la déhydrogénase d'aldéhyde 1 membre de la famille A2 (ALDH1a2) qui code la déhydrogénase rétinienne 2 (RALDH2), qui catalyse physiologiquement la synthèse de RA6.
Parce que l'augmentation in vivo de l'induction des cellules Treg intestinale est potentiellement importante dans le traitement des MII, dans le protocole suivant, nous détaillerons les procédures de production des DC de 1-hydroxylase-RALDH2-overexpressing (dC-CYP-ALDH) qui peut être utilisé pour l'étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.
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Protocol
Tous les protocoles d'étude des animaux in vivo ont été examinés et approuvés par le Loma Linda University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ainsi que par le Bureau d'examen des soins et de l'utilisation des animaux (ACURO) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research Ministère de la Défense.
1. Préparation du Lentivirus qui exprime à la fois 1-hydroxylase et RALDH2 (lenti-CYP-ALDH Virus)
- Jour 0 : Tôt le matin, préparez 5 x 105 cellules/mL de cellules 293T dans le milieu de culture cellulaire CM-10-D.
- Graines 20 ml/plaque dans des plats de culture de 150 mm x 25 mm. Culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h. La confluence atteindra 80 à 90 % après 24 h.
- Jour 1: Faire 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, et 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot et magasin à -20 oC.
- Faire 2 M CaCl2 et conserver à température ambiante.
- Pour chaque plat de culture de 150 mm x 25 mm, préparer un mélange de précipitations d'ADN dans un tube de culture stérile de 50 ml. Tout d'abord, ajoutez 1 620 oL de 2x HBS, 9,5 g de PMD2G (VSVG), 17,5 g de pCMVR8,74 (Capsid), 27 g de plasmide Lenti-CYP-ALDH (un vecteur lentiviral qui transporte à la fois CYP27B1 et ALDH1a2). Deuxièmement, ajouter H2O à un volume final de 3 037,5 L.
- Dans le dernier, ajouter 202,5 l de 2 M CaCl2 goutte à goutte tout en mélangeant la solution aux concentrations finales de 1x HBS et 125 mM CaCl2. CaCl2 doit être le dernier à être ajouté. Laisser les mélanges de transfection à température ambiante pendant 20 min avec un mélange occasionnel. Pour plusieurs plats de culture de 150 mm x 25 mm, agrandir en conséquence.
- Ajoutez les 3 240 L de mélange de précipitations d'ADN dans le sens de la chute à un plat de culture de 150 mm x 25 mm contenant les cellules 293T. Faites tourbillonner doucement le plat de culture d'un côté à l'autre tout en ajoutant le mélange de précipitations d'ADN. Incuber le plat à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Jour 2 : Retirez la solution de transfection de phosphate de calcium, lavez doucement avec 1x PBS, et redonnez la culture cellulaire avec le milieu de culture cellulaire CM-4-D. Incuber les cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Jour 3 : Récoltez les supernatants dans des bouteilles de rangement stériles et entreposez-les à 4'8 oC. Reconstituer la culture cellulaire avec frais CM-4-D milieu de culture cellulaire. Culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pour 24 h.
- Jour 4: Récoltez les supernatants dans des bouteilles de rangement stériles. Filtrer les supernatants du Jour 3 et du Jour 4 à travers un filtre de 0,45 m. Pour concentrer le virus pseudotype VSVG, transférer les supernatants dans des tubes de centrifugeuse et tourner à 4 780 x g pendant 24 h à 4 oC.
- Jour 5 : Versez les supernatants des granulés (le granule est souvent visible) et laissez les tubes s'écouler sur un essuie-tout dans une armoire stérile de biosécurité pendant plusieurs minutes.
- Resuspendre les granulés par pipetting avec PBS stérile contenant 5% de glycérol. Le volume de la suspension sera de 33,3 L par 150 mm x 25 mm plat de culture.
- Aliquot 200 l/tube et magasin à -80 oC. Faire un aliquot séparé de 50 l/vial à des fins de titration. Les titers doivent être dans la fourchette de 108à 109 unités de transduiseur (TUs)/mL.
- Ajouter de l'eau de Javel dans les plats de culture et les jeter.
REMARQUE : Ces cellules transfectées sont la plus grande préoccupation de sécurité dans le protocole puisque tous les éléments lentiviraux sont exprimés dans les cellules.
2. Génération de DCdérivés dérivés de moelle osseuse (BMDCs)
- Récoltez les tibias et les fémurs de 4 à 5 souris Balb/c dans un tube de polypropylène stérile de 50 ml contenant le milieu de culture6.
- Transférer les tibias et les fémurs dans un plat de culture de 100 mm x 20 mm contenant le milieu de culture. Enlever les tissus tels que les muscles des tibias et des fémurs à l'aide de ciseaux et de forceps disséquants.
- Couper les deux extrémités des tibias et des fémurs pour exposer la cavité de la moelle osseuse.
- Dessiner 10 ml de culture dans une seringue de 10 ml attachée à une aiguille de 30 G.
- Insérez soigneusement l'aiguille dans la cavité de la moelle osseuse et rincer la moelle osseuse dans un tube de polypropylène stérile propre de 50 ml. Répétez cette procédure si nécessaire, pour s'assurer que la moelle osseuse a été complètement vidée.
- Pelleter les cellules de la moelle osseuse par centrifugation (400 x g) à 2'8 oC pendant 5 min. Aspirez le supernatant.
- Resuspendre la pastille avec 5 ml de tampon de lyse des globules rouges 1x.
- Incuber les cellules à température ambiante pendant 4 à 5 min avec des secousses occasionnelles.
- Arrêtez la réaction en ajoutant 30 ml de milieu de culture.
- Pelleter les cellules par centrifugation (400 x g) à 2'8 oC pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 10 ml de cm-10-R milieu de culture cellulaire. Si nécessaire, les cellules peuvent être passées à travers une passoire à cellules de 40 m pour enlever les débris.
- Effectuer un compte cellulaire et ajuster les cellules à 1 x 106 cellules/mL en utilisant le milieu de culture cellulaire CM-10-R.
- Ajouter le granulocyte murine recombinant/macrophage facteur de stimulation de la colonie (GM-CSF, concentration finale de 100 U/mL) et interleukine-4 murine (IL-4, concentration finale 10 U/mL).
REMARQUE : Les solutions de stock de GM-CSF et d'IL-4 sont stockées à -80 oC à 100 000 U/mL (1 000x) et 10 000 U/mL (1 000x), respectivement. - Distribuer les cellules dans 6 plaques de culture de puits à 4 ml/puits et la culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pour 48 h.
- Enlever les cellules non adhérentes avec un tuyauterie doux.
- Ajouter le milieu de culture cellulaire CM-10-R frais contenant le GM-CSF (100 U/mL) et l'IL-4 (10 U/mL). Culture les cellules pour un autre 48 h.
- Récoltez les cellules non adhérentes (BMDC) pour la transduction par le virus lenti-CYP-ALDH.
3. Transduction des CD avec le virus lenti-CYP-ALDH pour générer des cellules DC-CYP-ALDH
- Préparer 1 x 106 DC/puits dans un volume total de 0,5 ml de milieu de culture cellulaire CM-10-R contenant 50 l de virus et 8 protaminede g/mL dans une plaque de culture de 6 puits.
- Culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Remplacer le milieu par un milieu de culture cellulaire CM-10-R frais et la culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pour un autre 24 h. À ce stade, les activités enzymatiques de 1-hydroxylase et RALDH2 peuvent être évaluées (voir l'étape 4). Si nécessaire, répétez les étapes 3.1-3.3 pour une deuxième transduction.
- Ajouter le lipopolysaccharide (100 ng/mL) et la culture des cellules pendant 24 h.
- Récoltez les cellules (cellules DC-CYP-ALDH) pour des expériences.
4. Évaluation de la sur-exprimée 1-hydroxylase et RALDH2 dans les cellules DC-CYP-ALDH
- Évaluation de la sur-exprimée 1-hydroxylase dans les cellules DC-CYP-ALDH
- Graine 1.0 x 106 cellules DC-CYP-ALDH/puits dans 2 ml de milieu de culture cellulaire CM-10-R dans 12 plaques de culture de puits.
- Ajouter 25 (OH)D à la concentration finale de 2,5 M. Incuber les cellules DC-CYP-ALDH pendant 24 h.
- Récoltez les supernatants et entreposez-les à -20 oC.
- Analyse de 1,25 (OH)2Concentrations De D chez les supernatants à l'aide d'un radioimmunoassay (RIA) disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux).
- Déterminer l'expression de l'hydroxylase de 1 o-hydroxylase dans les cellules DC-CYP-ALDH par tri des cellules activées par fluorescence (FACS) à l'aide d'un anticorps anti-CYP27B1.
- Évaluation du RALDH2 surexprimé dans les cellules DC-CYP-ALDH
REMARQUE : L'expression et l'activité du RALDH2 surexprimé sont déterminées à l'aide d'un kit commercial de détection de déhydrogénase d'aldéhyde (ALDH) (voir Tableau des matériaux).- Graine 1 mL de DC-CYP-ALDH ou cellules témoins (1 x 105 cellules/mL en tampon d'analyse) dans chacun des deux tubes de 5 ml (l'un étiqueté comme « Contrôle » et l'autre étiqueté comme « Test »).
- Ajouter 10 lde de solution de diéthylaminobenzaldéhyde (DEAB) (1,5 mm d'éthanol à 95 %) à chacun des tubes témoins et mélanger immédiatement. LE DEAB est un inhibiteur de RALDH2.
- Ajouter 5 ll de substrat de fluorescence RALDH activé (300 M) dans les tubes de contrôle et d'essai et mélanger immédiatement.
- Incuber les tubes pendant 45 min.
- Pelleter les cellules par centrifugation à 400 x g à 2'8 oC pendant 5 min. Aspirez les supernatants.
- Reconstituer les cellules en 200 l de tampon d'assay.
- Gardez les cellules sur la glace et procédez à l'analyse par LE FACS.
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Representative Results
Les cellules de DC-CYP-ALDH ont exprimé la quantité sensiblement accrue de 1-hydroxylase. Pour déterminer si les cellules DC-CYP-ALDH générées à partir de BMDCs ont exprimé une quantité significativement accrue de cellules de 1-hydroxylase, les BMDC ont été transduisés avec le virus lenti-CYP-ALDH pour produire des cellules DC-CYP-ALDH dérivées de la moelle osseuse (cellules BMDC-CYP-ALDH). Par la suite, les cellules bMDC-CYP-ALDH ont été examinées pour l'expression de 1-hydroxylase par FACS. Nos données ont montré que les cellules BMDC-CYP-ALDH, par rapport aux BMDC parentaux, affichaient une expression améliorée de la 1-hydroxylase(figure 1A). Nous avons également déterminé l'activité enzymatique de la 1-hydroxylase dans les cellules BMDC-CYP-ALDH. Pour ce faire, 1,0 x 106 cellules BMDC-CYP-ALDH dans 2 mL de cm-10-R de culture cellulaire ont été ajoutées dans 12 plaques de culture de puits. 25 (OH)D a ensuite été ajouté à la culture cellulaire à la concentration finale de 2,5 M. Les cellules ont été cultivées à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h et les supernatants ont été récoltés pour la mesure de 1,25 (OH)2D à l'aide d'un radioimmunoassay (RIA). Nos données ont montré que 1,25 (OH)2D concentrations dans les supernatants de culture des cellules BMDC-CYP (BMDCs transduisés avec le virus lenti-CYP-GFP) et le BMDC-CYP Les cellules de l'ALDH étaient chacune environ 20 fois plus élevées que celles des BMDC parentaux et des cellules BMDC-ALDH (BMDCs transduisparaient avec le virus lenti-ALDH) (figure 1B).
Les cellules de DC-CYP-ALDH ont exprimé la quantité sensiblement accrue de RALDH2. Pour déterminer si les cellules BMDC-CYP-ALDH ont exprimé une quantité significativement accrue de RALDH2, un substrat RALDH2 a été ajouté dans les cultures cellulaires en présence ou absence de l'inhibiteur de RALDH2 diethylaminobenzaldéhyde (DEAB) (15 'M). Le produit fluorescent retenu à l'intérieur des cellules a été analysé par FACS. Nos données ont montré que les intensités moyennes de fluorescence (IMF) des cellules BMDC-CYP-ALDH étaient approximativement 6fois plus élevées que celles des BMDC parentaux, suggérant que les cellules BMDC-CYP-ALDH, par rapport aux BMDC parentaux, ont exprimé une activité enzymatique RALDH2 significativement améliorée (Figure 2A,B).
Les cellules DC-CYP-ALDH ont augmenté in vitro l'induction des cellules Treg foxp3etCCR9. Pour étudier si les cellules d'ALDH de DC-CYP-ALDH ont pu augmenter l'induction des cellules de Treg gut-homing in vitro, nous avons transduisé des cellules de DC2.4 (une ligne d'ALDH de moelle-dérivée26,27,28,29, avec le virus lenti-CYP-ALDH et avons produit des cellules d'ALDH de DC2.4-CYP-CYP-ALDH. Par la suite, nous avons déterminé si les cellules d'ALDH de DC2.4-CYP-ALDH étaient en mesure d'augmenter l'induction des cellules de Treg gut-homing in vitro. En conséquence, les cellules Naïves de CD4et de T ont été purifiées des souris c57BL/6. Les cellulesCD4 naïfs purifiées à 5 x 105 cellules/puits ont ensuite été cocultivées avec les cellules parentales DC2.4 (1 x 105 cellules/bien) ou les cellules DC2.4-CYP-ALDH (1 x 105 cellules/puits) dans 24 plaques de culture de puits dans un milieu sans sérum en présence d'un anticorps monoclonal anti-CD3 (5 g/mL) et d'IL-2 humain recombinant (50 U/mL). En outre, 25 (OH)D et le rétinol à diverses concentrations ont également été ajoutés dans les cultures. Les cellules ont été incubées à 37 oC et 5 % de CO2. Cinq jours plus tard, les cellules ont été analysées par FACS pour les expressions du foxp3 et du c-c de c chemokine de type 9 (CCR9). Nos données ont montré qu'en présence des substrats, les cellules DC2.4 n'ont pas modifié de façon significative l'abondance descellules foxp3etCCR9 dans les populations de cellules CD4et T(figure 3A,B). En revanche, les cellules DC2.4-CYP-ALDH ont considérablement amélioré l'abondance descellules foxp3etCCR9 chez les cellules CD4et T. En outre, plus 25 (OH)D ajouté, plus la capacité des cellules DC2.4-CYP-ALDH d'augmenter l'abondance de foxp3-CCR9- cellules parmi les cellules CD4et T. Par conséquent, nos données soutiennent que les cellules DC-CYP-ALDH peuvent augmenter l'induction des cellules Treg intestinales in vitro.
Les cellules DC-CYP-ALDH ont augmenté in vivo l'induction des cellules Treg foxp3etCCR9. Pour déterminer si les cellules DC-CYP-ALDH pourraient augmenter l'induction des cellules Treg intestinales in vivo, nous avons administré par voie intrapéritone l'une des cellules suivantes chez les souris Balb/c : les cellules d'Administration parentale SDC2.4, les cellules DC2.4-CYP (dC2.4 cellules transdulées avec le virus lenti-CYP-GFP), et les cellules DC-2.4-CYP-AL. Quatre jours après l'administration cellulaire, les ganglions lymphatiques mésentériques ont été examinés par le FACS(figure 4A). Nos données ont montré que les cellules DC2.4-CYP-ALDH, par rapport aux témoins, ont considérablement augmenté l'abondance descellules Foxp3etCCR9 chez les cellules CD3et T(figure 4B,C). Sur la base de ces résultats, nous concluons que l'administration cellulaire DC-CYP-ALDH augmente considérablement l'induction des cellules Foxp3etCCR9dans les tissus lymphoïdes périphériques.
Figure 1 : Les cellules DC-CYP-ALDH ont exprimé une augmentation significative de la quantité de 1-hydroxylase. (A) Les cellules BMDC-CYP-ALDH ont été générées et analysées par FACS. Une parcelle de terrain FACS représentative montre l'expression d'une hydroxylase de 1 o dans les BMDC parentaux et les cellules BMDC-CYP-ALDH (fermées sur les cellules vivantes). (B) 1 substrat hydroxylase (c.-à-d. 25 (OH)D) a été ajouté dans les cultures DC. 24 h plus tard, les supernatants ont été recueillis et 1,25 (OH)2D concentrations ont été mesurées. Les données montrent des concentrations de 1,25(OH)2D dans les cultures des BMDC parentaux, des cellules BMDC-CYP, des cellules BMDC-ALDH et des cellules BMDC-CYP-ALDH. lt; 0,01. Test ANOVA. n ' 4. Ce chiffre est adapté de Xu et coll.6. Droit d'auteur 2019. L'American Association of Immunologist, Inc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les cellules DC-CYP-ALDH ont exprimé une augmentation significative de la quantité de RALDH2. (A) Les cellules BMDC-CYP-ALDH ont été générées et analysées comme décrit dans le protocole. Les parcelles fac-aminoacées superposées représentatives montrent la fluorescence de l'aminoactate BODIPY dans les BMDC et les cellules BMDC-CYP-ALDH en présence (DEAB) ou en absence (-DEAB) de l'inhibiteur RALHD2 diethylaminobenzaldehyde (DEAB). (B) Intensités moyennes de fluorescence (IMF) de l'aminoactate DEBODIPY dans les BMDC et les cellules bMDC-CYP-ALDH en l'absence de DEAB. lt; 0,05; t-test; n ' 4. Ce chiffre est adapté de Xu et coll.6. Droit d'auteur 2019. L'American Association of Immunologist, Inc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les cellules DC-CYP-ALDH ont augmenté in vitro l'induction des cellules Treg foxp3etCCR9. (A) CD4- cellules T naïves ont été isolés de C57BL/6 spleens de souris. Les lymphocytes CD4et T ont ensuite été activés dans les cultures par un mAb anti-CD3 (5 g/mL) en présence des cellules DC2.4 parentales ou des cellules DC2.4-CYP-ALDH. En outre, les cultures ont été ajoutées avec les concentrations indiquées de 25 (OH)D et de rétinol. Cinq jours plus tard, les cellules ont été recueillies et analysées par FACS pour les expressions de foxp3 et CCR9 dans cD3-CD4- population de cellules T. Les parcelles facS représentatives montrent les expressions du foxp3 et du CCR9 dans les populations de cellules CD3etCD4. (B) Données cumulatives de (A). lt; 0,05; Test ANOVA; n ' 4. Ce chiffre est adapté de Xu et coll.6. Droit d'auteur 2019. L'American Association of Immunologist, Inc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Les cellules DC-CYP-ALDH ont augmenté in vivo l'induction des cellules Treg foxp3etCCR9. (A) Les souris de Balb/c intraperitoneally (i.p.) ont reçu l'un des transferts suivants de DC (transfert) : aucun transfert de DC (aucun transfert), cellules parentales de DC2.4, cellules de DC2.4-CYP, et cellules dC2.4-CYP-ALDH. Quatre jours plus tard, les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) ont été analysés par FACS. (B) Les parcelles facS représentatives montrent les expressions de foxp3 et CCR9 dans la population de cellules CD3et T. (C) Les données cumulatives de (B) montrent le pourcentage de cellules foxp3etCCR9 dans la population de cellules CD3et T. Les cellules ont été fermées sur les lymphocytes CD3et T pour toutes les analyses. Le cas échéant, les données présentées sont des moyens ' SEM. 'p 'lt; 0.05; Test ANOVA; n n ' 4-6. Ce chiffre est adapté de Xu et coll.6. Droit d'auteur 2019. L'American Association of Immunologist, Inc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans cet article nous décrivons l'utilisation des cellules de DC-CYP-ALDH, pour augmenter l'induction des cellules de Treg d'intestin-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques. Nos données ont montré que les cellules DC-CYP-ALDH peuvent synthétiser localement des concentrations élevées de novo de 1,25 (OH)2D et RA in vitro en présence de substrats correspondants (c.-à-d. 25[OH]D et rétinol, respectivement). Puisque les concentrations suffisantes de sang de 25(OH)D et de rétinol peuvent être facilement réalisées par des supplémentations de vitamine D et d'A respectivement dans les patients qui ont des insuffisances30,31,nous raisonnons que les cellules d'ALDH de DC-CYP-ALDH peuvent augmenter l'induction des cellules de Treg d'intestin-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques quand les concentrations normales de sang de 25 (OH)D et le rétinol sont présentes. Pour soutenir ce raisonnement, nos données démontrent que dans les animaux sains normaux qui n'ont pas des insuffisances de vitamine D et de vitamine A, les cellules de DC-CYP-ALDH augmentent l'induction des cellules de Treg qui expriment des molécules de régulation (c.-à-d., foxp3 et IL-10) et un récepteur d'intestin-homing (c.-à-d., CCR9). Par conséquent, cette technologie peut être utilisée pour une étude plus approfondie des cellules Treg gut-homing pour le traitement des MII.
Une étape critique de ce protocole est la production du virus lenti-CYP-ALDH avec des titers élevés. Les titres de virus préférés doivent être de 108à 109 TUs/mL. Un haut titer du virus lenti-CYP-ALDH est nécessaire pour une efficacité de transduction élevée dans les DC.
Une autre étape critique de ce protocole est l'efficacité de la transduction dans les DC. Puisque les cellules de DC-CYP-ALDH ne sont pas tolérables in vitro dans cette technologie, il est essentiel que le taux de transduction soit plus de 90% pour s'assurer que les cellules d'ALDH de DC-CYP-ALDH peuvent augmenter efficacement l'induction des cellules de Treg gut-homing in vivo. En outre, les cellules DC-CYP-ALDH peuvent être purifiées par LE FACS avant l'administration in vivo32.
Un avantage unique de ce protocole est que les cellules DC-CYP-ALDH n'ont pas besoin d'être tolérables in vitro avant l'administration in vivo. On s'attend à ce que les cellules DC-CYP-ALDH, à la suite des actions combinées de 1,25(OH)2D et RA, soient maintenues dans un statut tolérogène in vivo parce que les deux 1,25 (OH)2D et RA ont été montrées pour tolératiser les DC33,34. Par conséquent, nous prévoyons que les cellules DC-CYP-ALDH n'auront pas de problèmes d'instabilité dans un environnement proinflammatoire in vivo.
Actuellement, nous avons seulement démontré que les cellules DC-CYP-ALDH peuvent augmenter la fréquence (nombre) des cellules de Treg gut-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques et les intestins6. Par conséquent, la fonction de régulation dans les intestins dans son ensemble est améliorée parce que le pourcentage de cellules Treg dans les intestins est augmenté. La figure 4 montre que, par rapport à ceux qui ont des traitements témoins, le traitement intrapéritonéal avec des cellules DC-CYP-ALDH a considérablement augmenté le pourcentage de cCR9-foxp3- cellules Treg dans les ganglions lymphatiques mésentériques, ce qui signifie que plus de cellules Treg dans les ganglions lymphatiques mésentériques sont en mesure de spécifiquement à la maison dans les tissus intestinaux. La figure 4 montre en outre que la plupart des cellules Foxp3et T dans les ganglions lymphatiques mésentériques sont négatives pour le CCR9 et n'ont donc pas de capacité intestinale. Cependant, si les cellules DC-CYP-ALDH peuvent également améliorer la fonction réglementaire de chaque cellule treg en soi (comme les niveaux d'expression améliorés de foxp3 et/ou IL-10) nécessite une étude plus approfondie.
Les réactifs et les matériaux décrits ici sont pour des études animales seulement. Cependant, le protocole est applicable pour les études humaines en utilisant des réactifs et des matériaux humains correspondants, sauf que les DC seront générés à partir de monocytes sanguins périphériques chez l'homme. L'objectif ultime de ce protocole est la génération de cellules cliniques DC-CYP-ALDH de qualité pour le traitement des MII.
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Disclosures
Xiaolei Tang et David J. Baylink sont les inventeurs d'un brevet en instance lié à cette étude.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Bureau du sous-secrétaire à la Défense pour les affaires de santé dans le cadre du Programme de recherche médicale révisé par les pairs dans le cadre du Prix No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles de l'auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Ce travail a également été partiellement soutenu par des subventions pour l'innovation en recherche du Département de médecine de l'Université de Loma Linda (681207-2967 [XT et GG], 681205-2967 [XT], et 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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