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Immunology and Infection

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Published: January 22, 2020 doi: 10.3791/60585

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming-regulatorischen T-Zell-Induktion vor. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen des aktiven Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und des aktiven VitaminS A (Retinoinsäure oder RA) de novo zu produzieren.

Abstract

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere stört. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Darmhoming-regulatorische T (Treg)-Zellen eine vielversprechende Therapie für IBD sind. Dementsprechend stellt dieser Artikel ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming Treg-Zellinduktion dar. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo, aktivem Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktivem Vitamin A (Retinsäure oder RA) zu produzieren. Wir wählten 1,25(OH)2D und RA auf der Grundlage früherer Erkenntnisse, die zeigten, dass 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z. B. Gabelstapler-Box P3 und Interleukin-10) und dass RA die Expression von Darm-Homing-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann. Um solche technisch entwickelten dendritischen Zellen zu erzeugen, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um dendritische Zellen zu transduzieren, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1, das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2, die Retinaldehyddehydrogenase 2 kodiert, die physiologisch die Synthese von RA katalysiert. Dieses Protokoll kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.

Introduction

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere1,2stört. Aus diesem Grund hemmen derzeit verfügbare, von der US Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Medikamente die Funktionen von Entzündungsmediatoren oder blockieren die Homing von Immunzellen in den Darm. Die entzündungshemmenden Mediatoren und Immunzellen, die gezielt sind, sind jedoch auch für die Immunabwehr notwendig. Infolgedessen gefährden die Entzündungsmediatoren die systemische Immunabwehr und die Immunzellen-Homing-Blocker schwächen die Darmimmunabwehr, die beide zu schwerwiegenden Folgen führen können3,4. Darüber hinaus können die Immunzellen-Homing-Blocker auch das Homing von regulatorischen T (Treg)-Zellen in den Darm blockieren und damit die bereits beeinträchtigte Darmimmuntoleranz bei IBD-Patienten verschlechtern. Darüber hinaus kann die Blockierung der Treg-Zelle, die in den Darm einfließt, auch zu einer systemischen Immunsuppression aufgrund der Ansammlung von Treg-Zellen im Blut führen5. Schließlich funktionieren Inhibitoren und Blocker vorübergehend und erfordern daher häufige Verabreichungen. Häufige Verabreichung dieser Inhibitoren und Blocker können die unerwünschten Nebenwirkungen weiter verschlimmern.

Kürzlich haben wir eine neue Strategie vorgeschlagen, die potenziell die Nebenwirkungen imZusammenhang mit aktuellen Medikamenten für die IBD-Behandlung 6 mildern oder sogar beseitigen kann. Diese Strategie verstärkt die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren Lymphgeweben6. Die Begründung dieser Strategie ist, dass Darm-Homing Treg Zellen speziell Heimat des Darms und wird daher nicht die systemische Immunabwehr gefährden. Da Treg-Zellen potenziell Gedächtnisbildenkönnen 7,8, Darm-Homing-Treg-Zellen können potenziell eine stabile Kontrolle der chronischen Darmentzündung bei IBD-Patienten bieten und damit sollte die Behandlung nicht so häufig verabreicht werden müssen. Da diese Strategie die Induktion von Darmhoming-Treg-Zellen in vivo verstärkt, hat sie nicht die Sorge der In-vivo-Instabilität in einer hochgradig proinflammatorischen Umgebung, die mit dem Adoptivtransfer von in vitro erzeugten Treg-Zellen9,10verbunden ist. In dieser Hinsicht sind in vitro erzeugte Treg-Zellen eine der vorgeschlagenen Strategien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen11,12,13 und Transplantatabstoßung14,15. Schließlich werden in dieser Strategie dendritische Zellen (DCs) entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo zu produzieren: aktives Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktives Vitamin A (Retinoinsäure oder RA). Wir haben uns für 1,25(OH)2D und RA entschieden, weil 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z.B. Gabelstapler p3 [foxp3] und Interleukin-10 [IL-10])16,17 und dass RA die Expression von Darmhoming-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann18. Da sowohl 1,25(OH)2D als auch RA auch DCs28,29tolerisieren können, gehen wir davon aus, dass die konstruierten DCs stabil in einem tolerogenen Status in vivo gehalten werden und damit die In-vivo-Instabilitätsbedenken umgehen, die mit in vitro erzeugten tolerogenen DCs (TolDCs)19,20,21verbunden sind. In dieser Hinsicht sind TolDCs auch eine der vorgeschlagenen Strategien für die In-vivo-Augmentation der Treg-Zellfunktionen19,20,21. Um unsere Argumentation zu unterstützen, haben wir gezeigt, dass die entwickelten DCs, nach in vivo Lieferung, die Induktion von Darm-homing Treg-Zellen in peripherenlymphoidenGeweben 6 erhöhen können.

Ein weiterer Vorteil unserer vorgeschlagenen Strategie ist, dass 1,25(OH)2D auch andere Funktionen hat, die IBD-Patienten potenziell zugute kommen können. Zu diesen anderen Funktionen gehört die Fähigkeit von 1,25(OH)2D, die Sekretion antimikrobieller Mittel zu stimulieren22 und die Karzinogenese23zu unterdrücken. Infektionen und Krebserkrankungen werden häufig mit IBD24,25assoziiert.

Um die DCs zu erzeugen, die lokal hohe Konzentrationen von 1,25(OH)2D und RA de novo erzeugen können, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um DCs zu entwickeln, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1 (CYP27B1), das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase (1-Hydroxylase) kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2 (ALDH1a2), die Retinaldehyddehydrogenase 2 (RALDH2) kodiert, die physiologisch die Synthese von RA6katalysiert.

Da die In-vivo-Augmentation der Darmhoming-Treg-Zellinduktion für die Behandlung von IBD potenziell wichtig ist, werden wir im folgenden Protokoll die Verfahren zur Erzeugung der 1-Hydroxylase-RALDH2-overexzierenden DCs (DC-CYP-ALDH-Zellen) kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.

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Protocol

Alle In-vivo-Tierstudienprotokolle wurden vom Loma Linda University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) sowie dem Animal Care and Use Review Office (ACURO) der US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) des Verteidigungsministerium.

1. Herstellung des Lentivirus, das sowohl 1-Hydroxylase als auch RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH-Virus) ausdrückt

  1. Tag 0: Am frühen Morgen 5 x 105 Zellen/ml von 293T Zellen im CM-10-D-Zellkulturmedium vorbereiten.
  2. Samen 20 ml/Platte in 150 mm x 25 mm Kulturgerichte. Kultur die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h. Konfluenz erreicht 80–90% nach 24 h.
  3. Tag 1: Machen Sie 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl und 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot und lagern bei -20 °C.
  4. 2 M CaCl2 machen und bei Raumtemperatur lagern.
  5. Für jede Kulturschale von 150 mm x 25 mm eine DNA-Fällungsmischung in einem sterilen 50 ml Kulturrohr zubereiten. Fügen Sie zunächst 1.620 l 2x HBS, 9,5 g PMD2G (VSVG), 17,5 g pCMVR8,74 (Capsid), 27 g Lenti-CYP-ALDH-Plasmid (ein Lentiviral-Vektor, der sowohl CYP27B1 als auch ALDH1a2 trägt) hinzu. Zweitens fügen Sie H2O zu einem Endvolumen von 3.037,5 l hinzu.
  6. In der letzten, fügen Sie 202,5 l von 2 M CaCl2 tropfenweise beim Mischen der Lösung auf enddauernde Konzentrationen von 1x HBS und 125 mM CaCl2. CaCl2 muss der letzte sein, der hinzugefügt wird. Lassen Sie die Transfektionsmischungen bei Raumtemperatur 20 min bei gelegentlichem Mischen. Für mehrere 150 mm x 25 mm Kulturgerichte entsprechend skalieren.
  7. Fügen Sie die 3.240 l DNA-Fällungsmischung tropfenweise zu einer 150 mm x 25 mm Kulturschale hinzu, die die 293T-Zellen enthält. Wirbeln Sie die Kulturschale vorsichtig nebeneinander, während Sie die DNA-Fällungsmischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.
  8. Tag 2: Entfernen Sie die Calciumphosphat-Transfektionslösung, waschen Sie vorsichtig mit 1x PBS und speisen Sie die Zellkultur mit CM-4-D-Zellkulturmedium wieder ein. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h.
  9. Tag 3: Die Überstande in sterilen Lagerflaschen ernten und bei 4–8 °C lagern. Füllen Sie die Zellkultur mit einem frischen CM-4-D-Zellkulturmedium auf. Die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für weitere 24 h skulturen.
  10. Tag 4: Ernte die Überstande in sterile Lagerflaschen. Filtern Sie die Überräube ab Tag 3 und Tag 4 durch einen 0,45 m Filter. Um das VSVG-Pseudotypvirus zu konzentrieren, übertragen Sie die Überwälten in Zentrifugenröhren und drehen Sie bei 4.780 x g für 24 h bei 4 °C.
  11. Tag 5: Gießen Sie die Überräube von den Pellets (das Pellet ist oft sichtbar) und lassen Sie die Rohre auf einem Papiertuch in einem sterilen Biosicherheitsschrank für mehrere Minuten abfließen.
  12. Die Pellets durch Pipettieren mit sterilem PBS mit 5 % Glycerin wieder aufhängen. Das Volumen für die Resuspension beträgt 33,3 l pro 150 mm x 25 mm Kulturschale.
  13. Aliquot 200 l/Tube und lagern bei -80 °C. Machen Sie ein separates Aliquot von 50 l/Fläfürstigkeitszwecke. Titer sollten im Bereich von 108–109 Messeinheiten (TUs)/ml liegen.
  14. Bleichmittel in die Kulturgerichte geben und entsorgen.
    HINWEIS: Diese transfizierten Zellen sind das größte Sicherheitsproblem im Protokoll, da alle lentiviralen Elemente in den Zellen exprimiert werden.

2. Erzeugung von Knochenmark-abgeleiteten DCs (BMDCs)

  1. Ernte Tibias und Oberschenkelknochen von 4–5 Balb/c Mäusen in ein 50 ml steriles Polypropylenrohr, das das Kulturmedium6enthält.
  2. Übertragen Sie die Tibias und Oberschenkel in ein 100 mm x 20 mm Kulturgericht, das das Kulturmedium enthält. Entfernen Sie Gewebe wie Muskeln von den Tibias und Oberschenkelknochen mit sezierender Schere und Zange.
  3. Schneiden Sie beide Enden der Tibias und Oberschenkelknochen, um die Knochenmarkhöhle freizulegen.
  4. Zeichnen Sie 10 ml Kulturmedium in einer 10 ml Spritze, die an einer 30 G Nadel befestigt ist.
  5. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark in ein sauberes 50 ml steriles Polypropylenrohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf, um sicherzustellen, dass das Knochenmark vollständig ausgespült wurde.
  6. Pellet die Knochenmarkzellen durch Zentrifugation (400 x g) bei 2–8 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.
  7. Das Pellet mit 5 ml 1x rotem Blutzelllysepuffer wieder aufhängen.
  8. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 4-5 min mit gelegentlichem Schütteln.
  9. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30 ml Kulturmedium hinzufügen.
  10. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (400 x g) bei 2–8 °C für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml CM-10-R Zellkulturmedium. Bei Bedarf können die Zellen durch ein 40-m-Zellsieb geleitet werden, um Schmutz zu entfernen.
  11. Führen Sie eine Zellanzahl aus, und passen Sie die Zellen mithilfe des CM-10-R-Zellkulturmediums auf 1 x 106 Zellen/ml an.
  12. Fügen Sie rekombinanten murinen Granulozyten/Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF, Endkonzentration = 100 U/ml) und murines Interleukin-4 (IL-4, Endkonzentration = 10 U/ml) hinzu.
    HINWEIS: Die Lagerlösungen von GM-CSF und IL-4 werden bei -80 °C bei 100.000 U/ml (1.000x) bzw. 10.000 U/ml (1.000x) gelagert.
  13. Verteilen Sie die Zellen in 6 Brunnenkulturplatten bei 4 ml/Well und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 48 h.
  14. Entfernen Sie nicht haftende Zellen mit sanfter Pipettierung.
  15. Fügen Sie frisches CM-10-R-Zellkulturmedium hinzu, das das GM-CSF (100 U/ml) und IL-4 (10 U/mL) enthält. Kultur die Zellen für weitere 48 h.
  16. Ernte nicht haftende Zellen (BMDCs) zur Transduktion durch das lenti-CYP-ALDH-Virus.

3. Transduktion von DCs mit lenti-CYP-ALDH Virus zur Erzeugung von DC-CYP-ALDH-Zellen

  1. Bereiten Sie 1 x 106 DCs/Well in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml CM-10-R-Zellkulturmedium vor, das 50 l Virus und 8 g/ml Protamin in einer 6-Well-Kulturplatte enthält.
  2. Kultur der Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h.
  3. Ersetzen Sie das Medium durch frisches CM-10-R-Zellkulturmedium und kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für weitere 24 h. Zu diesem Zeitpunkt können die enzymatischen Aktivitäten von 1-Hydroxylase und RALDH2 ausgewertet werden (siehe Schritt 4). Wiederholen Sie ggf. die Schritte 3.1–3.3 für eine zweite Transduktion.
  4. Fügen Sie Lipopolysaccharid (100 ng/ml) hinzu und kultiieren Sie die Zellen für 24 h.
  5. Ernte der Zellen (DC-CYP-ALDH-Zellen) für Experimente.

4. Auswertung der überexprimierten 1-Hydroxylase und RALDH2 in DC-CYP-ALDH-Zellen

  1. Auswertung der überexprimten 1-Hydroxylase in DC-CYP-ALDH-Zellen
    1. Samen 1,0 x 106 DC-CYP-ALDH-Zellen/gut in 2 ml CM-10-R-Zellkulturmedium in 12 Brunnenkulturplatten.
    2. Fügen Sie 25(OH)D zur Endkonzentration von 2,5 m hinzu. Inkubieren Sie die DC-CYP-ALDH-Zellen für 24 h.
    3. Die Überräube ernten und bei -20 °C lagern.
    4. Assay für 1,25(OH)2D Konzentrationen in den Überstandunterhaltsmitteln mit einem handelsüblichen Radioimmunoassay (RIA) (siehe Tabelle der Materialien).
    5. Bestimmen Sie die Expression von 1-Hydroxylase in DC-CYP-ALDH-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) mit einem Anti-CYP27B1-Antikörper.
  2. Auswertung der überexprimtralen RALDH2 in DC-CYP-ALDH-Zellen
    HINWEIS: Die Expression und Aktivität des überexprimierenden RALDH2 wird mit einem kommerziellen Aldehyddehydrogenase (ALDH)-Detektionskit bestimmt (siehe Materialtabelle).
    1. Samen 1 ml DC-CYP-ALDH oder Kontrollzellen (1 x 105 Zellen/ml im Testpuffer) in je zwei 5 ml-Röhren (eine mit der Bezeichnung "Control" und die andere mit der Bezeichnung "Test") bezeichnet.
    2. In jedem der Steuerröhrchen 10 l Diethylaminobenzaldehyd (DEAB)-Lösung (1,5 mM in 95% Ethanol) hinzufügen und sofort mischen. DEAB ist ein RALDH2-Hemmer.
    3. Fügen Sie den Kontroll- und Reagenzröhrchen 5 l aktiviertes RALDH-Fluoreszenzsubstrat (300 m) hinzu und mischen Sie sie sofort.
    4. Inkubieren Sie die Rohre für 45 min.
    5. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g bei 2–8 °C für 5 min. Aspirieren Sie die Überwälten.
    6. Rekonstituieren Sie die Zellen in 200 L Assaypuffer.
    7. Halten Sie die Zellen auf Eis und gehen Sie für die Analyse durch FACS.

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Representative Results

DC-CYP-ALDH-Zellen exprimiert signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase. Um festzustellen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen, die aus BMDCs erzeugt wurden, eine signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase exprimierten, wurden BMDCs mit dem Lenti-CYP-ALDH-Virus zur Herstellung von knochen-marrow-abgeleiteten DC-CYP-ALDH-Zellen (BMDC-CYP-ALDH-Zellen) transduziert. Anschließend wurden die BMDC-CYP-ALDH-Zellen auf die Expression von 1-Hydroxylase durch FACS untersucht. Unsere Daten zeigten, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu den elterlichen BMDCs eine verbesserte Expression der 1-Hydroxylase zeigten (Abbildung 1A). Wir haben auch die enzymatische Aktivität der 1-Hydroxylase in den BMDC-CYP-ALDH-Zellen bestimmt. Dazu wurden 1,0 x 106 BMDC-CYP-ALDH-Zellen in 2 ml CM-10-R-Zellkulturmedium in 12 Brunnenkulturplatten eingebracht. 25(OH)D wurde dann der Zellkultur bei der Endkonzentration von 2,5 m zugesetzt. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h kultiviert und die Überräube wurden für die Messung von 1,25(OH)2D mittels eines Radioimmunoassays (RIA) geerntet. Unsere Daten zeigten, dass 1,25(OH)2D-Konzentrationen in den Kulturüberstanddern der BMDC-CYP-Zellen (BMDCs mit lenti-CYP-GFP-Virus transduziert) und der BMDC-CYP-ALDH-Zellen jeweils etwa 20-fach höher waren als die der elterlichen BMDCs und der BMDC-ALDH-Zellen (BMDCs, die mit lenti-ALDH-Virus transduziert wurden)(Abbildung 1B).

DC-CYP-ALDH-Zellen exprimiert signifikant erhöhte Menge an RALDH2. Um festzustellen, ob BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine signifikant erhöhte Menge an RALDH2 exprimieren, wurde den Zellkulturen in Gegenwart oder Abwesenheit des RALDH2-Inhibitors Diethylaminobenzaldehyd (DEAB) (15 M) ein RALDH2-Substrat zugesetzt. Das in den Zellen zurückgehaltene fluoreszierende Produkt wurde von FACS analysiert. Unsere Daten zeigten, dass die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) der BMDC-CYP-ALDH-Zellen etwa 6-x höher waren als die der elterlichen BMDCs, was darauf hindeutet, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu den elterlichen BMDCs eine signifikant verbesserte ralDH2-enzymatische Aktivität ausdrückten (Abbildung 2A,B).

DC-CYP-ALDH-Zellen verstärkten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vitro. Um zu untersuchen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen in der Lage waren, die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in vitro zu verstärken, transduzierten wir DC2.4-Zellen (eine Knochenmark-abgeleitete DC-Linie26,27,28,29), mit lenti-CYP-ALDH-Virus und erzeugten DC2.4-CYP-ALDH-Zellen. Anschließend stellten wir fest, ob die DC2.4-CYP-ALDH-Zellen in der Lage waren, die Induktion von Darmhoming Treg-Zellen in vitro zu verstärken. Dementsprechend wurden naive CD4+ T-Zellen von C57BL/6-Mäusen gereinigt. Gereinigte naive CD4+ T-Zellen bei 5 x 105 Zellen/Well wurden dann entweder mit den elternförmigen DC2.4-Zellen (1 x 105 Zellen/Well) oder den DC2.4-CYP-ALDH-Zellen (1 x 105 Zellen/Well) in 24 Brunnenkulturplatten in einem serumfreien Medium in Gegenwart eines monoklonalen Anti-CD3-Antikörpers (5 g/ml) und rekombinantem humanem IL-2 (50 U/ml). Darüber hinaus wurden 25(OH)D und Retinol in verschiedenen Konzentrationen in die Kulturen aufgenommen. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5%CO2inkubiert. Fünf Tage später wurden die Zellen von FACS auf die Ausdrücke von Foxp3 und c-c Chemokin-Rezeptor Typ 9 (CCR9) analysiert. Unsere Daten zeigten, dass die DC2.4-Zellen in Gegenwart der Substrate die Häufigkeit von Foxp3+CCR9+ Zellen in den CD4+ T-Zellpopulationen nicht signifikant veränderten (Abbildung 3A,B). Im Gegensatz dazu haben die DC2.4-CYP-ALDH-Zellen die Häufigkeit von Foxp3+CCR9+ Zellen unter CD4+ T-Zellen signifikant verbessert. Darüber hinaus, je mehr 25(OH)D hinzugefügt, desto größer die Fähigkeit der DC2.4-CYP-ALDH-Zellen, die Fülle von foxp3+CCR9+ Zellen unter CD4+ T-Zellen zu erhöhen. Daher unterstützen unsere Daten, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen die Induktion von Darmhoming Treg-Zellen in vitro verstärken können.

DC-CYP-ALDH-Zellen ergänzten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo. Um festzustellen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verstärken könnten, verabreichten wir eine der folgenden Zellen intraperitoneal in Balb/c-Mäuse: die elterlichen DC2.4-Zellen, die DC2.4-CYP-Zellen (DC2.4-Zellen, die mit dem lenti-CYP-GFP-Virus transduziert wurden) und die DC-2.4-CYP-ALDH-Zellen. Vier Tage nach der Zellverabreichung wurden mesenterische Lymphknoten von FACS untersucht (Abbildung 4A). Unsere Daten zeigten, dass die DC2.4-CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu den Kontrollen die Häufigkeit von Foxp3+CCR9+ Zellen unter CD3+ T-Zellen signifikant erhöht haben (Abbildung 4B,C). Basierend auf diesen Ergebnissen kommen wir zu dem Schluss, dass die DC-CYP-ALDH-Zelladministration die Induktion von Foxp3+CCR9+ T-Zellen in peripheren Lymphgeweben signifikant erhöht.

Figure 1
Abbildung 1: DC-CYP-ALDH-Zellen exprimieren signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase. (A) BMDC-CYP-ALDH-Zellen wurden von FACS erzeugt und analysiert. Ein repräsentatives FACS-Diagramm zeigt die Expression von 1-Hydroxylase in den elterlichen BMDCs und den BMDC-CYP-ALDH-Zellen (auf lebenden Zellen abgegrenzt). (B) 1-Hydroxylase-Substrat (d. h. 25(OH)D) wurde den DC-Kulturen zugesetzt. 24 H später wurden die Überstande gesammelt und 1,25(OH)2D Konzentrationen gemessen. Die Daten zeigen Konzentrationen von 1,25(OH)2D in den Kulturen der elterlichen BMDCs, der BMDC-CYP-Zellen, der BMDC-ALDH-Zellen und der BMDC-CYP-ALDH-Zellen. **p < 0,01. ANOVA-Test. n = 4. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: DC-CYP-ALDH-Zellen exprimieren signifikant erhöhte Menge an RALDH2. (A) BMDC-CYP-ALDH-Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben erzeugt und analysiert. Repräsentativ überlagerte FACS-Plots zeigen die BODIPY-Aminoacetatfluoreszenz in den BMDCs und den BMDC-CYP-ALDH-Zellen in Gegenwart (+DEAB) oder Abwesenheit (-DEAB) des RALHD2-Inhibitors Diethylaminobenzaldehyd (DEAB). (B) Mittlere Fluoreszenzintensitäten (MFI) von BODIPY-Aminoacetat in den BMDCs und den BMDC-CYP-ALDH-Zellen in Abwesenheit von DEAB. *p < 0,05; t-Test; n = 4. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: DC-CYP-ALDH-Zellen verstärkten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vitro. (A) CD4+ naive T-Zellen wurden aus C57BL/6 Mausmilen isoliert. Die CD4+ T-Zellen wurden dann in Kulturen durch ein Anti-CD3 mAb (5 g/ml) in Gegenwart entweder der elterlichen DC2.4-Zellen oder der DC2.4-CYP-ALDH-Zellen aktiviert. Zusätzlich wurden die Kulturen mit den angegebenen Konzentrationen von 25(OH)D und Retinol hinzugefügt. Fünf Tage später wurden die Zellen von FACS für die Ausdrücke von Foxp3 und CCR9 in CD3+CD4+ T Zellpopulation gesammelt und analysiert. Repräsentative FACS-Plots zeigen die Ausdrücke von foxp3 und CCR9 in den CD3+CD4+ T-Zellpopulationen. (B) Kumulierte Daten aus (A). *p < 0,05; ANOVA-Test; n = 4. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: DC-CYP-ALDH-Zellen verstärkten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo. (A) Balb/c-Mäuse intraperitoneal (i.p.) erhielten eine der folgenden DC-Übertragungen (Transfer): keine DC-Übertragung (keine Übertragung), elterliche DC2.4-Zellen, DC2.4-CYP-Zellen und DC2.4-CYP-ALDH-Zellen. Vier Tage später wurden mesenterische Lymphknoten (MLNs) von FACS analysiert. (B) Repräsentative FACS-Plots zeigen die Ausdrücke von foxp3 und CCR9 in cd3+ T Zellpopulation. (C) Die kumulativen Daten aus (B) zeigen den Prozentsatz der Foxp3+CCR9+ Zellen in der CD3+ T-Zellpopulation. Für alle Analysen wurden Zellen auf CD3+ T-Zellen abgegrenzt. Gegebenenfalls handelt es sich bei den dargestellten Daten um Mittel , die SEM. *p < 0,05; ANOVA-Test; n = 4–6. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von DC-CYP-ALDH-Zellen zur Erweiterung der Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren lymphoiden Geweben. Unsere Daten haben gezeigt, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen lokal hohe Konzentrationen de novo von 1,25(OH)2D und RA in vitro in Gegenwart entsprechender Substrate (d.h. 25[OH]D bzw. Retinol) synthetisieren können. Da ausreichende Blutkonzentrationen von 25(OH)D und Retinol leicht durch Vitamin D- und A-Supplementierungen bei Patienten mit Defiziten30,31erreicht werden können, weisen wir darauf hin, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren lymphoiden Geweben verstärken können, wenn normale Blutkonzentrationen von 25(OH)D und Retinol vorhanden sind. Um diese Argumentation zu untermauern, zeigen unsere Daten, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen bei normalen gesunden Tieren ohne Vitamin-D- und Vitamin-A-Mangel die Induktion von Treg-Zellen verstärken, die sowohl regulatorische Moleküle (z. B. Foxp3 und IL-10) als auch einen Darmhoming-Rezeptor (d. h. CCR9) ausdrücken. Daher kann diese Technologie für die weitere Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen zur Behandlung von IBD verwendet werden.

Ein entscheidender Schritt dieses Protokolls ist die Produktion des Lenti-CYP-ALDH-Virus mit hohem Titer. Die bevorzugten Virustitter sollten 108–109 TUs/ml betragen. Ein hoher Titer des lenti-CYP-ALDH-Virus ist für eine hohe Transduktionseffizienz in DCs notwendig.

Ein weiterer wichtiger Schritt dieses Protokolls ist die Transduktionseffizienz in DCs. Da DC-CYP-ALDH-Zellen in dieser Technologie nicht in vitro tolerisiert werden, ist es wichtig, dass die Transduktionsrate mehr als 90% beträgt, um sicherzustellen, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo effizient verstärken können. Darüber hinaus können die DC-CYP-ALDH-Zellen vor der In-vivo-Verabreichung32durch FACS weiter gereinigt werden.

Ein einzigartiger Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen vor der In-vivo-Verabreichung nicht in vitro alerisiert werden müssen. Es wird erwartet, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen infolge der kombinierten Aktionen von 1,25(OH)2D und RA in einem tolerogenen Status in vivo beibehalten werden, da sowohl 1,25(OH)2D als auch RA nachweislich DCs33,34tolerisieren. Daher gehen wir davon aus, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen in einer in vivo proinflammatorischen Umgebung keine Instabilitätsprobleme haben werden.

Derzeit haben wir nur gezeigt, dass DC-CYP-ALDH-Zellen die Häufigkeit (Anzahl) von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren lymphoiden Geweben und Darmen erhöhen können6. Folglich wird die regulatorische Funktion im Darm als Ganzes verbessert, weil der Prozentsatz der Treg-Zellen im Darm erhöht wird. Abbildung 4 zeigt, dass im Vergleich zu denen mit Kontrollbehandlungen die intraperitoneale Behandlung mit DC-CYP-ALDH-Zellen den Anteil der CCR9+Foxp3+ Treg-Zellen in den mesenterischen Lymphknoten signifikant erhöht hat, was bedeutet, dass mehr Treg-Zellen in den mesenterischen Lymphknoten in der Lage sind, gezielt in das Darmgewebe zu beherbergen. Abbildung 4 zeigt ferner, dass die meisten Foxp3+ T-Zellen in mesenterischen Lymphknoten für CCR9 negativ sind und daher keine Darmhoming-Kapazität haben. Ob DC-CYP-ALDH-Zellen jedoch auch die regulatorische Funktion jeder Treg-Zelle an sich verbessern können (z. B. verbesserte Expressionsniveaus von Foxp3 und/oder IL-10), bedarf weiterer Untersuchungen.

Die hier beschriebenen Reagenzien und Materialien sind nur für Tierversuche vorgesehen. Das Protokoll ist jedoch für Studien am Menschen anwendbar, indem entsprechende menschliche Reagenzien und Materialien verwendet werden, mit der Ausnahme, dass DCs aus peripheren Blutmonozyten beim Menschen erzeugt werden. Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist die Erzeugung klinischer DC-CYP-ALDH-Zellen zur Behandlung von IBD.

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Disclosures

Drs. Xiaolei Tang und David J. Baylink sind Erfinder eines anhängigen Patents im Zusammenhang mit dieser Studie.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs durch das Peer Reviewed Medical Research Program unter Auszeichnung Nr. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium gebilligt. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch Research Innovation Grants vom Department of Medicine der Loma Linda University (681207-2967 [XT und GG], 681205-2967 [XT] und 325491 [DJB]) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes ThermoFisher Scientific Cat# 03-377-23
100 mm x 20 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430167
12-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-82
150 mm x 25 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430559
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) Sigma-Aldrich Cat# H4014
293T cells ATCC CRL-3216
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
6-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-83
ALDEFLUOR kit Stemcell Technologies Cat# 01700
Anti-CYP27B1 Abcam Cat# ab95047
BD FACSAria II BD Biosciences N/A
CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C1016
CM-10-D cell culture medium DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-10-R cell culture medium RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-4-D cell culture medium DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430513
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430514
Dissecting scissor ThermoFisher Scientific Cat# 08-940
DMEM medium ThermoFisher Scientific Cat# 11960044
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific Cat# 16000044
Forceps ThermoFisher Scientific Cat# 22-327379
Gibco ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific Cat# A1049201
Glycerol Sigma-Aldrich Cat# G5516
Goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab205718
HEPES Millipore Cat# 391340
Lenti-CYP-ALDH Custom-made 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.
L-glutamine ThermoFisher Scientific Cat#25030081
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Cat# L3755
Murine GM-CSF Peprotech Cat# 315-03
Murine IL-4 Peprotech Cat# 214-14
Na2HPO4 Sigma-Aldrich Cat# NIST2186II
NaCl Sigma-Aldrich Cat# S9888
Needles ThermoFisher Scientific Cat# 14-841-02
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
pCMVR8.74 Addgene Plasmid# 22036
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific Cat#15140148
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
PMD2G Addgene Plasmid# 12259
Polypropylene tube, 15 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12500
Polypropylene tube, 50 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12502
Protamine sulfate Sigma-Aldrich Cat# P3369
Rabbit polycloncal IgG isotype control Abcam Cat# ab171870
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement Heartland Assays
RPMI 1640 medium, no glutamine ThermoFisher Scientific Cat# 21870076
Sodium pyruvat ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Sorvall Legend XTR Centrifuge ThermoFisher Scientific Cat# 75004521
Sterile Cell strainers, 40 mm ThermoFisher Scientific Cat# 07-201-430
Sterile storage bottles, 500 mL ThermoFisher Scientific Cat# CLS431432

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 155 Darmhoming regulatorische T-Zellen 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase Cytochrom P450 Familie 27 Unterfamilie B Mitglied 1 1,25-Dihydroxyvitamin D Foxp3 Dendritische Zellen Retinaldehyddehydrogenase 2 c-c Chemokin-Rezeptor Typ 9
In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction
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Bi, H., Wasnik, S., Baylink, D. J.,More

Bi, H., Wasnik, S., Baylink, D. J., Liu, C., Tang, X. In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction. J. Vis. Exp. (155), e60585, doi:10.3791/60585 (2020).

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