Summary
ここでは、腸内ホーミング調節T細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)de novoの高濃度を局所的に産生するように設計される。
Abstract
炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮障壁を破壊することは一般に受け入れられている。我々は最近、腸内調節T(Treg)細胞がIBDに対する有望な治療法であることを示した。したがって、この記事では、腸内ホーミングTreg細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、2つの分子deノボ、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の局所的に高濃度を産生するように設計される。我々は、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3およびインターロイキン-10)の発現を誘導し、RAがT細胞における腸内受容体の発現を刺激できることを示す以前の知見に基づいて1,25(OH)2DおよびRAを選択した。このような工学的樹状細胞を生成するために、レンチウイルスベクターを使用して樹状細胞を伝調し、2つの遺伝子を過剰発現させます。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼをコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチナルアルデヒドデヒドロゲナーゼ2をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2であり、RAの合成を生理学的に触媒する。このプロトコルは、生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。
Introduction
炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮バリア1、2を破壊することが一般的に受け入れられている。このため、現在利用可能な米国食品医薬品局(FDA)承認薬物は、炎症メディエーターの機能を阻害するか、腸内の免疫細胞のホーミングをブロックする。しかし、標的とされる炎症性メディエーターや免疫細胞も免疫防御に必要です。その結果、炎症性メディエーター阻害剤は全身免疫防御を損ない、免疫細胞ホーミング遮断薬は腸内免疫防御を弱め、いずれも重篤な結果につながる可能性がある3、4。さらに、免疫細胞ホーミングブロッカーはまた、腸内の調節T(Treg)細胞のホーミングをブロックすることができ、したがって、IBD患者における既に侵害された腸内免疫寛容を悪化させることができる。さらに、腸内へのTreg細胞ホーミングの遮断は、血液5中のTreg細胞の蓄積による全身免疫抑制にもつながる可能性がある。最後に、阻害剤およびブロッカーは一過性に機能し、それによって頻繁な投与を必要とする。これらの阻害剤およびブロッカーの頻繁な投与は、さらに不利な副作用を悪化させる可能性があります。
最近、我々は潜在的に軽減またはIBD治療のための現在の薬物に関連する副作用を排除することができる新しい戦略を提案しました6.この戦略は、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強する。この戦略の根拠は、腸のホーミングTreg細胞が腸に特異的に家であり、したがって、全身性免疫防御を損なわないということです.さらに、Treg細胞は記憶7、8を形成する可能性があるため、腸内ホーミングTreg細胞はIBD患者における慢性腸炎の安定した制御を提供する可能性があり、それによって、治療を頻繁に投与する必要はない。さらに、この戦略は、生体内における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するので、インビトロ発生Treg細胞9、10の養子移入に関連する高炎症性環境における生体内不安定性の懸念を有しない。この点に関して、in vitro生成Treg細胞は、自己免疫疾患11、12、13および移植拒絶反応14、15の治療のための提案された戦略の1つである。最後に、この戦略では、樹状細胞(DC)は、活性ビタミンD(1,25-ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の2つの分子の局所的に高濃度を生成するように設計されています。1,25(OH)2DとRAを選んだのは、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3[foxp3]およびインターロイキン-10[IL-10])16、17、RAがT細胞18における腸ホーミング受容体の発現を刺激することができるからである。1,25(OH)2D と RA の両方が DC28,29を許容できるため、設計された DC が生体内の対レフォゲン状態で安定的に維持され、したがって、インビトロ生成トレロゲン DC (TolDCs)19,20,21に関連する生体内不安定性の懸念を回避する理由 .この点で、TolDCはまた、Treg細胞機能19、20、21の生体内増強のための提案された戦略の一つである。我々の推論を支持するために、我々は、設計されたDCが生体内送達時に、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強できることを示した。
私たちの提案された戦略のもう一つの利点は、1,25(OH)2 Dはまた、潜在的にIBD患者に利益をもたらす可能性のある他の機能を持っているということです。これらの他の機能は、抗菌剤22の分泌を刺激し、発癌を抑制する1,25(OH)2Dの能力を含む。感染症や癌は、しばしばIBD24、25に関連付けられています。
1,25(OH)2DとRA de novoの両方の局所的に高濃度を生成できるDCを生成するために、2つの遺伝子を過剰発現するためにDCを設計するためにレンチウイルスベクターを使用しています。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼ(1α-ヒドロキシラーゼ)をコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1(CYP27B1)であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(RALDH2)をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2(ALDH1a2)であり、RA6の合成を生理学的に触媒する。
生体内での腸内ホーミングTreg細胞誘導はIBDの治療において潜在的に重要であるため、以下のプロトコルでは、1α-ヒドロキシラーゼ-RALDH2-過剰発現DC(DC-CYP-ALDH細胞)の生成手順を詳述します。生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。
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Protocol
生体内動物研究プロトコルはすべて、ロマリンダ大学の動物ケアと使用委員会(IACUC)と米国陸軍医学研究・マテリエルコマンド(USAMRMC)の動物ケアと使用レビューオフィス(ACURO)によってレビューされ、承認されました。国防総省
1. 1α-ヒドロキシラーゼとRALDH2(レンズCYP-ALDHウイルス)の両方を発現するレンチウイルスの調製
- 0日目:早朝、CM-10-D細胞培養培地中の293T細胞の5x105細胞/mLを調製する。
- 150 mm x 25 mm の培養料理で 20 mL/プレートをシードします。細胞を37°Cで培養し、24時間のCO2を5%培養すると、24時間後に約80~90%に達する。
- 1 日目: 2x HBS (50 mM HEPES、280 mM NaCl、および 1.5 mM Na2HPO4、 pH 7.1) を作成します。アリコートと-20°で保存します。
- 2 M CaCl2を作成し、室温で保管します。
- 150mm×25mm培養皿ごとに、滅菌50mL培養管内にDNA沈殿混合物を調製する。まず、2x HBSの1,620 μL、PMD2G(VSVG)の9.5μg、pCMVR8.74(Capsid)の17.5μg、レンティCYP-ALDHプラスミド(CYP27B1とALDH1a2の両方を運ぶレンチウイルスベクター)の27μgを追加します。次に、H2O を最終容積 3,037.5°L に加えます。
- 最後に、溶液を1x HBSおよび125 mM CaCl2の最終濃度に混合しながら、2M CaCl2の202.5 μLをドロップワイズに加えます。CaCl2は最後に追加する必要があります。トランスフェクション混合物を室温で20分間、時折混合したままにしておきます。複数の150ミリメートルx25ミリメートルの培養料理の場合は、それに応じてスケールアップ。
- 3,240 μLのDNA沈殿混合物を、293T細胞を含む150mm x 25mm培養皿に1つに加えます。DNA沈殿混合物を加えながら、培養皿側をゆっくりと左右に旋回する。37°Cで料理をインキュベートし、24時間5%CO2でインキュベートします。
- 2日目:リン酸カルシウムトランスフェクション液を除去し、1x PBSでやさしく洗浄し、CM-4-D細胞培養培地で細胞培養物を再供給する。細胞を37°Cでインキュベートし、24時間5%CO2でインキュベートします。
- 3日目:無菌保管ボトルで上清を収穫し、4~8°Cで保管してください。新鮮なCM-4-D細胞培養培地で細胞培養を補充します。細胞を37°Cで培養し、さらに24時間CO2を5%培養する。
- 4日目:上清を滅菌保存ボトルに収穫する。3日目と4日目の上清を0.45μmフィルターまでフィルターします。VSVG擬似型ウイルスを濃縮するには、上清を遠心管に移し、4°Cで24時間4,780 x gでスピンします。
- 5日目:ペレットから上清を注ぎ(ペレットが見えることが多い)、チューブを無菌バイオセーフティキャビネットのペーパータオルに数分間流し込みます。
- 5%グリセロールを含む滅菌PBSでピペットをピペットで再サスペンドします。サスペンションの容積は150 mm x 25 mm 培養皿あたり33.3μLになります。
- アリコート200°L/チューブと-80°で保存。滴定のために50°L/バイアルの別のアリコートを作ります。テッターは、108~ 109形質転換単位 (T)/mL の範囲内である必要があります。
- 培養料理に漂白剤を加え、捨てます。
注:これらのトランスフェクトされた細胞は、すべてのレンチウイルス要素が細胞内で発現されるため、プロトコルにおける最大の安全上の懸念事項です。
2. 骨髄由来DC(BMDC)の生成
- 4〜5 Balb/cマウスから培養培地6を含む50mL滅菌ポリプロピレンチューブにチビアスおよび大腿骨を収穫する。
- チビアスと大腿骨を100mm×20mm培養物に移し、培養培地を含む。筋などの組織を脛骨や大腿骨から取り除き、はさみや鉗子を解剖します。
- 脛骨と大腿骨の両端をカットして骨髄腔を露出させます。
- 30G針に取り付けた10mLシリンジに10mL培養培地を描きます。
- 慎重に骨髄腔に針を挿入し、きれいな50 mL滅菌ポリプロピレンチューブに骨髄をフラッシュします。必要に応じてこの手順を繰り返し、骨髄が完全に洗い流されていることを確認します。
- 遠心分離(400 x g)で骨髄細胞を2~8°Cで5分間ペレット化し、上清を吸引する。
- 1x赤血球リシスバッファーの5 mLでペレットを再サスペンドします。
- 時折振りながら、室温で細胞を4~5分間インキュベートします。
- 30mLの培養培地を添加して反応を停止する。
- 5分間2~8°Cで遠心分離(400 x g)で細胞をペレット化し、CM-10-R細胞培養培地の10mLで細胞を再サスペンドします。必要に応じて、細胞を40μmの細胞ストレーナーを通過して破片を除去することができます。
- CM-10-R細胞培養培地を使用して、細胞数を1x 106セル/mLに調整します。
- 組換えマウス顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF、最終濃度=100 U/mL)とマウスインターロイキン-4(IL-4、最終濃度=10U/mL)を加えます。
注:GM-CSFおよびIL-4のストックソリューションは、それぞれ100,000 U/mL(1,000x)と10,000 U/mL(1,000x)で-80°Cで保存されています。 - 細胞を4mL/ウェルで6ウェル培養プレートに分配し、細胞を37°Cで、5%CO2で48時間培養します。
- 穏やかなピペットで非付着細胞を除去します。
- GM-CSF(100 U/mL)およびIL-4(10 U/mL)を含む新鮮なCM-10-R細胞培養培地を追加します。細胞をさらに48時間培養する。
- レンチCYP-ALDHウイルスによる伝達のための非付着細胞(BMdCC)を収穫する。
3. DC-CYP-ALDH細胞を生成するレンチCYP-ALDHウイルスを用いたDCの導入
- 50 μLのウイルスと8μg/mLプロタミンを含むCM-10-R細胞培養培地の総体積0.5mLで1 x 106 DC/ウェルを6ウェル培養プレートに調製します。
- 細胞を37°Cで培養し、24時間CO2を5%培養する。
- 培地を新鮮なCM-10-R細胞培養培地に置き換え、細胞を37°Cで培養し、さらに24時間CO2を5%培養します。この時点で、1α-ヒドロキシラーゼおよびRALDH2の酵素活性を評価することができる(ステップ4参照)。必要に応じて、2 番目のトランスダクションに対して手順 3.1 ~ 3.3 を繰り返します。
- リポ多糖(100ng/mL)を加え、細胞を24時間培養する。
- 実験のために細胞(DC-CYP-ALDH細胞)を採取する。
4. DC-CYP-ALDH細胞における過剰発現1α-ヒドロキシラーゼおよびRALDH2の評価
- DC-CYP-ALDH細胞における過剰発現1α-ヒドロキシラーゼの評価
- 種子1.0 x 106 DC-CYP-ALDH細胞/ウェルCM-10-R細胞培養培地の2mLで12ウェル培養プレートに。
- 25(OH)Dを2.5μMの最終濃度に加えます。DC-CYP-ALDH細胞を24時間インキュベートします。
- 上清を収穫し、-20°Cで保存します。
- 市販の放射性免疫測定法(RIA)を用いた上清中の1,25(OH)2D濃度に対するアッセイ(材料表参照)。
- 抗CYP27B1抗体を用いて蛍光活性化細胞選別(FACS)によりDC-CYP-ALDH細胞における1α-ヒドロキシラーゼの発現を決定する。
- DC-CYP-ALDH細胞における過剰発現RALDH2の評価
注:過剰発現ALDH2の発現および活性は、市販のアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)検出キットを用いて決定される(材料表を参照)。- DC-CYP-ALDHまたは対照セルの種子1 mL(アッセイバッファー内の1 x105細胞/mL)の2つの5mLチューブ(1つは「コントロール」とラベル付けされ、もう1つは「テスト」とラベル付けされた)である。
- 各コントロールチューブにジエチルアミノベンズアルデヒド(DEAB)溶液(95%エタノール中1.5mM)を10μL加え、すぐに混ぜます。DEAB は RALDH2 阻害剤です。
- 5μLの活性化RALDH蛍光基板(300μM)を制御管および試験管に加え、すぐに混合します。
- チューブを45分間インキュベートします。
- 細胞を400 x gで2~8°Cで5分間遠心分離してペレットを与え、上清を吸引する。
- 200μLのアッセイ緩衝液で細胞を再構成する。
- 細胞を氷の上に置き、FACSによる分析を進めます。
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Representative Results
DC-CYP-ALDH細胞は、1α-ヒドロキシラーゼの有意に増加量を発現した。BMdCsから生成されたDC-CYP-ALDH細胞が1α-ヒドロキシラーゼの有意な増加量を発現したかどうかを判断するために、BMCCをレンズCYP-ALDHウイルスで形質転換し、骨髄由来DC-CYP-ALDH細胞(BMDC-CYP-ALDH細胞)を産生した。続いて、BMDC-CYP-ALDH細胞をFACSによる1α-ヒドロキシラーゼの発現について調べた。我々のデータは、BMDC-CYP-ALDH細胞を、親BMDCと比較した場合、1α−ヒドロキシラーゼの増強発現を示した(図1A)。また、BMDC-CYP-ALDH細胞における1α-ヒドロキシラーゼの酵素活性を決定した。これを行うために、CM-10-R細胞培養培地の2mL中の1.0x106 BMDC-CYP-ALDH細胞を12ウェル培養プレートに添加した。25(OH)Dを2.5μMの最終濃度で細胞培養に添加した。細胞を37°Cで培養し、24時間5%CO2で培養し、放射性免疫測定法(RIA)を用いて1,25(OH)2Dの測定のために上清を採取した。我々のデータは、BMDC-CYP細胞(レンチCYP-GFPウイルスで伝達されたBMdPC)およびBMDC-CYP-ALDH細胞の培養上清中の1,25(OH)2D濃度が、それぞれ親BMdCおよびBMDC-ALDH細胞(BMDC-ALDH)とBMDC-ALDH細胞(BMDC-ALDH)のものよりも約20倍高いことを示した。
DC-CYP-ALDH細胞は、RALDH2の有意に増加した量を発現した。BMDC-CYP-ALDH細胞がRALDH2の有意に増加した量を発現したかどうかを判断するために、RALDH2阻害剤ジエチルアミノベンズアルデヒド(DEAB)の有無において、RALDH2基質を細胞培養物に添加した(15μM)。細胞内部に保持された蛍光産物をFACSにより分析した。我々のデータは、BMDC-CYP-ALDH細胞の平均蛍光強度(MI)が親BMMCのそれより約6倍高かっていることを示し、BMDC-CYP-ALDH細胞が親BMdCsと比較した場合、RALDH2酵素活性を有意に増強したことを示唆した(図2A、B)。
DC-CYP-ALDH細胞は、foxp3+CCR9+腸ホーミングTreg細胞インビトロの誘導を増強した。DC-CYP-ALDH細胞がインビトロで腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強できるかどうかを調べるために、レンチCYP-ALDHウイルスを用いてDC2.4細胞(骨髄由来DCライン26、27、28、29)をレンチCYP-ALDHウイルスで誘導し、DC2.4-CYP-ALDH細胞を生成した。続いて、DC2.4-CYP-ALDH細胞がインビトロで腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強できるかどうかを判断した。従って、ナイーブCD4+T細胞をC57BL/6マウスから精製した。精製したナイーブCD4+T細胞を5 x105細胞/ウェルで、親DC2.4細胞(1x 105細胞/ウェル)またはDC2.4-CYP-ALDH細胞(1x)のいずれかで共培養した。 105細胞/ウェル)抗CD3モノクローナル抗体(5μg/mL)および組換えヒトIL-2(50 U/mL)の存在下で、24ウェル培養培地中のプレートを無血清培地中に培養した。また、種々の濃度で25(OH)Dおよびレチノールも培養物に添加した。細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートした。5日後、細胞をFACSにより、foxp3およびc-cケモカイン受容体9型(CCR9)の式について分析した。我々のデータは、基質の存在下で、DC2.4細胞がCD4+T細胞集団におけるfoxp3+CCR9+細胞の豊富さを有意に変化させないことを示した(図3A,B)。対照的に、DC2.4-CYP-ALDH細胞は、CD4+T細胞の中でfoxp3+CCR9+細胞の豊富さを有意に増強した。 さらに、25(OH)Dが添加されるほど、CD4+T細胞の中でfoxp3+CCR9+細胞の存在量を増加させるDC2.4-CYP-ALDH細胞の能力が大きくなる。したがって、我々のデータは、DC-CYP-ALDH細胞がインビトロで腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強することができることをサポートしています。
DC-CYP-ALDH細胞は、生体内のfoxp3+CCR9+腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強した。DC-CYP-ALDH細胞が生体内の腸内トレッグ細胞の誘導を増強できるかどうかを判断するために、親DC2.4細胞、DC2.4-CYP細胞(レンチCYP-GFPウイルスで転移したDC2.4細胞)、およびDC-2.4-CYP-ALP細胞のバルト/cマウスに、以下の細胞のうちの1つを腹腔内投与した。細胞投与の4日後に、腸間膜リンパ節をFACSにより調べた(図4A)。我々のデータは、DC2.4-CYP-ALDH細胞が対照と比較した場合、CD3+T細胞間のfoxp3+CCR9+細胞の存在量を有意に増加させたことを示した(図4B,C)。これらの結果に基づいて、DC-CYP-ALDH細胞投与により、末梢リンパ組織におけるfoxp3+CCR9+T細胞の誘導が著しく増強すると結論付ける。
図1:DC-CYP-ALDH細胞は、1α-ヒドロキシラーゼの有意に増加量を発現した。(A)BMDC-CYP-ALDH細胞を生成し、FACSにより分析した。代表的なFACSプロットは、親BMdCsおよびBMDC-CYP-ALDH細胞(生細胞上でゲート)における1α-ヒドロキシラーゼの発現を示す。(B)1α-ヒドロキシラーゼ基質(すなわち、25(OH)D)をDC培養物に添加した。24時間後、上清を回収し、1,25(OH)2D濃度を測定した。このデータは、親BMdCs、BMDC-CYP細胞、BMDC-ALDH細胞、およびBMDC-CYP-ALDH細胞の培養における1,25(OH)2Dの濃度を示す。**p< 0.01.ANOVAテスト。n = 4。この図は、Xu et al.6から適合しています。著作権 2019.米国免疫学者協会はこちらから、この図の大きなバージョンをご覧ください。
図2:DC-CYP-ALDH細胞は、RALDH2の有意に増加量を発現した。(A)BMDC-CYP-ALDH細胞を生成し、プロトコルに記載されているように分析した。代表的な重ね合合合FACSプロットは、ALHD2阻害剤ジエチルアミノベンズアルデヒド(DEAB)の存在(+DEAB)または不在(-DEAB)におけるBMDCおよびBMDC-CYP-ALDH細胞におけるBODIPYアミノ酢酸蛍光を示す。(B)DEABが存在しない場合のBMDCおよびBMDC-CYP-ALDH細胞におけるBODIPYアミノ酢酸の平均蛍光強度(MI)。*p < 0.05;t検定;n = 4。この図は、Xu et al.6から適合しています。著作権 2019.米国免疫学者協会はこちらから、この図の大きなバージョンをご覧ください。
図3:DC-CYP-ALDH細胞は、インビトロでfoxp3+CCR9+腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強した。(A)CD4+ナイーブT細胞をC57BL/6マウス脾臓から単離した。CD4+T細胞を、親DC2.4細胞またはDC2.4-CYP-ALDH細胞の存在下で抗CD3 mAb(5μg/mL)によって培養中に活性化した。さらに、培養物を25(OH)Dおよびレチノールの示された濃度で添加した。5日後、CD3+CD4+T細胞集団におけるfoxp3およびCCR9の式についてFACSによって細胞を収集し、分析した。代表的なFACSプロットは、CD3+CD4+ T細胞集団におけるfoxp3およびCCR9の式を示す。(B) (A) からの累積データ 。*p < 0.05;ANOVAテスト;n = 4。この図は、Xu et al.6から適合しています。著作権 2019.米国免疫学者協会はこちらから、この図の大きなバージョンをご覧ください。
図4:DC-CYP-ALDH細胞は、生体内のfoxp3+CCR9+腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強した。 (A)Balb/cマウスは腹腔内(i.p.)次のDC伝達(転送)の1つを受け取りました:DC転送なし(転送なし)、親DC2.4細胞、DC2.4-CYP細胞、およびDC2.4-CYP-ALDH細胞。4日後、腸間膜リンパ節(MlN)をFACSで分析した。(B)代表的なFACSプロットは、CD3+T細胞集団におけるfoxp3およびCCR9の式を示す。(C)(B)からの累積データは、CD3 + T細胞集団における foxp3+CCR9+細胞のパーセンテージを示す。細胞をCD3+T細胞上でゲートし、すべての分析を行った。該当する場合、提示されるデータは平均 ± SEM. *p < 0.05;ANOVAテスト;n = 4 –6。この図は、Xu et al.6から適合しています。著作権 2019.米国免疫学者協会はこちらから、この図の大きなバージョンをご覧ください。
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Discussion
この記事では、末梢リンパ組織における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するためのDC-CYP-ALDH細胞の使用について説明する。我々のデータは、DC-CYP-ALDH細胞が対応する基質(すなわち、25[OH]Dおよびレチノール)の存在下でインビトロで1,25(OH)2DおよびRAの両方の局所的に高濃度のde novoを合成できることを示している。25(OH)Dとレチノールの十分な血中濃度は、欠乏症30、31を有する患者においてそれぞれビタミンDおよびA補充を介して容易に達成することができるので、我々は、DC-CYP-ALDH細胞が25(OH)Dおよびレチノの正常な血中濃度が存在する場合に末梢リンパ組織における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強することができる理由である。この推論を裏付けるために、我々のデータは、ビタミンDおよびビタミンA欠乏症を有さない正常な健康動物において、DC-CYP-ALDH細胞が調節分子(すなわち、foxp3およびIL-10)と腸ホーミング受容体(すなわち、CCR9)の両方を発現するTreg細胞の誘導を増強することを示している。したがって、この技術は、IBDの治療のための腸ホーミングTreg細胞のさらなる調査に使用することができる。
このプロトコルの重要なステップの 1 つは、高力力を持つレンティ CYP-ALDH ウイルスの生産です。.推奨されるウイルスの検出器は、108– 109 TUs/mL である必要があります。CCの高い転調効率を得するには、レンズCYP-ALDHウイルスの高い力力が必要です。
このプロトコルのもう 1 つの重要なステップは、DC の伝達効率です。DC-CYP-ALDH細胞は、この技術ではインビトロで耐性を持たないため、DC-CYP-ALDH細胞が生体内での腸内トーミングトレグ細胞の誘導を効率的に増強できるように、転帰率が90%を超えることが不可欠です。加えて、DC-CYP-ALDH細胞は、生体内投与32の前にFACSによってさらに精製することができる。
このプロトコルのユニークな利点は、DC-CYP-ALDH細胞がインビボ投与の前にインビトロで許容される必要がなされないことです。DC-CYP-ALDH細胞は、1,25(OH)2DおよびRAの組み合わせ作用の結果として、1,25(OH)2DおよびRAの両方がDC33、34を許容することが示されているため、生体内での対レロゲン状態で維持されると予想される。したがって、DC-CYP-ALDH細胞は、生体内炎症性環境において不安定な懸念を持たないことを期待する。
現在、我々は、DC-CYP-ALDH細胞が末梢リンパ組織および腸6における腸ホーミングTreg細胞の頻度(数)を増加させることができることを実証したに過ぎない。その結果、腸全体の調節機能が増強される。図4は、対照治療と比較した場合、DC-CYP-ALDH細胞による腹腔内治療は、腸間膜リンパ節におけるCCR9+foxp3+Treg細胞の割合を有意に増加させ、腸間膜リンパ節のより多くのTreg細胞が腸組織に特異的に生息できることを意味する。図4はさらに、腸間膜リンパ節のほとんどのfoxp3+T細胞がCCR9に対して陰性であり、したがって腸ホーミング能力を有しないことを示す。しかし、DC-CYP-ALDH細胞が各Treg細胞の制御機能を高めることができるかどうか(foxp3および/またはIL-10の発現レベルの増強など)、さらなる調査が必要である。
ここで説明する試薬および材料は、動物実験のみを目的としています。しかし、このプロトコルは、対応するヒト試薬および材料を用いたヒト研究に適用可能であるが、DCはヒトの末梢血単球から生成されることを除いて。このプロトコルの究極の目標は、IBDの治療のための臨床グレードDC-CYP-ALDH細胞の生成です。
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Disclosures
小雷唐博士とデビッド・J・ベイリンク博士は、この研究に関連する保留中の特許の発明者です。
Acknowledgments
この作品は、第1報のピアレビュー医学研究プログラムを通じて、国防次官補事務局の支援を受けました。W81XWH-15-1-0240 (XT)意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるものではありません。この研究はまた、ロマリンダ大学医学科(681207-2967[XTとGG]、681205-2967[XT]、および325491[DJB])からの研究イノベーション助成金によって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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