Summary
Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.
Abstract
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial de la mucosa. Recientemente demostramos que las células T reguladoras intestinales (Treg) son una terapia prometedora para la EII. En consecuencia, este artículo presenta un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir concentraciones localmente altas de dos moléculas de novo, vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA basándose en hallazgos anteriores que muestran que 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabecera P3 e interleucina-10) y que la AR puede estimular la expresión de receptores intestinales en células T. Para generar estas células dendríticas diseñadas, utilizamos un vector lentiviral para transducir las células dendríticas para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1o-hidroxilasa, que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2, que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA. Este protocolo se puede utilizar para la investigación futura de células Treg intestinales in vivo.
Introduction
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial mucosa1,2. Por esta razón, actualmente disponibles medicamentos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus sitios) inhiben las funciones de los mediadores inflamatorios o bloquean la localización de células inmunitarias en el intestino. Sin embargo, los mediadores inflamatorios y las células inmunitarias que están dirigidas también son necesarios para las defensas inmunitarias. Como resultado, los inhibidores del mediador inflamatorio comprometen la defensa inmune sistémica y los bloqueadores de homing de células inmunitarias debilitan la defensa inmune intestinal, lo que puede conducir a consecuencias graves3,4. Además, los bloqueadores de homing de células inmunitarias también pueden bloquear la homing de células T reguladoras (Treg) en el intestino y por lo tanto pueden empeorar la tolerancia inmunitaria intestinal ya comprometida en pacientes con EII. Además, el bloqueo de la célula de Treg homing en el intestino también puede conducir a la supresión inmune sistémica debido a la acumulación de células Treg en la sangre5. Por último, los inhibidores y bloqueadores funcionan de forma transitoria y, por lo que, requieren administraciones frecuentes. La administración frecuente de estos inhibidores y bloqueadores puede exacerbar aún más los efectos secundarios adversos.
Recientemente, propusimos una estrategia novedosa que potencialmente puede mitigar o incluso eliminar los efectos secundarios asociados con los fármacos actuales para el tratamiento de la EII6. Esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6. La razón de esta estrategia es que las células Treg intestinales específicamente hogar del intestino y por lo tanto no comprometerá las defensas inmunitarias sistémicas. Además, dado que las células Treg pueden potencialmente formar memoria7,8, las células Treg intestinales pueden potencialmente proporcionar un control estable de la inflamación intestinal crónica en pacientes con EII y, por lo tanto, el tratamiento no debe ser necesario administrar con tanta frecuencia. Además, dado que esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales in vivo, no tiene la preocupación de la inestabilidad in vivo en un entorno altamente proinflamatorio que se asocia con la transferencia adoptiva de células Treg generadas in vitro9,10. En este sentido, las células Treg generadas in vitro son una de las estrategias propuestas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes11,12,13 y rechazo de trasplante14,15. Finalmente, en esta estrategia, las células dendríticas (CC) están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de dos moléculas de novo: vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA porque 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabezal de horquilla P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 y que RA puede estimular la expresión de receptores de homing intestinal en las células T18. Debido a que tanto 1,25(OH)2D como RA también pueden tolerizar los CC28,29,raquemos por ello que los CC de ingeniería se mantendrán establemente en un estado tolerogénico in vivo y, por lo tanto, eludan las preocupaciones de inestabilidad in vivo asociadas con los CC tolerogénicos generados in vitro (TolDCs)19,20,21. En este sentido, los TolDC son también una de las estrategias propuestas para el aumento in vivo de las funciones celulares treg19,20,21. Para apoyar nuestro razonamiento, hemos demostrado que los controladores de tecnología de desarrollo, tras la entrega in vivo, pueden aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6.
Una ventaja adicional de nuestra estrategia propuesta es que 1,25(OH)2D también tiene otras funciones que potencialmente pueden beneficiar a los pacientes con EII. Estas otras funciones incluyen la capacidad de 1,25(OH)2D para estimular la secreción de antimicrobianos22 y para suprimir la carcinogénesis23. Las infecciones y los cánceres se asocian con frecuencia con la EII24,25.
Para generar los CC que pueden producir concentraciones localmente altas de 1,25(OH)2D y RA de novo, utilizamos un vector lentiviral para diseñar dCs para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D-hidroxilasa (1o-hidroxilasa), que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 (ALDH1a2) que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2 (RALDH2), que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA6.
Debido a que el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal es potencialmente importante en el tratamiento de la EII, en el siguiente protocolo detallaremos los procedimientos para la generación de los DC subexpresantes 1--hidroxilasa-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que se puede utilizar para la futura investigación de células Treg intestinales in vivo.
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Protocol
Todos los protocolos de estudio animal in vivo fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad lomána (IACUC), así como por la Oficina de Revisión de Cuidado y Uso de Animales (ACURO) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) Departamento de Defensa.
1. Preparación del Lentivirus que expresa tanto 1o-hidroxilasa como RALDH2 (virus lenti-CYP-ALDH)
- Día 0: En la madrugada, prepare 5 x 105 células/ml de células 293T en el medio de cultivo celular CM-10-D.
- Semilla s20 mL/placa en platos de cultivo de 150 mm x 25 mm. Cultivo de las células a 37oC y 5%co2 durante 24 h. La confluencia alcanzará el 80-90% después de 24 h.
- Día 1: Hacer 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, y 1.5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot y almacenar a -20oC.
- Hacer 2 M CaCl2 y almacenar a temperatura ambiente.
- Para cada plato de cultivo de 150 mm x 25 mm, prepare una mezcla de precipitación de ADN en un tubo de cultivo estéril de 50 ml. En primer lugar, añadir 1.620 l de 2 x HBS, 9,5 g de PMD2G (VSVG), 17,5 g de pCMVR8,74 (Capsid), 27 g de plásmido Lenti-CYP-ALDH (un vector lentiviral que transporta tanto CYP27B1 como ALDH1a2). En segundo lugar, añada H2O a un volumen final de 3.037,5 l.
- En el último, añadir 202,5 l de 2 M CaCl2 en sentido de gota mientras se mezcla la solución a las concentraciones finales de 1x HBS y 125 mM CaCl2. CaCl2 debe ser el último en agregarse. Deje las mezclas de transfección a temperatura ambiente durante 20 minutos con mezcla ocasional. Para múltiples platos de cultivo de 150 mm x 25 mm, escale verticalmente en consecuencia.
- Agregue los 3.240 l de mezcla de precipitación de ADN con gota a un plato de cultivo de 150 mm x 25 mm que contenga las células 293T. Gire suavemente la guarnición del cultivo de lado a lado mientras agrega la mezcla de precipitación de ADN. Incubar el plato a 37oC y 5%CO2 durante 24 h.
- Día 2: Retire la solución de transfección de fosfato cálcico, lave suavemente con 1 pbS y vuelva a alimentar el cultivo celular con un medio de cultivo celular CM-4-D. Incubar las células a 37oC y 5%co2 durante 24 h.
- Día 3: Cosecha los sobrenatantes en botellas de almacenamiento estériles y guárdalos a 4-8oC. Reponer el cultivo celular con un medio de cultivo celular CM-4-D fresco. Cultivo de las células a 37oC y 5% co2 para otras 24 h.
- Día 4: Cosecha los sobrenatantes en botellas de almacenamiento estériles. Filtrar los sobrenadores desde el día 3 y el día 4 a través de un filtro de 0,45 m. Para concentrar el virus pseudotipo VSVG, transfiera los sobrenatantes a tubos de centrífuga y gire a 4.780 x g durante 24 h a 4 oC.
- Día 5: Vierta los sobrenadores de los pellets (el pellet es a menudo visible) y deje que los tubos drenen en una toalla de papel en un gabinete de bioseguridad estéril durante varios minutos.
- Resuspenda los pellets pipeteando con PBS estéril que contenga 5% glicerol. El volumen de resuspensión será de 33,3 ml por plato de cultivo de 150 mm x 25 mm.
- Aliquot 200 l/tubo y conservar a -80 oC. Haga una alícuota separada de 50 l/vial para fines de valoración. Los titers deben estar dentro del rango de 108–109 unidades de transducción (TU)/ml.
- Agregue lejía a los platos de cultivo y deséchelos.
NOTA: Estas células transinfectadas son la mayor preocupación de seguridad en el protocolo, ya que todos los elementos lentivirales se expresan en las células.
2. Generación de CC derivados de médula ósea (BMC)
- Cosecha tibias y fémures de 4-5 ratones Balb/c en un tubo de polipropileno estéril de 50 ml que contiene el medio de cultivo6.
- Transfiera las tibias y los fémures a un plato de cultivo de 100 mm x 20 mm que contenga el medio de cultivo. Retire los tejidos como los músculos de las tibias y los fémures usando tijeras y fórceps disecantes.
- Corte ambos extremos de las tibias y fémures para exponer la cavidad de la médula ósea.
- Dibuje un medio de cultivo de 10 ml en una jeringa de 10 ml unida a una aguja de 30 G.
- Inserte cuidadosamente la aguja en la cavidad de la médula ósea y latire la médula ósea en un tubo de polipropileno estéril limpio de 50 ml. Repita este procedimiento si es necesario, para asegurarse de que la médula ósea se ha eliminado por completo.
- Peletizar las células de la médula ósea por centrifugación (400 x g)a 2-8 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet con 5 ml de 1 x tampón de lisis de glóbulos rojos.
- Incubar las células a temperatura ambiente durante 4-5 min con agitación ocasional.
- Detenga la reacción añadiendo 30 ml de medio de cultivo.
- Reventar las células por centrifugación (400 x g)a 2-8 oC durante 5 min. Resuspender las células en 10 ml de medio de cultivo celular CM-10-R. Si es necesario, las células se pueden pasar a través de un colador de células de 40 m para eliminar los desechos.
- Realice un recuento de celdas y ajuste las celdas a 1 x 106 celdas/ml usando el medio de cultivo de células CM-10-R.
- Añadir el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrofagos recombinantes (GM-CSF, concentración final a 100 U/ml) e interleucina murina-4 (IL-4, concentración final a 10 U/ml).
NOTA: Las soluciones de stock de GM-CSF e IL-4 se almacenan a -80 oC a 100.000 U/ml (1.000x) y 10.000 U/ml (1.000x), respectivamente. - Distribuya las células en 6 placas de cultivo de pozos a 4 ml/pozo y linolie las células a 37oC y 5%CO2 durante 48 h.
- Retire las celdas no adherentes con un pipeteo suave.
- Agregue el nuevo medio de cultivo de células CM-10-R que contenga el GM-CSF (100 U/mL) y el IL-4 (10 U/mL). Cultivo de las células durante otras 48 h.
- Cosecha de células no adherentes (BMCD) para la transducción por el virus lenti-CYP-ALDH.
3. Transducción de DC con el virus lenti-CYP-ALDH para generar células DC-CYP-ALDH
- Preparar 1 x 106 DCs/bien en un volumen total de 0,5 ml de medio de cultivo celular CM-10-R que contenga 50 s de virus y protamina de 8 g/ml en una placa de cultivo de 6 pocillos.
- Cultivo de las células a 37oC y 5%co2 durante 24 h.
- Sustituya el medio por un nuevo medio de cultivo celular CM-10-R y el cultivo de las células a 37 oC y 5% deCO2 para otros 24 h. En este momento, se pueden evaluar las actividades enzimáticas de 1o-hidroxilasa y RALDH2 (ver paso 4). Si es necesario, repita los pasos 3.1–3.3 para una segunda transducción.
- Añadir lipopolisacárido (100 ng/mL) y cultivar las células durante 24 h.
- Cosecha las células (células DC-CYP-ALDH) para experimentos.
4. Evaluación de las células sobreexpresadas de 1o-hidroxilasa y RALDH2 en células DC-CYP-ALDH
- Evaluación de la sobreexpresa de la hidroxilasa de 1o en células DC-CYP-ALDH
- Semilla 1.0 x 106 CÉLULAs DC-CYP-ALDH/bien en 2 mL de medio de cultivo celular CM-10-R en 12 placas de cultivo de pozo.
- Añadir 25(OH)D a la concentración final de 2,5 m. Incubar las células DC-CYP-ALDH durante 24 horas.
- Cosecha los supernatantes y guárdalos a -20oC.
- Ensayo para concentraciones de 1,25(OH)2Den los supernatantes utilizando un radioinmunoensayo (RIA) disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).
- Determinar la expresión de 1-hidroxilasa en células DC-CYP-ALDH por fluorescencia activada clasificación celular (FACS) utilizando un anticuerpo anti-CYP27B1.
- Evaluación del RALDH2 sobreexpresado en células DC-CYP-ALDH
NOTA: La expresión y la actividad del RALDH2 sobreexpresado se determinan utilizando un kit de detección de aldehído deshidrogenasa comercial (ALDH) (ver Tabla de materiales).- Semilla 1 mL de DC-CYP-ALDH o células de control (1 x 105 celdas/ml en tampón de ensayo) en cada uno de dos tubos de 5 ml (uno etiquetado como "Control" y el otro etiquetado como "Prueba").
- Añadir 10 l de solución de dietilominobenzaldehído (DEAB) (1,5 mM en etanol al 95%) a cada uno de los tubos de control y mezclar inmediatamente. DEAB es un inhibidor de RALDH2.
- Añadir 5 l de sustrato de fluorescencia RALDH activado (300 m) a los tubos de control y ensayo y mezclar inmediatamente.
- Incubar los tubos durante 45 min.
- Peletizar las células por centrifugación a 400 x g a 2-8 oC durante 5 min. Aspirar los sobrenadores.
- Reconstituir las celdas en 200 ml de búfer de ensayo.
- Mantenga las células en hielo y proceda para el análisis por FACS.
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Representative Results
Las células DC-CYP-ALDH expresaron un aumento significativo de la cantidad de 1o-hidroxilasa. Para determinar si las células DC-CYP-ALDH generadas a partir de BMDC expresaron una cantidad significativamente mayor de 1o-hidroxilasa, los BMDC fueron transducidos con el virus lenti-CYP-ALDH para producir células DC-CYP-ALDH derivadas de médula ósea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, las células BMDC-CYP-ALDH fueron examinadas para la expresión de 1-hidroxilasa por FACS. Nuestros datos mostraron que las células BMDC-CYP-ALDH, en comparación con los BMDC parentales, mostraron una expresión mejorada de la 1a-hidroxilasa(Figura 1A). También determinamos la actividad enzimática de la 1a-hidroxilasa en las células BMDC-CYP-ALDH. Para ello, se añadieron 1.0 x 106 células BMDC-CYP-ALDH en 2 mL de medio de cultivo celular CM-10-R en 12 placas de cultivo de pozos. 25(OH)D se añadió entonces al cultivo celular a la concentración final de 2,5 M. Las células se cultivaron a 37 oC y 5% de CO2 durante 24 h y los sobrenatantes se cosecharon para la medición de 1,25(OH)2D utilizando un radioinmunoensayo (RIA). Nuestros datos mostraron que las concentraciones de 1,25(OH)2Den los sobrenatantes de cultivo de las células BMDC-CYP (BMDC transducidas con el virus lenti-CYP-GFP) y las células BMDC-CYP-ALDH fueron aproximadamente 20 veces más altas que las de los BMDC parentales y las células BMDC-ALDH (BMDC transducidas con virus lenti-ALDH)(Figura 1B).
Las células DC-CYP-ALDH expresaron un aumento significativo de la cantidad de RALDH2. Para determinar si las células BMDC-CYP-ALDH expresaron un aumento significativo de la cantidad de RALDH2, se añadió un sustrato de RALDH2 a los cultivos celulares en presencia o ausencia del inhibidor de RALDH2 diethylaminobenzaldehídehído (DEAB) (15 m). El producto fluorescente retenido dentro de las células fue analizado por FACS. Nuestros datos mostraron que las intensidades de fluorescencia medias (IMF) de las células BMDC-CYP-ALDH eran aproximadamente 6 veces más altas que las de los BMC parentales, lo que sugiere que las células BMDC-CYP-ALDH, en comparación con los BMDC parentales, expresaron una actividad enzimática Significativamente mejorada de RALDH2(Figura 2A,B).
Las células DC-CYP-ALDH aumentaron la inducción de foxp3+CCR9+ células Treg intestinales in vitro. Para investigar si las células DC-CYP-ALDH fueron capaces de aumentar la inducción de células Treg intestinales in vitro, transdujo células DC2.4 (una línea de CC derivada de la médula ósea26,27,28,29), con el virus lenti-CYP-ALDH y generamos células DC2.4-CYP-ALDH. Posteriormente, determinamos si las células DC2.4-CYP-ALDH fueron capaces de aumentar la inducción de células Treg intestinales in vitro. En consecuencia, las células CD4+ T ingenuas fueron purificadas a partir de ratones C57BL/6. Las células CD4+ T ingenuas purificadas a 5 x 105 células/bien fueron entonces cocultivadas con las células DC2.4 parentales (1 x 105 células/bien) o las células DC2.4-CYP-ALDH (1 x 105 células/pozo) en 24 placas de cultivo de pozo en un medio libre de suero en presencia de un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (5 g/ml) y IL-2 humano recombinante (50 U/ml). Además, 25(OH)D y retinol en varias concentraciones también se añadieron a los cultivos. Las células fueron incubadas a 37oC y 5%co2. Cinco días más tarde, facS analizó las células para las expresiones de foxp3 y c-c quimioquina tipo 9 (CCR9). Nuestros datos mostraron que en presencia de los sustratos, las células DC2.4 no cambiaron significativamente la abundancia de foxp3+CCR9+ células en las poblaciones de células CD4+ T(Figura 3A,B). Por el contrario, las células DC2.4-CYP-ALDH mejoraron significativamente la abundancia de foxp3+CCR9+ células entre las células CD4+ T. Además, cuanto más 25(OH)D añadido, mayor es la capacidad de las células DC2.4-CYP-ALDH para aumentar la abundancia de foxp3+CCR9+ células entre las células CD4+ T. Por lo tanto, nuestrosoporte de datos que las células DC-CYP-ALDH pueden aumentar la inducción de células Treg intestinales in vitro.
Las células DC-CYP-ALDH aumentaron la inducción de foxp3+CCR9+ células Treg intestinales in vivo. Para determinar si las células DC-CYP-ALDH podrían aumentar la inducción de células Treg intestinales in vivo, administramos por vía intraperitoneal una de las siguientes células en ratones Balb/c: las células DC2.4 parentales, las células DC2.4-CYP (células DC2.4 transducidas con virus lenti-CYP-GFP) y las células DC-2.4-CYP-ALDH. Cuatro días después de la administración celular, facéfilos linfáticos mesentéricos fueron examinados por FACS(Figura 4A). Nuestros datos mostraron que las células DC2.4-CYP-ALDH, en comparación con los controles, aumentaron significativamente la abundancia de foxp3+CCR9+ células entre células CD3+ T(Figura 4B,C). Basándonos en estos resultados, llegamos a la conclusión de que la administración celular DC-CYP-ALDH aumenta significativamente la inducción de células foxp3+CCR9+ T en tejidos linfoides periféricos.
Figura 1: Células DC-CYP-ALDH expresadas significativamente mayor cantidad de 1-hidroxilasa. (A) LAS células BMDC-CYP-ALDH fueron generadas y analizadas por FACS. Una gráfica FACS representativa muestra la expresión de 1o-hidroxilasa en los BMDC parentales y las células BMDC-CYP-ALDH (cerradas en células vivas). (B) 1o-hidroxilasa sustrato (es decir, 25(OH)D) se añadió a los cultivos de CC. 24 h más tarde, se recogieron los sobrenatantes y se midieron 1,25 (OH)2D concentraciones. Los datos muestran concentraciones de 1,25(OH)2D en los cultivos de los BMDC parentales, las células BMDC-CYP, las células BMDC-ALDH y las células BMDC-CYP-ALDH. **p < 0.01. Prueba ANOVA. n 4. Esta figura está adaptada de Xu et al.6. Copyright 2019. La Asociación Americana de Inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2: Células DC-CYP-ALDH expresadas significativamente mayor cantidad de RALDH2. (A) Las células BMDC-CYP-ALDH se generaron y analizaron como se describe en el protocolo. Las gráficas FACS superpuestas representativas muestran la fluorescencia del aminoacetato DE BODIPY en los BMDC y las células BMDC-CYP-ALDH en presencia (+DEAB) o ausencia (-DEAB) del inhibidor RALHD2 diethylaminobenzaldehyde (DEAB). (B) Intensidades medias de fluorescencia (IMF) de aminoácido sPOIPY en los BMC y las células BMDC-CYP-ALDH en ausencia de DEAB. *p < 0.05; prueba t; n 4. Esta figura está adaptada de Xu et al.6. Copyright 2019. La Asociación Americana de Inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 3: Células DC-CYP-ALDH aumentaron la inducción de foxp3+CCR9+ células Treg intestinales in vitro. (A) CD4+ células T ingenuas se aislaron de los bazos del ratón C57BL/6. Las células CD4+ T fueron entonces activadas en cultivos por un anti-CD3 mAb (5 g/mL) en presencia de las células parentales DC2.4 o las células DC2.4-CYP-ALDH. Además, los cultivos se añadieron con las concentraciones indicadas de 25(OH)D y retinol. Cinco días más tarde, facS recogió y analizó las células para las expresiones de foxp3 y CCR9 en la población de células CD3+CD4+ T. Las gráficas FACS representativas muestran las expresiones de foxp3 y CCR9 en las poblaciones de células CD3+CD4+ T. (B) Datos acumulados de (A). *p < 0.05; Prueba aNOVA; n 4. Esta figura está adaptada de Xu et al.6. Copyright 2019. La Asociación Americana de Inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4: Células DC-CYP-ALDH aumentaron la inducción de foxp3+CCR9+ células Treg intestinales in vivo. (A) Los ratones Balb/c por vía intraperitoneal (i.p.) recibieron una de las siguientes transferencias de CC (Transferencia): sin transferencia de CC (sin transferencia), células DC2.4 parentales, células DC2.4-CYP y células DC2.4-CYP-ALDH. Cuatro días después, facS analizó los ganglios linfáticos mesentéricos (LMM). (B) Las gráficas FACS representativas muestran las expresiones de foxp3 y CCR9 en la población de células CD3+ T. (C) Los datos acumulados de (B) muestran el porcentaje de foxp3+CCR9+ células en la población de células CD3+ T. Las células se encerradon en las células CD3+ T para todos los análisis. En su caso, los datos presentados son medios: SEM. *p < 0,05; Prueba aNOVA; n 4–6. Esta figura está adaptada de Xu et al.6. Copyright 2019. La Asociación Americana de Inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
En este artículo describimos el uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos. Nuestros datos han demostrado que las células DC-CYP-ALDH pueden sintetizar concentraciones localmente altas de novo de 1,25(OH)2D y RA in vitro en presencia de sustratos correspondientes (es decir, 25[OH]D y retinol, respectivamente). Debido a que las concentraciones sanguíneas suficientes de 25(OH)D y retinol se pueden lograr fácilmente a través de suplementos de vitamina D y A respectivamente en pacientes que tienen deficiencias30,31, razonamos que las células DC-CYP-ALDH pueden aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos cuando hay concentraciones normales de sangre de 25(OH)D y retinol. Para apoyar este razonamiento, nuestros datos demuestran que en animales sanos normales que no tienen deficiencias de vitamina D y vitamina A, las células DC-CYP-ALDH aumentan la inducción de células Treg que expresan ambas moléculas reguladoras (es decir, foxp3 e IL-10) y un receptor de tripa (es decir, CCR9). Por lo tanto, esta tecnología se puede utilizar para la investigación adicional de células Treg intestinales para el tratamiento de la EII.
Un paso crítico de este protocolo es la producción de virus lenti-CYP-ALDH con tituladores altos. Los lanzadores de virus preferidos deben ser 108–109 TU/ml. Un alto titer del virus lenti-CYP-ALDH es necesario para una alta eficiencia de transducción en DC.
Otro paso crítico de este protocolo es la eficiencia de transducción en los controladores de datos. Debido a que las células DC-CYP-ALDH no se toleran in vitro en esta tecnología, es esencial que la tasa de transducción sea superior al 90% para garantizar que las células DC-CYP-ALDH puedan aumentar eficientemente la inducción de células Treg intestinales in vivo. Además, las células DC-CYP-ALDH pueden ser purificadas aún más por FACS antes de la administración in vivo32.
Una ventaja única de este protocolo es que las células DC-CYP-ALDH no necesitan ser tolerizadas in vitro antes de la administración in vivo. Se espera que las células DC-CYP-ALDH, como resultado de las acciones combinadas de 1,25(OH)2D y RA, se mantengan en un estado tolerogénico in vivo porque se ha demostrado que tanto 1,25(OH)2D como RA tolerizan los DC33,34. Por lo tanto, anticipamos que las células DC-CYP-ALDH no tendrán problemas de inestabilidad en un ambiente proinflamatorio in vivo.
Actualmente, sólo hemos demostrado que las células DC-CYP-ALDH pueden aumentar la frecuencia (número) de las células Treg intestinales en los tejidos linfoides periféricos y los intestinos6. Por lo tanto, la función reguladora en los intestinos en su conjunto se mejora porque el porcentaje de células Treg en los intestinos se incrementa. La Figura 4 muestra que, en comparación con los tratamientos de control, el tratamiento intraperitoneal con células DC-CYP-ALDH aumentó significativamente el porcentaje de células CCR9+foxp3+ Treg en los ganglios linfáticos mesentéricos, lo que significa que más células Treg en los ganglios linfáticos mesentéricos son capaces de alojar específicamente en los tejidos intestinales. La Figura 4 muestra además que la mayoría de los linfocitos foxp3+ T en ganglios linfáticos mesentéricos son negativos para CCR9 y, por lo tanto, no tienen capacidad de descomponer el intestino. Sin embargo, si las células DC-CYP-ALDH también pueden mejorar la función reguladora de cada célula Treg per se (como niveles de expresión mejorados de foxp3 y/o IL-10) requiere una investigación adicional.
Los reactivos y materiales descritos aquí son sólo para estudios en animales. Sin embargo, el protocolo es aplicable a los estudios en humanos mediante el uso de reactivos y materiales humanos correspondientes, excepto que los controladores de rendimiento se generarán a partir de monocitos de sangre periférica en humanos. El objetivo final de este protocolo es la generación de células DC-CYP-ALDH de grado clínico para el tratamiento de la EII.
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Disclosures
Los Doctores Xiaolei Tang y David J. Baylink son inventores de una patente pendiente relacionada con este estudio.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación Médica Revisado por Pares bajo el Premio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por las Becas de Innovación en Investigación del Departamento de Medicina de la Universidad Loma Linda (681207-2967 [XT y GG], 681205-2967 [XT] y 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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