Summary
Un protocole pour la génération de paysages chimiques dynamiques par photolyse dans des configurations microfluidiques et millifluidiques est présenté. Cette méthodologie est appropriée pour étudier divers processus biologiques, y compris le comportement motile, l'absorption des nutriments, ou l'adaptation aux produits chimiques des micro-organismes, à la fois au niveau de la cellule unique et au niveau de la population.
Abstract
Nous démontrons une méthode pour la génération des impulsions chimiques contrôlées et dynamiques, où le chimioattractant localisé devient soudainement disponible à l'échelle micro-pour créer des micro-environnements pour des expériences microbiennes de chimiotaxis. Pour créer des impulsions chimiques, nous avons développé un système pour introduire des sources d'acides aminés quasi-instantanément par photolyse d'acides aminés en cage dans une chambre microfluidique de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenant une suspension bactérienne. Nous avons appliqué cette méthode à la bactérie chimiotaxique, Vibrio ordalii, qui peut gravir activement ces gradients chimiques dynamiques tout en étant suivi par microscopie vidéo. Les acides aminés, rendus biologiquement inertes («caged») par modification chimique avec un groupe de protection photomovible, sont uniformément présents dans la suspension, mais pas disponibles pour la consommation jusqu'à leur libération soudaine, qui se produit à des points définis par l'utilisateur dans le temps et l'espace au moyen d'un faisceau LED axé sur les UV-A. Le nombre de molécules libérées dans l'impulsion peut être déterminé par une relation d'étalonnage entre le temps d'exposition et la fraction non-curation, où le spectre d'absorption après la photolyse est caractérisé par l'utilisation de la spectroscopie UV-Vis. Une membrane de polycarbonate nanoporeux (PCTE) peut être intégrée dans le dispositif microfluidique pour permettre l'élimination continue par l'écoulement des composés non encages et du support usé. Un lien fort et irréversible entre la membrane PCTE et la structure microfluidique PDMS est atteint en enrobant la membrane d'une solution de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) suivie d'une activation plasmatique des surfaces à cautionr. Un système contrôlé par ordinateur peut générer des séquences d'impulsions définies par l'utilisateur à différents endroits et avec des intensités différentes, de manière à créer des paysages de ressources avec la variabilité spatiale et temporelle prescrite. Dans chaque paysage chimique, la dynamique du mouvement bactérien à l'échelle individuelle et leur accumulation au niveau de la population peuvent être obtenues, permettant ainsi la quantification de la performance chimiothérapeutique et ses effets sur les agrégations bactériennes dans des environnements écologiquement pertinents.
Introduction
Les microbes s'appuient sur la chimiotaxie, le processus de détection des gradients chimiques et la modification de la motilité en réponse1, pour naviguer dans les paysages chimiques, approcher les sources nutritives et les hôtes, et échapper aux substances nocives. Ces processus à l'échelle micrométrique déterminent la cinétique macro-échelle des interactions entre les microbes et leur environnement2,3. Les progrès récents dans les technologies de microfluidique et de microfabrication, y compris la lithographie douce4, ont révolutionné notre capacité à créer des microenvironnements contrôlés dans lesquels étudier les interactions des microbes. Par exemple, des expériences antérieures ont étudié la chimiotaxie bactérienne en générant des gradients stables et hautement contrôlés de concentrations de nutriments intermédiaires à élevés5,6. Cependant, dans les environnements naturels, les gradients chimiques à l'échelle micrométrique peuvent être de courte durée, dissipées par la diffusion moléculaire, et les conditions de fond sont souvent très diluées7. Pour mesurer directement la réponse chimiothérapeutique des populations microbiennes d'abord exposées à des environnements chimiques instables, nous avons conçu et décrit ici des méthodes pour combiner la technologie microfluidique avec la photolyse, imitant ainsi les gradients que les bactéries sauvages rencontrent dans la nature.
La technologie de déballage utilise des sondes sensibles à la lumière qui encapsulent fonctionnellement des biomolécules sous une forme inactive. L'irradiation libère la molécule en cage, permettant la perturbation ciblée d'un processus biologique8. En raison du contrôle rapide et précis de la chimie cellulaire que le démantèle permet9, la photolyse des composés en cage a traditionnellement été utilisé par les biologistes, les physiologistes et les neuroscientifiques pour étudier l'activation des gènes10, canaux ioniques11, et les neurones12. Plus récemment, les scientifiques ont mis à profit les avantages significatifs de la photolyse pour étudier la chimiotaxie13, pour déterminer la dynamique de commutation de flagelle des cellules bactériennes individuelles exposées à un stimulus chimioattractant étape14,15, et d'étudier les modèles de motilité des spermatozoïdes simples dans les gradients tridimensionnels (3D)16.
Dans notre approche, nous mettons en œuvre la photolyse des acides aminés en cage dans les dispositifs microfluidiques pour étudier la réponse comportementale d'une population bactérienne aux impulsions chimiques commandées, qui deviennent presque instantanément disponibles par photorelease. L'utilisation d'un objectif de faible grossissement (4x) (NA - 0,13, profondeur de mise au point d'environ 40 m) permet à la fois l'observation de la réponse agrégative au niveau de la population de milliers de bactéries sur un grand champ de vision (3,2 mm x 3,2 mm), et la mesure du mouvement au niveau d'une seule cellule. Nous présentons deux applications de cette méthode : 1) la libération d'une impulsion chimique unique pour étudier la dynamique bactérienne d'accumulation-dissipation à partir de conditions uniformes, et 2i) la libération des impulsions multiples pour caractériser la dynamique d'accumulation bactérienne dans des conditions de chimioattractant séquentitentes et spatialement variables et spatialement. Cette méthode a été testée sur la bactérie marine Vibrio ordalii effectuant des chimiotaxis vers le glutamate d'acide aminé17, mais la méthode est largement applicable à différentes combinaisons d'espèces et de chimioattractants, ainsi qu'à des processus biologiques au-delà de la chimiotaxie (p. ex., absorption des nutriments, exposition aux antibiotiques, détection du quorum). Cette approche promet d'aider à élucider l'écologie et le comportement des micro-organismes dans des environnements réalistes et de découvrir les compromis cachés auxquels les bactéries individuelles sont confrontées lorsqu'elles naviguent dans des gradients dynamiques éphémères.
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Protocol
1. Fabrication du dispositif microfluidique pour l'expérience à impulsion chimique unique
- Concevez le canal à l'aide d'un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD) et imprimez-le sur un film de transparence pour créer le masque photo (Figure 1A).
- Fabriquer le maître par lithographie douce (dans des conditions de chambre propre).
- Nettoyer une plaquette de silicium (4 pouces) en succession rapide avec de l'acétone, du méthanol et de l'isopropanol, puis sécher à l'azote. Cuire la gaufrette au four à 130 oC pendant 5 min.
- Placez la plaquette au centre d'un spin-coater et versez le photoresist SU-8 sur la plaquette. Rampez la vitesse du spin-coater jusqu'à 500 tr/min sur 5 s, et maintenez à 500 tr/min pendant 10 s. Rampez jusqu'à la vitesse finale de plus de 10 s et maintenez à cette vitesse pendant 30 s.
REMARQUE : La valeur exacte de la vitesse finale dépend de l'épaisseur du revêtement ciblé et du SU-8 utilisé. - Après le processus de spin-enrobage, cuire la plaquette à 65 oC, puis à 95 oC. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante (RT) pendant au moins 5 min.
REMARQUE : Le temps de cuisson dépend de l'épaisseur ciblée et du type de photorésistance utilisé. En règle générale, pour chaque couche de 100 m, la plaquette doit être cuite au four pendant 5 min à 65 oC et 45 min à 95 oC. - Placez le masque photo sur la plaquette pour vous assurer que seule la région d'intérêt est exposée et polymérisée. Exposer à la lumière UV pour le temps recommandé dans le manuel SU-8.
REMARQUE : Ici, avec une énergie d'exposition de 200 mJ cm-2 à une longueur d'onde de 350 nm, la plaquette a été exposée pendant 150 s. - Cuire la plaquette à 65 oC et 95 oC pour le temps recommandé dans le manuel SU-8.
REMARQUE : En règle générale, pour chaque couche de 100 m, la plaquette doit être cuite au four pendant 5 min à 65 oC et 45 min à 95 oC. - Immerger la plaquette dans un bécher rempli de méthacrylate polyméthyle (PMMA) développeur afin d'obtenir le maître. Secouez doucement le bécher pour s'assurer que le photoresist non polymérisé est lavé. Cuire le maître à 200 oC pour recouper la couche SU-8.
- Préparer un mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS) en combinant l'élastomère avec son agent de séchage (Table of Materials) à un rapport de 10:1 dans un bécher (ici, 40 ml). Mélanger vigoureusement jusqu'à ce que le liquide soit homogène.
REMARQUE : Le mélange PDMS semblera opaque parce que des bulles sont générées pendant le processus de mélange.
CAUTION: Afin d'empêcher la peau d'entrer en contact avec des produits chimiques potentiellement dangereux ou des matières biologiques, toujours porter une blouse de laboratoire et des gants en plastique jetables tout au long du protocole et de suivre tous les protocoles de sécurité spécifiques selon le matériel Fiche de données sur la sécurité (MSDS). - Décorer le mélange PDMS dans une chambre à vide pendant 45 min à RT. Pour accélérer le processus, relâchez périodiquement le vide afin d'éclater les bulles qui se forment à l'interface.
REMARQUE : Le processus de dégazage doit être effectué dans un délai de 1 h pour empêcher le mélange de PDMS de commencer à guérir. - Retirer la poussière de la surface du maître à l'effet d'un nettoyant pressurisé, puis verser le mélange de PDMS dégazé sur le maître et cuire au four à 80 oC pendant 2 h.
REMARQUE : Alternativement, cuire la nuit (ou pendant au moins 12 h) à 60 oC permettrait d'obtenir le même PDMS durci. - Couper le PDMS avec une lame autour des microstructures (à une distance d'environ 5 mm) puis éplucher soigneusement le PDMS du maître.
- Percer des trous pour servir d'inlet et de sortie du microcanal (ici, une danse et une prise, voir Figure 1A). Assurez-vous que rien ne touche la face inférieure du PDMS où les caractéristiques sont situées.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Le microcanal doit être scellé avec du ruban adhésif pour empêcher l'accumulation de poussière et d'autres particules pendant le stockage. - Attachez le microcanal PDMS à une lame de verre.
- Nettoyez soigneusement une lameenneenne en verre avec du savon, de l'isopropanol et de l'eau déionisée. Laissez sécher le verre ou utilisez de l'air comprimé pour accélérer le processus.
- Enlever les particules de poussière en tamponnant avec du ruban adhésif. Attachez le microcanal PDMS sur la glissière de verre propre, immédiatement après le traitement des deux surfaces avec du plasma (en utilisant soit un système de couronne ou une chambre d'oxygène plasma) pendant 2 min.
- Placer l'appareil microfluidique pour chauffer sur une plaque chaude à 80 oC pendant au moins 1 h pour renforcer le lien chimique avec le verre.
2. Fabrication de l'appareil Millifluidic imprimé en 3D pour l'expérience avec des impulsions multiples
- Concevez la forme 3D à l'aide d'un logiciel de conception 3D et imprimez le maître pour le moule PDMS avec une imprimante 3D haute résolution (Figure 1B).
REMARQUE : Voir tableau des matériaux pour l'imprimante 3D et le matériau de moule utilisé pour créer le maître. - Répétez les étapes 1.3-1.4, puis nettoyez la surface du maître en tamponnant avec du ruban adhésif. Mettre le maître sur une échelle, puis, tout en évitant la région centrale du maître qui sera occupé par la membrane, verser sur la quantité exacte de mélange PDMS non durci (ici, 23,4 g) afin d'obtenir la hauteur désirée de PDMS en correspondant à la hauteur du maître (ici, 0,5 mm). Retirez les bulles restantes à l'aide d'air comprimé.
- Placer le plâtre PDMS sur le maître dans un four à 45 oC pour cuire au moins 12 h.
- Attachez le moule 3D PDMS à un plat Petri.
- Épluchez délicatement la couche durcie de PDMS et perforez les trous d'inlet et de sortie pour l'injection de la suspension bactérienne (Figure 1C).
- Activez à la fois la surface d'un plat Petri (90 mm x 15 mm) et le moule PDMS avec plasma d'oxygène pendant 2 min. Attachez le moule PDMS sur le plat Petri. Appuyez doucement sur le moule sur le plat Petri, mais n'appuyez pas là où les caractéristiques sont situées car cela peut effondrer la chambre d'interrogatoire.
- Placer le plat Petri collé au moule PDMS 3D dans un four à 45 oC pendant au moins 12 h pour renforcer le lien chimique.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
- Fonctionnalisation de surface de membrane18
- Activer la membrane de polycarbonate nanoporeux (PCTE) dans une chambre de plasma d'oxygène pendant 1 min à RT.
CAUTION: Évitez d'utiliser un système de couronne pour l'activation du plasma, car il endommagera la membrane. - Sous une hotte chimique, diluer une solution commerciale de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) dans de l'eau déionisée à 1% en volume (ici, 40 ml), à l'aide d'un tube de polypropylène.
CAUTION : La solution APTES est extrêmement toxique (score de danger pour la santé des SMD3) et doit être manipulée avec un soin extrême exclusivement sous une hotte chimique avec des gants. Changer de gants immédiatement après avoir manipulé la solution APTES. Les fumées APTES sont destructrices pour les muqueuses et les voies respiratoires supérieures. Les organes cibles d'APTES sont les nerfs, le foie et les reins. Si un capot de fumée n'est pas disponible, un écran facial et un respirateur intégral doivent être mis en œuvre. - Transférer la solution APTES diluée dans un plat Petri et immerger la membrane activée dans la solution APTES pendant 20 min.
- Retirez la membrane de la solution APTES à l'égard d'une pince à épiler et placez-la sur une lingette de chambre blanche pour sécher.
- Activer la membrane de polycarbonate nanoporeux (PCTE) dans une chambre de plasma d'oxygène pendant 1 min à RT.
- Pour la fabrication des canaux microfluidiques PDMS qui se trouveront sur la membrane et permettront le lavage de l'arène bactérienne, répétez les étapes 1.1-1.7.
- Attachez les canaux de lavage PDMS à la membrane fonctionfonctionnelle.
- Activez à la fois le canal de lavage PDMS et la membrane PCTE avec une chambre plasmadique à l'oxygène pendant 2 min.
REMARQUE : La membrane, qui sera prise en sandwich entre deux couches de PDMS, devrait être plus petite que le canal de lavage de PDMS. - Immédiatement après le traitement plasmatique, mettre en contact la membrane fonctionfonctionnelle et le canal de lavage PDMS en appuyant doucement sur le canal de lavage PDMS sur la membrane.
REMARQUE : N'exercez pas de pression excessive à ce stade, car elle pourrait causer l'attachement (irréversible) de la membrane au toit du canal, bloquant le canal.
- Activez à la fois le canal de lavage PDMS et la membrane PCTE avec une chambre plasmadique à l'oxygène pendant 2 min.
- Sandwich de la membrane entre deux couches PDMS (Figure 1E).
- Activer à la fois le canal de lavage stratifié collé PDMS-membrane PCTE et le moule 3D PDMS précédemment collé au plat Petri avec une chambre de plasma d'oxygène pendant 2 min. Mettez-les en contact et appuyez ensemble.
- Placer le plat Petri collé à la structure du sandwich dans un four à 45 oC pendant au moins 12 h pour renforcer le lien chimique.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Culture cellulaire
- Croissance d'une population de V. ordalii (souche 12B09 ou 12B09pGFP) pendant la nuit pendant 20 h en 2216 moyen19 sur un shaker orbital (600 tr/min) à 30 oC et les cellules de récolte en phase exponentielle tardive. Pour les isolats hébergeant le pGFP, ajouter la spectinomycine (50 g mL-1) pour maintenir le plasmide.
- Centrifuger un aliquot de 1 ml de cellules à 2500 x g pendant 3 min, retirer le supernatant et re-suspendre les cellules dans 1 ml d'eau de mer artificielle filtrée. Répétez cette étape.
- Affamer la population de V. ordalii sur un shaker orbital (600 tr/min) à 30 oC pendant 3 h.
- Préparer une solution d'eau de mer artificielle de 10 mM (ici, 1 ml) de 4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate (MNI-caged-L-glutamate) et stocker à -20 oC.
REMARQUE : Protégez la solution MNI-Caged- L-glutamate de la lumière ambiante pour empêcher la photolyse. - Diluer les cellules 50x en re-suspendant les cellules affamées dans une solution artificielled'eau de mer de 1 mM MM MNI-caged- L-glutamate.
REMARQUE: Cela assurera une concentration bactérienne finale inférieure à 5 x 107 mL-1 (la valeur exacte dépend de la concentration initiale des cellules en fin de exponentielle, qui est généralement de 109 ml-1). La concentration bactérienne a été estimée à l'aide d'un spectrophotomètre à densité optique (OD) de 600 nm.
4. Calibration du Protocole de déminage
- Placer une gouttelette (20 l) d'une solution artificielle d'eau de mer de L-glutamate20 à une concentration C0 à 10 mm sur une lame de verre. Encapsulez la gouttelette en la recouvrant d'une chambre circulaire PDMS (diamètre d '5 mm, hauteur h '250 'm).
- Placez la glissière de verre sur une scène de microscope et exposez la chambre entière pendant 20 ms à un faisceau LED à une longueur d'onde de 395 nm (puissance 295 mW) en utilisant un objectif 4x (ouverture numérique [NA] - 0,13).
- Ouvrez la chambre PDMS et extrayez une gouttelette (1 l) pour analyse à l'arme UV-Vis.
- Répéter les étapes 4.1-4.3 pour différentes durées de l'éclairage LED de 0.1 s, 0.5 s, 2.5 s, 25 s, 250 s (ou jusqu'à saturation de la réaction chimique) et 0 s (pour obtenir le fond). Reproduisez les étapes de la procédure 4.1-4.4 au moins 3x (ici, 4x).
- Du spectre d'absorption, extraire la valeur à 405 nm, qui représentent le pic dans le spectre d'absorption de la molécule de cage21. Pour déterminer le taux k de la réaction de déminage chimique par l'exposition LED14, utilisez l'équation cinétique de premier ordre suivante pour l'ajustement numérique des données expérimentales17
où C(t) est la valeur du spectre d'absorption de la solution à 405 nm (après suppression de fond) avec un temps de décamance de t secondes. Pour le petit temps de déminage t tel que kt 1, Eq. 1 peut être simplifié à la formulation linéaire
5. Expérience à impulsion chimique unique
- Maintenir le canal microfluidique sous vide pendant 20 minutes pour réduire la concentration de gaz dans le PDMS de sorte que les bulles sont moins susceptibles de se former pendant le processus de remplissage.
- Extraire le canal de la pompe à vide et immédiatement introduire la suspensionbactérienne diluée en 1 mM MNI-caged- L-glutamate dans l'eau de mer artificielle dans le microcanal doucement en utilisant une micropipette pour éviter les dommages flageller par les forces de cisaillement mécanique (ici, l'ensemble du processus de remplissage a pris 5-10 s). Après avoir rempli le canal avec la suspension bactérienne, sucer la solution en excès avec du papier essuie-tout, et sceller l'entrée et la sortie avec des bouchons PDMS en les pressant doucement dans les trous.
REMARQUE : De cette façon, l'écoulement de fluide dans la chambre est empêché. - Placez le microcanal sur une scène de microscope et déplacez la scène pour placer le champ de vision en milieu de canal. Configurer le microscope pour effectuer l'imagerie en contraste de phase (objectif 4x) à un taux d'image de 12 fps.
REMARQUE : Cette valeur peut être variée, mais ne doit pas être inférieure à 10 fps pour permettre la reconstruction des trajectoires bactériennes par l'analyse d'image (voir la section 7 du protocole). - Définir le trou d'épingle du faisceau LED à l'ouverture minimale. En réglant le temps d'exposition de la caméra à 5 s, enregistrez quelques images pour obtenir des mesures précises de l'emplacement spatial et de la taille du faisceau LED.
REMARQUE : La source lumineuse LED se connecte à l'illuminateur d'épifluorescence du microscope par l'intermédiaire de la connexion liquide de guide de lumière. Le faisceau LED n'affecte pas la capture vidéo, parce que l'acquisition de vidéos et la stimulation LED sont commandées indépendamment via un logiciel. - Effectuez l'imagerie continue pendant une durée totale de 10 min (20 min pour la plus grande impulsion chimique), et activez simultanément le faisceau LED focalisé à 395 nm pour la durée désirée (dans cette expérience, t -20 ms, 100 ms, 500 ms) à un point de temps défini par l'utilisateur (ici, 10 s après le début de l'acquisition vidéo) via un logiciel de microscope. Pour obtenir plusieurs répliques d'un même processus, déplacez l'étape pour enregistrer la réponse bactérienne sur différentes positions du canal microfluidique. Reproduisez cette procédure pour chaque taille d'impulsion, à l'aide d'un nouveau microcanal.
REMARQUE : Le processus de déminage génère une impulsion cylindrique axisymmétrique qui se diffuse radialement vers l'extérieur dans le plan d'imagerie. - Mener des expériences distinctes sans décamance chimique à un grossissement plus élevé (objectif 20x, NA 0,45) à un taux de trame plus élevé (50 fps) pour enregistrer le mouvement de nage impartial de la bactérie.
6. Expérience de l'impulsion chimique multiple
- Maintenir la chambre millifluidique sous vide pendant 20 min.
- Placez le plat Petri contenant la chambre millifluidique sur un stade de microscope. Remplissez la chambre sous la membrane avec la suspension bactérienne diluée (ici, l'ensemble du processus de remplissage a pris 10-15 s) de GFP-fluorescent V. ordalii dans 1 mM MNI-caged- L-glutamate solution dans l'eau de mer artificielle. Après avoir rempli le canal avec la suspension bactérienne, sucer la solution en excès avec du papier essuie-tout, et sceller l'entrée et la sortie avec des bouchons PDMS en les pressant doucement dans les trous.
REMARQUE : De cette façon, l'écoulement de fluide dans la chambre est empêché. Pour permettre une meilleure visualisation des bactéries dans cette configuration où l'imagerie se produit à travers la membrane nanopouse, il est fortement recommandé d'utiliser des souches fluorescentes au lieu du type sauvage (comme utilisé dans l'expérience à impulsion chimique unique). - Remplissez une seringue d'une solution artificielle d'eaude mer de 1 mM m MM m MM MM-L-glutamate et attachez le tube à l'inlet et à la sortie du canal de lavage au-dessus de la membrane.
- Connectez le tube à un réservoir de déchets et assurez-vous que le tuyau est entièrement immergé dans le réservoir de déchets liquides pour éviter les oscillations de pression.
- Définir le débit approprié sur la pompe à seringues (ici, 50 min-1l ) pour obtenir le débit moyen souhaité dans le canal de lavage, qui dépend de la géométrie du canal.
- Démarrer la pompe à seringues pour établir le flux dans le canal de lavage au-dessus de la membrane.
- Exécutez le logiciel contrôlant le faisceau LED et l'étape de microscope pour générer des séquences définies par l'utilisateur des impulsions à différents endroits et avec différentes intensités.
REMARQUE : Le flux continu de la solution artificielle d'eaude mer de 1 mM MM MM MNI-Encage- L-glutamate dans le canal de lavage au-dessus de la membrane réapprovisionne la solution composée en cage et lave le milieu usé de l'arène bactérienne. - Enregistrez la vidéo à l'aide d'un objectif 4x à intervalles réguliers sur une période de plusieurs heures et sur plusieurs endroits contigus pour couvrir une grande surface (ici, 1 cm x 1 cm, Figure 1F).
7. Analyse d'image et analyse de données
- Reconstruction des trajectoires bactériennes
- À partir des films enregistrés avec l'objectif 4x, reconstruire les trajectoires bactériennes à l'aide d'un logiciel de suivi17.
REMARQUE : Ces trajectoires représentent les projections 2D du mouvement bactérien 3D dans le microcanal. - À partir des trajectoires bactériennes reconstruites, déterminez la vitesse de dérive radiale de chaque individu nageant en projetant sa vitesse de nage sur la direction vers le centre de l'impulsion chimique (Figure 2D). Pour la visualisation de la dynamique spatio-temporelle de la vitesse de dérive radiale, utilisez une grille de binning de taille spatiale de 75 m x 75 m et fenêtre temporelle d'intervalle de 5 à 10 s (Figure 2D,E).
REMARQUE : En raison de la symétrie cylindrique du processus, les données peuvent être analysées en coordonnées polaires et moyennes sur la dimension angulaire (figure 3). - À partir des trajectoires bactériennes reconstruites, déterminez la dynamique spatio-temporelle de la distribution des bactéries lorsqu'elles réagissent aux impulsions chimiques (Figure 2E).
- À partir des films à haute résolution enregistrés avec l'objectif 20x au cours des expériences à impulsion unique, extraire la distribution de la vitesse de nage et le temps de course pour la population bactérienne comme ils répondent à l'impulsion chimique (Figure 4).
- À partir des films enregistrés avec l'objectif 4x, reconstruire les trajectoires bactériennes à l'aide d'un logiciel de suivi17.
- Estimer le coefficient de diffusion des bactéries en tenant compte de la dynamique de dissipation de la population bactérienne après la chimiotaxie est terminée17 (ici, pour t 'gt; 300 s; Figure 3).
- Estimer le coefficient de diffusion du glutamate en appliquant l'équation Stokes-Einstein
où les molécules d'acides aminés sont supposées être des particules sphériques avec un rayon hydrodynamique22rG, kB est la constante De Boltzmann (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T est la température (296 K), et est la viscosité dynamique de l'eau de mer artificielle (salinité 36 g kg-1) à 23 c C (10-3 Pa)
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Representative Results
Nous avons utilisé les dispositifs microfluidiques et millifluidiques (Figure 1) pour étudier les profils d'accumulation bactérienne dans des conditions nutritives dynamiques. Les trajectoires bactériennes ont été extraites de vidéos enregistrées acquises par microscopie de contraste de phase de la dynamique accumulation-dissipation d'une population bactérienne à la suite d'une impulsion chimique libérée par photolyse(figure 2 et figure 3). En moyenne des millions de trajectoires, la dynamique spatiotemporale de la vitesse de dérive radiale et de la concentration bactérienne a été obtenue. Des statistiques décrivant la baignade en l'absence d'un gradient chimique ont été obtenues dans le cadre d'expériences distinctes avec une résolution spatiale et temporelle plus élevée (figure 4).
Figure 1 : Dispositifs microfluidiques et millifluidiques pour des expériences bactériennes dans des conditions nutritives dynamiques. (A) Photomasque du canal microfluidique utilisé pour observer l'accumulation bactérienne à une seule impulsion chimique. (B) Photomasque du canal microfluidique utilisé pour laver la chambre bactérienne millifluidique pour les expériences multi impulsions. Les petits points sont des micropiliers (200 m) qui aident à lier la membrane au PDMS, tout en empêchant la membrane de s'effondrer ou de s'effondrer au centre. (C) Conception du maître imprimé 3D utilisé pour créer la chambre bactérienne. (D) La couche PDMS avec le modelage de la chambre bactérienne. (E) Le dispositif millifluidique complet (vue du haut, membrane PCTE en blanc). (F) Schéma du dispositif millifluidique pour la génération de conditions nutritives dynamiques (vue latérale). Le diagramme de rayon optique est montré sur le fond de l'appareil, où un faisceau violet (395 nm) effectue le découssage du chimioattractant, tandis qu'un faisceau bleu (indépendant) (470 nm) est employé pour l'observation des bactéries fluorescentes (harboring pGFP) par une caméra sCMOS, qui capture la densité bactérienne (centre inférieur). L'appareil est placé sur une scène motorisée (en bas à droite), qui peut être déplacée dans le plan x-y pour libérer des impulsions chimiques à des positions définies par l'utilisateur (contrôlée s'il y a un logiciel NIS, en bas à gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Réponses bactériennes représentatives à une impulsion chimique. (A,B) Projection d'intensité maximale montrant la position bactérienne (blanche) sur un intervalle de 0,5 s, montrée (A) immédiatement après, et (B) 40 s après la libération de l'impulsion (objectif : 4x, NA - 0,13, Ph 2; enregistrement vidéo à 12 fps). (C) Trajectoires bactériennes (noir) montrées 60 s après la libération de l'impulsion. La région ombragée représente l'impulsion chimique libérée par la photolyse à t ' 0 s au milieu du champ de vision (croix noire), qui se diffuse par la suite. Les trajectoires ont été reconstruites à l'aide d'un logiciel interne personnalisé. (D,E) Dynamique temporelle de la vitesse de dérive radiale (D) et de la concentration bactérienne (E) suite à une libération d'impulsion au centre du champ de vision. Dans le panneau D, les valeurs négatives de la vitesse de dérive (en couleur bleue) correspondent au mouvement chimiotaxique dirigé vers le centre de l'impulsion. Ce chiffre a été modifié après Brumley et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Profils spatio-temporels de la vitesse de dérive radiale et de la concentration bactérienne à la suite d'une libération d'impulsion chimique. (A,B) La vitesse de dérive radiale (A) et la concentration bactérienne (B) en fonction du temps et de la distance du centre d'une impulsion de glutamate de 35 M. Dans le panneau A, les valeurs négatives de la vitesse de dérive (en couleur bleue) correspondent au mouvement chimiotaxique dirigé vers le centre de l'impulsion. Les valeurs ont été calculées en faisant la moyenne sur toutes les trajectoires. La ligne pointillée noire à 250 s délimite grossièrement la période de chimiotaxis actifs (ombrage bleu dans le panneau A, région I), après quoi les cellules diffusent isotropically vers l'extérieur (ombrage vert dans le panneau A, région II). (C) Concentration bactérienne (redimensionné sur l'arrière-plan B0) en fonction de la distance à t 10, 30, 60 s après la création d'une impulsion chimique de diffusion. Les bactéries s'agrégent près du site du pouls en raison de la chimiotaxie. (D) La concentration bactérienne prend 20 min pour se détendre à l'arrière-plan B0 par diffusion bactérienne. L'enset montre l'ajustement de la diffusion diffuse avec un coefficient de diffusion de DB - 165 m2 s-1. Les panneaux A, C et D ont été modifiés à partir de Brumley et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Statistiques de natation pour une population bactérienne en l'absence de gradients chimiques. (A) Les trajectoires représentent les projections bidimensionnelles du mouvement bactérien tridimensionnel dans le microcanal. Les trajectoires bactériennes sont extraites à l'aide d'un script de suivi interne personnalisé. Ici, la croix bleue indique le début de la piste, et les symboles rouges et verts indiquent des événements de réorientation. Les données ont été enregistrées à 50 fps avec un objectif de 20x, NA 0,45. (B) Répartition probable de la vitesse de nage bactérienne mesurée (noir) ainsi qu'un ajustement de distribution gamma (bleu). Étant donné que la profondeur de mise au point lors de l'imagerie avec un objectif 20x (NA 0,45) n'est que de quelques microns24, les trajectoires enregistrées sont essentiellement planaires et les mesures de la vitesse de nage ne sont pas biaisées par la projection. (C) Répartition de probabilité du temps entre les réorientations successives. Ces données étaient nécessaires pour calibrer efficacement un modèle individuel qui tient compte du modèle de réorientation, de la répartition de la vitesse de baignade et des statistiques de réorientation des organismes. Ce chiffre a été modifié à partir de Brumley et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cette méthode permet aux chercheurs d'étudier les chimiotaxis bactériens sous des gradients dynamiques contrôlés dans des dispositifs micro et millifluidiques, permettant l'acquisition de données reproductibles. La création quasi instantanée d'impulsions chimiques à l'échelle micrométrique par photolyse vise à reproduire les types d'impulsions nutritives que les bactéries rencontrent à l'état sauvage à partir d'une gamme de sources, par exemple, la diffusion diffuse des panaches derrière les particules marines en s'enfoncement25, ou le nutriment se propageant à partir de cellules phytoplanctoniques lysées26.
Nous avons présenté deux applications de cette méthode : 1) la libération d'une seule impulsion chimique pour étudier la dynamique d'accumulation bactérienne-dissipation à partir de conditions uniformes, et 2) la libération de pouls multiples pour caractériser les profils d'accumulation bactérienne dans des conditions nutritives non-équilibre. La première application est particulièrement adaptée pour caractériser les réponses comportementales des microbes lors de la première rencontre d'une source nutritive. Dans de telles conditions, dans lesquelles la concentration des molécules chimioattractantes est extrêmement faible, la phase précoce de la chimiotaxie est dominée par les événements stochastiques liant-unbinding des molécules chimioattractant aux chimiorécepteurs17. Notre méthode, en libérant rapidement et précisément une masse connue de chimioattractant dans un fond zéro-nutriment, offre des avantages significatifs par rapport aux approches précédentes pour caractériser la réponse bactérienne dans des conditions dynamiques27,28,29. Les avantages comprennent la connaissance de la distribution complète de la chimioattractant à tous les endroits et en tout temps (puisque sa diffusion est connue), et d'éviter complètement la génération de flux de fluide qui est intrinsèquement associée à d'autres dispositifs, tels que le micro-injecteur27 ou trois-inlet géométries30.
Dans la deuxième application, les impulsions chimiques se produisent dans un grand domaine quasi-2D selon une séquence définie par l'utilisateur dans l'espace et le temps qui est entièrement personnalisable via un logiciel, qui peut être utilisé pour imposer des séquences aléatoires ou des modèles particuliers. Fait important, cette méthode fournit un lien puissant entre la dynamique comportementale à haute résolution de la chimiotaxie bactérienne et l'absorption des nutriments sur des échelles de temps de secondes et la dynamique à long terme, comme la croissance et potentiellement l'évolution. L'arène bactérienne est considérablement plus grande (2 cm x 2 cm) que la gamme spatiale d'interaction chimique des bactéries avec une seule impulsion (de centaines de micromètres pour les plus petites impulsions à quelques millimètres pour les plus grandes impulsions). La clé du maintien d'un faible fond chimique (beaucoup plus faible que la concentration des impulsions chimiques à leur libération) est l'inclusion de la membrane nanopouse PCTE prise en sandwich entre les deux couches PDMS18. En appliquant un flux de fluide dans le canal microfluidique placé en haut de l'appareil, un lavage continu des composés non encages et utilisé moyen dans l'arène bactérienne est réalisé au moyen de la diffusion moléculaire à travers la membrane nanoporeuse, sans créer de flux dans la section d'essai de l'appareil où les bactéries sont situées (Figure 1).
En modulant le faisceau LED focalisé dans le temps, l'amplitude, la taille et la géométrie, la technologie de photorelease confère à l'expérimentateur une grande flexibilité pour générer différents types d'environnements chimiques. Dans le même temps, alors que les tests présentés ici ont été effectués dans des conditions quiescentes, notre méthode peut être élargie pour tester les chimiotaxis bactériens sous différentes configurations de débit. En reconstituant fidèlement la dynamique de l'accumulation bactérienne par microscopie vidéo, notre méthode génère de grandes quantités de données de haute qualité qui peuvent être utilisées pour estimer les statistiques du comportement bactérien et l'absorption potentielle de nutriments par les cellules bactériennes. Notre approche microfluidique expérimentale, imitant les paysages nutritifs auxquels les bactéries pourraient être confrontées dans des conditions environnementales naturelles, permet l'étude systématique du comportement de recherche de nourriture des espèces microbiennes qui sont essentielles dans le cycle des nutriments à l'échelle macroscopique2,3. En tant que tel, le type de données générées par cette méthodologie est utile pour calibrer efficacement les taux d'absorption de la population et mieux tirer la cinétique des nutriments dans les modèles écosystémiques à l'échelle mésométrique.
La fabrication des moules PDMS pour faire la grande arène bactérienne a été effectuée à l'aide d'un service d'impression 3D commercial. Cependant, des résultats similaires peuvent être obtenus à l'aide d'une imprimante 3D haut de gamme en interne, avec une résolution de 50 à 100 m requis pour résoudre les plus petites caractéristiques des conceptions de microcanaux. Une surface lisse du matériau imprimé en 3D pour le moule PDMS est nécessaire pour obtenir un bon lien entre le PDMS moulé et les autres surfaces de l'appareil (c.-à-d. verre, polystyrène, PDMS). Pour notre application, l'utilisation d'un plat Petri en polystyrène (90 mm x 15 mm) comme surface inférieure de l'arène 3D présente deux avantages par rapport à l'utilisation d'une lame de verre comme couramment utilisé dans les études microfluidiques: premièrement, il réduit considérablement l'attachement des cellules bactériennes par rapport à une surface de verre (bien que l'attachement pourrait dépendre des propriétés de surface particulières du microbe à l'étude); deuxièmement, il fournit un confinement secondaire, qui peut empêcher les fuites de supports sur l'équipement de microscopie en cas de déversement. Le processus de durcissement des moules PDMS se produit généralement à une température élevée (70 à 80 oC), mais dans cette application, l'expérimentateur doit cuire le moule PDMS à une température considérablement plus basse (45 oC dans le cas actuel, voir Tableau des matériaux),en dessous de la déviation thermique et de la température de fusion du matériau utilisé pour l'impression 3D du maître. La température de cuisson plus basse allonge considérablement le processus de durcissement (du jour au lendemain), mais ne modifie pas les propriétés mécaniques et chimiques du SMD.
Bien que notre méthode ait été appliquée à une combinaison particulière de bactéries et de chimioattractants, la méthodologie convient pour tester divers processus biologiques, y compris l'absorption des nutriments ou l'exposition aux antibiotiques, et peut être appliquée à des systèmes modèles de différentes espèces et chimioattractants, étant donné qu'une myriade de molécules ont été (ou peuvent être) en cage8. Une limitation potentielle découle des coûts des composés en cage disponibles dans le commerce, mais ces coûts sont comparables à ceux encourus lors de l'utilisation des sondes moléculaires généralement utilisées dans les sciences de la vie pour la viabilité cellulaire, le comptage ou la coloration intracellulaire. Malgré cette limitation potentielle, la méthodologie proposée peut trouver de vastes applications dans les sciences biophysiques et biomédicales, afin de caractériser les réponses précoces et la dynamique d'adaptation des populations microbiennes à une résolution à cellule unique en gradients chimiques dynamiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l'installation de microfabrication FIRST de l'ETH Zurich. Ce travail a été soutenu par un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (à D.R.B.), un Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (à R.S.), et une subvention de la Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (à R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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