Summary
Ein Protokoll zur Erzeugung dynamischer chemischer Landschaften durch Photolyse in mikrofluidischen und millifluidischen Setups wird vorgestellt. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, einschließlich des Motilverhaltens, der Nährstoffaufnahme oder der Anpassung an Chemikalien von Mikroorganismen, sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene.
Abstract
Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung kontrollierter, dynamischer chemischer Impulse, bei denen lokalisiertes Chemoattractant plötzlich auf mikroscale verfügbar wird, um Mikroumgebungen für mikrobielle Chemotaxis-Experimente zu schaffen. Um chemische Impulse zu erzeugen, haben wir ein System entwickelt, um Aminosäurequellen nahezu augenblicklich durch Photolyse von Käfig-Aminosäuren in einer polydimethylsiloxanen (PDMS) Mikrofluidkammer einzuführen, die eine bakterielle Suspension enthält. Wir haben diese Methode auf das chemotaktische Bakterium Vibrio ordaliiangewendet, das diese dynamischen chemischen Gradienten aktiv erklimmen kann, während es durch Videomikroskopie verfolgt wird. Aminosäuren, die durch chemische Modifikation mit einer photoabnehmbaren Schutzgruppe biologisch inert ("käfig") gerendert werden, sind in der Suspension einheitlich vorhanden, können aber bis zu ihrer plötzlichen Freisetzung, die zu benutzerdefinierten Zeitpunkten in Zeit und Raum mit Hilfe eines nahezu UV-A fokussierten LED-Strahls erfolgt, nicht zum Verzehr stehen. Die Anzahl der im Puls freigesetzten Moleküle kann durch eine Kalibrierbeziehung zwischen Belichtungszeit und unkaging fraktion bestimmt werden, wobei das Absorptionsspektrum nach der Photolyse durch UV-Vis-Spektroskopie gekennzeichnet ist. Eine nanoporöse Polycarbonatmembran (PCTE) kann in das mikrofluidische Gerät integriert werden, um die kontinuierliche Entfernung der ungecaged Compounds und der verbrauchten Medien durch den Fluss zu ermöglichen. Eine starke, irreversible Verbindung zwischen der PCTE-Membran und der mikrofluidischen PdMS-Struktur wird durch Beschichtung der Membran mit einer Lösung aus 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) und anschließender Plasmaaktivierung der zu verklebenden Oberflächen erreicht. Ein computergesteuertes System kann benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Stellen und mit unterschiedlichen Intensitäten erzeugen, um Ressourcenlandschaften mit vorgeschriebener räumlicher und zeitlicher Variabilität zu schaffen. In jeder chemischen Landschaft kann die Dynamik der bakteriellen Bewegung auf der individuellen Skala und ihre Akkumulation auf Populationsebene erreicht werden, wodurch die Quantifizierung der chemotaktischen Leistung und ihrer Auswirkungen auf bakterielle Aggregationen in ökologisch relevanten Umgebungen ermöglicht wird.
Introduction
Mikroben verlassen sich auf Chemotaxis, den Prozess der Erkennung chemischer Gradienten und Modifizieren der Beweglichkeit in Reaktion1, um chemische Landschaften zu navigieren, Nährstoffquellen und Wirte zu nähern und schädlichen Substanzen zu entkommen. Diese mikroskalen Prozesse bestimmen die makroskalige Kinetik der Wechselwirkungen zwischen Mikroben und ihrer Umgebung2,3. Jüngste Fortschritte in der Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechnologien, einschließlich der weichen Lithographie4, haben unsere Fähigkeit revolutioniert, kontrollierte Mikroumgebungen zu schaffen, in denen die Wechselwirkungen von Mikroben untersucht werden können. Zum Beispiel haben frühere Experimente bakterielle Chemotaxis untersucht, indem hochkontrollierte, stabile Gradienten von mittleren bis hohen Nährstoffkonzentrationen5,6erzeugt wurden. In natürlichen Umgebungen können jedoch mikroskalige chemische Gradienten kurzlebig sein, die durch molekulare Diffusion abgeführt werden, und die Hintergrundbedingungen sind oft stark verdünnt7. Um die chemotaktische Reaktion von mikrobiellen Populationen, die zuerst in stabilen chemischen Umgebungen ausgesetzt waren, direkt zu messen, haben wir Methoden entwickelt und hier beschrieben, um mikrofluidische Technologie mit Photolyse zu kombinieren und dabei Gradienten nachzuahmen, denen wilde Bakterien in der Natur begegnen.
Die Unkaging-Technologie verwendet lichtempfindliche Sonden, die Biomoleküle funktionell in inaktiver Form verkapseln. Die Bestrahlung setzt das Käfigmolekül frei, wodurch die gezielte Störung eines biologischen Prozessesermöglicht wird 8. Aufgrund der schnellen und präzisen Kontrolle der zellulären Chemie, die die Unkaging bietet9, Photolyse von Käfigverbindungen wurde traditionell von Biologen, Physiologen und Neurowissenschaftlern verwendet, um die Aktivierung der Gene10, Ionenkanäle11, und Neuronen12zu studieren. In jüngerer Zeit haben Wissenschaftler die signifikanten Vorteile der Photolyse genutzt, um Chemotaxis13zu untersuchen, um die Flagella-Schaltdynamik einzelner Bakterienzellen zu bestimmen, die einem stufenweisen Chemolockantenreiz14,15, ausgesetzt sind, und um Motilitätsmuster einzelner Spermien in dreidimensionalen (3D) Gradienten16zu untersuchen.
In unserem Ansatz implementieren wir die Photolyse von Käfig-Aminosäuren in mikrofluidischen Geräten, um die Verhaltensreaktion einer bakterienpopulation auf kontrollierte chemische Impulse zu untersuchen, die durch Photorelease nahezu sofort verfügbar werden. Die Verwendung eines objektiven Objektivs mit geringer Vergrößerung (4x) (NA = 0,13, Schwerpunkttiefe ca. 40 m) ermöglicht sowohl die Beobachtung der aggregationiven Reaktion von Tausenden von Bakterien auf Populationsebene über ein großes Sichtfeld (3,2 mm x 3,2 mm) als auch die Messung der Bewegung auf Einzelzellebene. Wir stellen zwei Anwendungen dieser Methode vor: 1) die Freisetzung eines einzelnen chemischen Impulses zur Untersuchung der bakteriellen Akkumulations-Dissipationsdynamik ausgehend von einheitlichen Bedingungen und 2i) die Freisetzung mehrerer Impulse, um die bakterielle Akkumulationsdynamik unter zeitverändernden, räumlich heterogenen Chemopitantenbedingungen zu charakterisieren. Diese Methode wurde an den Meeresbakterien Vibrio ordalii getestet, die Chemotaxis in Richtung der Aminosäure Glutamat17durchführen, aber die Methode ist allgemein anwendbar auf verschiedene Kombinationen von Arten und Chemoattractants, sowie auf biologische Prozesse jenseits von Chemotaxis (z. B. Nährstoffaufnahme, Antibiotika-Exposition, Quorum-Erkennung). Dieser Ansatz verspricht dabei, die Ökologie und das Verhalten von Mikroorganismen in realistischen Umgebungen aufzuklären und die versteckten Kompromisse aufzudecken, denen einzelne Bakterien beim Navigieren in flüchtigen dynamischen Gradienten ausgesetzt sind.
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Protocol
1. Herstellung des Mikrofluidischen Geräts für das Einzel-Chemie-Puls-Experiment
- Entwerfen Sie den Kanal mithilfe der CAD-Software (Computer-Aided Design), und drucken Sie ihn auf einen Transparenzfilm, um die Fotomaske zu erstellen (Abbildung 1A).
- Fertigen Sie den Meister durch weiche Lithographie (unter Reinraumbedingungen).
- Einen Siliziumwafer (4 Zoll) in schneller Folge mit Aceton, Methanol und Isopropanol reinigen, dann mit Stickstoff trocknen. Den Wafer im Ofen bei 130 °C 5 min backen.
- Legen Sie den Wafer in die Mitte eines Spincoaters und gießen Sie SU-8 Photoresist auf den Wafer. Rampen Sie die Geschwindigkeit des Spincoaters bis zu 500 U/min über 5 s, und halten Sie bei 500 U/min für 10 s. Ramp bis zur Endgeschwindigkeit über 10 s und halten Sie bei dieser Geschwindigkeit für 30 s.
HINWEIS: Der genaue Wert der Endgeschwindigkeit hängt von der angestrebten Schichtdicke und der verwendeten SU-8 ab. - Nach dem Spin-Coating-Prozess den Wafer bei 65 °C und dann bei 95 °C backen. Lassen Sie den Wafer bei Raumtemperatur (RT) mindestens 5 min abkühlen.
HINWEIS: Die Backzeit hängt von der gezielten Dicke und Art des verwendeten Photowiderstands ab. In der Regel sollte der Wafer für jede Schicht von 100 m 5 min bei 65 °C und 45 min bei 95 °C gebacken werden. - Legen Sie die Fotomaske auf den Wafer, um sicherzustellen, dass nur der Bereich von Interesse ausgesetzt und polymerisiert wird. Setzen Sie UV-Licht für die im SU-8-Handbuch empfohlene Zeit aus.
HINWEIS: Hier wurde der Wafer mit einer Belichtungsenergie von 200 mJ cm-2 bei einer Wellenlänge von 350 nm für 150 s ausgesetzt. - Backen Sie den Wafer bei 65 °C und 95 °C für die im SU-8-Handbuch empfohlene Zeit.
HINWEIS: In der Regel sollte der Wafer für jede Schicht von 100 m 5 min bei 65 °C und 45 min bei 95 °C gebacken werden. - Tauchen Sie den Wafer in einen Becher ein, der mit Polymethylmethacrylat (PMMA) Entwickler gefüllt ist, um den Master zu erhalten. Schütteln Sie den Becher vorsichtig, um sicherzustellen, dass der nicht polymerisierte Photoresist ausgewaschen wird. Backen Sie den Master bei 200 °C, um die SU-8-Schicht weiter zu vernetzen.
- Bereiten Sie ein Polydimethylsiloxan (PDMS) Gemisch vor, indem Sie das Elastomer mit seinem Härtungsmittel (Materialtabelle) im Verhältnis 10:1 in einem Becher (hier 40 ml) kombinieren. Kräftig mischen, bis die Flüssigkeit homogen ist.
HINWEIS: Die PDMS-Mischung sieht undurchsichtig aus, da während des Mischvorgangs Blasen erzeugt werden.
VORSICHT: Um zu verhindern, dass die Haut mit potenziell gefährlichen Chemikalien oder biologischem Material in Berührung kommt, tragen Sie immer einen Labormantel und Einweg-Kunststoffhandschuhe während des gesamten Protokolls und befolgen Sie spezifische Sicherheitsprotokolle gemäß dem Material Sicherheitsdatenblatt (MSDS). - Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einer Vakuumkammer für 45 min bei RT. Um den Prozess zu beschleunigen, lassen Sie das Vakuum regelmäßig los, um die Blasen zu platzen, die sich an der Schnittstelle bilden.
HINWEIS: Der Entgasungsprozess muss innerhalb von 1 h durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die PDMS-Mischung mit der Aushärtung beginnt. - Mit einem Druckreiniger Staub von der Oberfläche des Masters entfernen, dann die entgaste PDMS-Mischung auf den Master gießen und im Ofen bei 80 °C für 2 h backen.
HINWEIS: Alternativ würde das Backen über Nacht (oder für mindestens 12 h) bei 60 °C das gleiche gehärtete PDMS erreichen. - Schneiden Sie das PDMS mit einer Klinge um die Mikrostrukturen (in einem Abstand von ca. 5 mm) und schälen Sie das PDMS dann vorsichtig vom Master.
- Stanzlöcher als Ein- und Auslass des Mikrokanals (hier ein Einlass und ein Auslass, siehe Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass nichts die untere Seite des PDMS berührt, in dem sich die Features befinden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Der Mikrokanal sollte mit Klebeband versiegelt werden, um die Ansammlung von Staub und anderen Partikeln während der Lagerung zu verhindern. - Kleben Sie den PDMS-Mikrokanal an einen Glasschlitten.
- Reinigen Sie eine Glasrutsche gründlich mit Seife, Isopropanol und entionisiertem Wasser. Lassen Sie das Glas gleiten trocken oder verwenden Sie Druckluft, um den Prozess zu beschleunigen.
- Entfernen Sie Staubpartikel, indem Sie mit Klebeband dabben. Verkleben Sie den PDMS-Mikrokanal unmittelbar nach der Behandlung beider Oberflächen mit Plasma (entweder mit einem Corona-System oder einer Plasma-Sauerstoffkammer) für 2 min.
- Legen Sie das mikrofluidische Gerät auf eine Kochplatte bei 80 °C für mindestens 1 h zu erhitzen, um die chemische Bindung mit dem Glas zu stärken.
2. Herstellung des 3D-gedruckten Millifluidischen Geräts für das Experiment mit mehreren Impulsen
- Entwerfen Sie die 3D-Form mit 3D-Design-Software und drucken Sie den Master für die PDMS-Form mit einem hochauflösenden 3D-Drucker(Abbildung 1B).
HINWEIS: Siehe Materialtabelle für den 3D-Drucker und das Formmaterial, das zum Erstellen des Masters verwendet wird. - Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.4, und reinigen Sie dann die Oberfläche des Masters, indem Sie mit Klebeband dabben. Setzen Sie den Master auf eine Skala, dann, unter Vermeidung der zentralen Bereich des Masters, die von der Membran besetzt wird, gießen Sie auf die genaue Menge der ungehärteten PDMS-Mischung (hier, 23,4 g), um die gewünschte Höhe von PDMS zu erhalten, indem Sie die Höhe des Masters (hier, 0,5 mm). Entfernen Sie alle verbleibenden Blasen mit Hilfe von Druckluft.
- Den PDMS auf den Master in einen Ofen bei 45 °C geben, um mindestens 12 h zu backen.
- Die 3D-PDMS-Form an eine Petrischale kleben.
- Die gehärtete PDMS-Schicht und die Lochein- und Auslasslöcher für die Injektion der bakteriellen Suspension vorsichtig abziehen (Abbildung 1C).
- Aktivieren Sie sowohl die Oberfläche einer Petrischale (90 mm x 15 mm) als auch die PDMS-Form mit Sauerstoffplasma für 2 min. Verkleben Sie die PDMS-Form auf der Petrischale. Drücken Sie vorsichtig die Form auf die Petrischale, aber drücken Sie nicht, wo sich die Merkmale befinden, da dies die Verhörkammer zusammenbrechen kann.
- Die Mitdersächse an die PDMS 3D-Form geklebte Form bei 45 °C mindestens 12 h in einen Ofen geben, um die chemische Bindung zu stärken.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
- Membranoberflächenfunktionalisierung18
- Aktivieren Sie die nanoporöse Polycarbonatmembran (PCTE) in einer Sauerstoffplasmakammer für 1 min bei RT.
VORSICHT: Vermeiden Sie die Verwendung eines Coronasystems für die Plasmaaktivierung, da es die Membran beschädigt. - Unter einer chemischen Haube eine kommerzielle Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in entionisiertem Wasser auf 1 Volumen%(hier, 40 ml) verdünnen, indem Sie ein Polypropylenrohr verwenden.
VORSICHT: Die APTES-Lösung ist akut toxisch (MSDS Health Hazard Score 3) und sollte ausschließlich unter einer chemischen Haube mit Handschuhen mit äußerster Sorgfalt behandelt werden. Handschuhe sofort nach der Handhabung der APTES-Lösung wechseln. APTES Dämpfe sind zerstörerisch für die Schleimhäute und die oberen Atemwege. Die Zielorgane von APTES sind Nerven, Leber und Niere. Wenn keine Dunstabzugshaube verfügbar ist, müssen ein Gesichtsschutz und ein Vollschutzgerät implementiert werden. - Übertragen Sie die verdünnte APTES-Lösung in eine Petrischale und tauchen Sie die aktivierte Membran 20 min in die APTES-Lösung ein.
- Entfernen Sie die Membran aus der APTES-Lösung mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Trocknen auf ein Reinraumtuch.
- Aktivieren Sie die nanoporöse Polycarbonatmembran (PCTE) in einer Sauerstoffplasmakammer für 1 min bei RT.
- Für die Herstellung der mikrofluidischen PDMS-Kanäle, die auf der Membran liegen und das Waschen der Bakterienarena ermöglichen, wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.7.
- Die PDMS-Waschkanäle an die funktionalisierte Membran kleben.
- Aktivieren Sie sowohl den PDMS-Waschkanal als auch die PCTE-Membran mit einer Sauerstoffplasmakammer für 2 min.
HINWEIS: Die Membran, die zwischen zwei PDMS-Schichten eingeklemmt wird, sollte kleiner sein als der PDMS-Waschkanal. - Bringen Sie unmittelbar nach der Plasmabehandlung die funktionalisierte Membran und den PDMS-Waschkanal in Kontakt, indem Sie den PDMS-Waschkanal vorsichtig auf die Membran drücken.
HINWEIS: Wenden Sie in diesem Stadium keinen übermäßigen Druck an, da dies zu einer (irreversiblen) Befestigung der Membran am Dach des Kanals führen und den Kanal blockieren könnte.
- Aktivieren Sie sowohl den PDMS-Waschkanal als auch die PCTE-Membran mit einer Sauerstoffplasmakammer für 2 min.
- Sandwich die Membran zwischen zwei PDMS-Schichten (Abbildung 1E).
- Aktivieren Sie sowohl die gebundene Laminat-PDMS-Waschkanal-PCTE-Membran als auch die zuvor mit der Petrischale mit einer Sauerstoffplasmakammer für 2 min verklebte 3D-PDMS-Form. Bringen Sie sie in Kontakt und drücken Sie sie zusammen.
- Die Petrischale an die Sandwichstruktur in einem Ofen bei 45 °C für mindestens 12 h verklebt, um die chemische Bindung zu stärken.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Zellkultur
- Wachsen Sie eine Population von V. ordalii (Stamm 12B09 oder 12B09pGFP) über Nacht für 20 h in 2216 Medium19 auf einem Orbitalshaker (600 Rpm) bei 30 °C und Erntezellen in der spätexponentiellen Phase. Für Isolate, die pGFP beherbergen, fügen Sie Spectinomycin (50 g mL-1) hinzu, um das Plasmid zu erhalten.
- Zentrifugieren Sie eine 1 ml Aliquot von Zellen bei 2500 x g für 3 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml gefiltertem künstlichem Meerwasser wieder auf. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Verhungern Sie die Population von V. ordalii auf einem Orbital-Shaker (600 Rpm) bei 30 °C für 3 h.
- Bereiten Sie eine künstliche Meerwasserlösung von 10 mM (hier, 1 ml) 4-Methoxy-7-Nitroindolinyl-Käfig- L-Glutamat (MNI-kaltert-L-Glutamat)vor und lagern Sie bei -20 °C.
HINWEIS: Schützen Sie die MNI-Käfig-L-Glutamat-Lösung vor Umgebungslicht, um eine Photolyse zu verhindern. - Verdünnen Sie die Zellen 50x, indem Sie die ausgehungerten Zellen in einerkünstlichen Meerwasserlösung von 1 mM MNI-Käfig-L-Glutamat wieder aufhängen.
HINWEIS: Dadurch wird eine endgültige Bakterienkonzentration unter 5 x 107 ml-1 sichergestellt (der genaue Wert hängt von der Anfangskonzentration der Zellen im späten Exponential ab, die typischerweise 109 ml-1beträgt). Die bakterielle Konzentration wurde mit einem Spektralphotometer bei einer optischen Dichte (OD) von 600 nm geschätzt.
4. Kalibrierung des Unkaging-Protokolls
- Legen Sie ein Tröpfchen (20 l) einer künstlichen Meerwasserlösung von MNI-Käfig-L-Glutamat20 bei einer Konzentration C0 = 10 mM auf eine Glasrutsche. Verkapseln Sie den Tröpfchen, indem Sie ihn mit einer kreisförmigen PDMS-Kammer bedecken (Durchmesser d = 5 mm, Höhe h = 250 m).
- Stellen Sie den Glasschlitten auf eine Mikroskopstufe und setzen Sie die gesamte Kammer für 20 ms einem LED-Strahl bei einer Wellenlänge von 395 nm (Leistung 295 mW) mit einem 4x Objektiv (numerische Blende [NA] = 0,13) aus.
- Öffnen Sie die PDMS-Kammer und extrahieren Sie ein Tröpfchen (1 L) zur Analyse mit einem UV-Vis Spektralphotometer.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1 x 4.3 für verschiedene Daueren der LED-Beleuchtung von 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (oder bis zur Sättigung der chemischen Reaktion) und 0 s (um den Hintergrund zu erhalten). Replizieren Sie die Prozedurschritte 4.1 x 4.4 mindestens 3x (hier 4x).
- Aus dem Absorptionsspektrum extrahieren Sie den Wert bei 405 nm, der den Peak im Absorptionsspektrum des Käfigmoleküls21darstellt. Um die Rate k der chemischen Unkaging-Reaktion durch die LED-Exposition14zu bestimmen, verwenden Sie die folgende Kinetikgleichung erster Ordnung für die numerische Anpassung der experimentellen Daten17
wobei C(t) der Wert des Absorptionsspektrums der Lösung bei 405 nm (nach Hintergrundentfernung) mit einer unkapaten Zeit von t Sekunden ist. Für kleine Unkaging-Zeit t so, dass kt 1, Eq. 1 kann auf die lineare Formulierung vereinfacht werden
5. Single Chemical-Pulse Experiment
- Halten Sie den mikrofluidischen Kanal 20 min unter Vakuum, um die Gaskonzentration innerhalb des PDMS zu reduzieren, so dass sich Blasen während des Füllprozesses weniger wahrscheinlich bilden.
- Extrahieren Sie den Kanal aus der Vakuumpumpe und führen Sie sofort dieverdünnte bakterielle Suspension in 1 mM MNI-Käfig-L-Glutamat in künstlichem Meerwasser in den Mikrokanal sanft mit einer Mikropipette ein, um Flagellarschäden durch mechanische Scherkräfte zu vermeiden (hier dauerte der gesamte Füllvorgang 5-10 s). Nachdem Sie den Kanal mit der bakteriellen Suspension gefüllt haben, saugen Sie die Lösung im Übermaß mit Papiertuch und versiegeln Ein- und Auslass mit PDMS-Steckern, indem Sie sie vorsichtig in die Löcher drücken.
HINWEIS: Auf diese Weise wird der Flüssigkeitsfluss in der Kammer verhindert. - Legen Sie den Mikrokanal auf eine Mikroskopstufe und bewegen Sie die Bühne, um das Sichtfeld in der Mitte des Kanals zu setzen. Richten Sie das Mikroskop ein, um die Bildgebung im Phasenkontrast (4x Objektiv) mit einer Bildrate von 12 fps durchzuführen.
HINWEIS: Dieser Wert kann variiert werden, sollte aber nicht weniger als 10 fps betragen, um die Rekonstruktion der bakteriellen Bahnen durch Bildanalyse zu ermöglichen (siehe Protokollabschnitt 7). - Stellen Sie das Loch des LED-Strahls auf die minimale Blende ein. Durch Festlegen der Belichtungszeit der Kamera auf 5 s können Sie einige Frames aufzeichnen, um präzise Messungen der räumlichen Position und Größe des LED-Strahls zu erhalten.
HINWEIS: Die LED-Lichtquelle wird über eine Flüssigkeitslichtführungsverbindung mit dem Epifluoreszenz-Beleuchtungsgerät des Mikroskops verbunden. Der LED-Strahl hat keinen Einfluss auf die Videoaufnahme, da Videoaufnahme und LED-Stimulation unabhängig über Software geleitet werden. - Führen Sie eine kontinuierliche Bildgebung für eine Gesamtdauer von 10 min (20 min für den größten chemischen Impuls) durch und aktivieren Sie gleichzeitig den fokussierten LED-Strahl bei 395 nm für die gewünschte Dauer (in diesem Experiment t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) zu einem benutzerdefinierten Zeitpunkt (hier 10 s nach Beginn der Videoaufnahme) über Mikroskopsoftware. Um mehrere Replikationen desselben Prozesses zu erhalten, bewegen Sie die Bühne, um die bakterielle Reaktion über verschiedene Positionen des mikrofluidischen Kanals aufzuzeichnen. Replizieren Sie dieses Verfahren für jede Pulsgröße mit einem neuen Mikrokanal.
HINWEIS: Der Uncaging-Prozess erzeugt einen axisymmetrischen zylindrischen Impuls, der in der Bildebene radial nach außen diffundiert. - Führen Sie separate Experimente ohne chemische Unkaging bei höherer Vergrößerung (20x Objektiv, NA = 0,45) mit einer höheren Bildrate (50 fps) durch, um die unvoreingenommene Schwimmbewegung der Bakterien aufzuzeichnen.
6. Mehrere chemisch-pulsige Experimente
- Bewahren Sie die Millifluidische Kammer 20 min unter Vakuum auf.
- Legen Sie die Petrischale mit der Millifluidischen Kammer auf eine Mikroskopstufe. Füllen Sie die Kammer unterhalb der Membran mit der verdünnten bakteriellen Suspension (hier dauerte der gesamte Füllvorgang 10-15 s) gfP-fluoreszierender V. ordalii in 1 mM MNI-Käfig- L-Glutamatlösung in künstlichem Meerwasser. Nachdem Sie den Kanal mit der bakteriellen Suspension gefüllt haben, saugen Sie die Lösung im Übermaß mit Papiertuch und versiegeln Ein- und Auslass mit PDMS-Steckern, indem Sie sie vorsichtig in die Löcher drücken.
HINWEIS: Auf diese Weise wird der Flüssigkeitsfluss in der Kammer verhindert. Um eine bessere Visualisierung von Bakterien in diesem Setup zu ermöglichen, in dem die Bildgebung durch die nanoporöse Membran erfolgt, wird dringend empfohlen, fluoreszierende Stämme anstelle des Wildentyps zu verwenden (wie im Einzel-Chemie-Puls-Experiment verwendet). - Füllen Sie eine Spritze mit einer künstlichen Meerwasserlösungvon 1 mM MNI-Käfig-L-Glutamat und befestigen Sie Schläuche am Ein- und Auslass des Waschkanals über der Membran.
- Schließen Sie die Schläuche an ein Abfallreservoir an und stellen Sie sicher, dass die Schläuche vollständig in das Flüssigkeitsabfallreservoir eingetaucht sind, um Druckschwankungen zu vermeiden.
- Stellen Sie die entsprechende Durchflussrate auf der Spritzenpumpe ein (hier 50 l min-1), um die gewünschte mittlere Durchflussrate im Waschkanal zu erhalten, die von der Kanalgeometrie abhängt.
- Starten Sie die Spritzenpumpe, um den Durchfluss im Waschkanal über der Membran zu ermitteln.
- Führen Sie die Software aus, die den LED-Strahl und die Mikroskopstufe steuert, um benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Orten und mit unterschiedlichen Intensitäten zu erzeugen.
HINWEIS: Der kontinuierliche Fluss der künstlichen Meerwasserlösung von 1mM MNI-Käfig-L-Glutamat im Waschkanal über der Membran füllt die Käfig-Verbindungslösung auf und wäscht das verbrauchte Medium aus der Bakterienarena. - Nehmen Sie Videos mit einem 4x Objektiv in regelmäßigen Zeitintervallen über einen Zeitraum von mehreren Stunden und über mehrere zusammenhängende Stellen auf, um eine große Oberfläche zu bedecken (hier 1 cm x 1 cm, Abbildung 1F).
7. Bildanalyse und Datenanalyse
- Rekonstruktion der bakteriellen Bahnen
- Aus den Filmen mit dem 4x Objektiv aufgenommen, rekonstruieren Sie die bakteriellen Bahnen mit Tracking-Software17.
HINWEIS: Diese Bahnen stellen die 2D-Projektionen der 3D-Bakterienbewegung im Mikrokanal dar. - Aus den rekonstruierten bakteriellen Flugbahnen wird die radiale Driftgeschwindigkeit jedes Schwimmenden bestimmt, indem man seine Schwimmgeschwindigkeit über die Richtung in Richtung des Zentrums des chemischen Impulses projiziert (Abbildung 2D). Für die Visualisierung der räumlich-zeitlichen Dynamik der radialen Driftgeschwindigkeit verwenden Sie ein Binning-Raster mit der räumlichen Größe 75 x 75 m und einem zeitlichen Fenster mit einem Intervall von 5 x 10 s(Abbildung 2D,E).
HINWEIS: Aufgrund der zylindrischen Symmetrie des Prozesses können die Daten in Polarkoordinaten analysiert und über die Winkelbemaßung gemittelt werden (Abbildung 3). - Aus den rekonstruierten bakteriellen Bahnen, bestimmen Sie die räumlich-zeitliche Dynamik der Verteilung von Bakterien, wie sie auf die chemischen Impulse reagieren (Abbildung 2E).
- Aus den höher auflösenden Filmen, die mit dem 20-fachen Ziel während der Einpulsexperimente aufgenommen wurden, extrahieren Sie die Verteilung der Schwimmgeschwindigkeit und der Laufzeit für die Bakterienpopulation, wenn sie auf den chemischen Puls reagieren (Abbildung 4).
- Aus den Filmen mit dem 4x Objektiv aufgenommen, rekonstruieren Sie die bakteriellen Bahnen mit Tracking-Software17.
- Schätzen Sie den Diffusionskoeffizienten von Bakterien unter Berücksichtigung der Ableitungsdynamik der Bakterienpopulation, nachdem Chemotaxis abgeschlossen ist17 (hier für t > 300 s; Abbildung 3).
- Schätzen Sie den Diffusionskoeffizienten von Glutamat, indem Sie die Stokes-Einstein-Gleichung anwenden
wobei davon ausgegangen wird, dass es sich bei den Aminosäuremolekülen um kugelförmige Partikel mit hydrodynamischem Radius22rGhandelt, kB die Boltzmann-Konstante (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T ist die Temperatur (296 K) und die dynamische Viskosität des künstlichen Meerwassers (Salzgehalt 36 g kg-1) bei 23 °C (10-3 Pa s)23
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Representative Results
Wir verwendeten die mikrofluidischen und millifluidischen Geräte (Abbildung 1), um bakterielle Akkumulationsprofile unter dynamischen Nährstoffbedingungen zu untersuchen. Bakterielle Flugbahnen wurden aus aufgezeichneten Videos extrahiert, die durch Phasenkontrastmikroskopie der Akkumulations-Ableitungsdynamik einer bakterienpopulation nach einem durch Photolyse freigesetzten chemischen Impuls aufgenommen wurden (Abbildung 2 und Abbildung 3). Durch die durchschnittliche Durchschnittliche Millionen von Flugbahnen wurde die raumzeitliche Dynamik der radialen Driftgeschwindigkeit und der bakteriellen Konzentration erreicht. Statistiken, die das Schwimmen in Ermangelung eines chemischen Gradienten beschreiben, wurden in separaten Experimenten mit höherer räumlicher und zeitlicher Auflösung ermittelt (Abbildung 4).
Abbildung 1: Mikrofluidische und millifluidische Geräte für bakterielle Experimente unter dynamischen Nährstoffbedingungen. (A) Fotomaske des mikrofluidischen Kanals, der zur Beobachtung der bakteriellen Ansammlung zu einem einzelnen chemischen Puls verwendet wird. (B) Fotomaske des mikrofluidischen Kanals, mit dem die millifluidische Bakterienkammer für die Multipulsexperimente gewaschen wird. Die kleinen Punkte sind Mikrosäulen (200 m groß), die die Bindung der Membran an das PDMS unterstützen und gleichzeitig dazu beitragen, dass die Membran in der Mitte knickt oder zusammenbricht. (C) Design des 3D-gedruckten Masters zur Herstellung der Bakterienkammer. (D) Die PDMS-Schicht mit der Musterung der Bakterienkammer. (E) Das komplette millifluidische Gerät (obere Ansicht, PCTE-Membran in weiß). (F) Schemat des millifluidischen Geräts zur Erzeugung dynamischer Nährstoffbedingungen (Seitenansicht). Das Optics-Strahldiagramm wird auf der Unterseite des Geräts dargestellt, wo ein violetter Strahl (395 nm) die Unkaging des Chemoattraktions durchführt, während ein (unabhängiger) Blaustrahl (470 nm) für die Beobachtung von fluoreszierenden Bakterien (mit pGFP) durch eine sCMOS-Kamera verwendet wird, die die bakterielle Dichte (unteres Zentrum) erfasst. Das Gerät wird auf einer motorisierten Bühne (unten rechts) platziert, die in der x-y-Ebene bewegt werden kann, um chemische Impulse an benutzerdefinierten Positionen freizusetzen (gesteuert über NIS-Software, unten links). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative bakterielle Reaktionen auf einen chemischen Puls. (A,B) Maximale Intensitätsprojektion mit bakterieller Position (weiß) über ein 0,5 s Intervall, gezeigt (A) unmittelbar danach und (B) 40 s nach der Pulsfreisetzung (Objektiv: 4x, NA = 0,13, Ph 2; Videoaufnahme bei 12 fps). (C) Bakterielle Flugbahnen (schwarz) zeigten 60 s nach der Pulsfreisetzung. Der schattierte Bereich stellt den chemischen Impuls dar, der durch Photolyse bei t = 0 s in der Mitte des Sichtfeldes (schwarzes Kreuz) freigesetzt wird, der anschließend diffundiert. Trajektorien wurden mit individueller Eigensoftware rekonstruiert. (D,E) Zeitliche Dynamik der radialen Driftgeschwindigkeit (D) und der Bakterienkonzentration (E) nach einer Pulsfreisetzung in der Mitte des Sichtfeldes. In Panel D entsprechen negative Werte der Driftgeschwindigkeit (in blauer Farbe) der gerichteten chemotaktischen Bewegung in Richtung des Zentrums des Pulses. Diese Zahl wurde nach Brumley et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Räumlich-zeitliche Profile der radialen Driftgeschwindigkeit und der bakteriellen Konzentration nach einer chemischen Pulsfreisetzung. (A,B) Die radiale Driftgeschwindigkeit (A) und die bakterielle Konzentration (B) als Funktion von Zeit und Entfernung vom Zentrum eines 35-M-Glutamatimpulses. In Panel A entsprechen negative Werte der Driftgeschwindigkeit (in blauer Farbe) der gerichteten chemotaktischen Bewegung in Richtung des Zentrums des Pulses. Die Werte wurden durch Mittelung über alle Flugbahnen berechnet. Die schwarze gestrichelte Linie bei t = 250 s begrenzt grob den Zeitraum der aktiven Chemotaxis (blaue Schattierung in Panel A, Bereich I), nach dem die Zellen isotrop nach außen diffundieren (grüne Schattierung in Panel A, Region II). (C) Bakterielle Konzentration (über den Hintergrund B0neu skaliert) als Funktion des Abstands bei t = 10, 30, 60 s nach der Schaffung eines diffundierenden chemischen Impulses. Bakterien aggregieren in der Nähe der Stelle des Pulses durch Chemotaxis. (D) Die bakterielle Konzentration dauert ca. 20 min, um sich durch bakterielle Diffusion im Hintergrund B0 zu entspannen. Der Einset zeigt die Passform der diffusiven Streuung mit einem Diffusionskoeffizienten von DB = 165 m2 s-1. Die Panels A, C und D wurden von Brumley et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schwimmstatistiken für eine Bakterienpopulation ohne chemische Gradienten. (A) Trajektorien stellen die zweidimensionalen Projektionen der dreidimensionalen bakteriellen Bewegung im Mikrokanal dar. Bakterielle Flugbahnen werden mithilfe eines benutzerdefinierten internen Tracking-Skripts extrahiert. Hier zeigt das blaue Kreuz den Anfang der Spur an, und rote und grüne Symbole zeigen Neuorientierungsereignisse an. Die Daten wurden mit 50 fps mit einem 20-fachen Objektiv, NA 0,45, aufgezeichnet. (B) Wahrscheinlichkeitsverteilung der gemessenen bakteriellen Schwimmgeschwindigkeit (schwarz) zusammen mit einer Gammaverteilung (blau). Da die Schärfentiefe bei der Bildgebung mit einem 20-fachen Objektiv (NA 0,45) nur wenige Mikrometer24 beträgt,sind die aufgezeichneten Flugbahnen im Wesentlichen planar und Messungen der Schwimmgeschwindigkeit werden durch die Projektion nicht verzerrt. (C) Wahrscheinlichkeitsverteilung der Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Neuorientierungen. Diese Daten waren erforderlich, um ein individuelles Modell effektiv zu kalibrieren, das das Neuorientierungsmuster, die Verteilung der Schwimmgeschwindigkeit und die Neuorientierungsstatistiken der Organismen berücksichtigt. Diese Zahl wurde von Brumley et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Chemotaxis unter kontrollierten, dynamischen Gradienten in mikro- und millifluidischen Geräten zu untersuchen und so eine reproduzierbare Datenerfassung zu ermöglichen. Die nahezu sofortige Erzeugung chemischer Impulse im Mikromaßstab durch Photolyse zielt darauf ab, die Arten von Nährstoffpulsen, denen Bakterien in freier Wildbahn begegnen, aus einer Reihe von Quellen zu reproduzieren, zum Beispiel die diffusive Ausbreitung von Pflaumen hinter sinkenden Meerespartikeln25, oder die Nährstoffausbreitung aus lysierten Phytoplanktonzellen26.
Wir stellten zwei Anwendungen dieser Methode vor: 1) die Freisetzung eines einzelnen chemischen Impulses zur Untersuchung der bakteriellen Akkumulations-Ableitungsdynamik ausgehend von einheitlichen Bedingungen und 2) die Freisetzung mehrerer Impulse, um die bakteriellen Akkumulationsprofile unter nicht-gleichgewichtigen Nährstoffbedingungen zu charakterisieren. Die erste Anwendung eignet sich besonders, um die Verhaltensreaktionen von Mikroben zu charakterisieren, wenn sie zum ersten Mal auf eine Nährstoffquelle stoßen. Unter solchen Bedingungen, in denen die Konzentration von Chemolockantenmolekülen extrem gering ist, wird die frühe Phase der Chemotaxis von den stochastischen Bindungs-unverbindlichen Ereignissen von Chemoattractantmolekülen an die Chemorezeptoren17dominiert. Unsere Methode, durch die schnelle und präzise Freisetzung einer bekannten Masse von Chemoattractant in einem Null-Nährstoff-Hintergrund, bietet signifikante Vorteile gegenüber früheren Ansätzen, um die bakterielle Reaktion unter dynamischen Bedingungen zu charakterisieren27,28,29. Zu den Vorteilen gehört es, die vollständige Verteilung von Chemoattraktionanten an allen Standorten und zu allen Zeiten zu kennen (da seine Diffusivität bekannt ist) und die vollständige Vermeidung der Erzeugung von Flüssigkeitsfluss, die inhärent mit anderen Geräten verbunden ist, wie dem Mikroinjektor27 oder den Dreieinlassgeometrien30.
In der zweiten Anwendung treten die chemischen Impulse in einer großen, quasi-2D-Domäne nach einer benutzerdefinierten Sequenz in Raum und Zeit auf, die über Software vollständig anpassbar ist, die verwendet werden kann, um zufällige Sequenzen oder bestimmte Muster aufzuzwingen. Wichtig ist, dass diese Methode eine starke Verbindung zwischen der hochauflösenden Verhaltensdynamik von bakteriellen Chemotaxis und der Nährstoffaufnahme über Zeitskalen von Sekunden und langfristige Dynamiken wie Wachstum und potenzieller Evolution bietet. Die Bakterienarena ist deutlich größer (2 cm x 2 cm) als der räumliche Bereich der chemischen Interaktion der Bakterien mit einem einzigen Puls (von Hunderten von Mikrometern für die kleinsten Impulse bis zu einigen Millimetern für die größten Impulse). Der Schlüssel zur Aufrechterhaltung eines niedrigen chemischen Hintergrunds (viel niedriger als die Konzentration der chemischen Impulse bei ihrer Freisetzung) ist die Einbeziehung der nanoporösen PCTE-Membran, die zwischen den beiden PDMS-Schichten eingeklemmt ist18. Durch die Anwendung eines Flüssigkeitsflusses in dem mikrofluidischen Kanal, der oben auf dem Gerät platziert ist, wird ein kontinuierliches Auswaschen der nicht gehässigen Verbindungen und verbrauchten Mediums in der bakteriellen Arena durch molekulare Diffusion durch die nanoporöse Membran realisiert, ohne einen Durchfluss im Testabschnitt des Geräts zu erzeugen, in dem sich Bakterien befinden (Abbildung 1).
Durch die Modulation des fokussierten LED-Strahls in Zeit, Amplitude, Größe und Geometrie verleiht die Photorelease-Technologie dem Experimentatoren große Flexibilität bei der Erzeugung verschiedener Arten chemischer Umgebungen. Während die hier vorgestellten Tests unter stillen Bedingungen durchgeführt wurden, kann unsere Methode weiter ausgebaut werden, um bakterielle Chemotaxis unter verschiedenen Strömungskonfigurationen zu testen. Durch die originalgetreue Rekonstruktion der bakteriellen Akkumulationsdynamik durch Videomikroskopie generiert unsere Methode große Mengen qualitativ hochwertiger Daten, die verwendet werden können, um die Statistiken des bakteriellen Verhaltens und die potenzielle Nährstoffaufnahme durch Bakterienzellen abzuschätzen. Unser experimenteller mikrofluidischer Ansatz, der Nährstofflandschaften imitiert, denen Bakterien unter natürlichen Umweltbedingungen ausgesetzt sein könnten, ermöglicht die systematische Untersuchung des Futterverhaltens von mikrobiellen Arten, die für das Radfahren von Nährstoffen im makroskopischen Maßstab2,3unerlässlich sind. Daher ist die Art der durch diese Methode generierten Daten nützlich, um die Aufnahmeraten der Bevölkerung effektiv zu kalibrieren und die Nährstoffkinetik in mesoskalien Ökosystemmodellen besser abzuleiten.
Die Herstellung der PDMS-Formen zur Herstellung der großen Bakterienarena erfolgte mit einem kommerziellen 3D-Druckservice. Ähnliche Ergebnisse können jedoch mit einem High-End-3D-Drucker im hauseigenen Haus erzielt werden, dessen Auflösung für die Auflösung der kleinsten Features der Mikrokanal-Designs eine Auflösung von 50 bis 100 m erfordert. Eine glatte Oberfläche des 3D-gedruckten Materials für die PDMS-Form ist erforderlich, um eine gute Verklebung zwischen dem gegossenen PDMS und den anderen Oberflächen des Geräts (z.B. Glas, Polystyrol, PDMS) zu erreichen. Für unsere Anwendung bietet die Verwendung einer Polystyrol-Petrischale (90 mm x 15 mm) als untere Oberfläche der 3D-Arena zwei Vorteile gegenüber der Verwendung eines Glasschlittens, wie sie in Mikrofluidik-Studien üblich ist: Erstens reduziert sie die Befestigung von Bakterienzellen im Vergleich zu einer Glasoberfläche erheblich (obwohl die Befestigung von den besonderen Oberflächeneigenschaften der betrachteten Mikrobe abhängen könnte); zweitens bietet es eine sekundäre Einschließung, die ein Auslaufen von Medien über Mikroskopiegeräte bei Verschüttungen verhindern kann. Der PDMS-Formhärtungsprozess erfolgt in der Regel bei einer hohen Temperatur (70 bis 80 °C), aber in dieser Anwendung muss der Experimentator die PDMS-Form bei einer deutlich niedrigeren Temperatur (45 °C im aktuellen Fall, siehe Materialtabelle) unter der Wärmeumlenkung und der Schmelztemperatur des für den 3D-Druck des Masters verwendeten Materials backen. Die niedrigere Backtemperatur verlängert den Aushärtungsprozess (über Nacht) erheblich, ändert aber nicht die mechanischen und chemischen Eigenschaften des PDMS.
Obwohl unsere Methode auf eine bestimmte Kombination von Bakterien und Chemoattractanten angewendet wurde, eignet sich die Methode, um verschiedene biologische Prozesse zu testen, einschließlich Nährstoffaufnahme oder Antibiotika-Exposition, und kann auf Modellsysteme verschiedener Arten und Chemoattractanten angewendet werden, da eine Vielzahl von Molekülen8Käfig egelten (oder sein können). Eine mögliche Einschränkung ergibt sich aus den Kosten kommerziell erhältlicher Käfigverbindungen, aber diese Kosten sind vergleichbar mit denen, die bei der Verwendung der molekularen Sonden entstehen, die typischerweise in den Biowissenschaften für Zelllebensfähigkeit, Zählen oder intrazelluläre Färbung verwendet werden. Ungeachtet dieser potenziellen Einschränkung kann die vorgeschlagene Methodik breite Anwendungen in den biophysikalischen und biomedizinischen Wissenschaften finden, um frühe Reaktionen und Anpassungsdynamiken von mikrobiellen Populationen bei Einzelzellauflösung auf dynamische chemische Gradienten zu charakterisieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken der FIRST Mikrofabrikation an der ETH Zürich. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (nach D.R.B.), einen Gordon and Betty Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (nach R.S.) und ein Stipendium der Swiss National Science Foundation. 1-002745-000 (nach R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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