Summary
미세 유체 및 밀리유체 설정 내에서 광용해로 동적 화학 적 경관의 생성을위한 프로토콜이 제시된다. 이 방법론은 운동성 행동, 영양소 섭취 또는 미생물의 화학 물질에 대한 적응을 포함한 다양한 생물학적 과정을 단일 세포 및 집단 수준에서 연구하는 데 적합합니다.
Abstract
우리는 미생물 화학 변균 실험을위한 마이크로 환경을 만들기 위해 지역화 된 화학 력체가 마이크로 스케일에서 갑자기 사용할 수있는 제어 되고 역동적 인 화학 펄스의 생성 방법을 보여줍니다. 화학 적 펄스를 만들기 위해, 우리는 세균 현탁액을 포함하는 다디메틸실록산 (PDMS) 미세 유체 챔버 내에서 케이지 된 아미노산의 광분해에 의해 거의 즉각적으로 아미노산 소스를 소개하는 시스템을 개발했습니다. 우리는 비디오 현미경 검사법에 의해 추적되는 동안 적극적으로 이러한 동적 화학 그라데이션을 등반 할 수있는 화학 박테리아, Vibrio ordalii에이방법을 적용했습니다. 광이동식 보호기와 화학적 변형에 의해 생물학적으로 불활성('케이지')으로 렌더링된 아미노산은 현탁액에 균일하게 존재하지만, UV-A에 가까운 LED 빔을 통해 사용자가 정의한 시간과 공간에서 발생하는 갑작스런 방출까지 는 소비할 수 없습니다. 펄스에서 방출되는 분자의 수는 노출 시간과 분획 해제 분획 사이의 교정 관계에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 광용해 후 흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광법을 사용하는 것이 특징입니다. 나노다공성 폴리카보네이트(PCTE) 멤브레인은 미유체 장치로 통합되어 미주된 화합물 및 소비된 매체의 흐름에 의해 연속적으로 제거할 수 있다. PCTE 멤브레인과 PDMS 미세유체 구조 사이의 강력하고 돌이킬 수 없는 결합은 결합될 표면의 플라즈마 활성화에 이어 3-아미노프로필리에톡실란(APTES)의 용액으로 멤브레인을 코팅함으로써 달성된다. 컴퓨터 제어 시스템은 서로 다른 위치와 다른 강도의 사용자 정의 펄스 시퀀스를 생성하여 규정된 공간 및 시간적 가변성을 가진 리소스 풍경을 생성할 수 있습니다. 각 화학 적 풍경에서, 개별 규모에서 세균 운동의 역학 및 인구 수준에서의 축적을 얻을 수 있습니다.
Introduction
미생물은 화학 적 구배를 감지하고 반응1에서운동성을 수정하는 과정인 화학 요법에 의존하여 화학 적 경관을 탐색하고 영양공급원과 숙성에 접근하고 유해 물질을 탈출합니다. 이러한 마이크로 스케일 프로세스는 미생물과 환경 간의 상호 작용의 거시 적 역학을 결정2,3. 최근 연질 리소그래피4를포함한 미세 유체학 및 미세 제조 기술의 발전은 미생물의 상호 작용을 연구할 수 있는 제어된 미세 환경을 만드는 우리의 능력에 혁명을 일으켰습니다. 예를 들어, 과거 실험에서는 중급에서 고영양농도의 고도로 조절되고 안정된 그라데이션을 생성하여 세균화학을 연구한5,6. 그러나 자연 환경에서는 미세 크기의 화학 그라데이션이 단명할 수 있으며 분자 확산에 의해 소멸될 수 있으며 배경 조건은 종종 매우희석되어 7. 불안정한 화학 환경에 처음 노출된 미생물 집단의 화학반응을 직접 측정하기 위해 미세 유체 기술과 광분해를 결합하여 야생 박테리아가 자연에서 마주치는 그라데이션을 모방하는 방법을 고안하고 여기에 설명했습니다.
Uncaging 기술은 생체 분자를 비활성 형태로 기능적으로 캡슐화하는 빛에 민감한 프로브를 사용합니다. 조사는 갇힌 분자를 방출하여 생물학적 과정의 표적 교란을허용8. 세포 화학의 신속하고 정밀한 제어로 인하여9,케이지 화합물의 광분석은 전통적으로 생물학자, 생리학자 및 신경과학자들에 의해 유전자10,이온 채널11,및 뉴런12의활성화를 연구하기 위해 사용되어 왔다. 최근 과학자들은화학요법(13)을연구하기 위해 광분해의 유의한 장점을 활용하고, 단계별 화학력 자극14,15에노출된 개별 세균 세포의 편동기 전환 역학을 결정하고, 3차원(3D) 그라데이션16에서단일 정자 세포의 운동성 패턴을 조사하였다.
우리의 접근에서는, 우리는 광유체 장치 내의 케이지된 아미노산의 광용해를 구현하여 광방출을 통해 거의 즉각적으로 이용 가능해지는 제어된 화학 펄스에 대한 세균 집단의 행동 반응을 연구합니다. 저배율(4x) 목적(NA = 0.13, 초점 깊이 약 40 μm)을 사용하면 넓은 시야(3.2 mm x 3.2 mm)에서 수천 개의 박테리아의 집단 수준 집계 반응을 관찰하고 단일 셀 수준에서 모션을 측정할 수 있습니다. 우리는이 방법의 두 가지 응용 프로그램을 제시: 1) 균일 한 조건에서 시작 하는 박테리아 축적-발산 역학을 연구 하는 단일 화학 펄스의 릴리스, 그리고 2i)시간 변화 하에서 세균 축적 역학을 특성화 하는 다중 펄스의 릴리스, 공간적으로 이질적인 화학 력 조건. 이 방법은 아미노산글루타메이트(17)를향한 화학탁증을 수행하는 해양 박테리아 비브리오 오르달리에 대해 시험되었지만, 이 방법은 화학적 화학요법(예를 들어, 영양 섭취, 항생제 노출, 쿼럼 센싱)을 넘어서는 생물학적 과정뿐만 아니라 종 및 화학유량의 상이한 조합에 광범위하게 적용가능하다. 이 접근법은 현실적인 환경에서 미생물의 생태와 행동을 해명하고 일시적인 동적 그라데이션을 탐색 할 때 개별 박테리아가 직면하는 숨겨진 절충을 밝히는 데 도움이 될 것을 약속합니다.
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Protocol
1. 단일 화학 펄스 실험을위한 미세 유체 장치 제조
- CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 채널을 디자인하고 투명 필름에 인쇄하여 포토 마스크를만듭니다(그림 1A).
- 부드러운 리소그래피로 마스터를 제작합니다(클린룸 조건하에서).
- 실리콘 웨이퍼(4인치)를 아세톤, 메탄올 및 이소프로판올로 연속해서 세척한 다음 질소를 사용하여 건조시면 됩니다. 웨이퍼를 오븐에서 130°C에서 5분간 굽습니다.
- 웨이퍼를 스핀 코터 중앙에 놓고 SU-8 포토레지스트를 웨이퍼에 붓습니다. 스핀 코터의 속도를 5초 이상 500rpm까지 램프하고 10초 동안 500rpm으로 유지하며, 10초 이상의 최종 속도를 최대10초까지 램프하고 30초 동안 이 속도로 유지합니다.
참고: 최종 속도의 정확한 값은 대상 코팅 두께와 사용된 SU-8에 따라 달라집니다. - 스핀 코팅 공정 후, 웨이퍼를 65°C에서 구운 다음 95°C에서 굽습니다. 웨이퍼를 실온(RT)에서 5분 이상 식힙니다.
참고: 베이킹 시간은 사용된 포토레지스트의 두께와 유형에 따라 다릅니다. 일반적으로, 매 100 μm 층마다 웨이퍼는 65°C에서 5분, 95°C에서 45분 동안 구워져야 한다. - 포토 마스크를 웨이퍼위에 놓아 관심 영역만 노출되고 중합되도록 합니다. SU-8 설명서에서 권장하는 시간 동안 UV 광에 노출하십시오.
참고: 여기서, 350 nm의 파장에서 200 mJcm-2의 노출 에너지로, 웨이퍼는 150s에 노출되었다. - SU-8 매뉴얼에서 권장되는 시간 동안 웨이퍼를 65°C 및 95°C에서 굽습니다.
참고: 일반적으로 100 μm 층마다 웨이퍼는 65°C에서 5분, 95°C에서 45분 동안 구워져야 합니다. - 마스터를 얻기 위해 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 개발자로 채워진 비커에 웨이퍼를 담급니다. 비커를 부드럽게 흔들어 중합되지 않은 포토레지스트가 씻겨나도록 합니다. 200°C에서 마스터를 구워 SU-8 층을 더 가교합니다.
- 탄성중합체와경화제(재료표)를10:1 비율로 비커(여기, 40 mL)로 결합하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 혼합물을 준비한다. 액체가 균일할 때까지 힘차게 섞으세요.
참고: PDMS 혼합물은 혼합 과정에서 기포가 생성되기 때문에 불투명하게 보입니다.
주의: 잠재적으로 유해한 화학 물질 이나 생물학적 물질과 접촉 하는 피부를 방지 하기 위해, 항상 프로토콜 을 통해 실험실 코트와 일회용 플라스틱 장갑을 착용 하 고 재료에 따라 특정 안전 프로토콜을 따르십시오. 안전 데이터 시트 (MSDS). - RT에서 45분 동안 진공 챔버에서 PDMS 혼합물을 탈기합니다. 프로세스를 신속하게 처리하려면 주기적으로 진공을 해제하여 인터페이스에서 형성되는 기포를 파열시보입니다.
참고 : 탈기 과정은 PDMS 혼합물이 치료되기 시작되지 않도록 1 시간 이내에 수행해야합니다. - 가압 세제로 마스터 표면에서 먼지를 제거한 다음 탈기된 PDMS 혼합물을 마스터에 붓고 80°C에서 오븐에서 2시간 동안 굽습니다.
참고: 또는, 60°C에서 하룻밤(또는 적어도 12시간 동안) 베이킹하면 동일한 경화 PDMS를 얻을 수 있다. - 미세 구조 (약 5mm의 거리에서) 주위에 블레이드로 PDMS를 잘라 다음 조심스럽게 마스터에서 PDMS를 벗겨.
- 마이크로채널의 입구 및 출구역할을 하는 펀치 구멍(여기, 하나의 입구 및 하나의 콘센트, 도 1A참조). 피처가 있는 PDMS의 아래쪽 면에 아무 것도 닿지 않는지 확인합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 마이크로 채널은 보관 중에 먼지 및 기타 입자가 쌓이는 것을 방지하기 위해 접착제 테이프로 밀봉되어야 합니다. - PDMS 마이크로채널을 유리 슬라이드에 결합합니다.
- 비누, 이소프로판올 및 탈이온수로 유리 슬라이드를 철저히 청소하십시오. 유리 슬라이드를 건조시키거나 압축 공기를 사용하여 공정 속도를 높이십시오.
- 접착제 테이프로 두드리면 먼지 입자를 제거합니다. 깨끗한 유리 슬라이드에 PDMS 마이크로 채널을 결합, 플라즈마와 두 표면을 처리 한 직후 (코로나 시스템 또는 플라즈마 산소 챔버 중 하나를 사용하여) 2 분.
- 유리와의 화학적 결합을 강화하기 위해 적어도 1 시간 동안 80 °C에서 열판에 가열하는 미세 유체 장치를 놓습니다.
2. 다중 펄스를 이용한 실험을 위한 3D 프린팅 밀리플루언스 장치 제작
- 3D 디자인 소프트웨어를 사용하여 3D 모양을 설계하고 고해상도 3D 프린터로 PDMS 금형의 마스터를 인쇄합니다(그림1B).
참고: 마스터를 작성하는 데 사용되는 3D 프린터 및 금형 재료의 재료 표를 참조하십시오. - 1.3-1.4 단계를 반복한 다음 접착제 테이프로 두드리며 마스터의 표면을 청소합니다. 마스터를 스케일에 넣고, 멤브레인에 의해 점유될 마스터의 중앙 영역을 피하면서, 마스터의 높이와 일치시켜 PDMS의 원하는 높이를 얻기 위해 경화되지 않은 PDMS 혼합물의 정확한 양(여기, 23.4 g)을 부어 (여기, 0.5 mm). 압축 공기의 도움으로 남아있는 거품을 제거합니다.
- PDMS 캐스트를 45°C의 오븐에 놓고 적어도 12시간 동안 굽습니다.
- 3D PDMS 몰드를 페트리 접시에 결합합니다.
- 경화 된 PDMS 층을 부드럽게 벗겨 내고 세균 현탁액의 주입을위한 입구 및 출구 구멍을 펀치합니다(도 1C).
- 페트리 접시(90mm x 15mm)의 표면과 산소 플라즈마로 PDMS 몰드를 2분 동안 활성화합니다. 부드럽게 페트리 접시에 금형을 누르지,하지만이 심문 챔버를 붕괴 할 수 있기 때문에 피처가있는 위치를 누르지 마십시오.
- PDMS 3D 몰드에 결합된 페트리 접시를 적어도 12시간 동안 오븐에 45°C에서 놓고 화학결합을 강화한다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 멤브레인 표면 기능화18
- RT에서 산소 플라즈마 챔버에서 나노 다공성 폴리 카보네이트 (PCTE) 멤브레인을 1 분 동안 활성화하십시오.
주의: 멤브레인이 손상되기 때문에 플라즈마 활성화를 위해 코로나 시스템을 사용하지 마십시오. - 화학적 후드 하에서, 폴리프로필렌 튜브를 사용하여, 탈이온화된 물에 3-아미노프로필트리에톡실란(APTES)의 상업적 용액을 1% 부피(here, 40 mL)로 희석한다.
주의: APTES 용액은 급성 독성(MSDS 건강 위험 점수 3)이며 장갑이 달린 화학 후드 아래에서만 극도의 주의를 기울여 처리해야 합니다. APTES 솔루션을 취급한 직후 장갑을 교체하십시오. APTES 연기는 점막 및 상부 호흡기에 파괴적입니다. APTES의 표적 기관은 신경, 간 및 신장입니다. 연기 후드를 사용할 수 없는 경우 페이스 쉴드와 전면 호흡보호구를 구현해야 합니다. - 희석된 APTES 용액을 페트리 접시에 옮기고 활성화된 멤브레인을 APTES 용액에 20분 동안 담근다.
- 핀셋으로 APTES 용액에서 멤브레인을 제거하고 클린룸 와이프에 놓아 말리십시오.
- RT에서 산소 플라즈마 챔버에서 나노 다공성 폴리 카보네이트 (PCTE) 멤브레인을 1 분 동안 활성화하십시오.
- 멤브레인에 놓여 세균 경기장의 세척을 허용 PDMS 미세 유체 채널의 제조를 위해, 단계를 반복 1.1−1.7.
- PDMS 세척 채널을 기능화된 멤브레인에 결합합니다.
- PDMS 세척 채널과 산소 플라즈마 챔버로 PCTE 멤브레인을 2 분 동안 활성화하십시오.
참고: 두 PDMS 층 사이에 끼워질 멤브레인은 PDMS 세척 채널보다 작아야 합니다. - 플라즈마 처리 직후, PDMS 세척 채널을 멤브레인에 부드럽게 눌러 기능화된 멤브레인과 PDMS 세척 채널을 접촉시킵니다.
참고: 채널을 차단하여 멤브레인이 채널 지붕에 부착(돌이킬 수 없는) 원인이 될 수 있으므로 이 단계에서 과도한 압력을 가하지 마십시오.
- PDMS 세척 채널과 산소 플라즈마 챔버로 PCTE 멤브레인을 2 분 동안 활성화하십시오.
- 두 개의 PDMS 층 사이에 멤브레인을 끼치십시오(그림 1E).
- 보세 라미네이트 PDMS 세척 채널-PCTE 멤브레인과 이전에 2분 동안 산소 플라즈마 챔버로 페트리 접시에 접착된 3D PDMS 몰드를 모두 활성화하고 함께 누릅니다.
- 샌드위치 구조에 접합된 페트리 접시를 45°C에서 오븐에 놓고 적어도 12시간 동안 화학 결합을 강화한다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
3. 세포 배양
- 30°C에서 궤도 셰이커(600 rpm)에서 2216 배지19에서 20시간 동안 밤새 V. 오르달리이(변형균 12B09 또는 12B09pGFP)의 인구를 키우고 후기 지수 상에서 세포를 수확한다. pGFP를 품고 있는 분리된 경우, 플라스미드를 유지하기 위해 스펙티노마이신(50 μgmL-1)을첨가한다.
- 원심분리기 2500 x g에서 세포의 1 mL aliquot 3 분, 상류물을 제거하고 여과 된 인공 해수의 1 mL에서 세포를 다시 현탁. 이 단계를 반복합니다.
- 30 °C에서 궤도 셰이커 (600 rpm)에 V. ordalii의 인구를 굶어 3 시간.
- 4-메톡시-7-니트로인돌리닐-제주-L-글루타메이트(MNI-케이지-L-글루타메이트)의 10 mMM(여기, 1 mL)의 스톡 인공 해수 용액을 준비하고 -20°C에서 보관한다.
참고: MNI-케이지- L-글루타메이트 용액을 주변 광으로부터 보호하여 광용해를 방지합니다. - 1 mM MNI-케이지-L-글루타메이트의 인공 해수 용액에서 굶주린 세포를다시 현탁시킴으로써 세포를 50배 희석시켰다.
참고 : 이것은 5 x 107 mL-1보다 낮은 최종 세균 농도를 보장합니다 (정확한 값은 일반적으로 ~ 109 mL-1인늦은 지수에서 세포의 초기 농도에 따라 달라집니다). 세균 농도는 600 nm의 광학 밀도(OD)에서 분광광도계를 사용하여 추정되었다.
4. 무차체 의정서의 교정
- MNI-케이지드-L-글루타메이트(20)의 인공 해수 용액의 액적(20 μL)을 유리 슬라이드 상에 농도 C0=10 mM에 놓는다. 원형 PDMS 챔버 (직경 d = 5mm, 높이 h = 250 μm)로 덮어서 액을 캡슐화합니다.
- 유리 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 4배 의 목표(숫자 조리개 [NA] = 0.13)를 사용하여 395 nm(전력 295 mW)의 파장에서 LED 빔에 20ms의 전체 챔버를 노출시다.
- PDMS 챔버를 열고 UV-Vis 분광광도계로 분석을 위해 액적(1 μL)을 추출합니다.
- 0.1s, 0.5s, 2.5s, 25s, 250s(또는 화학 반응의 포화까지) 및 0s(배경을 얻기 위해)의 다양한 LED 조명 지속 시간 동안 4.1-4.3 단계를 반복합니다. 절차 단계 4.1-4.4를 적어도 3배(여기, 4x)를 복제합니다.
- 흡수 스펙트럼으로부터, 405 nm에서 값을 추출하는데, 이는 케이지분자(21)의흡수 스펙트럼에서 피크를 나타낸다. LED노출(14)에의한 화학적 미진 반응의 레이트 k를 결정하기 위해, 실험 데이터의 수치적 적합도에 대해 다음의 1차 역학방정식을 사용한다(17)
여기서 C(t)는 405 nm (배경 제거 후)에서 용액의 흡수 스펙트럼의 값이며 t 초의 끊임없는 시간입니다. kt 1, Eq. 1과 같은 작은 미주 시간 t의 경우 선형 제형으로 단순화 할 수 있습니다.
5. 단일 화학 펄스 실험
- 충진 공정 중에 기포가 형성될 가능성이 적도록 PDMS 내의 가스 농도를 줄이기 위해 진공 하에서 미세 유체 채널을 20분 동안 유지합니다.
- 진공 펌프에서 채널을 추출하고 즉시 1 mMM-caged-L-글루타메이트에 희석 된 세균 현탁액을 기계적 전단력에 의한 기모 손상을 피하기 위해 마이크로 파이펫을 사용하여 마이크로 채널에 미세 채널로 부드럽게 도입합니다 (여기서 전체 충진 공정은 5-10 초가 걸렸습니다). 세균 성 서스펜션으로 채널을 채운 후 종이 타월로 용액을 과도하게 빨고 입구와 출구를 PDMS 플러그로 밀봉하여 구멍에 부드럽게 밀어 넣습니다.
참고 : 이런 식으로 챔버의 유체 흐름이 방지됩니다. - 마이크로채널을 현미경 스테이지에 놓고 스테이지를 이동하여 중간 채널에서 시야를 설정합니다. 12fps의 프레임 속도로 위상 대비(4배 대)에서 이미징을 수행하도록 현미경을 설정합니다.
참고: 이 값은 다양할 수 있지만 이미지 분석을 통해 박테리아 궤적을 재구성할 수 있도록 10fps 미만이어야 합니다(프로토콜 섹션 7 참조). - LED 빔의 핀홀을 최소 조리개에 설정합니다. 카메라의 노출 시간을 5초로 설정하여 몇 프레임을 기록하여 LED 빔의 공간 위치와 크기를 정확하게 측정합니다.
참고: LED 광원은 액체 광 가이드 연결을 통해 현미경의 에피 형광 조명기에 연결됩니다. 비디오 수집 및 LED 자극은 소프트웨어를 통해 독립적으로 명령되기 때문에 LED 빔은 비디오 캡처에 영향을 미치지 않습니다. - 총 10분(가장 큰 화학 펄스의 경우 20분)의 연속 이미징을 수행하고, 현미경 소프트웨어를 통해 사용자 정의 시점(비디오 수집 시작 후 10초)에서 원하는 지속 시간(이 실험에서 t = 20ms, 100ms, 500ms)에서 395 nm에서 집중된 LED 빔을 동시에 활성화합니다. 동일한 프로세스의 여러 복제를 얻으려면 스테이지를 이동하여 미세 유체 채널의 다른 위치에 걸쳐 세균 반응을 기록합니다. 새 마이크로채널을 사용하여 각 펄스 크기에 대해 이 절차를 복제합니다.
참고: 케이징 해제 프로세스는 이미징 평면에서 방사형으로 확산되는 축대칭 원통형 펄스를 생성합니다. - 박테리아의 편견없는 수영 동작을 기록하기 위해 더 높은 프레임 속도 (50 fps)에서 더 높은 배율 (20x 목표, NA = 0.45)에서 화학적 분해없이 별도의 실험을 수행합니다.
6. 다중 화학 펄스 실험
- 20 분 동안 진공 하에서 밀리 플루이드 챔버를 유지하십시오.
- 밀리플루이드 챔버를 포함하는 페트리 접시를 현미경 단계에 놓습니다. 인공 해수에서 1 mM MNI-케이지- L-글루타메이트 용액에서 GFP 형광 V. ordalii의 희석 된 세균 현탁액 (여기, 전체 충진 공정이 10-15 s)으로 멤브레인 아래 의 챔버를 채웁니다. 세균 성 서스펜션으로 채널을 채운 후 종이 타월로 용액을 과도하게 빨고 입구와 출구를 PDMS 플러그로 밀봉하여 구멍에 부드럽게 밀어 넣습니다.
참고 : 이런 식으로 챔버의 유체 흐름이 방지됩니다. 이미징이 나노 다공성 멤브레인을 통해 발생하는이 설정에서 박테리아의 더 나은 시각화를 허용하려면 야생 유형 대신 형광 균주를 사용하는 것이 좋습니다 (단일 화학 펄스 실험에서 사용되는 대로). - 주사기를 1 mM MNI-케이지-L-글루타메이트의 인공 해수 용액으로 채우고 멤브레인 위의 세척 채널의 입구 및 출구에 튜브를 부착합니다.
- 튜브를 폐기물 저장소에 연결하고 압력이 진동하지 않도록 튜브가 유체 폐기물 저장소에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다.
- 주사기 펌프(here, 50 μLmin-1)에적절한 유량을 설정하여 채널 형상에 의존하는 세척 채널에서 원하는 평균 유량을 구한다.
- 주사기 펌프를 시작하여 멤브레인 위의 세척 채널에서 흐름을 설정합니다.
- LED 빔과 현미경 단계를 제어하는 소프트웨어를 실행하여 서로 다른 위치와 다른 강도로 사용자 정의 펄스 시퀀스를 생성합니다.
참고 : 멤브레인 위의 세척 채널에서 1 mM MNI-caged-L-글루타메이트의 인공 해수 용액의 연속 흐름은 케이지 화합물 용액을 보충하고 세균 분야에서 소비 된 매체를 세척합니다. - 몇 시간 동안 일정한 시간 간격으로 4x 목표를 사용하여 비디오를 녹화하고 여러 연속 위치에 걸쳐 큰 표면을 덮습니다(여기, 1cm x 1cm, 그림 1F).
7. 이미지 분석 및 데이터 분석
- 세균 성 궤적의 재건
- 4x 목표로 녹화된 영화에서 추적 소프트웨어17을사용하여 박테리아 궤적을 재구성합니다.
참고: 이러한 궤적들은 마이크로채널에서 3D 세균 운동의 2D 투영을 나타냅니다. - 재구성된 세균 궤적으로부터, 화학 펄스의 중심을 향해 그 수영 속도를 투사하여 각 수영 개인의 방사형 드리프트 속도를 결정한다(그림2D). 시선 드리프트 속도의 공간-시간 역학의 시각화를 위해 공간 크기 75 μm x 75 μm 및 5-10초 간격의 시간창(그림2D,E)의비닝 그리드를 사용합니다.
참고: 프로세스의 원통형 대칭으로 인해 데이터는 극좌표로 분석하고 각도 치수를 통해 평균화될 수있습니다(그림 3). - 재구성된 박테리아 궤적으로부터, 화학적 맥박에 반응할 때 박테리아 분포의 spatio-측두엽 역학을 결정한다(그림2E).
- 단일 펄스 실험 동안 20x 객관적으로 기록된 고해상도 영화에서, 화학 펄스에 반응할 때 세균 집단에 대한 수영 속도 및 실행 시간의 분포를 추출한다(그림4).
- 4x 목표로 녹화된 영화에서 추적 소프트웨어17을사용하여 박테리아 궤적을 재구성합니다.
- 화학요법이 완료된 후 세균 집단의 소산 역학을 고려하여 박테리아의 확산 계수를추정하는 17(여기, t > 300s; 그림 3).
- 스토크스-아인슈타인 방정식을 적용하여 글루타민산염의 확산 계수를 추정
아미노산 분자가 유체역학적 반경22rG를가진 구형 입자로 가정되는 경우, kB는 볼츠만 상수(1.38 x 10-23 m2 kgs-2 K-1), T는 온도(296 K), 및 인공 해수의 동적 점도(염도 36 gkg-1)에서23°C(23°C)이다.
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Representative Results
우리는 동적 영양소 조건 하에서 세균 축적 프로파일을 연구하기 위해 미세 유체 및 밀리유체 장치(그림 1)를사용했습니다. 세균 궤적은 광용해에 의해 방출된 화학적 맥박에 따른 세균 집단의 축적-소산 역학의 상 대비 현미경 검사법에 의해 획득된 기록된 비디오에서 추출되었다(도2 및 그림 3). 수백만 개의 궤적을 평균화함으로써, 시선 의 드리프트 속도와 세균 농도의 시공간역학을 얻었다. 화학 그라데이션이 없는 상태에서 수영을 설명하는 통계는 더 높은 공간 및 시간적 분해능을 가진 별도의 실험에서 얻어졌다(그림4).
그림 1: 동적 영양소 조건하에서 세균 실험을 위한 미세 유체 및 밀리유체 장치. (a)단일 화학 펄스로 세균 축적을 관찰하는 데 사용되는 미세 유체 채널의 포토마스크. (B)다중 펄스 실험을 위해 밀리플루이드 세균 챔버를 세척하는 데 사용되는 미세 유체 채널의 포토마스크. 작은 점은 PDMS에 멤브레인의 결합을 돕는 마이크로 필라 (크기 200 μm)이며, 동시에 중앙에서 멤브레인이 좌굴또는 붕괴되는 것을 방지합니다. (C)세균 챔버를 만드는 데 사용되는 3D 인쇄 마스터의 디자인. (D)세균 챔버의 패터닝을 가진 PDMS 층. (E)완전한 밀리플루이드 장치 (상단보기, 흰색PCTE 멤브레인). (F)동적 영양 조건(측면 도면)의 생성을 위한 밀리플루이드 장치의 회로도. 광학 광선 다이어그램은 장치의 바닥에 도시되어, 보라색 빔 (395 nm)은 화학 유도체의 무취를 수행하는 반면,(독립적 인) 파란색 빔 (470 nm)은 세균 밀도 (바닥 중심)를 캡처하는 sCMOS 카메라를 통해 형광 박테리아 (항재 pGFP)의 관찰에 사용됩니다. 이 장치는 전동 스테이지(오른쪽 아래)에 배치되며, x-y 평면에서 이동하여 사용자 정의 위치에서 화학 펄스를 방출할 수 있습니다(NIS 소프트웨어를 통해 제어됨, 왼쪽 아래). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 화학 펄스에 대한 대표적인 세균 반응. (A, B) 0.5s 간격에 걸쳐 세균 위치(흰색)를 나타내는 최대 강도 프로젝션, 도시된(A)바로 다음에, 및(B)펄스 방출 후 40s(목표: 4x, NA= 0.13, Ph2; 12 fps에서의 비디오 녹화). (C)세균 궤적(검정)은 펄스 방출 후 60s를 나타내고 있다. 그늘진 영역은 투시 필드(블랙 크로스)의 중간에 있는 t =0s에서 광용해로 방출된 화학적 펄스를 나타내며, 이는 이후에 확산됩니다. 궤적은 사용자 지정 사내 소프트웨어를 사용하여 재구성되었습니다. (D,E) 시선 의 시간 적 역학(D)및 세균 농도(E)시야의 중심에서 펄스 방출에 따라. 패널 D에서 드리프트 속도(파란색)의 음수 값은 펄스 의 중심을 향한 지시된 화학 적 움직임에 해당합니다. 이 수치는 브럼리 외17후 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 화학 펄스 방출 에 따른 방사형 드리프트 속도 및 세균 농도의 Spatio-측두엽 프로파일. (A, B) 방사형 드리프트속도(A)및 세균농도(B)는35 μM 글루타메이트 펄스의 중심으로부터의 시간 및 거리의 함수로서. 패널 A에서 드리프트 속도(파란색)의 음수 값은 펄스 의 중심을 향한 지시된 화학 적 움직임에 해당합니다. 값은 모든 궤적을 평균화하여 계산되었습니다. t = 250s의 검은 색 파선은 활성 화학 요법 (패널 A, 영역 I의 파란색 차광)의 기간을 대략 구분한 다음 세포가 이색성으로 바깥쪽으로 확산됩니다 (패널 A, 영역 II의 녹색 차광). (c)세균 농도 (배경 B0에 걸쳐 재스케일링) t = 10, 30, 60s에서 거리의 함수로서 확산 화학 펄스의 생성 후. 박테리아는 화학 요법으로 인한 맥박 부위에 가깝습니다. (D)세균 농도는 세균 확산에 의해B0 배경으로이완하는 데 ~20분이 걸린다. 인세트는 DB= 165 μm2 s-1의확산 계수로 확산 확산의 적합성을 나타낸다. 패널 A, C 및 D는 브럼리 외17에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 화학 그라데이션이 없는 세균 집단에 대한 수영 통계. (a)궤계는 마이크로채널에서 3차원 세균 운동의 2차원 투영을 나타낸다. 박테리아 궤적 사용자 지정 사내 추적 스크립트를 사용 하 여 추출 됩니다. 여기서 파란색 십자가는 트랙의 시작을 나타내고 빨간색과 녹색 기호는 방향 전환 이벤트를 나타냅니다. 데이터는 20배 목표, NA 0.45를 가진 50 fps에서 기록되었습니다. (B)측정된 세균 수영 속도(검정)의 확률 분포와 감마 분포 적합(파란색)을 함께 분포한다. 20x 대물(NA 0.45)으로 이미징할 때 초점 의 깊이는 소수미크론(24)에불과하기 때문에 기록된 궤적은 본질적으로 평면이며 수영 속도의 측정은 투영에 의해 편향되지 않습니다. (C)연속적인 방향 전환 사이의 시간의 확률 분포. 이러한 데이터는 재방향 패턴, 수영 속도 분포 및 유기체의 방향 전환 통계를 고려하는 개별 기반 모델을 효과적으로 교정하는 데 필요했습니다. 이 그림은 브럼리 외17에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법을 통해 연구원은 마이크로 및 밀리플루언스 장치에서 제어되고 동적 그라데이션하에서 세균 성 화학 요법을 연구하여 재현 가능한 데이터 수집을 가능하게합니다. 광분해에 의한 마이크로스케일에서 의한 화학펄스의 거의 즉각적인 생성은 박테리아가 다양한 소스로부터 야생에서 발생하는 영양소 펄스의 유형을 재현하는 것을 목표로 하며, 예를 들어, 가라앉는 해양입자(25)뒤에 있는 깃털의 확산, 또는 용해된 식물성 플랑크톤세포(26)로부터퍼지는 영양소를 재현하는 것을 목적으로 한다.
우리는이 방법의 두 가지 응용 프로그램을 제시: 1) 균일 한 조건에서 시작 하는 박테리아 축적-발산 역학을 연구 하는 단일 화학 펄스의 방출, 그리고 2) 비 평형 영양소 조건 하에서 박테리아 축적 프로필을 특성화 하는 다중 펄스의 릴리스. 첫번째 신청은 영양공급원을 처음 만날 때 미생물의 행동 반응을 특성화하기 위하여 특히 적중합니다. 이러한 조건하에서, 화학유량 분자의 농도가 극히 낮은, 화학탁증의 초기 단계는 화학수용체(17)에대한 화학유인성 분자의 회항 결합-결합없는 사건에 의해 지배된다. 우리의 방법은, 제로 영양소 배경에서 화학력의 알려진 질량을 신속하고 정밀하게 방출함으로써, 동적 조건27,28,29하에서 세균 반응을 특성화하기 위해 이전의 접근법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 장점은 모든 위치에서 그리고 항상 (그 확산성이 알려져 있기 때문에) 화학 유량의 전체 분포를 알고, 마이크로 인젝터(27) 또는 3-입구 기하학(30)과같은 다른 장치와 본질적으로 연관되는 유체 흐름의 생성을 완전히 피하는 것을 포함한다.
두 번째 응용 프로그램에서, 화학 펄스는 임의의 순서 또는 특정 패턴을 부과하는 데 사용할 수있는 소프트웨어를 통해 완벽하게 사용자 정의 공간과 시간에 사용자 정의 시퀀스에 따라 큰, 준 - 2D 도메인에서 발생합니다. 중요한 것은, 이 방법은 세균성 화학요법의 고해상도 행동 역학과 성장 및 잠재적으로 진화와 같은 장기적인 역학의 시간 척도에 걸쳐 영양 섭취 사이의 강력한 링크를 제공합니다. 세균 경기장은 상당히 큰 (2 cm x 2 cm) 단일 펄스와 박테리아의 화학 적 상호 작용의 공간 범위 보다 (가장 작은 펄스에 대 한 마이크로 미터의 수백에서 가장 큰 펄스에 대 한 몇 밀리미터). 낮은 화학적 배경의 유지 보수의 핵심은 (방출시 화학 펄스의 농도보다 훨씬 낮음) 두 PDMS 층(18)사이에 끼워진 나노 다공성 PCTE 멤브레인의 포함이다. 장치의 상단에 배치된 미세 유체 채널에 유체 흐름을 적용함으로써, 박테리아가 위치한 장치의 시험 섹션에서 흐름을 생성하지 않고, 나노 다공성 멤브레인을 통한 분자 확산을 통해 세균 분야에서 미주된 화합물 및 소비 배지의 연속 세척이 실현된다(도1).
photorelease 기술은 시간, 진폭, 크기 및 형상에 초점을 맞춘 LED 빔을 변조하여 실험자가 다양한 유형의 화학 환경을 생성할 수 있는 뛰어난 유연성을 제공합니다. 동시에, 여기에 제시된 시험이 정지 조건 하에서 수행되는 동안, 우리의 방법은 다른 교류 구성의 밑에 세균성 화학요법을 시험하기 위하여 더 확장될 수 있습니다. 비디오 현미경을 통해 세균 축적 역학을 충실하게 재구성함으로써, 우리의 방법은 세균 행동의 통계와 세균 세포에 의한 잠재적 인 영양소 섭취를 추정하는 데 사용할 수있는 고품질의 데이터를 대량으로 생성합니다. 박테리아가 자연 환경 조건하에서 직면 할 수있는 영양 풍경을 모방 한 우리의 실험 미세 유체 접근 법은 거시 적 규모의 영양소 순환에 필수적인 미생물 종의 위조 행동에 대한 체계적인 연구를 할 수 있습니다2,3. 따라서 이 방법론을 통해 생성된 데이터 유형은 인구 증가율을 효과적으로 보정하고 메조스케일 생태계 모델에서 영양소 역학을 더 잘 유도하는 데 유용합니다.
대형 세균 경기장을 만들기 위해 PDMS 금형의 제조는 상업용 3D 프린팅 서비스를 사용하여 수행되었다. 그러나 마이크로채널 설계의 가장 작은 기능을 해결하는 데 필요한 50-100 μm의 해상도로 집에서 고급 3D 프린터를 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. PDMS 금형에 대한 3D 프린팅 재료의 매끄러운 표면은 주조 PDMS와 장치의 다른 표면(즉, 유리, 폴리스티렌, PDMS) 사이의 양호한 접합을 달성하기 위해 요구된다. 우리의 응용 프로그램에 대 한, 폴리스티렌 페트리 접시의 사용 (90 mm x 15 mm) 3D 경기장의 낮은 표면으로 일반적으로 미세 유체 학 연구에 사용 되는 유리 슬라이드의 사용에 비해 두 가지 장점을 제시: 첫째, 그것은 상당히 유리 표면에 비해 세균 세포의 부착을 감소 (비록 부착 고려 중인 미생물의 특정 표면 특성에 따라 달라질 수 있습니다); 둘째, 유출 시 현미경 장비에 대한 매체의 누출을 방지할 수 있는 보조 봉쇄를 제공합니다. PDMS 금형 경화 공정은 일반적으로 고온(70−80°C)에서 발생하지만, 이 응용 분야에서 실험자는 마스터의 3D 프린팅에 사용되는 재료의 열 편향 및 용융 온도 아래에서 상당히 낮은 온도(현재 의 경우 45°C, 재료 표참조)에서 PDMS 금형을 구워야 합니다. 낮은 베이킹 온도는 경화 공정(하룻밤)을 상당히 길게 하지만 PDMS의 기계적 및 화학적 특성은 변하지 않는다.
우리의 방법은 박테리아와 화학 유착제의 하나의 특정 조합에 적용되었지만, 방법론은 영양소 섭취 또는 항생제 노출을 포함한 다양한 생물학적 과정을 테스트하기에 적합하며, 무수한 분자가 케이지8이었음을감안할 때 다른 종 및 화학 력의 모델 시스템에 적용 될 수 있습니다. 한 가지 잠재적인 제한은 시판되는 케이지 화합물의 비용에서 발생하지만, 이러한 비용은 세포 생존, 계수 또는 세포 내 염색을 위해 생명 과학에서 일반적으로 사용되는 분자 프로브를 사용할 때 발생하는 비용과 유사합니다. 이러한 잠재적 한계에도 불구하고, 제안된 방법론은 생물물리학 및 생물의학 전반에 걸친 광범위한 응용을 발견하여, 동적 화학 그라데이션에 대한 단일 세포 해상도에서 미생물 집단의 조기 반응 및 적응 역학을 특성화할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 ETH 취리히에서 첫 번째 미세 가공 시설에 감사드립니다. 이 작품은 호주 연구위원회 발견 초기 경력 연구원 상 DE180100911 (D.R.B.), 고든과 베티 무어 해양 미생물 이니셔티브 조사자 상 GBMF3783 (R.S.에), 스위스 국립 과학 재단 보조금에 의해 지원되었다 1-002745-000 (R.S.로)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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