Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generere kontrollerte, dynamiske kjemiske landskap for å studere mikrobiell atferd

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/60589
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5, 1, 1, 1, 6, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

Summary

En protokoll for generering av dynamiske kjemiske landskap etter fotolyse innenfor mikrofluidiske og millifluidiske oppsett presenteres. Denne metoden er egnet til å studere ulike biologiske prosesser, inkludert motilatferd, næringsopptak eller tilpasning til kjemikalier av mikroorganismer, både på enkeltcelle- og befolkningsnivå.

Abstract

Vi demonstrerer en metode for generering av kontrollerte, dynamiske kjemiske pulser – der lokalisert kjemoattractant plutselig blir tilgjengelig på mikroskalaen – for å skape mikromiljøer for mikrobielle akserieeksperimenter. For å skape kjemiske pulser utviklet vi et system for å introdusere aminosyrekilder nær øyeblikkelig ved fotolyse av buraminosyrer i et mikrofluidant polydimethylsiloxane (PDMS) mikrofluidisk kammer som inneholder en bakteriell suspensjon. Vi brukte denne metoden på kjemotaktisk bakterie, Vibrio ordalii, som aktivt kan klatre disse dynamiske kjemiske gradienter mens de spores av videomikroskopi. Aminosyrer, gjengitt biologisk inert ('bur') ved kjemisk modifikasjon med en fotoremovable beskyttende gruppe, er jevnt tilstede i suspensjonen, men ikke tilgjengelig for forbruk før deres plutselige utgivelse, som oppstår på brukerdefinerte punkter i tid og rom ved hjelp av en nær-UV-A fokusert LED-stråle. Antall molekyler som frigjøres i pulsen kan bestemmes av en kalibreringssammenheng mellom eksponeringstid og uncaging fraksjon, hvor absorpsjonsspekteret etter fotolyse er preget av bruk av UV-Vis spektroskopi. En nanoporøs polykarbonat (PCTE) membran kan integreres i mikrofluidisk enhet for å tillate kontinuerlig fjerning ved strømning av de uformede forbindelsene og de brukte mediene. Et sterkt, irreversibelt bånd mellom PCTE membranog PDMS mikrofluidisk struktur oppnås ved å dekke membranen med en løsning av 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) etterfulgt av plasmaaktivering av overflatene som skal bindes. Et datastyrt system kan generere brukerdefinerte sekvenser av pulser på forskjellige steder og med forskjellige intensiteter, for å skape ressurslandskap med foreskrevet romlig og tidsmessig variasjon. I hvert kjemisk landskap kan dynamikken i bakteriell bevegelse i den enkelte skala og deres akkumulering på befolkningsnivå oppnås, og dermed tillate kvantifisering av kjemotaktisk ytelse og dens effekter på bakterielle aggregasjoner i økologisk relevante miljøer.

Introduction

Mikrober stole på chemotaxis, prosessen med å oppdage kjemiske gradienter og modifisere motilitet som svar1, for å navigere kjemiske landskap, tilnærming næringskilder og verter, og unnslippe skadelige stoffer. Disse mikroskalaprosessene bestemmer makroskaleretikken til interaksjoner mellom mikrober og deres miljø2,3. Nylige fremskritt innen mikrofluidikk og mikrofabrikasjonsteknologier, inkludert myk litografi4,har revolusjonert vår evne til å skape kontrollerte mikromiljøer der vi kan studere mikrober. For eksempel har tidligere eksperimenter studert bakteriell chemotaxis ved å generere svært kontrollerte, stabile gradienter av mellomliggende til høye næringskonsentrasjoner5,6. Men i naturlige miljøer kan mikroskala kjemiske gradienter kortvarige – forsvant av molekylær diffusjon – og bakgrunnsforholdene er ofte svært fortynnede7. For å måle den kjemotaktiske responsen fra mikrobielle populasjoner som først ble utsatt for ustødige kjemiske miljøer, utviklet vi og her beskriver metoder for å kombinere mikrofluidisk teknologi med fotolyse, og dermed etterligne gradienter som ville bakterier møter i naturen.

Uncaging teknologi benytter lysfølsomme sonder som funksjonelt innkapsle biomolekyler i en inaktiv form. Bestråling frigjør burmolekylet, slik at målrettet perturbasjon av en biologisk prosess8. På grunn av den raske og presise kontrollen av cellulær kjemi som uncaging gir9,har fotolyse av burforbindelser tradisjonelt vært ansatt av biologer, fysiologer og nevrologer for å studere aktivering av gener10, ion kanaler11, og nevroner12. Mer nylig har forskere utnyttet de betydelige fordelene med fotolyse for å studere chemotaxis13, for å bestemme flagella bytte dynamikken i individuelle bakterielle celler utsatt for en trinnvis kjemoattractant stimulus14,15, og for å undersøke motilitetmønstre av enkelt sædceller i tredimensjonale (3D) gradienter16.

I vår tilnærming implementerer vi fotolyse av buraminosyrer i mikrofluidiske enheter for å studere atferdsresponsen til en bakteriell populasjon til kontrollerte kjemiske pulser, som blir nesten øyeblikkelig tilgjengelig gjennom fotoutgivelse. Bruk av et mål for lav forstørrelse (4x) (NA = 0,13, fokusdybde ca. 40 μm) gjør det mulig å både observasjonen av befolkningsnivået aggregativ respons av tusenvis av bakterier over et stort synsfelt (3,2 mm x 3,2 mm), og måling av bevegelse på encellenivå. Vi presenterer to anvendelser av denne metoden: 1) utgivelsen av en enkelt kjemisk puls for å studere bakteriell akkumulering-spredningsdynamikk fra ensartede forhold, og 2i) frigjøring av flere pulser for å karakterisere bakterieakkumuleringsdynamikken under tidsvarierende, romlig heterogene kjemoattractantforhold. Denne metoden har blitt testet på de marine bakteriene Vibrio ordalii utfører chemotaxis mot aminosyreglutamat17, men metoden er bredt anvendelig for ulike kombinasjoner av arter og kjemoattractanter, samt til biologiske prosesser utover chemotaxis (f.eks næringsopptak, antibiotikaeksponering, quorumssensing). Denne tilnærmingen lover å bidra til å belyse økologiog oppførsel av mikroorganismer i realistiske miljøer og å avdekke de skjulte avveiningene som individuelle bakterier står overfor når du navigerer flyktige dynamiske gradienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabrikasjon av mikrofluidisk enhet for enkelt kjemisk puls eksperiment

  1. Design kanalen ved hjelp av dataassistert design (CAD) programvare og skriv den ut på en gjennomsiktigfilm for å lage fotomasken (Figur 1A).
  2. Fremstille mesteren ved myk litografi (under rene rom).
    1. Rengjør en silisiumwafer (4 tommer) i rask rekkefølge med aceton, metanol og isopropanol, og tørk deretter ved hjelp av nitrogen. Stek waferen i ovnen ved 130 °C i 5 min.
    2. Plasser wafer en i midten av en spin-coater og hell SU-8 photoresist på wafer. Ramphastigheten på spin-coater opp til 500 rpm over 5 s, og holde på 500 rpm for 10 s. Rampe opp til den endelige hastigheten over 10 s og opprettholde med denne hastigheten for 30 s.
      MERK: Den nøyaktige verdien av den endelige hastigheten avhenger av den målrettede beleggtykkelsen og SU-8 som brukes.
    3. Etter spin-beleggprosessen, bake wafer ved 65 °C og deretter ved 95 °C. La wafer avkjøles ved romtemperatur (RT) i minst 5 min.
      MERK: Steketiden avhenger av den målrettede tykkelsen og typen fotoresist som brukes. Som en generell regel, for hvert 100 μm lag, skal wafer bakt i 5 min ved 65 °C og 45 min ved 95 °C.
    4. Plasser fotomasken på wafer for å sikre at bare interesseområdet blir eksponert og polymerisert. Utsett UV-lys for tiden som anbefales i SU-8-håndboken.
      MERK: Her, med eksponeringsenergi på 200 mJ cm-2 ved en bølgelengde på 350 nm, ble wafer en eksponert i 150 s.
    5. Stek waferen ved 65 °C og 95 °C for tiden som er anbefalt i SU-8-håndboken.
      MERK: Som en generell regel, for hvert 100 μm lag skal wafer bakt i 5 min ved 65 °C og 45 min ved 95 °C.
    6. Fordyp wafer i et beger fylt med polymetylmetakrylat (PMMA) utvikler for å få mesteren. Rist forsiktig begeret for å sikre at den upolymeriserte fotoresistens en vasking. Stek originalen ved 200 °C for å krysskoble SU-8-laget ytterligere.
  3. Forbered en polydimethylsiloxane (PDMS) blanding ved å kombinere elastomermed herdingsmiddelet (Materialtabell) med et 10:1-forhold i et beger (her, 40 ml). Bland kraftig til væsken er homogen.
    MERK: PDMS-blandingen vil se ugjennomsiktig ut fordi bobler genereres under blandeprosessen.
    FORSIKTIG: For å hindre at huden kommer i kontakt med potensielt farlige kjemikalier eller biologisk materiale, bruk alltid en laboratoriefrakk og engangshansker i hele protokollen og følg spesifikke sikkerhetsprotokoller i henhold til materialet Sikkerhetsdatablad (MSDS).
  4. Degas PDMS-blandingen i et vakuumkammer i 45 min ved RT. For å fremskynde prosessen, slipp periodisk vakuumet for å sprekke boblene som dannes i grensesnittet.
    MERK: Avgassingsprosessen må utføres innen 1 timer for å hindre at PDMS-blandingen begynner å kurere.
  5. Fjern støv fra overflaten av mesteren med en trykksatt rengjøringsmiddel, hell deretter den avgasserte PDMS-blandingen på mesteren og stek i ovnen ved 80 °C i 2 timer.
    MERK: Alternativt vil baking over natten (eller i minst 12 timer) ved 60 °C oppnå de samme herdede PDMS.
  6. Klipp PDMS med et blad rundt mikrostrukturene (i en avstand på ca. 5 mm) og fjern deretter PDMS forsiktig fra mesteren.
  7. Punch hull for å tjene som innløp og utløp av mikrokanalen (her, ett innløp og ett uttak, se figur 1A). Kontroller at ingenting berører bunnen av PDMS der funksjonene er plassert.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her. Mikrokanalen skal forsegles med tape for å hindre opphopning av støv og andre partikler under lagring.
  8. Lim PDMS-mikrokanalen til et glasslysbilde.
    1. Rengjør en glasssklie grundig med såpe, isopropanol og deionisert vann. La glasset gli tørt eller bruke trykkluft for å øke hastigheten på prosessen.
    2. Fjern støvpartikler ved å dabbing med tape. Lim PDMS mikrokanal på det rene glasslysbildet, umiddelbart etter behandling av begge overflater med plasma (ved hjelp av enten et koronasystem eller et plasmaoksygenkammer) i 2 min.
    3. Plasser den mikrofluidiske enheten for å varme på en kokeplate ved 80 °C i minst 1 t for å styrke det kjemiske båndet med glasset.

2. Fabrikasjon av den 3D-trykte Millifluidic Device for eksperimentet med flere pulser

  1. Design 3D-figuren ved hjelp av 3D-designprogramvare, og skriv ut originalen for PDMS-formen med en 3D-skriver med høy oppløsning (figur 1B).
    MERK: Se Materialtabell for 3D-skriveren og muggmaterialet som brukes til å lage originalen.
  2. Gjenta trinn 1.3−1.4, og rengjør deretter overflaten av mesteren ved å dabbing med tape. Sett mesteren på en skala, da, mens du unngår den sentrale regionen av master som vil bli okkupert av membranen, hell på den nøyaktige mengden av uherdet PDMS blanding (her, 23,4 g) for å oppnå ønsket høyde av PDMS ved å matche høyden på master (her, 0,5 mm). Fjern eventuelle gjenværende bobler ved hjelp av trykkluft.
  3. Plasser PDMS-oppleggslisten i en ovn ved 45 °C for å bake i minst 12 timer.
  4. Lim 3D PDMS-formen til en Petri-tallerken.
    1. Fjern forsiktig det herdede PDMS-laget og stanse innløps- og utløpshull for injeksjon av bakteriesuspensjonen (figur 1C).
    2. Aktiver både overflaten på en Petriskål (90 mm x 15 mm) og PDMS-formen med oksygenplasma i 2 min. Lim PDMS-formen på Petri-fatet. Trykk forsiktig på formen til Petri-fatet, men ikke trykk på hvor funksjonene er plassert, da dette kan kollapse avhørskammeret.
    3. Plasser Petri-fatet bundet til PDMS 3D-formen i en ovn ved 45 °C i minst 12 timer for å styrke det kjemiske båndet.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  5. Funksjonalisering av membranoverflaten18
    1. Aktiver nanoporøse polykarbonatmembranen (PCTE) i et oksygenplasmakammer i 1 min ved RT.
      FORSIKTIG: Unngå å bruke et koronasystem for plasmaaktivering fordi det vil skade membranen.
    2. Under en kjemisk hette, fortynn en kommersiell løsning av 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) i deionisert vann til 1% etter volum (her, 40 ml), ved hjelp av et polypropylenrør.
      FORSIKTIG: APTES-løsningen er akutt giftig (MSDS helsefarescore 3) og bør håndteres med ekstrem forsiktighet utelukkende under en kjemisk hette med hansker. Bytt hansker umiddelbart etter håndtering av APTES-oppløsning. APTES røyk er ødeleggende for slimhinnene og øvre luftveier. Målorganene til APTES er nerver, lever og nyre. Hvis en røykhette ikke er tilgjengelig, må et ansiktsskjold og åndedrettsvern i ansiktet implementeres.
    3. Overfør den fortynnede APTES-oppløsningen i en Petriskål og senk den aktiverte membranen i APTES-oppløsningen i 20 min.
    4. Fjern membranen fra APTES-løsningen med pinsett og plasser den på et rentromtørk for å tørke.
  6. For fabrikasjon av PDMS mikrofluidiske kanaler som vil ligge på membranen og tillate vasking av bakteriearenaen, gjenta trinn 1.1−1.7.
  7. Lim PDMS-vaskekanalene til den funksjonaliserte membranen.
    1. Aktiver både PDMS vaskekanal og PCTE membran med et oksygenplasmakammer i 2 min.
      MERK: Membranen, som vil bli klemt mellom to PDMS-lag, bør være mindre enn PDMS vaskekanal.
    2. Umiddelbart etter plasmabehandlingen, ta den funksjonaliserte membranen og PDMS-vaskekanalen i kontakt ved å trykke forsiktig pdms vaskekanalen på membranen.
      MERK: Ikke bruk for mye trykk på dette stadiet, fordi det kan føre til (irreversibel) feste av membranen til kanalens tak, blokkerer kanalen.
  8. Smør membranen mellom to PDMS-lag (figur 1E).
    1. Aktiver både den limte laminat PDMS vaskekanal−PCTE membranog 3D PDMS-formen som tidligere var bundet til Petri-fatet med et oksygenplasmakammer i 2 min. Ta dem i kontakt og trykk sammen.
    2. Plasser Petri-fatet bundet til sandwichstrukturen i en ovn ved 45 °C i minst 12 timer for å styrke det kjemiske båndet.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.

3. Cellekultur

  1. Vokse en populasjon av V. ordalii (stamme 12B09 eller 12B09pGFP) over natten for 20 timer i 2216 medium19 på en orbital shaker (600 rpm) ved 30 ° C og høste celler i sen-eksponentiell fase. For isolater som huser pGFP, tilsett spektrinmycin (50 μg ml-1)for å opprettholde plasmidet.
  2. Sentrifuge en 1 ml aliquot av celler ved 2500 x g i 3 min, fjern supernatant og re-suspendere cellene i 1 ml filtrert kunstig sjøvann. Gjenta dette trinnet.
  3. Sulte befolkningen i V. ordalii på en orbital shaker (600 rpm) ved 30 ° C for 3 timer.
  4. Forbered en lager kunstig sjøvannløsning på 10 mM (her, 1 ml) av 4-metoksy-7-nitroindolinyl-bur-L-glutamat (MNI-bur-L-glutamat) og lagre på -20 °C.
    MERK: Beskytt MNI-buret- L-glutamatoppløsningen mot omgivelseslys for å forhindre fotolyse.
  5. Fortynn cellene 50x ved å suspendere de sultede cellene i en kunstig sjøvannsløsning på 1 mM MNI-bur-L-glutamat.
    MERK: Dette vil sikre en endelig bakteriell konsentrasjon lavere enn 5 x 107 ml-1 (den nøyaktige verdien avhenger av den opprinnelige konsentrasjonen av celler i sen eksponentiell, som vanligvis er ~ 109 ml-1). Bakteriell konsentrasjon ble estimert ved hjelp av et spektrofotometer ved optisk tetthet (OD) på 600 nm.

4. Kalibrering av Uncaging-protokollen

  1. Plasser en dråpe (20 μL) av en kunstig sjøvannsoppløsning av MNI-bur-L-glutamat20 ved konsentrasjon C0 = 10 mM på et glasslysbilde. Kapsling av dråpeved å dekke den med et sirkulært PDMS-kammer (diameter d = 5 mm, høyde h = 250 μm).
  2. Plasser glasssklien på et mikroskopstadium og utsett hele kammeret i 20 ms til en LED-stråle med en bølgelengde på 395 nm (effekt 295 mW) ved hjelp av et 4x-mål (numerisk blenderåpning [NA] = 0,13).
  3. Åpne PDMS-kammeret og trekk ut en dråpe (1 μL) for analyse med et UV-Vis spektrometometer.
  4. Gjenta trinn 4.1−4.3 for ulike varigheter av LED-belysning på 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (eller til metning av den kjemiske reaksjonen) og 0 s (for å oppnå bakgrunnen). Replikere prosedyren trinn 4.1−4.4 minst 3x (her, 4x).
  5. Fra absorpsjonsspekteret, trekk ut verdien på 405 nm, som representerer toppen i absorpsjonsspekteret av burmolekylet21. Hvis du vil fastslå frekvensen k for den kjemiske uncaging reaksjonen ved LED-eksponering14,bruk følgende førsteordre kinetikkligning for den numeriske passformen til eksperimentelle data17
    Equation 1
    der C(t) er verdien av absorpsjonsspekteret av løsningen ved 405 nm (etter fjerning av bakgrunn) med en uncaging tid på t sekunder. For liten uncaging tid t slik at kt 1, Eq 1 kan forenkles til lineær formulering
    Equation 2

5. Enkelt kjemisk puls eksperiment

  1. Opprettholde den mikrofluidiske kanalen under vakuum i 20 min for å redusere gasskonsentrasjonen i PDMS slik at bobler er mindre sannsynlig å danne seg under fyllingsprosessen.
  2. Trekk ut kanalen fra vakuumpumpen og introduser umiddelbart den fortynnebakteriellesuspensjonen i 1 mM MNI-bur- L-glutamat i kunstig sjøvann i mikrokanalen forsiktig ved hjelp av en mikropipette for å unngå flagellarskade ved mekaniske skjærekrefter (her tok hele fyllingsprosessen 5-10 s). Etter å ha fylt kanalen med bakteriell suspensjon, suge oppløsningen i overkant med papirhåndkle, og tetning innløp og uttak med PDMS plugger ved å trykke dem forsiktig inn i hullene.
    MERK: På denne måten forhindres væskestrømmen i kammeret.
  3. Plasser mikrokanalen på et mikroskopstadium og flytt scenen for å angi visningsfeltet i midtkanal. Sett opp mikroskopet til å utføre bildebehandling i fasekontrast (4x mål) med en bildefrekvens på 12 fps.
    MERK: Denne verdien kan varieres, men bør ikke være mindre enn 10 fps for å tillate rekonstruksjon av bakteriebanene gjennom bildeanalyse (se protokollavsnitt 7).
  4. Sett pinhole av LED-strålen på minimum blenderåpning. Ved å sette eksponeringstiden for kameraet til 5 s, ta opp noen rammer for å oppnå nøyaktige målinger av den romlige plasseringen og størrelsen på LED-strålen.
    MERK: LED-lyskilden kobles til mikroskopets epifluorescensilluminator via væskelysføringstilkobling. LED-strålen påvirker ikke videoopptak, fordi videooppkjøp og LED-stimulering kommanderes uavhengig via programvare.
  5. Utfør kontinuerlig bildebehandling for en total varighet på 10 min (20 min for den største kjemiske pulsen), og aktiver samtidig den fokuserte LED-strålen på 395 nm for ønsket varighet (i dette eksperimentet, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) på et brukerdefinert tidspunkt (her, 10 s etter starten av videooppkjøpet) via mikroskopprogramvare. For å få flere replikeringer av samme prosess, flytt scenen for å registrere bakteriell respons over forskjellige posisjoner i den mikrofluidiske kanalen. Repliker denne prosedyren for hver pulsstørrelse ved hjelp av en ny mikrokanal.
    MERK: Den uforsonlige prosessen genererer en aksisymmetrisk sylindrisk puls som sprer radialt utover i bildeplanet.
  6. Utfør separate eksperimenter uten kjemisk uncaging ved høyere forstørrelse (20x mål, NA = 0,45) med en høyere bildefrekvens (50 fps) for å registrere bakterienes objektive svømmebevegelse.

6. Flere kjemisk-puls eksperiment

  1. Oppretthold det millifluidiske kammeret under vakuum i 20 min.
  2. Plasser Petri-fatet som inneholder det millifluidiske kammeret på et mikroskopstadium. Fyll kammeret under membranen med den fortynnede bakterielle suspensjonen (her tok hele fyllingsprosessen 10–15 s) av GFP-fluorescerende V. ordalii i 1 mM MNI-bur-L-glutamatløsning i kunstig sjøvann. Etter å ha fylt kanalen med bakteriell suspensjon, suge oppløsningen i overkant med papirhåndkle, og tetning innløp og uttak med PDMS plugger ved å trykke dem forsiktig inn i hullene.
    MERK: På denne måten forhindres væskestrømmen i kammeret. For å tillate bedre visualisering av bakterier i dette oppsettet hvor avbildningen oppstår gjennom nanoporøse membranen, anbefales det sterkt å bruke fluorescerende stammer i stedet for den ville typen (som brukes i det enkle kjemiske pulseksperimentet).
  3. Fyll en sprøyte med en kunstig sjøvannsløsning på1 mM MNI-bur- L-glutamat og fest slangen til innløpet og uttaket til vaskekanalen over membranen.
  4. Koble slangen til et avfallsreservoar og sørg for at slangen er helt nedsenket i væskeavfallsbeholderen for å unngå trykksvingninger.
  5. Still inn riktig strømningshastighet på sprøytepumpen (her, 50 μL min-1)for å oppnå ønsket gjennomsnittlig strømningshastighet i vaskekanalen, som avhenger av kanalgeometrien.
  6. Start sprøytepumpen for å etablere strømmen i vaskekanalen over membranen.
  7. Kjør programvaren som kontrollerer LED-strålen og mikroskopstadiet for å generere brukerdefinerte sekvenser av pulser på forskjellige steder og med forskjellige intensiteter.
    MERK: Den kontinuerlige strømmen av den kunstige sjøvannsløsningen av 1 mM MNI-bur-L-glutamat i vaskekanalen over membranen fyller opp den bursammensatte løsningen og vasker det brukte mediet fra bakteriearenaen.
  8. Ta opp video ved hjelp av en 4x målsetting med jevne mellomrom over en periode på flere timer og over flere sammenhengende steder for å dekke en stor overflate (her, 1 cm x 1 cm, Figur 1F).

7. Bildeanalyse og dataanalyse

  1. Rekonstruksjon av bakteriebanene
    1. Fra filmene som er tatt opp med 4x-målet, rekonstruerer du bakteriebanene ved hjelp av sporingsprogramvare17.
      MERK: Disse banene representerer 2D-projeksjonene til 3D-bakteriebevegelsen i mikrokanalen.
    2. Fra de rekonstruerte bakterielle banene, bestemme radial drift hastighet av hver svømmende person ved å projisere sin svømmehastighet over retning mot midten av den kjemiske pulsen (Figur 2D). For visualisering av spatio-temporal dynamikken i radial drift hastighet, bruk et binning rutenett med romlig størrelse 75 μm x 75 μm og temporal vindu av 5-10 s intervall(Figur 2D,E).
      MERK: På grunn av prosessens sylindriske symmetri kan data analyseres i polarkoordinater og i gjennomsnitt over vinkeldimensjonen (figur 3).
    3. Fra de rekonstruerte bakterielle banene, bestem spatio-temporal dynamikken i fordelingen av bakterier når de reagerer på de kjemiske pulsene (Figur 2E).
    4. Fra filmene med høyere oppløsning som er tatt opp med 20x-målet under single-pulse-eksperimentene, trekker ut fordelingen av svømmehastighet og kjøretid for bakteriepopulasjonen når de reagerer på den kjemiske pulsen (Figur 4).
  2. Estimer diffusjonskoeffisienten for bakterier ved å vurdere spredningsdynamikken til bakteriepopulasjonen etter at chemotaxis er fullført17 (her, for t > 300 s; Figur 3).
  3. Estimer diffusjonskoeffisienten for glutamat ved å bruke Stokes-Einstein-ligningen
    Equation 3
    der aminosyremolekylene antas å være sfæriske partikler med hydrodynamisk radius22rG, kB er Boltzmann konstant (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T er temperaturen (296 K), og η er den dynamiske viskositeten til det kunstige sjøvannet (saltinitet 36 g kg-1) ved 23 °C (10-3 Pa s)23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brukte mikrofluidiske og millifluidiske enheter (figur 1) til å studere bakterielle akkumuleringsprofiler under dynamiske næringsforhold. Bakterielle baner ble hentet fra innspilte videoer kjøpt av fasekontrastmikroskopi av akkumuleringsspredningsdynamikken til en bakteriell populasjon etter en kjemisk puls utgitt av fotolyse (figur 2 og figur 3). Ved å snitte millioner av baner ble den spatiotemporale dynamikken i radial drift hastighet og bakteriell konsentrasjon oppnådd. Statistikk som beskriver svømming i fravær av en kjemisk gradient ble oppnådd i separate eksperimenter med høyere romlig og timelig oppløsning (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Mikrofluidiske og millifluidiske enheter for bakterielle eksperimenter under dynamiske næringsforhold. (A) Fotomaske av den mikrofluidiske kanalen som brukes til å observere bakteriell akkumulering til en enkelt kjemisk puls. (B) Fotomaske av mikrofluidics kanalen som brukes til å vaske millifluidic bakteriell kammer for multi puls eksperimenter. De små prikkene er mikropillærer (200 μm i størrelse) som hjelper liming av membranen til PDMS, og samtidig bidra til å hindre membranen fra å knekke eller kollapse i midten. (C) Utformingen av 3D trykt master brukes til å lage bakteriekammeret. (D) PDMS-laget med mønster av bakteriekammeret. (E) Den komplette millifluidiske enheten (toppvisning, PCTE membran i hvitt). (F) Skjematisk av millifluidic enheten for generering av dynamiske næringsforhold (sidevisning). Optikkstrålediagrammet vises på undersiden av enheten, hvor en fiolett stråle (395 nm) utfører uncaging av kjemoattractant, mens en (uavhengig) blå stråle (470 nm) brukes til observasjon av fluorescerende bakterier (harboring pGFP) gjennom et sCMOS-kamera, som fanger bakteriell tetthet (nederste sentrum). Enheten er plassert på et motorisert stadium (nederst til høyre), som kan flyttes i x-y-flyet for å frigjøre kjemiske pulser ved brukerdefinerte posisjoner (kontrollert via NIS-programvare, nederst til venstre). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representative bakterielle responser på en kjemisk puls. - Jeg har ikke noe åsi. Maksimal intensitetprojeksjon som viser bakteriell posisjon (hvit) over et 0,5-s intervall, vist (A) umiddelbart etter, og (B) 40 s etter pulsutgivelsen (mål: 4x, NA = 0,13, Ph 2; videoopptak ved 12 fps). (C) Bakterielle baner (svart) vist 60 s etter pulsutgivelsen. Den skyggelagte regionen representerer den kjemiske pulsen utgitt av fotolyse på t = 0 s midt i synsfeltet (svart kors), som senere sprer seg. Baner ble rekonstruert ved hjelp av tilpasset intern programvare. -Jeg har ikke noe å si. Temporal dynamikk i radial drift hastighet (D) og av bakteriell konsentrasjon (E) etter en pulsutslipp i midten av synsfeltet. I panel D tilsvarer negative verdier av drivhastigheten (i blå farge) rettet kjemotaktisk bevegelse mot midten av pulsen. Dette tallet er endret etter Brumley et al.17. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Spatio-temporale profiler av radial drift hastighet og bakteriell konsentrasjon etter en kjemisk pulsutslipp. - Jeg har ikke noe åsi. Den radiale drivhastigheten (A) og bakteriekonsentrasjonen (B) som en funksjon av tid og avstand fra midten av en 35 μM glutamatpuls. I panel A tilsvarer negative verdier av drivhastigheten (i blå farge) rettet kjemotaktisk bevegelse mot midten av pulsen. Verdiene ble beregnet ved å gjennomsnitt over alle baner. Den svarte stiplede linjen på t = 250 s grovt delimits perioden med aktiv chemotaxis (blå skyggelegging i panel A, region I), hvoretter cellene diffuse isotropisk utover (grønn skyggelegging i panel A, region II). (C) Bakteriell konsentrasjon (omskalert over bakgrunnen B0) som en funksjon av avstand på t = 10, 30, 60 s etter etableringen av en diffus kjemisk puls. Bakterier aggregeres nær pulsstedet på grunn av chemotaxis. (D) Bakteriell konsentrasjon tar ~ 20 min å slappe av til bakgrunnen B0 ved bakteriell diffusjon. Innfeltviser passformen til diffusspremsingen med en diffusjonskoeffisient av DB = 165 μm2 s-1. Panel a, C og D har blitt endret fra Brumley et al.17. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Svømmestatistikk for en bakteriell populasjon i fravær av kjemiske gradienter. (A) Baner representerer de todimensjonale projeksjonene av den tredimensjonale bakterielle bevegelsen i mikrokanalen. Bakterielle baner ekstraheres ved hjelp av et tilpasset internt sporingsskript. Her indikerer det blå korset starten på sporet, og røde og grønne symboler indikerer reorienteringshendelser. Data ble registrert på 50 fps med en 20x mål, NA 0,45. (B) Sannsynlighetsfordeling av målt bakteriell svømmehastighet (svart) sammen med en gammafordelingspassform (blå). Fordi dybden av fokus når bildebehandling med en 20x mål (NA 0,45) er bare noen få mikron24,de registrerte banene er i hovedsak planar og målinger av svømmehastigheten er ikke partisk av projeksjonen. (C) Sannsynlighetsfordeling av tiden mellom påfølgende reorienteringer. Disse dataene var nødvendige for effektivt å kalibrere en individuell basert modell som tar hensyn til reorienteringsmønsteret, fordelingen av svømmehastighet og reorienteringsstatistikken til organismene. Dette tallet er endret fra Brumley et al.17. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metoden gjør det mulig for forskere å studere bakteriell chemotaxis under kontrollerte, dynamiske gradienter i mikro- og millifluidiske enheter, noe som muliggjør reproduserbar datainnsamling. Den nesten øyeblikkelige etableringen av kjemiske pulser på mikroskalaen ved fotolyse har som mål å reprodusere de typer næringspulser som bakterier møter i naturen fra en rekke kilder, for eksempel diffus spredning av plommer bak synkende marine partikler25,eller næringsstoffet sprer seg fra lysed planteplanktonceller26.

Vi presenterte to anvendelser av denne metoden: 1) frigjøring av en enkelt kjemisk puls for å studere bakteriell akkumulering-spredningsdynamikk fra ensartede forhold, og 2) frigjøring av flere pulser for å karakterisere bakterieakkumuleringsprofilene under ikke-likevektsnæringsforhold. Den første applikasjonen er spesielt egnet til å karakterisere de atferdsmessige reaksjonene til mikrober når du først møter en næringskilde. Under slike forhold, der konsentrasjonen av kjemoattractantmolekyler er ekstremt lav, domineres den tidlige fasen av chemotaxis av stokastisk binding-uforpliktende hendelser av kjemoattractantmolekyler til kjemoreseptorene17. Vår metode, ved raskt og presist slippe ut en kjent masse chemoattractant i en null-næringsbakgrunn, tilbyr betydelige fordeler over tidligere tilnærminger for å karakterisere bakteriell respons under dynamiske forhold27,28,29. Fordeler inkluderer å vite full fordeling av kjemoattractant på alle steder og til enhver tid (siden diffusiteten er kjent), og helt unngå generering av væskeflyt som er iboende forbundet med andre enheter, for eksempel mikroinjektoren27 eller tre-innløpgeometrier30.

I det andre programmet forekommer de kjemiske pulsene i et stort, kvasi-2D-domene i henhold til en brukerdefinert sekvens i rom og tid som er fullt tilpassbar via programvare, som kan brukes til å pålegge tilfeldige sekvenser eller bestemte mønstre. Viktigere, denne metoden gir en kraftig sammenheng mellom høy oppløsning atferdsdynamikk bakteriell chemotaxis og næringsopptak over tidsskalaer av sekunder og langsiktig dynamikk, som vekst og potensielt evolusjon. Bakteriearenaen er betydelig større enn det romlige utvalget av kjemisk interaksjon av bakteriene med en enkelt puls (fra hundrevis av mikrometer for de minste pulsene til noen få millimeter for de største pulsene). Nøkkelen til vedlikehold av en lav kjemisk bakgrunn (mye lavere enn konsentrasjonen av de kjemiske pulsene ved frigjøring) er inkluderingen av nanoporous PCTE membran klemt mellom de to PDMS lagene18. Ved å bruke en væskestrøm i den mikrofluidiske kanalen plassert på toppen av enheten, blir en kontinuerlig utvasking av de uvaskede forbindelsene og tilbrakt medium i bakteriearenaen realisert ved hjelp av molekylær diffusjon gjennom nanoporøse membran, uten å skape flyt i testdelen av enheten der bakterier er plassert (Figur 1).

Ved å modulere den fokuserte LED-strålen i tid, amplitude, størrelse og geometri, gir fotoutgivelsesteknologi eksperimentereren stor fleksibilitet til å generere ulike typer kjemiske miljøer. Samtidig, mens testene som presenteres her ble utført under quiescent forhold, kan vår metode utvides ytterligere for å teste bakteriell chemotaxis under forskjellige strømningskonfigurasjoner. Ved trofast å rekonstruere bakteriell akkumuleringdynamikk gjennom videomikroskopi, genererer vår metode store mengder data av høy kvalitet som kan brukes til å estimere statistikken over bakteriell atferd og det potensielle næringsopptaket av bakterielle celler. Vår eksperimentelle mikrofluidiske tilnærming, etterligne næringslandskap som bakterier kan møte under naturlige miljøforhold, tillater systematisk studie av den foraging atferd en mikrobiell arter som er avgjørende i sykling av næringsstoffer på makroskopisk skala2,3. Som sådan er typen data generert gjennom denne metoden nyttig for effektivt å kalibrere befolkningsopptaksrater og bedre utlede næringskinetikk i mesoscale økosystemmodeller.

Fabrikasjonen av PDMS-formene for å lage den store bakteriearenaen ble utført ved hjelp av en kommersiell 3D-utskriftstjeneste. Lignende resultater kan imidlertid oppnås ved hjelp av en high-end 3D-skriver internt, med en oppløsning på 50-100 μm som kreves for å løse de minste funksjonene i mikrokanaldesignene. En jevn overflate av det 3D-trykte materialet for PDMS-formen er nødvendig for å oppnå en god binding mellom støpte PDMS og de andre overflatene på enheten (dvs. glass, polystyren, PDMS). For vår applikasjon, bruk av en polystyren Petri parabolen (90 mm x 15 mm) som den nedre overflaten av 3D-arenaen presenterer to fordeler over bruk av et glass lysbilde som vanligvis ansatt i mikrofluidics studier: for det første reduserer det betydelig vedlegg av bakterielle celler sammenlignet med en glassoverflate (selv om vedlegg kan avhenge av de spesielle overflateegenskapene til mikroben under vurdering); for det andre, det gir sekundær inneslutning, som kan forhindre lekkasje av media over mikroskopi utstyr i tilfelle av søl. PDMS mold herding prosessen oppstår vanligvis ved høy temperatur (70-80 ° C), men i dette programmet eksperimentereren må bake PDMS mold ved en betydelig lavere temperatur (45 ° C i dagens tilfelle, se Tabell av materialer), under varmeavbøyning og smeltetemperaturen av materialet som brukes for 3D-utskrift av master. Den lavere steketemperaturen forlenger herdingsprosessen betydelig (over natten), men endrer ikke pdms mekaniske og kjemiske egenskaper betydelig.

Selv om vår metode har blitt brukt på en bestemt kombinasjon av bakterier og kjemoattractant, er metodikken egnet til å teste ulike biologiske prosesser, inkludert næringsopptak eller antibiotikaeksponering, og kan brukes på modellsystemer av forskjellige arter og kjemoattractanter, gitt at en myriade av molekyler har vært (eller kan)bur8. En potensiell begrensning oppstår fra kostnadene ved kommersielt tilgjengelige burforbindelser, men disse kostnadene er sammenlignbare med de som oppstår ved bruk av molekylære sonder som vanligvis brukes i biovitenskap for cellelevedyktighet, telling eller intracellulær farging. Til tross for denne potensielle begrensningen, kan den foreslåtte metodikken finne brede anvendelser på tvers av biofysiske og biomedisinske vitenskaper, for å karakterisere tidlige svar og tilpasningsdynamikk av mikrobielle populasjoner ved encellesoppløsning til dynamiske kjemiske gradienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker det første mikrofabrikasjonsanlegget på ETH Zürich. Dette arbeidet ble støttet av en Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (til D.R.B.), en Gordon og Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (til R.S.), og en Swiss National Science Foundation stipend 1-002745-000 (til R.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648 >98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube Greiner Bio-One 210261 50 ml
Centrifuge Eppendorf 5424R to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line VWR-CH 390-0384 to bake 3D master
Duster VWR-CH 16650-22 to clean the wafer and microchannels
Hot plate VWR-CH 444-0601 to bond the microchannels
Isopropanol Sigma-Aldrich W292907
LightSafe micro centrifuge tubes Sigma-Aldrich Z688312 1.5 ml
MATLAB Mathworks for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube Eppendorf 30120086 1.5 ml
Microscope glass slide VWR-CH 631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE Nikon Instruments MEA53100 with motorized stage
MNI-Glutamate Tocris Bioscience 1490 >98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment Stratasys Objet30 3D printer
Mold printing service 3D Printing Studios Custom https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W to calibrate the uncaging
NIS Elements Nikon Instruments Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line VWR-CH 466-3516 to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050 MicroChem Corp. SU8-3050
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane Sterlitech PCT0447100 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing Scientific Commodities BB31695-PE/2 I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish VWR-CH 25373-100 bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale VWR-CH 611-2605 to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla Oxford Instruments for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt Instant Ocean Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015 Dassault Systemes SolidWorks Used to design the mold
Spectra X light engine Lumencolor for LED 395 nm
Sylgard 184 Dow Corning 110-41-155 PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok) B Braun Omnifix 4616308F
Syringe Needle Agani A228 from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite Harvard Apparatus 70-4506 Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey Stratasys Dual Syringe Pump
Vortex-Genie Scientific Industries SI-0236 Mold Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Tags

Bioengineering Utgave 155 burforbindelser kjemiske pulser chemotaxis mikrobiell økologi mikrofluidikk motilitet fotolyse polykarbonatmembran
Generere kontrollerte, dynamiske kjemiske landskap for å studere mikrobiell atferd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carrara, F., Brumley, D. R., Hein,… More

Carrara, F., Brumley, D. R., Hein, A. M., Yawata, Y., Salek, M. M., Lee, K. S., Sliwerska, E., Levin, S. A., Stocker, R. Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior. J. Vis. Exp. (155), e60589, doi:10.3791/60589 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter