Summary
Se presenta un protocolo para la generación de paisajes químicos dinámicos por fotólisis dentro de configuraciones microfluídicas y milifluídicas. Esta metodología es adecuada para estudiar diversos procesos biológicos, incluyendo el comportamiento móvil, la acumulación de nutrientes o la adaptación a los productos químicos de los microorganismos, tanto a nivel de una sola célula como de población.
Abstract
Demostramos un método para la generación de pulsos químicos controlados y dinámicos, donde la quimioattractant localizada se vuelve repentinamente disponible a escala micropara crear microambientes para experimentos de quimiotaxis microbianos. Para crear pulsos químicos, desarrollamos un sistema para introducir fuentes de aminoácidos casi instantáneamente por fotólisis de aminoácidos enjaulados dentro de una cámara microfluida de polidimetilsiloxano (PDMS) que contiene una suspensión bacteriana. Aplicamos este método a la bacteria quimiotáctica, Vibrio ordalii,que puede escalar activamente estos degradados químicos dinámicos mientras se rastrea mediante microscopía de vídeo. Los aminoácidos, que se vuelven biológicamente inertes («enjaulados») por modificación química con un grupo protector fotoextraíble, están uniformemente presentes en la suspensión, pero no están disponibles para su consumo hasta su liberación repentina, que se produce en puntos definidos por el usuario en el tiempo y el espacio mediante un haz LED centrado cerca de los rayos UV-A. El número de moléculas liberadas en el pulso puede determinarse mediante una relación de calibración entre el tiempo de exposición y la fracción de desauno, donde el espectro de absorción después de la fotólisis se caracteriza por el uso de espectroscopia UV-Vis. Una membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) se puede integrar en el dispositivo microfluídico para permitir la eliminación continua por flujo de los compuestos no enjaulados y los medios gastados. Un enlace fuerte e irreversible entre la membrana PCTE y la estructura microfluídica PDMS se logra recubriendo la membrana con una solución de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguida de la activación plasmática de las superficies a unir. Un sistema controlado por ordenador puede generar secuencias de pulsos definidas por el usuario en diferentes ubicaciones y con diferentes intensidades, con el fin de crear paisajes de recursos con variabilidad espacial y temporal prescrita. En cada paisaje químico, se puede obtener la dinámica del movimiento bacteriano a escala individual y su acumulación a nivel de población, permitiendo así la cuantificación del rendimiento quimiotáctico y sus efectos en las agregaciones bacterianas en entornos ecológicamente relevantes.
Introduction
Los microbios se basan en la quimiotaxis, el proceso de detección de gradientes químicos y la modificación de la motilidad en la respuesta1,para navegar por paisajes químicos, acercarse a fuentes de nutrientes y huéspedes, y escapar de sustancias nocivas. Estos procesos a microescala determinan la cinética macroeconómica de las interacciones entre los microbios y su entorno2,3. Los recientes avances en microfluídicas y tecnologías de microfabricación, incluida la litografía blanda4,han revolucionado nuestra capacidad de crear microambientes controlados en los que estudiar las interacciones de los microbios. Por ejemplo, experimentos anteriores han estudiado la quimiotaxis bacteriana generando gradientes estables y altamente controlados de concentraciones de nutrientes intermedios a altos5,6. Sin embargo, en entornos naturales, los gradientes químicos a microescala pueden ser disipados de corta duración por difusión molecular, y las condiciones de fondo son a menudo altamente diluidas7. Para medir directamente la respuesta quimiotáctica de las poblaciones microbianas expuestas por primera vez a entornos químicos inestables, hemos ideado y aquí describimos métodos para combinar la tecnología microfluídica con la fotólisis, imitando así los gradientes que las bacterias silvestres encuentran en la naturaleza.
La tecnología de uncaging emplea sondas sensibles a la luz que encapsulan funcionalmente las biomoléculas de forma inactiva. La irradiación libera la molécula enjaulada, permitiendo la perturbación dirigida de un proceso biológico8. Debido al control rápido y preciso de la química celular que el uncaging ofrece9, la fotólisis de los compuestos enjaulados ha sido empleada tradicionalmente por biólogos, fisiólogos y neurocientíficos para estudiar la activación degenes 10,canales iónicos11y neuronas12. Más recientemente, los científicos han aprovechado las ventajas significativas de la fotólisis para estudiar la quimiotaxis13,para determinar la dinámica de conmutación de flagelos de células bacterianas individuales expuestas a un estímulo quimioatraer escalono14,15, e investigar patrones de motilidad de espermatozoides individuales en gradientes tridimensionales (3D)16.
En nuestro enfoque, implementamos la fotólisis de aminoácidos enjaulados dentro de dispositivos microfluídicos para estudiar la respuesta conductual de una población bacteriana a pulsos químicos controlados, que se vuelven casi instantáneamente disponibles a través de la fotoliberación. El uso de un objetivo de bajo aumento (4x) (NA a 0,13, profundidad de enfoque de aproximadamente 40 m) permite tanto la observación de la respuesta agregativa a nivel de población de miles de bacterias en un gran campo de visión (3,2 mm x 3,2 mm), como la medición del movimiento a nivel de una sola célula. Presentamos dos aplicaciones de este método: 1) la liberación de un solo pulso químico para estudiar la dinámica de acumulación bacteriana de disipación a partir de condiciones uniformes, y 2i) la liberación de múltiples pulsos para caracterizar la dinámica de acumulación bacteriana en condiciones de quimioatractorancias espacialmente heterogéneas que varían en el tiempo. Este método ha sido probado en las bacterias marinas Vibrio ordalii realizando quimiotaxis hacia el aminoácido glutamato17, pero el método es ampliamente aplicable a diferentes combinaciones de especies y quimioatractores, así como a procesos biológicos más allá de la quimiotaxis (por ejemplo, la aceptación de nutrientes, la exposición a antibióticos, la detección de quórum). Este enfoque promete ayudar a dilucidar la ecología y el comportamiento de los microorganismos en ambientes realistas y descubrir las compensaciones ocultas que enfrentan las bacterias individuales al navegar por gradientes dinámicos efímeros.
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Protocol
1. Fabricación del dispositivo microfluídico para el experimento de pulso químico único
- Diseñe el canal utilizando el software de diseño asistido por ordenador (CAD) e imprímalo en una película de transparencia para crear la máscara de foto(Figura 1A).
- Fabricar al maestro por litografía suave (en condiciones de sala limpia).
- Limpie una oblea de silicio (4 pulgadas) en rápida sucesión con acetona, metanol e isopropanol, luego seque con nitrógeno. Hornee la oblea en el horno a 130 oC durante 5 min.
- Coloque la oblea en el centro de un spin-coater y vierta su-8 fotorresistente en la oblea. Agujeree la velocidad del spin-coater hasta 500 rpm sobre 5 s, y manténgase a 500 rpm durante 10 s. Ramp hasta la velocidad final sobre 10 s y manténgalo a esta velocidad durante 30 s.
NOTA: El valor exacto de la velocidad final depende del espesor del recubrimiento específico y del SU-8 utilizado. - Después del proceso de recubrimiento de espín, hornee la oblea a 65 oC y luego a 95 oC. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante al menos 5 minutos.
NOTA: El tiempo de cocción depende del grosor específico y del tipo de fotorresistente utilizado. Como regla general, por cada capa de 100 m, la oblea debe ser horneada durante 5 min a 65 oC y 45 min a 95 oC. - Coloque la máscara fotográfica en la oblea para asegurarse de que sólo la región de interés está expuesta y polimerizada. Exponer a la luz UV durante el tiempo recomendado en el manual SU-8.
NOTA: Aquí, con una energía de exposición de 200 mJ cm-2 a una longitud de onda de 350 nm, la oblea se expuso durante 150 s. - Hornee la oblea a 65 oC y 95 oC durante el tiempo recomendado en el manual SU-8.
NOTA: Como regla general, por cada capa de 100 m, la oblea debe ser horneada durante 5 min a 65 oC y 45 min a 95 oC. - Sumerja la oblea en un vaso lleno de polimetilmetacrilato (PMMA) desarrollador con el fin de obtener el maestro. Agitar suavemente el vaso de precipitados para asegurarse de que el fotorresistente no polimerizado se lave. Hornee el maestro a 200 oC para cruzar aún más la capa SU-8.
- Preparar una mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS) combinando el elastómero con su agente de curado(Tabla de Materiales)en una proporción de 10:1 en un vaso de precipitados (aquí, 40 ml). Mezclar vigorosamente hasta que el líquido sea homogéneo.
NOTA: La mezcla pdmS se verá opaca porque se generan burbujas durante el proceso de mezcla.
ADVERTENCIA: Para evitar que la piel entre en contacto con productos químicos potencialmente peligrosos o material biológico, use siempre una capa de laboratorio y guantes de plástico desechables durante todo el protocolo y siga cualquier protocolo de seguridad específico de acuerdo con el Material Ficha de datos de seguridad (MSDS). - Desgasifique la mezcla PDMS en una cámara de vacío durante 45 min a RT. Para acelerar el proceso, libere periódicamente el vacío para reventar las burbujas que se forman en la interfaz.
NOTA: El proceso de desgasificación debe realizarse dentro de 1 h para evitar que la mezcla de PDMS comience a curarse. - Retire el polvo de la superficie del maestro con un limpiador presurizado, luego vierta la mezcla PDMS desgasificada sobre el maestro y hornee en un horno a 80 oC durante 2 h.
NOTA: Alternativamente, hornear durante la noche (o durante al menos 12 h) a 60 oC lograría el mismo PDMS endurecido. - Corte el PDMS con una hoja alrededor de las microestructuras (a una distancia de aproximadamente 5 mm) y luego pele cuidadosamente el PDMS del maestro.
- Perforar agujeros para servir como entrada y salida del microcanal (aquí, una entrada y una salida, véase la Figura 1A). Asegúrese de que nada toca la cara inferior del PDMS donde se encuentran las entidades.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. El microcanal debe sellarse con cinta adhesiva para evitar la acumulación de polvo y otras partículas durante el almacenamiento. - Enlace el microcanal PDMS a una diapositiva de vidrio.
- Limpie a fondo un portaobjetos de vidrio con jabón, isopropanol y agua desionizada. Deje que el vidrio se seque o utilice aire comprimido para acelerar el proceso.
- Retire las partículas de polvo mediante el corte con cinta adhesiva. Coloque el microcanal PDMS en el portaobjetos de vidrio limpio, inmediatamente después de tratar ambas superficies con plasma (mediante el uso de un sistema corona o una cámara de oxígeno de plasma) durante 2 min.
- Coloque el dispositivo microfluídico para calentar en una placa caliente a 80 oC durante al menos 1 h para fortalecer la unión química con el vidrio.
2. Fabricación del dispositivo millifluídico impreso en 3D para el experimento con múltiples pulsos
- Diseñe la forma 3D utilizando el software de diseño 3D e imprima el maestro para el molde PDMS con una impresora 3D de alta resolución(Figura 1B).
NOTA: Consulte Tabla de materiales para la impresora 3D y el material de molde utilizado para crear el maestro. - Repita los pasos 1.3 a 1.4 y, a continuación, limpie la superficie del maestro mediante el corte con cinta adhesiva. Poner el maestro en una escala, a continuación, evitando la región central del maestro que será ocupada por la membrana, verter en la cantidad exacta de mezcla PDMS no curada (aquí, 23,4 g) con el fin de obtener la altura deseada de PDMS haciendo coincidir la altura del maestro (aquí, 0,5 mm. Retire las burbujas restantes con la ayuda del aire comprimido.
- Coloque el PDMS fundido sobre el maestro en un horno a 45 oC para hornear durante al menos 12 h.
- Une el molde 3D PDMS a un plato Petri.
- Retire suavemente la capa de PDMS endurecida y golpee los orificios de entrada y salida para la inyección de la suspensión bacteriana(Figura 1C).
- Active tanto la superficie de una placa Petri (90 mm x 15 mm) como el molde PDMS con plasma de oxígeno durante 2 minutos Bond el molde PDMS en la placa Petri. Presione suavemente el molde a la placa Petri, pero no presione dónde se encuentran las características, ya que esto puede colapsar la cámara de interrogación.
- Coloque la placa Petri unida al molde PDMS 3D en un horno a 45 oC durante al menos 12 h para fortalecer la unión química.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
- Funcionalización de la superficie de la membrana18
- Active la membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) en una cámara de plasma de oxígeno durante 1 min a RT.
ADVERTENCIA: Evite el uso de un sistema corona para la activación plasmática, ya que dañará la membrana. - Bajo una campana química, diluir una solución comercial de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) en agua desionizada al 1% en volumen (aquí, 40 mL), mediante el uso de un tubo de polipropileno.
ADVERTENCIA: La solución APTES es agudamente tóxica (puntuación de peligro para la salud de mSDS 3) y debe manipularse con extremo cuidado exclusivamente bajo una campana química con guantes. Cambie los guantes inmediatamente después de manipular la solución APTES. Los humos de APTES son destructivos para las membranas mucosas y las vías respiratorias superiores. Los órganos diana de APTES son nervios, hígado y riñón. Si no hay una campana de humo sin disponibilidad, se debe implementar un protector facial y un respirador integral. - Transfiera la solución APTES diluida en una placa Petri y sumerja la membrana activada en la solución APTES durante 20 minutos.
- Retire la membrana de la solución APTES con pinzas y colóquela en una toallita de sala limpia para secarla.
- Active la membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) en una cámara de plasma de oxígeno durante 1 min a RT.
- Para la fabricación de los canales microfluídicos PDMS que se encuentran en la membrana y permiten el lavado de la arena bacteriana, repita los pasos 1.1-1.7.
- Unir los canales de lavado PDMS a la membrana funcionalizada.
- Active el canal de lavado PDMS y la membrana PCTE con una cámara de plasma de oxígeno durante 2 min.
NOTA: La membrana, que se intercalará entre dos capas de PDMS, debe ser más pequeña que el canal de lavado pdmS. - Inmediatamente después del tratamiento de plasma, ponga en contacto la membrana funcionalizada y el canal de lavado PDMS presionando suavemente el canal de lavado PDMS en la membrana.
NOTA: No aplique una presión excesiva en esta etapa, ya que podría causar (irreversible) la unión de la membrana al techo del canal, bloqueando el canal.
- Active el canal de lavado PDMS y la membrana PCTE con una cámara de plasma de oxígeno durante 2 min.
- Sandwich la membrana entre dos capas PDMS(Figura 1E).
- Active tanto la membrana PCTE del canal de lavado PDMS laminado unido como el molde 3D PDMS previamente unido a la placa Petri con una cámara de plasma de oxígeno durante 2 minutos.
- Colocar el plato Petri unido a la estructura del sándwich en un horno a 45 oC durante al menos 12 h para fortalecer el enlace químico.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
3. Cultivo celular
- Crecer una población de V. ordalii (cepa 12B09 o 12B09pGFP) durante la noche durante 20 h en 2216 medio19 en un agitador orbital (600 rpm) a 30 oC y cosechar células en fase exponencial tardía. Para los aislados que albergan pGFP, agregue la espectinomicina (50 g de ml-1) para mantener el plásmido.
- Centrifugar una alícuota de 1 ml de células a 2500 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de agua de mar artificial filtrada. Repita este paso.
- Matar de hambre la población de V. ordalii en un agitador orbital (600 rpm) a 30 oC durante 3 h.
- Preparar una solución de agua de mar artificial en stock de 10 mM (aquí, 1 mL) de 4-metoxi-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamato (MNI-caged- L-glutamato) y almacenar a -20 oC.
NOTA: Proteja la soluciónde MNI-enjaulado- L-glutamato de la luz ambiental para evitar la fotólisis. - Diluir las células 50x mediante la re-suspensión de las células hambrientas en una solución artificial de agua de mar de 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato.
NOTA: Esto asegurará una concentración bacteriana final inferior a 5 x 107 ml-1 (el valor exacto depende de la concentración inicial de las células en exponencial tardío, que suele ser de 109 ml-1). La concentración bacteriana se estimó utilizando un espectrofotómetro con densidad óptica (OD) de 600 nm.
4. Calibración del Protocolo de Uncaging
- Colocar una gota (20 l) de una solución artificial de agua de mar de MNI-enjaulado-L-glutamato20 a una concentración de C0 a 10 mM en un portaobjetos de vidrio. Encapsule la gota cubriéndola con una cámara PDMS circular (diámetro d a 5 mm, altura h a 250 m).
- Coloque el portaobjetos de vidrio en una etapa del microscopio y exponga toda la cámara durante 20 ms a un haz LED a una longitud de onda de 395 nm (potencia 295 mW) utilizando un objetivo 4x (apertura numérica [NA] a 0,13).
- Abra la cámara PDMS y extraiga una gota (1 l) para su análisis con un espectrofotómetro UV-Vis.
- Repita los pasos 4.1-4.3 para diferentes duraciones de iluminación LED de 0.1 s, 0.5 s, 2.5 s, 25 s, 250 s (o hasta la saturación de la reacción química) y 0 s (para obtener el fondo). Replicar los pasos del procedimiento 4.1 a 4.4 al menos 3veces (aquí, 4x).
- Del espectro de absorción, extraer el valor a 405 nm, que representan el pico en el espectro de absorción de la molécula de jaula21. Para determinar la tasa k de la reacción de desacondicionamiento químico por la exposición LED14,utilice la siguiente ecuación cinética de primer orden para el ajuste numérico de los datos experimentales17
donde C(t) es el valor del espectro de absorción de la solución a 405 nm (después de la eliminación de fondo) con un tiempo de desaparación de t segundos. Para un pequeño tiempo de desaparación t tal que kt 1, Eq. 1 se puede simplificar a la formulación lineal
5. Experimento de pulso químico único
- Mantenga el canal microfluídico al vacío durante 20 minutos para reducir la concentración de gas dentro del PDMS, de modo que las burbujas sean menos propensas a formarse durante el proceso de llenado.
- Extraiga el canal de la bomba de vacío e introduzca inmediatamente lasuspensión bacteriana diluida en 1 mM MNI-enjaulado- L-glutamato en agua de mar artificial en el microcanal suavemente usando un micropiqueta para evitar daños flageales por fuerzas de cizallamiento mecánicas (aquí, todo el proceso de llenado tomó 5-10 s). Después de llenar el canal con la suspensión bacteriana, succionar la solución en exceso con una toalla de papel, y sellar la entrada y la salida con tapones PDMS presionándolos suavemente en los orificios.
NOTA: De esta manera, se evita el flujo de fluido en la cámara. - Coloque el microcanal en una etapa del microscopio y mueva el escenario para establecer el campo de visión en el canal medio. Configure el microscopio para realizar imágenes en contraste de fase (objetivo 4x) a una velocidad de fotogramas de 12 fps.
NOTA: Este valor puede variar, pero no debe ser inferior a 10 fps para permitir la reconstrucción de las trayectorias bacterianas a través del análisis de imágenes (ver protocolo sección 7). - Ajuste el orificio del haz LED en la apertura mínima. Al ajustar el tiempo de exposición de la cámara a 5 s, grabe unos fotogramas para obtener mediciones precisas de la ubicación espacial y el tamaño del haz LED.
NOTA: La fuente de luz LED se conecta al iluminador de epifluorescencia del microscopio a través de una conexión de guía de luz líquida. El haz LED no afecta a la captura de vídeo, ya que la adquisición de vídeo y la estimulación LED se ordenan de forma independiente a través del software. - Realice imágenes continuas durante una duración total de 10 min (20 min para el pulso químico más grande) y active simultáneamente el haz LED enfocado a 395 nm durante la duración deseada (en este experimento, t a 20 ms, 100 ms, 500 ms) en un punto de tiempo definido por el usuario (aquí, 10 s después del inicio de la adquisición de vídeo) a través del software de microscopio. Para obtener múltiples réplicas del mismo proceso, mueva la etapa para registrar la respuesta bacteriana sobre diferentes posiciones del canal microfluídico. Replicar este procedimiento para cada tamaño de pulso, utilizando un nuevo microcanal.
NOTA: El proceso de desaparación genera un pulso cilíndrico axisimétrico que se difunde radialmente hacia afuera en el plano de imagen. - Llevar a cabo experimentos separados sin desafiamiento químico a mayor aumento (objetivo 20x, NA a 0,45) a una velocidad de fotogramas más alta (50 fps) para registrar el movimiento de natación imparcial de las bacterias.
6. Experimento de pulso químico múltiple
- Mantenga la cámara milifluida al vacío durante 20 minutos.
- Coloque el plato Petri que contiene la cámara milifluida en una etapa del microscopio. Llenar la cámara debajo de la membrana con la suspensión bacteriana diluida (aquí, todo el proceso de llenado tomó 10 x 15 s) de GFP-fluorescente V. ordalii en 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato solución en agua de mar artificial. Después de llenar el canal con la suspensión bacteriana, succionar la solución en exceso con una toalla de papel, y sellar la entrada y la salida con tapones PDMS presionándolos suavemente en los orificios.
NOTA: De esta manera, se evita el flujo de fluido en la cámara. Para permitir una mejor visualización de las bacterias en esta configuración donde la imagen se produce a través de la membrana nanoporosa, se recomienda encarecidamente utilizar cepas fluorescentes en lugar del tipo salvaje (como se utiliza en el experimento de pulso químico único). - Llene una jeringa con una solución artificial de agua de mar de 1 mM enjaulada porMNI-L-glutamato y conecte el tubo a la entrada y salida del canal de lavado por encima de la membrana.
- Conecte el tubo a un depósito de residuos y asegúrese de que el tubo esté completamente sumergido en el depósito de residuos de fluidos para evitar oscilaciones de presión.
- Ajuste el caudal adecuado en la bomba de la jeringa (aquí, 50 s min-1) para obtener el caudal medio deseado en el canal de lavado, que depende de la geometría del canal.
- Encienda la bomba de la jeringa para establecer el flujo en el canal de lavado por encima de la membrana.
- Ejecute el software que controla la fase de haz LED y microscopio para generar secuencias de pulsos definidas por el usuario en diferentes ubicaciones y con diferentes intensidades.
NOTA: El flujo continuo de la solución artificial de aguade mar de 1 mM MNI-enjaulado- L-glutamato en el canal de lavado por encima de la membrana repone la solución compuesta enjaulada y lava el medio gastado de la arena bacteriana. - Grabe vídeo utilizando un objetivo 4x a intervalos de tiempo regulares durante un período de varias horas y en múltiples ubicaciones contiguas para cubrir una superficie grande (aquí, 1 cm x 1 cm, Figura 1F).
7. Análisis de imágenes y análisis de datos
- Reconstrucción de las trayectorias bacterianas
- A partir de las películas grabadas con el objetivo 4x, reconstruir las trayectorias bacterianas utilizando el software de seguimiento17.
NOTA: Estas trayectorias representan las proyecciones 2D del movimiento bacteriano 3D en el microcanal. - A partir de las trayectorias bacterianas reconstruidas, determinar la velocidad de deriva radial de cada individuo nadando proyectando su velocidad de natación sobre la dirección hacia el centro del pulso químico(Figura 2D). Para la visualización de la dinámica espacio-temporal de la velocidad de deriva radial, utilice una cuadrícula de binning con un tamaño espacial de 75 m x 75 m y una ventana temporal de intervalo de 5 a 10 s(Figura 2D,E).
NOTA: Debido a la simetría cilíndrica del proceso, los datos se pueden analizar en coordenadas polares y promediar sobre la dimensión angular(Figura 3). - A partir de las trayectorias bacterianas reconstruidas, determinar la dinámica espacio-temporal de la distribución de bacterias a medida que responden a los pulsos químicos(Figura 2E).
- A partir de las películas de mayor resolución grabadas con el objetivo 20x durante los experimentos de un solo pulso, extraer la distribución de la velocidad de natación y el tiempo de ejecución para la población bacteriana a medida que responden al pulso químico(Figura 4).
- A partir de las películas grabadas con el objetivo 4x, reconstruir las trayectorias bacterianas utilizando el software de seguimiento17.
- Estimar el coeficiente de difusión de las bacterias considerando la dinámica de disipación de la población bacteriana después de que la quimiotaxis se complete17 (aquí, para t > 300 s; Figura 3).
- Estimar el coeficiente de difusión del glutamato aplicando la ecuación Stokes-Einstein
donde se supone que las moléculas de aminoácidos son partículas esféricas con radio hidrodinámico22rG, kB es la constante Boltzmann (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T es la temperatura (296 K), y es la viscosidad dinámica del agua de mar artificial (salinidad 36 g kg-1) a 23 oC (10-3 Pa s)
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Representative Results
Utilizamos los dispositivos microfluídicos y milifluidos(Figura 1)para estudiar perfiles de acumulación bacteriana en condiciones de nutrientes dinámicos. Las trayectorias bacterianas se extrajeron de los videos grabados adquiridos por microscopía de contraste de fase de la dinámica de acumulación-disipación de una población bacteriana después de un pulso químico liberado por la fotólisis(Figura 2 y Figura 3). Al promediar millones de trayectorias, se obtuvo la dinámica espaciotemporal de la velocidad de deriva radial y la concentración bacteriana. Las estadísticas que describen la natación en ausencia de un gradiente químico se obtuvieron en experimentos separados con mayor resolución espacial y temporal(Figura 4).
Figura 1: Dispositivos microfluídicos y milifluídicos para experimentos bacterianos en condiciones dinámicas de nutrientes. (A) Fotomáscara del canal microfluídico utilizada para observar la acumulación bacteriana en un solo pulso químico. (B) Fotomáscara del canal de microfluidos utilizado para lavar la cámara bacteriana milifluídica para los experimentos de pulsos múltiples. Los puntos pequeños son micropilares (200 m de tamaño) que ayudan a la unión de la membrana al PDMS, y al mismo tiempo ayudan a evitar que la membrana se desnude o se derrumbe en el centro. (C) Diseño del maestro impreso en 3D utilizado para crear la cámara bacteriana. (D) La capa PDMS con el patrón de la cámara bacteriana. (E) El dispositivo milifluídico completo (vista superior, membrana PCTE en blanco). (F) Esquema del dispositivo milifluido para la generación de condiciones dinámicas de nutrientes (vista lateral). El diagrama de rayos ópticos se muestra en la parte inferior del dispositivo, donde un haz violeta (395 nm) realiza el desacoplamiento del quimioatractor, mientras que un haz azul (independiente) (470 nm) se utiliza para la observación de bacterias fluorescentes (harboring pGFP) a través de una cámara sCMOS, que captura la densidad bacteriana (centro inferior). El dispositivo se coloca en una etapa motorizada (abajo a la derecha), que se puede mover en el plano x-y para liberar pulsos químicos en posiciones definidas por el usuario (controlado a través del software NIS, abajo a la izquierda). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Respuestas bacterianas representativas a un pulso químico. (A,B) Proyección de intensidad máxima que muestra la posición bacteriana (blanco) en un intervalo de 0,5 s, mostrado (A) inmediatamente después, y (B) 40 s después de la liberación del pulso (objetivo: 4x, NA a 0,13, Ph 2; grabación de vídeo a 12 fps). (C) Trayectorias bacterianas (negras) mostradas 60 s después de la liberación del pulso. La región sombreada representa el pulso químico liberado por la fotólisis en t a 0 s en el centro del campo de visión (cruz negra), que posteriormente se difunde. Las trayectorias fueron reconstruidas utilizando software interno personalizado. (D,E) Dinámica temporal de la velocidad de deriva radial (D) y de la concentración bacteriana (E) después de una liberación de pulso en el centro del campo de visión. En el panel D, los valores negativos de la velocidad de deriva (en color azul) corresponden al movimiento quimiotáctico dirigido hacia el centro del pulso. Esta cifra ha sido modificada después de Brumley et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfiles espacio-temporales de la velocidad de deriva radial y la concentración bacteriana después de una liberación de pulso químico. (A,B) La velocidad de deriva radial (A) y la concentración bacteriana (B) en función del tiempo y la distancia desde el centro de un pulso de glutamato de 35 m. En el panel A, los valores negativos de la velocidad de deriva (en color azul) corresponden al movimiento quimiotáctico dirigido hacia el centro del pulso. Los valores se calcularon promediando en todas las trayectorias. La línea discontinua negra en t a 250 s delimita aproximadamente el período de quimiotaxis activo (sombreado azul en el panel A, región I), después de lo cual las células se difunden isotrópicamente hacia afuera (sombreado verde en el panel A, región II). (C) Concentración bacteriana (redimensionada sobre el fondo B0) en función de la distancia a t a 10, 30, 60 s después de la creación de un pulso químico difusor. Las bacterias se agregan cerca del sitio del pulso debido a la quimiotaxis. (D) La concentración bacteriana tarda 20 minutos en relajarse en el fondo B0 por difusión bacteriana. El retén muestra el ajuste de la difusión difusa con un coeficiente de difusión de DB a 165 ám2 s-1. Los paneles A, C y D se han modificado de Brumley et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estadísticas de natación para una población bacteriana en ausencia de gradientes químicos. (A) Las trayectorias representan las proyecciones bidimensionales del movimiento bacteriano tridimensional en el microcanal. Las trayectorias bacterianas se extraen utilizando un script de seguimiento interno personalizado. Aquí la cruz azul indica el inicio de la pista, y los símbolos rojos y verdes indican eventos de reorientación. Los datos se registraron a 50 fps con un objetivo 20x, NA 0.45. (B) Distribución de probabilidad de la velocidad de natación bacteriana medida (negro) junto con un ajuste de distribución gamma (azul). Debido a que la profundidad de enfoque cuando la imagen con un objetivo 20x (NA 0.45) es sólo unas pocas micras24,las trayectorias grabadas son esencialmente planas y las mediciones de la velocidad de natación no están sesgadas por la proyección. (C) Distribución de probabilidad del tiempo entre reorientaciones sucesivas. Estos datos eran necesarios para calibrar eficazmente un modelo basado en individuos que tenga en cuenta el patrón de reorientación, la distribución de la velocidad de natación y las estadísticas de reorientación de los organismos. Esta cifra ha sido modificada de Brumley et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este método permite a los investigadores estudiar la quimiotaxis bacteriana bajo gradientes dinámicos controlados en dispositivos micro y milifluidos, lo que permite la adquisición de datos reproducibles. La creación casi instantánea de pulsos químicos a microescala por fotólisis tiene como objetivo reproducir los tipos de pulsos de nutrientes que las bacterias encuentran en la naturaleza a partir de una gama de fuentes, por ejemplo, la difusión difusa de plumas detrás del hundimiento de partículas marinas25,o la propagación de nutrientes de las células de fitoplancton lysed26.
Presentamos dos aplicaciones de este método: 1) la liberación de un solo pulso químico para estudiar la dinámica de acumulación bacteriana de disipación a partir de condiciones uniformes, y 2) la liberación de múltiples pulsos para caracterizar los perfiles de acumulación bacteriana en condiciones de nutrientes no de equilibrio. La primera aplicación es particularmente adecuada para caracterizar las respuestas conductuales de los microbios cuando se encuentra por primera vez con una fuente de nutrientes. En tales condiciones, en las que la concentración de moléculas quimioattractantes es extremadamente baja, la fase temprana de la quimiotaxis está dominada por los eventos estocásticos de unión y desvinculación de moléculas quimioatractoras a los quimiorreceptores17. Nuestro método, liberando rápida y precisamente una masa conocida de quimioatractor en un fondo de nutrientes cero, ofrece ventajas significativas sobre los enfoques anteriores para caracterizar la respuesta bacteriana en condiciones dinámicas27,28,29. Las ventajas incluyen conocer la distribución completa de quimioatractor en todos los lugares y en todo momento (ya que se conoce su difusividad), y evitar por completo la generación de flujo de fluido que está inherentemente asociado con otros dispositivos, como el microinyector27 o geometrías de tres entradas30.
En la segunda aplicación, los pulsos químicos se producen en un dominio grande, cuasi-2D de acuerdo con una secuencia definida por el usuario en el espacio y el tiempo que es totalmente personalizable a través de software, que se puede utilizar para imponer secuencias aleatorias o patrones particulares. Es importante destacar que este método proporciona un vínculo poderoso entre la dinámica conductual de alta resolución de la quimiotaxis bacteriana y la acumulación de nutrientes en escalas de tiempo de segundos y la dinámica a largo plazo, como el crecimiento y la potencial evolución. La arena bacteriana es considerablemente más grande (2 cm x 2 cm) que el rango espacial de interacción química de las bacterias con un solo pulso (de cientos de micrómetros para los pulsos más pequeños a unos pocos milímetros para los pulsos más grandes). La clave para el mantenimiento de un fondo químico bajo (mucho menor que la concentración de los pulsos químicos en su liberación) es la inclusión de la membrana pcTE nanoporosa intercalada entre las dos capas PDMS18. Mediante la aplicación de un flujo de fluido en el canal microfluídico colocado en la parte superior del dispositivo, un lavado continuo de los compuestos no enjaulados y medio gastado en la arena bacteriana se realiza por medio de la difusión molecular a través de la membrana nanoporosa, sin crear flujo en la sección de prueba del dispositivo donde se encuentran las bacterias(Figura 1).
Al modular el haz LED enfocado en el tiempo, la amplitud, el tamaño y la geometría, la tecnología de fotoliberación dota al experimentador de una gran flexibilidad para generar diferentes tipos de entornos químicos. Al mismo tiempo, mientras que las pruebas presentadas aquí se realizaron en condiciones de reposo, nuestro método se puede ampliar aún más para probar la quimiotaxis bacteriana bajo diferentes configuraciones de flujo. Al reconstruir fielmente la dinámica de acumulación bacteriana a través de la microscopía de vídeo, nuestro método genera grandes cantidades de datos de alta calidad que se pueden utilizar para estimar las estadísticas del comportamiento bacteriano y la posible acumulación de nutrientes por parte de las células bacterianas. Nuestro enfoque microfluídico experimental, imitando los paisajes de nutrientes que las bacterias podrían enfrentar en condiciones ambientales naturales, permite el estudio sistemático del comportamiento forrajista de especies microbianas que son esenciales en el ciclo de nutrientes a escala macroscópica2,3. Como tal, el tipo de datos generados a través de esta metodología es útil para calibrar eficazmente las tasas de absorción de la población y obtener mejor la cinética de nutrientes en los modelos de ecosistemas mesoescala.
La fabricación de los moldes PDMS para hacer la gran arena bacteriana se realizó utilizando un servicio comercial de impresión 3D. Sin embargo, se pueden lograr resultados similares utilizando una impresora 3D de gama alta en casa, con una resolución de 50 a 100 m necesaria para resolver las características más pequeñas de los diseños de microcanal. Se requiere una superficie lisa del material impreso en 3D para el molde PDMS para lograr una buena unión entre el CAST PDMS y las otras superficies del dispositivo (es decir, vidrio, poliestireno, PDMS). Para nuestra aplicación, el uso de una placa petri de poliestireno (90 mm x 15 mm) como superficie inferior de la arena 3D presenta dos ventajas sobre el uso de un portaobjetos de vidrio como comúnmente se emplea en estudios de microfluidos: en primer lugar, reduce considerablemente la unión de células bacterianas en comparación con una superficie de vidrio (aunque la unión puede depender de las propiedades particulares de la superficie del microbio considerado); en segundo lugar, proporciona contención secundaria, que puede evitar fugas de medios sobre equipos de microscopía en caso de derrames. El proceso de curado de moldes PDMS se produce típicamente a alta temperatura (70-80 oC), pero en esta aplicación el experimentador debe hornear el molde PDMS a una temperatura considerablemente más baja (45 oC en el caso actual, ver Tabla de materiales), por debajo de la desviación de calor y la temperatura de fusión del material utilizado para la impresión 3D del maestro. La temperatura de cocción más baja alarga considerablemente el proceso de curado (durante la noche), pero no cambia las propiedades mecánicas y químicas del PDMS.
Aunque nuestro método se ha aplicado a una combinación particular de bacterias y quimioatractores, la metodología es adecuada para probar diversos procesos biológicos, incluyendo la sugestión de nutrientes o la exposición a antibióticos, y se puede aplicar a sistemas modelo de diferentes especies y quimioatractores, dado que una miríada de moléculas han sido (o pueden ser) enjauladas8. Una posible limitación surge de los costos de los compuestos enjaulados disponibles comercialmente, pero estos costos son comparables a los incurridos cuando se utilizan las sondas moleculares normalmente empleadas en las ciencias de la vida para la viabilidad celular, el conteo o la tinción intracelular. A pesar de esta posible limitación, la metodología propuesta puede encontrar aplicaciones amplias en todas las ciencias biofísicas y biomédicas, para caracterizar las respuestas tempranas y la dinámica de adaptación de las poblaciones microbianas a resolución de una sola célula a gradientes químicos dinámicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen la primera instalación de microfabricación en ETH Zurich. Este trabajo fue apoyado por un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (a D.R.B.), un Premio de Investigador de la Iniciativa Microbiana De Gordon y Betty Moore GBMF3783 (a R.S.), y una beca de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias GBMF3783 (a R.S.), y una beca de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias GBMF3783 (a R.S.), y una beca de la Fundación Nacional suiza de Ciencias 1-002745-000 (a R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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