Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية الخاضعة للرقابة لدراسة السلوك الميكروبي

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/60589
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5, 1, 1, 1, 6, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتوليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية عن طريق الانحلال الضوئي داخل الاجهزة microfluidic وmillifluidic. هذه المنهجية مناسبة لدراسة العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك السلوك المتنوعة ، وامتصاص المغذيات ، أو التكيف مع المواد الكيميائية للكائنات الحية الدقيقة ، سواء على مستوى الخلية الواحدة أو السكان.

Abstract

نحن نُظهر طريقة لتوليد نبضات كيميائية ديناميكية خاضعة للرقابة - حيث يصبح attractant المترجم متاحًا فجأة على النطاق الصغير - لإنشاء بيئات صغيرة لتجارب chemotaxis الميكروبية. لإنشاء نبضات كيميائية ، قمنا بتطوير نظام لإدخال مصادر الأحماض الأمينية على الفور عن طريق التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل غرفة microfluidic polydimethylsiloxane (PDMS) التي تحتوي على تعليق بكتيري. طبقنا هذه الطريقة على البكتيريا الكيميائية ، Vibrio ordalii، والتي يمكن أن تتسلق بنشاط هذه التدرجات الكيميائية الديناميكية في حين يتم تعقبها عن طريق المجهر الفيديو. الأحماض الأمينية، التي قدمت خاملة بيولوجيا ('caged') عن طريق التعديل الكيميائي مع مجموعة حماية قابلة للإزالة الضوئية، موجودة بشكل موحد في التعليق ولكنها غير متوفرة للاستهلاك حتى إطلاقها المفاجئ، والذي يحدث في النقاط التي يحددها المستخدم في الزمان والمكان عن طريق شعاع LED مركز بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية A. يمكن تحديد عدد الجزيئات التي يتم إطلاقها في النبض من خلال علاقة معايرة بين وقت التعرض وكسر الكسر الغير مُقَدَّم، حيث يتميز طيف الامتصاص بعد التحليل الضوئي باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن دمج غشاء البولي المسامية النانوية (PCTE) في الجهاز الميكروسائلي للسماح بالإزالة المستمرة عن طريق تدفق المركبات غير المستقرة والوسائط المستهلكة. يتم تحقيق رابطة قوية لا رجعة فيها بين غشاء PCTE وبنية PDMS microfluidic عن طريق طلاء الغشاء مع محلول من 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) تليها تنشيط البلازما من الأسطح التي يتعين استعبادها. ويمكن للنظام الذي يتم التحكم فيه بالحاسوب أن يولد تسلسلات من النبضات يحددها المستخدم في مواقع مختلفة وبكثافة مختلفة، وذلك لخلق مناظر طبيعية للموارد ذات تغير مكاني وزمني مقرر. وفي كل مشهد كيميائي، يمكن الحصول على ديناميات الحركة البكتيرية على النطاق الفردي وتراكمها على مستوى السكان، مما يسمح بالقياس الكمي لأداء التكتيك الكيميائي وآثاره على التجمعات البكتيرية في البيئات ذات الصلة إيكولوجيا.

Introduction

تعتمد الميكروبات على chemotaxis ، وعملية الكشف عن التدرجات الكيميائية وتعديل الحركة في الاستجابة1، للتنقل في المناظر الطبيعية الكيميائية ، والاقتراب من مصادر المغذيات والمضيفين ، والهروب من المواد الضارة. هذه العمليات على نطاق صغير تحديد الحركية على نطاق كلي من التفاعلات بين الميكروبات وبيئتها2،3. وقد أحدثت التطورات الأخيرة في microfluidics وتقنيات microfabrication ، بما في ذلك الطباعة الحجرية لينة4، ثورة في قدرتنا على خلق البيئات الدقيقة التي تسيطر عليها لدراسة التفاعلات من الميكروبات. على سبيل المثال ، درست التجارب السابقة chemotaxis البكتيرية عن طريق توليد درجة عالية من التحكم ، وتدرجات مستقرة من تركيزات المغذيات المتوسطة إلى العالية5،6. ومع ذلك ، في البيئات الطبيعية ، يمكن أن تكون التدرجات الكيميائية على نطاق صغير قصيرة الأجل - تبدد عن طريق الانتشار الجزيئي - وظروف الخلفية غالبا ما تكون مخففة للغاية7. لقياس الاستجابة الكيميائية للمجموعات الميكروبية التي تعرضت لأول مرة لبيئات كيميائية غير مستقرة، ابتكرنا هنا ووصف طرقًا للجمع بين تقنية الموائع الدقيقة والتحلل الضوئي، وبالتالي محاكاة التدرجات التي تواجهها البكتيريا البرية في الطبيعة.

تستخدم تقنية Uncaging مسابر حساسة للضوء تغلف الجزيئات الحيوية وظيفياً في شكل غير نشط. التشعيع يطلق الجزيء في قفص، مما يسمح للاضطراب المستهدف من عملية بيولوجية8. بسبب السيطرة السريعة والدقيقة للكيمياء الخلوية التي uncaging يوفر9، وقد تم تقليديا استخدام التدليل الضوئي من المركبات القفص من قبل علماء الأحياء وعلم وظائف الأعضاء وعلماء الأعصاب لدراسة تفعيل الجينات10، قنوات أيون11، والخلايا العصبية12. في الآونة الأخيرة ، استفاد العلماء من المزايا الهامة للانطال الضوئي لدراسة chemotaxis13، لتحديد ديناميات تبديل flagella من الخلايا البكتيرية الفردية المعرضة لتحفيز chemoattractant خطوة خطوة14،15، والتحقيق في أنماط الحركة من الخلايا المنوية واحدة في ثلاثي الأبعاد (3D) التدرجات16.

في نهجنا ، نقوم بتنفيذ التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل الأجهزة microfluidic لدراسة الاستجابة السلوكية للسكان البكتيرية للنبضات الكيميائية التي تسيطر عليها ، والتي تصبح متاحة على الفور تقريبا من خلال الإفراج عن الصور. استخدام هدف التكبير المنخفض (4x) (NA = 0.13، عمق التركيز حوالي 40 ميكرومتر) يسمح لكل من مراقبة الاستجابة التجميعية على مستوى السكان لآلاف البكتيريا على مجال رؤية كبير (3.2 مم × 3.2 مم)، وقياس الحركة على مستوى الخلية الواحدة. نقدم تطبيقين لهذه الطريقة: 1) إطلاق نبضة كيميائية واحدة لدراسة ديناميات التراكم البكتيري-تبديد بدءاً من ظروف موحدة، و2)إطلاق نبضات متعددة لتوصيف ديناميات التراكم البكتيري في ظل ظروف جذب كيميائي متفاوتة زمنياً وغير متجانسة مكانياً. وقد تم اختبار هذه الطريقة على البكتيريا البحرية Vibrio ordalii أداء chemotaxis نحو الغلوتامات الأحماض الأمينية17، ولكن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على مجموعات مختلفة من الأنواع وchemoattractants ، وكذلك على العمليات البيولوجية وراء chemotaxis (على سبيل المثال ، امتصاص المواد الغذائية ، والتعرض للمضادات الحيوية ، واستشعار النصاب القانوني). يعد هذا النهج بالمساعدة في توضيح إيكولوجيا وسلوك الكائنات الحية الدقيقة في بيئات واقعية والكشف عن المفاضلات الخفية التي تواجهها البكتيريا الفردية عند التنقل في التدرجات الديناميكية الزائلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع جهاز Microfluidic لتجربة النبض الكيميائي واحد

  1. تصميم القناة باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وطباعتها على فيلم شفافية لإنشاء قناع الصورة(الشكل 1A).
  2. قم بتلفيق المعلم عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة (في ظل ظروف غرفة نظيفة).
    1. تنظيف رقاقة السيليكون (4 بوصة) في تعاقب سريع مع الأسيتون والميثانول والأيزوبروبانول، ثم تجف باستخدام النيتروجين. خبز رقاقة في الفرن على 130 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
    2. ضع الرقاقة في مركز مغطي الدوران واسكب SU-8 مقاوم للضوء على الرقاقة. منحدر سرعة الدوران معطف تصل إلى 500 دورة في الدقيقة أكثر من 5 s، والحفاظ على 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 s. منحدر تصل إلى السرعة النهائية أكثر من 10 s والحفاظ على هذه السرعة لمدة 30 s.
      ملاحظة: تعتمد القيمة الدقيقة للسرعة النهائية على سمك الطلاء المستهدف وSU-8 المستخدم.
    3. بعد عملية طلاء الدوران، اخبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية ثم عند درجة حرارة 95 درجة مئوية. اتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يعتمد وقت الخبز على السماكة المستهدفة ونوع مقاومة للضوء المستخدمة. وكقاعدة عامة، لكل طبقة 100 ميكرومتر يجب خبز الرقاقة لمدة 5 دقيقة عند 65 درجة مئوية و 45 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    4. ضع قناع الصورة على الرقاقة لضمان تعرض المنطقة ذات الاهتمام فقط وبلمرة. تعرض للضوء فوق البنفسجي للمرة الموصى بها في دليل SU-8.
      ملاحظة: هنا، مع طاقة التعرض من 200 mJ سم-2 في الطول الموجي من 350 نانومتر، وتعرض رقاقة لمدة 150 s.
    5. خبز رقاقة في 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية للوقت الموصى به في دليل SU-8.
      ملاحظة: كقاعدة عامة، لكل طبقة 100 ميكرومتر يجب خبز الرقاقة لمدة 5 دقيقة عند 65 درجة مئوية و45 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    6. تزج رقاقة في كوب مليئة بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) المطور من أجل الحصول على سيد. يهز بلطف الكأس لضمان أن يتم غسلها مقاومة ضوئيا غير بوليمر. خبز سيد في 200 درجة مئوية لمزيد من عبر ربط طبقة SU-8.
  3. إعداد خليط البوليديميثيلسيلوكسان (PDMS) عن طريق الجمع بين الإيلاتومي مع وكيل المعالجة(جدول المواد)بنسبة 10:1 في كوب (هنا، 40 مل). تخلط بقوة حتى السائل متجانسة.
    ملاحظة: سيبدو خليط PDMS معتمًا لأنه يتم إنشاء الفقاعات أثناء عملية الخلط.
    تنبيه: من أجل منع ملامسة الجلد للمواد الكيميائية أو البيولوجية التي يحتمل أن تكون خطرة، ارتدي دائمًا معطفالمختبر وقفازات بلاستيكية يمكن التخلص منها طوال البروتوكول واتبع أي بروتوكولات أمان محددة وفقًا للمادة ورقة بيانات السلامة (MSDS).
  4. Degas خليط PDMS في غرفة فراغ لمدة 45 دقيقة في RT. لتسريع العملية ، والإفراج عن فراغ بشكل دوري من أجل انفجار الفقاعات التي تشكل في واجهة.
    ملاحظة: يجب إجراء عملية إزالة الغازات في غضون ساعة واحدة لمنع خليط PDMS من البدء في العلاج.
  5. إزالة الغبار من سطح سيد مع منظف مضغوط، ثم صب خليط PDMS degassed على سيد وخبز في فرن في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، الخبز بين عشية وضحاها (أو لمدة 12 ساعة على الأقل) في 60 درجة مئوية من شأنه أن يحقق نفس PDMS تصلب.
  6. قطع PDMS مع شفرة حول الهياكل الدقيقة (على مسافة 5 ملم تقريبا) ومن ثم قشر بعناية PDMS من سيد.
  7. ثقوب لكمة لتكون بمثابة منفذ ومنفذ للmicrochannel (هنا، واحد ومنفذ واحد، انظر الشكل 1A). تأكد من عدم لمس أي شيء للوجه السفلي لـ PDMS حيث توجد الميزات.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يجب أن تكون القناة الدقيقة مختومة بشريط لاصق لمنع تراكم الغبار والجسيمات الأخرى أثناء التخزين.
  8. قم باربط قناة PDMS الصغيرة بشريحة زجاجية.
    1. تنظيف تماما شريحة زجاجية مع الصابون والأيزوبروبانول والماء deionized. دع الشريحة الزجاجية تجف أو استخدم الهواء المضغوط لتسريع العملية.
    2. إزالة جزيئات الغبار عن طريق الدابل مع شريط لاصق. السندات microchannel PDMS على الشريحة الزجاجية النظيفة، مباشرة بعد علاج كلا السطحين مع البلازما (باستخدام نظام الهالة أو غرفة الأكسجين البلازما) لمدة 2 دقيقة.
    3. ضع جهاز microfluidic لتسخين على لوحة ساخنة عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل لتقوية السندات الكيميائية مع الزجاج.

2. تصنيع جهاز ميليووسيك المطبوعة ثلاثية الأبعاد لتجربة نبضات متعددة

  1. تصميم شكل 3D باستخدام برنامج التصميم 3D وطباعة ماجستير لقالب PDMS مع طابعة ثلاثية الأبعاد عالية الدقة(الشكل 1B).
    ملاحظة: راجع جدول المواد للطابعة ثلاثية الأبعاد ومواد العفن المستخدمة لإنشاء الرئيسي.
  2. كرر الخطوات 1.3−1.4، ثم قم بتنظيف سطح المعلم عن طريق التداعب بشريط لاصق. وضع سيد على مقياس، ثم، مع تجنب المنطقة الوسطى من سيد التي سيتم شغلها من قبل الغشاء، صب على الكمية الدقيقة من خليط PDMS غير المعالجة (هنا، 23.4 غرام) من أجل الحصول على الارتفاع المطلوب من PDMS عن طريق مطابقة ارتفاع سيد (هنا، 0.5 ملم). إزالة أي فقاعات المتبقية مع مساعدة من الهواء المضغوط.
  3. وضع PDMS يلقي على سيد في فرن في 45 درجة مئوية لخبز لمدة 12 ساعة على الأقل.
  4. السندات قالب PDMS 3D إلى طبق بيتري.
    1. قشر بلطف قبالة طبقة PDMS تصلب وثقب فتحة ومنفذ ثقوب لحقن التعليق البكتيري(الشكل 1C).
    2. تنشيط كل من سطح طبق بيتري (90 ملم × 15 ملم) والعفن PDMS مع بلازما الأكسجين لمدة 2 دقيقة. السندات قالب PDMS على طبق بيتري. اضغط بلطف القالب إلى طبق بيتري، ولكن لا تضغط حيث توجد الميزات لأن هذا يمكن أن ينهار غرفة الاستجواب.
    3. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى قالب PDMS 3D في فرن عند 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
  5. وظيفة سطح الغشاء18
    1. تنشيط غشاء البولي (PCTE) المسامية النانوية في غرفة بلازما الأكسجين لمدة 1 دقيقة في RT.
      تنبيه: تجنب استخدام نظام الهالة لتنشيط البلازما لأنه سيضر الغشاء.
    2. تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، تمييع محلول تجاري من 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) في المياه المؤينة إلى 1٪ من حيث الحجم (هنا، 40 مل)، وذلك باستخدام أنبوب البولي بروبلين.
      تنبيه: إن محلول APTES سام بشكل حاد (درجة المخاطر الصحية MSDS 3) ويجب التعامل معه بعناية فائقة حصريًا تحت غطاء كيميائي مع قفازات. تغيير القفازات مباشرة بعد التعامل مع حل APTES. أبخرة APTES مدمرة للأغشية المخاطية والجهاز التنفسي العلوي. الأجهزة المستهدفة من APTES هي الأعصاب والكبد والكلى. إذا كان غطاء الدخان غير متوفر، يجب تنفيذ درع الوجه والتنفس كامل الوجه.
    3. نقل حل APTES المخفف في طبق بيتري وتزج الغشاء المنشط في حل APTES لمدة 20 دقيقة.
    4. إزالة الغشاء من حل APTES مع ملاقط ووضعه على مسح غرفة نظيفة لتجف.
  6. لتصنيع قنوات PDMS microfluidic التي سوف تقع على الغشاء والسماح بغسل الساحة البكتيرية، كرر الخطوات 1.1−1.7.
  7. السندات قنوات غسل PDMS إلى الغشاء وظيفية.
    1. تنشيط كل من قناة غسل PDMS وغشاء PCTE مع غرفة بلازما الأكسجين لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون الغشاء، الذي سيتم وضعبين طبقتين PDMS، أصغر من قناة غسيل PDMS.
    2. مباشرة بعد علاج البلازما، وجلب الغشاء الوظيفي وقناة الغسيل PDMS في اتصال عن طريق الضغط بلطف على قناة غسل PDMS على الغشاء.
      ملاحظة: لا تمارس ضغطًا مفرطًا في هذه المرحلة، لأنه قد يتسبب في إلحاق الغشاء (الذي لا رجعة فيه) بسقف القناة، مما يؤدي إلى سد القناة.
  8. ساندويتش الغشاء بين طبقتين PDMS(الشكل 1E).
    1. قم بتنشيط كل من قناة غسيل PDMS المعصفة - غشاء PCTE والعفن PDMS ثلاثي الأبعاد الذي تم استعباده سابقًا بطبق Petri مع غرفة بلازما أكسجين لمدة دقيقتين.
    2. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى هيكل شطيرة في فرن في 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

3- ثقافة الخلايا

  1. تنمو مجموعة من V. ordalii (سلالة 12B09 أو 12B09pGFP) بين عشية وضحاها لمدة 20 ساعة في 2216 المتوسطة19 على شاكر المداري (600 دورة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية وخلايا الحصاد في مرحلة أواخر الأسي. لعزل pGFP، إضافة spectinomycin (50 ميكروغرام مل-1)للحفاظ على البلازميد.
  2. الطرد المركزي 1 مل aliquot من الخلايا في 2500 × ز لمدة 3 دقيقة، وإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من مياه البحر الاصطناعية المصفاة. كرر هذه الخطوة.
  3. تجويع سكان V. ordalii على شاكر المداري (600 دورة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
  4. إعداد محلول مياه البحر الاصطناعي للمخزون من 10 مM (هنا، 1 مل) من 4-ميثوكسي-7-نيترويندولينيل-قفص-L-الغلوتامات (MNI-caged-L-الغلوتامات) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: حماية الحل MNI-قفص-L-الغلوتامات من الضوء المحيط لمنع تليسح ضوئي.
  5. تمييع الخلايا 50x عن طريق إعادة تعليق الخلايا الجائعة في محلولمياه البحر الاصطناعي من 1 MNI-قفص- L-الغلوتامات.
    ملاحظة: هذا سيضمن تركيز بكتيري نهائي أقل من 5 × 107 مل-1 (تعتمد القيمة الدقيقة على التركيز الأولي للخلايا في أواخر الأسي ، والذي عادة ما يكون ~ 109 مل-1). وقُدِّر التركيز البكتيري باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند الكثافة البصرية (OD) التي بلغت 600 نانومتر.

4 - معايرة بروتوكول التّهجية

  1. ضع قطرة (20 ميكرولتر) من محلول مياه البحر الاصطناعي من MNI-caged-L-الغلوتامات20 بتركيز C0 = 10 mM على شريحة زجاجية. قم بتغليف القطرات بتغطيتها بغرفة PDMS دائرية (قطرها d = 5 مم ، ارتفاع h = 250 ميكرومتر).
  2. ضع الشريحة الزجاجية على مرحلة المجهر واعرض الغرفة بأكملها لمدة 20 مللي ثانية لشعاع LED عند طول موجي 395 نانومتر (قوة 295 مليواط) باستخدام هدف 4x (الفتحة العددية [NA] = 0.13).
  3. افتح غرفة PDMS واستخرج قطرة (1 ميكرولتر) للتحليل باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
  4. كرر الخطوات 4.1−4.3 لفترات مختلفة من إضاءة LED من 0.1 s و 0.5 s و 2.5 s و 25 s و 250 s (أو حتى تشبع التفاعل الكيميائي) و 0 s (للحصول على الخلفية). نسخ الخطوات الإجراء 4.1−4.4 على الأقل 3x (هنا، 4x).
  5. من طيف الامتصاص ، استخرج القيمة عند 405 نانومتر ، والتي تمثل الذروة في طيف امتصاص جزيء القفص21. لتحديد معدل k من التفاعل الكيميائي uncaging من قبل التعرض LED14، استخدم معادلة الحركية من الدرجة الأولى التالية للاحتواء العددي للبيانات التجريبية17
    Equation 1
    حيث C(t)هو قيمة الطيف امتصاص الحل في 405 نانومتر (بعد إزالة الخلفية) مع وقت uncaging من t ثانية. لصغيرة uncaging الوقت ر مثل ذلك KT 1، Eq. 1 يمكن تبسيطها إلى صياغة خطية
    Equation 2

5. تجربة نبض كيميائي واحد

  1. الحفاظ على قناة microfluidic تحت فراغ لمدة 20 دقيقة للحد من تركيز الغاز داخل PDMS بحيث فقاعات أقل عرضة لتشكيل أثناء عملية التعبئة.
  2. استخراج القناة من مضخة فراغ وإدخال فورا تعليق البكتيريا المخفف في 1MNI MNI-قفص-L-الغلوتامات في مياه البحر الاصطناعية في microchannel بلطف باستخدام micropipette لتجنب الضرر flagellar بواسطة قوات القص الميكانيكية (هنا، استغرق عملية ملء كامل 5-10 ق). بعد ملء القناة مع تعليق البكتيرية، تمتص الحل الزائد مع منشفة ورقية، وختم فتحة ومنفذ مع المقابس PDMS عن طريق الضغط عليها بلطف في الثقوب.
    ملاحظة: بهذه الطريقة، يتم منع تدفق السوائل في الغرفة.
  3. ضع القناة الصغرى على مرحلة المجهر وحرك المسرح لتعيين مجال الرؤية في منتصف القناة. قم بإعداد المجهر لإجراء التصوير على تباين المرحلة (هدف 4x) بمعدل إطار 12 إطارًا في الثانية.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف هذه القيمة ولكن لا ينبغي أن تكون أقل من 10 إطارا في الثانية للسماح بإعادة بناء المسارات البكتيرية من خلال تحليل الصور (انظر البروتوكول القسم 7).
  4. تعيين الثقب من شعاع LED في فتحة الحد الأدنى. من خلال تعيين وقت التعرض للكاميرا إلى 5 s، سجل عدد قليل من الإطارات للحصول على قياسات دقيقة للموقع المكاني وحجم شعاع LED.
    ملاحظة: يتصل مصدر ضوء LED بمضيئة المجهر عبر اتصال دليل الضوء السائل. لا يؤثر شعاع LED على التقاط الفيديو ، لأن الحصول على الفيديو وتحفيز LED يتم أمرهما بشكل مستقل عبر البرامج.
  5. إجراء التصوير المستمر لمدة إجمالية قدرها 10 دقيقة (20 دقيقة لأكبر نبض ة كيميائية)، وفي وقت واحد تنشيط شعاع LED المركز عند 395 نانومتر للفترة المطلوبة (في هذه التجربة، t = 20 مللي ثانية، 100 مللي ثانية، 500 مللي ثانية) في نقطة زمنية محددة من قبل المستخدم (هنا، 10 ثانية بعد بدء اقتناء الفيديو) عبر برنامج المجهر. للحصول على نسخ متعددة من نفس العملية ، حرك المرحلة لتسجيل الاستجابة البكتيرية على مواقع مختلفة من القناة microfluidic. تكرار هذا الإجراء لكل حجم نبضة باستخدام قناة صغيرة جديدة.
    ملاحظة: تولد عملية uncaging نبضأسطواني محوري ينشر الراديإلى الخارج في مستوى التصوير.
  6. إجراء تجارب منفصلة دون uncaging الكيميائية في التكبير أعلى (20x الهدف، NA = 0.45) بمعدل إطار أعلى (50 إطارا في الثانية) لتسجيل حركة السباحة غير منحازة من البكتيريا.

6. تجربة متعددة النبض الكيميائي

  1. الحفاظ على غرفة مالية تحت فراغ لمدة 20 دقيقة.
  2. ضع طبق بيتري الذي يحتوي على غرفة المائع ة على خشبة المجهر. ملء الغرفة تحت الغشاء مع تعليق البكتيريا المخفف (هنا، استغرق عملية التعبئة بأكملها 10-15 ق) من GFP-الفلورسنت V. ordalii في 1 MM MNI-caged-L-الغلوتامات في مياه البحر الاصطناعية. بعد ملء القناة مع تعليق البكتيرية، تمتص الحل الزائد مع منشفة ورقية، وختم فتحة ومنفذ مع المقابس PDMS عن طريق الضغط عليها بلطف في الثقوب.
    ملاحظة: بهذه الطريقة، يتم منع تدفق السوائل في الغرفة. للسماح بتصور أفضل للبكتيريا في هذا الإعداد حيث يحدث التصوير من خلال الغشاء النانوي ، يوصى بشدة باستخدام سلالات الفلورسنت بدلاً من النوع البري (كما هو مستخدم في تجربة النبض الكيميائي الواحد).
  3. ملء حقنة مع محلول مياه البحر الاصطناعية من 1MNI MNI-caged-L-الغلوتامات وإرفاق أنابيب إلى منفذ ومنفذ قناة الغسيل فوق الغشاء.
  4. قم بتوصيل الأنابيب بخزان النفايات وتأكد من أن الأنابيب مغمورة بالكامل في خزان نفايات السوائل لتجنب تذبذبات الضغط.
  5. تعيين معدل التدفق المناسب على مضخة الحقنة (هنا، 50 ميكرولتر دقيقة-1)للحصول على متوسط معدل التدفق المطلوب في قناة الغسيل، والذي يعتمد على هندسة القناة.
  6. بدء مضخة حقنة لإنشاء تدفق في قناة الغسيل فوق الغشاء.
  7. تشغيل البرنامج الذي يتحكم في شعاع LED ومرحلة المجهر لتوليد تسلسل محدد من قبل المستخدم من النبضات في مواقع مختلفة وبكثافة مختلفة.
    ملاحظة: التدفق المستمر لمحلول مياه البحر الاصطناعية من 1MM MNI-caged-L-الغلوتامات في قناة الغسيل فوق الغشاء يجدد الحل المركب في قفص ويغسل المتوسط المستهلك من الساحة البكتيرية.
  8. تسجيل الفيديو باستخدام هدف 4x على فترات زمنية منتظمة على مدى عدة ساعات وعلى مواقع متجاورة متعددة لتغطية سطح كبير (هنا، 1 سم × 1 سم، الشكل 1F).

7- تحليل الصور وتحليل البيانات

  1. إعادة بناء المسارات البكتيرية
    1. من الأفلام المسجلة مع الهدف 4x، إعادة بناء المسارات البكتيرية باستخدام تتبع البرمجيات17.
      ملاحظة: تمثل هذه المسارات الإسقاطات 2D للحركة البكتيرية ثلاثية الأبعاد في القناة الدقيقة.
    2. من المسارات البكتيرية التي أعيد بناؤها ، حدد سرعة الانجراف الشعاعي لكل فرد سباحة من خلال إسقاط سرعة السباحة فوق الاتجاه نحو مركز النبض الكيميائي(الشكل 2D). لتصور الديناميات المكانية الزمانية لسرعة الانجراف الشعاعي، استخدم شبكة binning ذات الحجم المكاني 75 ميكرومتر × 75 ميكرومتر ونافذة زمنية من 5−10 s الفاصل الزمني(الشكل 2D،E).
      ملاحظة: بسبب التماثل الأسطواني للعملية، يمكن تحليل البيانات في إحداثيات قطبية ومتوسطها على البعد الزاوي(الشكل 3).
    3. من المسارات البكتيرية التي أعيد بناؤها ، وتحديد ديناميات المكانية والصدغية لتوزيع البكتيريا لأنها تستجيب للنبضات الكيميائية(الشكل 2هاء).
    4. من الأفلام عالية الدقة المسجلة مع هدف 20x خلال تجارب النبض الواحد ، استخراج توزيع سرعة السباحة ووقت التشغيل للسكان البكتيريين لأنها تستجيب للنبض الكيميائي(الشكل 4).
  2. تقدير معامل انتشار البكتيريا من خلال النظر في ديناميات تبديد السكان البكتيرية بعد الانتهاء من chemotaxis17 (هنا ، لt > 300 s ؛ الشكل 3).
  3. تقدير معامل انتشار الغلوتامات بتطبيق معادلة ستوكس-آينشتاين
    Equation 3
    حيث يفترض أن جزيئات الأحماض الأمينية هي جزيئات كروية ذات نصف قطر هيدروديناميكي22rG، kB هو ثابت بولتزمان (1.38 × 10 -23 م2 كجم s-2 K-1)، T هي درجة الحرارة (296 K) ، وهي اللزوجة الديناميكية لمياه البحر الاصطناعية (الملوحة 36g-1)عند 23 درجة مئوية (10-3 باسكال ق)23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمنا أجهزة الموائع الدقيقة والسائلة(الشكل 1)لدراسة ملامح التراكم البكتيري في ظل ظروف المغذيات الديناميكية. تم استخراج المسارات البكتيرية من مقاطع الفيديو المسجلة التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر على تباين المرحلة لديناميكيات تبديد التراكم للسكان البكتيريين بعد نبض كيميائي صدر عن التحليل الضوئي(الشكل 2 والشكل 3). وبمتوسط ملايين المسارات، تم الحصول على الديناميات الزمانية المكانية لسرعة الانجراف الشعاعي والتركيز البكتيري. تم الحصول على الإحصاءات التي تصف السباحة في غياب التدرج الكيميائي في تجارب منفصلة مع دقة مكانية وزمنية أعلى(الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: أجهزة ميكروفلويديك وميليوميك للتجارب البكتيرية في ظل ظروف المغذيات الديناميكية. (أ)قناع ضوئي للقناة microfluidic المستخدمة لمراقبة تراكم البكتيريا إلى نبضة كيميائية واحدة. (ب)قناع ضوئي لقناة microfluidics المستخدمة لغسل الغرفة البكتيرية المليمية للتجارب نبض متعددة. النقاط الصغيرة هي الركائز الدقيقة (200 ميكرومتر في الحجم) التي تساعد على ربط الغشاء بأجهزة PDMS ، وتساعد في الوقت نفسه على منع الغشاء من التواء أو الانهيار في المركز. (ج)تصميم الماجستير المطبوع ثلاثي الأبعاد المستخدم لإنشاء الغرفة البكتيرية. (د)طبقة PDMS مع نقش الغرفة البكتيرية. (E)الجهاز ميليووميوم كاملة (عرض أعلى، غشاء PCTE باللون الأبيض). (F)التخطيطي للجهاز ميليموتيك لتوليد الظروف الغذائية الحيوية (عرض الجانب). يظهر مخطط شعاع البصريات في الجزء السفلي من الجهاز ، حيث يقوم شعاع بنفسجي (395 نانومتر) بإزالة الاحتقان في الجذاب الكيميائي ، في حين يتم استخدام شعاع أزرق (مستقل) (470 نانومتر) لمراقبة البكتيريا الفلورية (التي تؤوي pGFP) من خلال كاميرا sCMOS ، والتي تلتقط الكثافة البكتيرية (أسفل المركز). يتم وضع الجهاز على مرحلة آلية (أسفل اليمين) ، والتي يمكن نقلها في الطائرة x-y لإطلاق النبضات الكيميائية في المواضع التي يحددها المستخدم (يتم التحكم فيها عبر برنامج NIS ، أسفل اليسار). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاستجابات البكتيرية التمثيلية للنبض الكيميائي. (A, B) أقصى قدر من الكثافة الإسقاط تظهر الموقف البكتيري (أبيض) على مدى 0.5 ق الفاصل الزمني، هو مبين(A)مباشرة بعد، و(B)40 ق بعد إطلاق النبض (الهدف: 4x، NA = 0.13، Ph 2؛ تسجيل الفيديو في 12 إطارا في الثانية). (C)المسارات البكتيرية (أسود) أظهرت 60 s بعد إطلاق النبض. تمثل المنطقة المعلّمة النبض الكيميائي الذي يطلقه الانحلال الضوئي عند t = 0 s في منتصف مجال الرؤية (الصليب الأسود) ، والذي ينتشر لاحقًا. أعيد بناء المسارات باستخدام البرمجيات المخصصة في المنزل. (د، هـ) الديناميات الزمنية لسرعة الانجراف الشعاعي(D)والتركيز البكتيري(E)بعد إطلاق النبض في وسط مجال الرؤية. في اللوحة D، تتوافق القيم السلبية لسرعة الانجراف (باللون الأزرق) مع الحركة الكيميائية الموجهة نحو مركز النبض. وقد تم تعديل هذا الرقم بعد بروملي وآخرون17. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الملامح المكانية - الزمنية لسرعة الانجراف الشعاعي والتركيز البكتيري بعد إطلاق النبض الكيميائي. (A, B) سرعة الانجراف الشعاعي(A)والتركيز البكتيري(B)كدالة للوقت والمسافة من مركز نبض الغلوتامات 35 ميكرومتر. في اللوحة A، تتوافق القيم السلبية لسرعة الانجراف (باللون الأزرق) مع الحركة الكيميائية الموجهة نحو مركز النبض. تم حساب القيم عن طريق المتوسط عبر جميع المسارات. الخط الأسود المتقطع عند t = 250 s يحد تقريبًا من فترة chemotaxis النشطة (اللمع الأزرق في اللوحة A ، المنطقة الأولى) ، وبعد ذلك تنتشر الخلايا متساوي الاستوائية إلى الخارج (اللمع الأخضر في اللوحة A ، المنطقة الثانية). (C)تركيز بكتيري (إعادة تحجيم على الخلفية B0)كدالة للمسافة عند t = 10، 30، 60 s بعد إنشاء نبض كيميائي منقول. البكتيريا تجميع قريبة من موقع النبض بسبب chemotaxis. (D)تركيز البكتيريا يستغرق ~ 20 دقيقة للاسترخاء إلى الخلفية B0 عن طريق الانتشار البكتيري. تظهر المجموعة نوبة الانتشار المنتشر مع معامل انتشار D B = 165 ميكرومتر2 s-1. تم تعديل الألواح A و C و D من Brumley et al.17. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إحصاءات السباحة للسكان البكتيريين في غياب التدرجات الكيميائية. (أ)تمثل المسارات الإسقاطات ثنائية الأبعاد للحركة البكتيرية ثلاثية الأبعاد في القناة الدقيقة. يتم استخراج المسارات البكتيرية باستخدام نص تتبع مخصص في المنزل. هنا يشير الصليب الأزرق إلى بداية المسار ، وتشير الرموز الحمراء والخضراء إلى أحداث إعادة التوجيه. تم تسجيل البيانات بمعدل 50 إطارًا في الثانية مع هدف 20x ، NA 0.45. (ب)التوزيع الاحتمالي لسرعة السباحة البكتيرية المقاسة (أسود) جنبا إلى جنب مع نوبة توزيع غاما (الأزرق). لأن عمق التركيز عند التصوير مع هدف 20x (NA 0.45) ليست سوى عدد قليل ميكرون24، والمسارات المسجلة هي أساسا planar والقياسات من سرعة السباحة ليست منحازة من قبل الإسقاط. (ج)التوزيع الاحتمالي للوقت بين عمليات إعادة التوجيه المتعاقبة. وكانت هذه البيانات مطلوبة لمعايرة نموذج فردي بشكل فعال يأخذ في الاعتبار نمط إعادة التوجيه، وتوزيع سرعة السباحة، وإحصاءات إعادة توجيه الكائنات الحية. وقد تم تعديل هذا الرقم من برومليوآخرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة الضريبة الكيميائية البكتيرية تحت التدرجات الديناميكية الخاضعة للرقابة في الأجهزة الدقيقة والسائلة، مما يتيح الحصول على بيانات قابلة للتكرار. يهدف الإنشاء شبه الفوري للنبضات الكيميائية على المقياس الدقيق عن طريق التحليل الضوئي إلى إعادة إنتاج أنواع البقول الغذائية التي تواجهها البكتيريا في البرية من مجموعة من المصادر ، على سبيل المثال ، الانتشار المختلف للأعمدة وراء الجسيمات البحرية الغارقة25، أو انتشار العناصر الغذائية من خلايا العوالق النباتية26.

قدمنا تطبيقين لهذه الطريقة: 1) إطلاق نبضة كيميائية واحدة لدراسة ديناميات التراكم البكتيري -تبديد بدءا من ظروف موحدة، و 2) إطلاق نبضات متعددة لتوصيف ملامح التراكم البكتيري في ظل الظروف الغذائية غير التوازن. التطبيق الأول مناسب بشكل خاص لتوصيف الاستجابات السلوكية للميكروبات عند مواجهة مصدر المغذيات لأول مرة. في ظل هذه الظروف ، حيث تركيز جزيئات attractant منخفض للغاية ، تهيمن المرحلة المبكرة من chemotaxis من خلال الأحداث العشوائية الملزمة غير الملزمة لجزيئات attractant الكيميائي إلى المستقبلات الكيميائية17. طريقتنا، من خلال الإفراج بسرعة وبدقة كتلة معروفة من chemoattractant في خلفية صفر المغذيات، ويقدم مزايا كبيرة على النهج السابقة لتوصيف الاستجابة البكتيرية في ظل الظروف الديناميكية27،28،29. وتشمل المزايا معرفة التوزيع الكامل للchemoattractant في جميع المواقع وفي جميع الأوقات (منذ diffusivity معروفة)، وتجنب تماما توليد تدفق السوائل التي ترتبط بطبيعتها مع الأجهزة الأخرى، مثل الميكروحقن27 أو ثلاثة مدخل الهندسة30.

في التطبيق الثاني ، تحدث النبضات الكيميائية في نطاق كبير شبه 2D وفقًا لتسلسل محدد من قبل المستخدم في المكان والزمان قابل للتخصيص بالكامل عبر البرامج ، والتي يمكن استخدامها لفرض تسلسل عشوائي أو أنماط معينة. والأهم من ذلك، توفر هذه الطريقة صلة قوية بين الديناميكيات السلوكية عالية الدقة من chemotaxis البكتيرية وامتصاص المغذيات على الجداول الزمنية من الثواني والديناميات على المدى الطويل، مثل النمو والتطور المحتمل. الساحة البكتيرية أكبر بكثير (2 سم × 2 سم) من النطاق المكاني للتفاعل الكيميائي للبكتيريا مع نبض واحد (من مئات ميكرومترات لأصغر البقول إلى بضعة ملليمترات لأكبر النبضات). مفتاح الحفاظ على خلفية كيميائية منخفضة (أقل بكثير من تركيز النبضات الكيميائية عند إطلاقها) هو إدراج غشاء PCTE المسامية المنموحة بين طبقتي PDMS18. من خلال تطبيق تدفق السوائل في قناة microfluidic وضعت في الجزء العلوي من الجهاز، ويتحقق غسل مستمر من المركبات غير المالموحدة وتنفق المتوسطة في الساحة البكتيرية عن طريق الانتشار الجزيئي من خلال غشاء النانوالمسامية، دون خلق تدفق في قسم الاختبار من الجهاز حيث توجد البكتيريا(الشكل 1).

من خلال تحوير شعاع LED المركز في الوقت والسعة والحجم والهندسة ، تمنح تقنية الالتقاط الضوئي المجرب مرونة كبيرة لتوليد أنواع مختلفة من البيئات الكيميائية. في الوقت نفسه ، في حين أن الاختبارات المقدمة هنا أجريت في ظل ظروف هادئة ، يمكن توسيع طريقتنا لاختبار chemotaxis البكتيرية تحت تكوينات تدفق مختلفة. من خلال إعادة بناء ديناميات التراكم البكتيري بأمانة من خلال المجهر الفيديو، لدينا طريقة يولد كميات كبيرة من البيانات ذات جودة عالية التي يمكن استخدامها لتقدير إحصاءات السلوك البكتيري وامتصاص المغذيات المحتملة من قبل الخلايا البكتيرية. نهجنا microfluidic التجريبية، ومحاكاة المناظر الطبيعية الغذائية التي قد تواجه البكتيريا في ظل الظروف البيئية الطبيعية، يسمح بدراسة منهجية لسلوك الأعلاف من الأنواع الميكروبية التي تعتبر ضرورية في ركوب الدراجات من المواد الغذائية على مقياس العيانية2،3. وعلى هذا النحو، فإن نوع البيانات المتولدة من خلال هذه المنهجية مفيد لمعايرة معدلات امتصاص السكان على نحو فعال واستخلاص حركية المغذيات على نحو أفضل في نماذج النظم الإيكولوجية المتوسطة الحجم.

تم تنفيذ تصنيع قوالب PDMS لجعل الساحة البكتيرية الكبيرة باستخدام خدمة الطباعة 3D التجارية. ومع ذلك، يمكن تحقيق نتائج مماثلة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد عالية الأبعاد في المنزل، مع دقة 50-100 ميكرومتر مطلوبة لحل أصغر ميزات تصاميم القنوات الدقيقة. مطلوب سطح أملس من المواد المطبوعة 3D لقالب PDMS لتحقيق الترابط جيدة بين PDMS المدلى بها والأسطح الأخرى من الجهاز (أي الزجاج، البوليسترين، PDMS). لتطبيقنا ، فإن استخدام طبق البوليسترين بيتري (90 مم × 15 مم) كسطح أقل من الساحة ثلاثية الأبعاد يقدم ميزتين على استخدام شريحة زجاجية كما هو مستخدم شائع في دراسات microfluidics: أولاً ، يقلل بشكل كبير من ارتباط الخلايا البكتيرية مقارنة بسطح زجاجي (على الرغم من أن التعلق قد يعتمد على خصائص سطح معينة للميكروب قيد النظر) ؛ ثانياً، يوفر الاحتواء الثانوي، الذي يمكن أن يمنع تسرب الوسائط عبر معدات الفحص المجهري في حالة الانسكابات. عادة ما تحدث عملية علاج العفن PDMS في درجة حرارة عالية (70-80 درجة مئوية)، ولكن في هذا التطبيق يجب على المجرب خبز قالب PDMS في درجة حرارة أقل بكثير (45 درجة مئوية في الحالة الحالية، انظر جدول المواد)،تحت انحراف الحرارة ودرجة حرارة ذوبان المواد المستخدمة للطباعة ثلاثية الأبعاد للسيد. انخفاض درجة حرارة الخبز يطيل إلى حد كبير عملية المعالجة (بين عشية وضحاها)، ولكن لا يغير الخصائص الميكانيكية والكيميائية للPDMS.

على الرغم من أن طريقتنا قد طبقت على مزيج معين واحد من البكتيريا وchemoattractant، والمنهجية هي مناسبة لاختبار العمليات البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك امتصاص المواد الغذائية أو التعرض للمضادات الحيوية، ويمكن تطبيقها على النظم النموذجية من الأنواع المختلفة وعوامل جذب الكيماوي، نظرا لأن عددا لا يحصى من الجزيئات قد تم (أو يمكن أن يكون) في قفص8. ينشأ أحد القيود المحتملة من تكاليف المركبات القفصية المتاحة تجاريًا ، ولكن هذه التكاليف مماثلة لتلك التي يتم تكبدها عند استخدام المسابير الجزيئية المستخدمة عادة في علوم الحياة لصلاحية الخلية أو العد أو تلطيخ هاوية الخلية. وعلى الرغم من هذا القيد المحتمل، قد تجد المنهجية المقترحة تطبيقات واسعة النطاق عبر العلوم البيوفيزيائية والطبية الحيوية، لتوصيف الاستجابات المبكرة وديناميات التكيف للمجموعات الميكروبية في الاستبانة وحيدة للخلايا إلى التدرجات الكيميائية الدينامية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون أول منشأة تصنيع صغيرة في ETH Zurich. تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي اكتشاف في وقت مبكر جائزة الباحث الوظيفي DE180100911 (إلى D.R.B.)، وغوردون وبيتي مور جائزة المحققين مبادرة الميكروبات البحرية GBMF3783 (إلى R.S.)، ومنحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم 1-002745-000 (إلى R.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648 >98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube Greiner Bio-One 210261 50 ml
Centrifuge Eppendorf 5424R to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line VWR-CH 390-0384 to bake 3D master
Duster VWR-CH 16650-22 to clean the wafer and microchannels
Hot plate VWR-CH 444-0601 to bond the microchannels
Isopropanol Sigma-Aldrich W292907
LightSafe micro centrifuge tubes Sigma-Aldrich Z688312 1.5 ml
MATLAB Mathworks for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube Eppendorf 30120086 1.5 ml
Microscope glass slide VWR-CH 631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE Nikon Instruments MEA53100 with motorized stage
MNI-Glutamate Tocris Bioscience 1490 >98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment Stratasys Objet30 3D printer
Mold printing service 3D Printing Studios Custom https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W to calibrate the uncaging
NIS Elements Nikon Instruments Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line VWR-CH 466-3516 to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050 MicroChem Corp. SU8-3050
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane Sterlitech PCT0447100 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing Scientific Commodities BB31695-PE/2 I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish VWR-CH 25373-100 bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale VWR-CH 611-2605 to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla Oxford Instruments for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt Instant Ocean Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015 Dassault Systemes SolidWorks Used to design the mold
Spectra X light engine Lumencolor for LED 395 nm
Sylgard 184 Dow Corning 110-41-155 PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok) B Braun Omnifix 4616308F
Syringe Needle Agani A228 from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite Harvard Apparatus 70-4506 Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey Stratasys Dual Syringe Pump
Vortex-Genie Scientific Industries SI-0236 Mold Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 155، المركبات القفصية، البقول الكيميائية، chemotaxis، الإيكولوجيا الميكروبية، microfluidics، حركية، تحلل ضوئي، غشاء البولي
توليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية الخاضعة للرقابة لدراسة السلوك الميكروبي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carrara, F., Brumley, D. R., Hein,… More

Carrara, F., Brumley, D. R., Hein, A. M., Yawata, Y., Salek, M. M., Lee, K. S., Sliwerska, E., Levin, S. A., Stocker, R. Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior. J. Vis. Exp. (155), e60589, doi:10.3791/60589 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter