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Bioengineering

माइक्रोबियल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए नियंत्रित, गतिशील रासायनिक परिदृश्य पैदा करना

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/60589
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5, 1, 1, 1, 6, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

Summary

माइक्रोफ्लूइडिक और मिलीफ्लूइडिक सेटअप के भीतर फोटोलिसिस द्वारा गतिशील रासायनिक परिदृश्य की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। यह पद्धति विविध जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जिसमें एकल कोशिका और जनसंख्या स्तर दोनों पर गतिशील व्यवहार, पोषक तत्व तेज या सूक्ष्मजीवों के रसायनों के अनुकूलन शामिल हैं।

Abstract

हम नियंत्रित, गतिशील रासायनिक दालों की पीढ़ी के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं- जहां स्थानीयकृत रसायनीय माइक्रोस्केल पर अचानक उपलब्ध हो जाता है- माइक्रोबियल कीमोटैक्सिस प्रयोगों के लिए सूक्ष्म वातावरण बनाने के लिए। रासायनिक दालों को बनाने के लिए, हमने बैक्टीरियल निलंबन वाले पॉलीडिमिथाइलसिलिऑक्सेन (पीडीएम) माइक्रोफ्लूइडिक कक्ष के भीतर बंदी अमीनो एसिड के फोटोलिसिस द्वारा अमीनो एसिड स्रोतों को तुरंत शुरू करने के लिए एक प्रणाली विकसित की। हमने इस विधि को कीमोटैक्टिक जीवाणु, विब्रियो ऑर्डलीमें लागू किया, जो वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्रैक किए जाने के दौरान सक्रिय रूप से इन गतिशील रासायनिक ढाल पर चढ़ सकता है। एक फोटोमूवेबल प्रोटेक्टिव प्रोटेक्टिव ग्रुप के साथ रासायनिक संशोधन द्वारा जैविक रूप से निष्क्रिय ('बंदी') प्रदान किए गए अमीनो एसिड, निलंबन में समान रूप से मौजूद हैं, लेकिन उनकी अचानक रिहाई तक खपत के लिए उपलब्ध नहीं हैं, जो उपयोगकर्ता-परिभाषित बिंदुओं पर समय और अंतरिक्ष में एक लगभग यूवी-ए केंद्रित एलईडी बीम के माध्यम से होता है। नाड़ी में जारी अणुओं की संख्या एक्सपोजर समय और अनकैगिंग अंश के बीच एक अंशांकन संबंध द्वारा निर्धारित की जा सकती है, जहां फोटोलिसिस के बाद अवशोषण स्पेक्ट्रम यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके विशेषता है। एक नैनोपोरस पॉलीकार्बोनेट (पीसीटीई) झिल्ली को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में एकीकृत किया जा सकता है ताकि अनकैगड यौगिकों और खर्च किए गए मीडिया के प्रवाह से निरंतर हटाने की अनुमति दी जा सके। पीसीटीई झिल्ली और पीडीएम माइक्रोफ्लूइडिक संरचना के बीच एक मजबूत, अपरिवर्तनीय बंधन झिल्ली को 3-अमीनोप्रोपाइथोक्सीलेन (एपीटीईएस) के समाधान के साथ कोटिंग करके हासिल किया जाता है जिसके बाद सतहों के प्लाज्मा सक्रियण को बंधुआ किया जाता है। एक कंप्यूटर-नियंत्रित प्रणाली विभिन्न स्थानों पर और विभिन्न तीव्रताओं के साथ दालों के उपयोगकर्ता-परिभाषित दृश्यों को उत्पन्न कर सकती है, ताकि निर्धारित स्थानिक और लौकिक परिवर्तनशीलता के साथ संसाधन परिदृश्य बनाया जा सके। प्रत्येक रासायनिक परिदृश्य में, व्यक्तिगत पैमाने पर बैक्टीरियल आंदोलन की गतिशीलता और जनसंख्या स्तर पर उनके संचय प्राप्त किए जा सकते हैं, जिससे कीमोटैक्टिक प्रदर्शन की मात्रा और पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक वातावरण में बैक्टीरियल एकत्रीकरण पर इसके प्रभाव की अनुमति दी जा सकती है।

Introduction

रोगाणु रसायन परिदृश्य को नेविगेट करने, पोषक तत्वों के स्रोतों और मेजबानों से संपर्क करने और हानिकारक पदार्थों से बचने के लिए, रासायनिक ढाल का पता लगाने और प्रतिक्रिया1में गतिशीलता को संशोधित करने की प्रक्रिया की कीमोटैक्सिस पर भरोसा करते हैं। ये माइक्रोस्केल प्रक्रियाएं रोगाणुओं और उनके पर्यावरण2,3के बीच बातचीत के मैक्रोस्केल काइनेटिक्स का निर्धारण करती हैं । सॉफ्ट लिथोग्राफी4सहित माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोफैब्रिकेशन प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति ने नियंत्रित सूक्ष्म वातावरण बनाने की हमारी क्षमता में क्रांतिकारी बदलाव किया है जिसमें रोगाणुओं की बातचीत का अध्ययन करना है। उदाहरण के लिए, पिछले प्रयोगों ने उच्च पोषक तत्व ों की सांद्रता5,6के लिए मध्यवर्ती के अत्यधिक नियंत्रित, स्थिर ढाल पैदा करके बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस का अध्ययन किया है। हालांकि, प्राकृतिक वातावरण में, माइक्रोस्केल रासायनिक ढाल अल्पकालिक हो सकता है-आणविक प्रसार से नष्ट-और पृष्ठभूमि की स्थिति अक्सर अत्यधिक पतला7हैं । माइक्रोबियल आबादी की कीमोटैक्टिक प्रतिक्रिया को सीधे मापने के लिए पहले अस्थिर रासायनिक वातावरण के संपर्क में आने के लिए, हमने तैयार किया और यहां माइक्रोफ्लूइडिक तकनीक को फोटोलिसिस के साथ संयोजित करने के तरीकों का वर्णन किया, जिससे जंगली बैक्टीरिया प्रकृति में सामना करने वाले ढाल की नकल करते हैं।

अनकैगिंग तकनीक प्रकाश संवेदनशील जांच को नियोजित करती है जो कार्यात्मक रूप से एक निष्क्रिय रूप में जैव अणुओं को समाहित करती है। विकिरण बंदी अणु विज्ञप्ति, एक जैविक प्रक्रिया8के लक्षित क्षोभ की अनुमति । सेलुलर रसायन विज्ञान के तेजी से और सटीक नियंत्रण के कारण, जो कि अनकैगिंग9,बंदी यौगिकों के फोटोलासिस को पारंपरिक रूप से जीव विज्ञानियों, फिजियोलॉजिस्ट और न्यूरोसाइंटिस्टों द्वारा जीन10,आयनचैनल11और न्यूरॉन्स12की सक्रियता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हाल ही में, वैज्ञानिकों ने फोटोलिसिस के महत्वपूर्ण फायदों का लाभ उठाया है, जो कीमोटैक्सिस13का अध्ययन करने के लिए, व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं की फ्लैगेला स्विचिंग गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए एक स्टेपवाइज कीमोआकर्षितेंट उत्तेजना14,15के संपर्क में है, और त्रि-आयामी (3 डी) ग्रेडिएंट्स16में एकल शुक्राणु कोशिकाओं के गतिशील पैटर्न की जांच करने के लिए ।

हमारे दृष्टिकोण में, हम रासायनिक दालों को नियंत्रित करने के लिए बैक्टीरियल आबादी की व्यवहार प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों के भीतर बंदी अमीनो एसिड के फोटोलिसिस को लागू करते हैं, जो फोटोरिलीज के माध्यम से लगभग तुरंत उपलब्ध हो जाते हैं। एक कम आवर्धन (4x) उद्देश्य (एनए = 0.13, लगभग 40 माइक्रोन की गहराई) का उपयोग देखने के एक बड़े क्षेत्र (3.2 मिमी x 3.2 मिमी) पर हजारों बैक्टीरिया की जनसंख्या स्तर की एकत्रित प्रतिक्रिया के अवलोकन और एकल-कोशिका स्तर पर गति की माप दोनों की अनुमति देता है। हम इस विधि के दो अनुप्रयोग प्रस्तुत करते हैं: 1) एक ही रासायनिक नाड़ी की रिहाई के लिए जीवाणु संचय −अपव्यय गतिशीलता एक समान परिस्थितियों से शुरू का अध्ययन करने के लिए, और 2i)समय के तहत जीवाणु संचय गतिशीलता की विशेषता के लिए कई दालों की रिहाई अलग, स्थानिक विषम रसायनकी स्थिति । इस विधि का परीक्षण अमीनो एसिड ग्लूटामेट17की ओर कीमोटैक्सिस का प्रदर्शन करने वाले समुद्री बैक्टीरिया विब्रियो ऑर्डली पर किया गया है, लेकिन यह विधि मोटे तौर पर प्रजातियों और कीमोप्रोफेंट के विभिन्न संयोजनों के साथ-साथ कीमोटैक्सिस (जैसे, पोषक तत्व तेज, एंटीबायोटिक एक्सपोजर, कोरम सेंसिंग) से परे जैविक प्रक्रियाओं पर लागू होती है। यह दृष्टिकोण यथार्थवादी वातावरण में सूक्ष्मजीवों की पारिस्थितिकी और व्यवहार को स्पष्ट करने और अल्पकालिक गतिशील ढाल को नेविगेट करते समय व्यक्तिगत बैक्टीरिया का सामना करने वाले छिपे हुए व्यापार-नापसंद को उजागर करने में मदद करने का वादा करता है।

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Protocol

1. एकल रासायनिक-पल्स प्रयोग के लिए माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस का निर्माण

  1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके चैनल डिजाइन करें और फोटो मास्क(चित्रा 1ए)बनाने के लिए इसे ट्रांसपेरेंसी फिल्म पर प्रिंट करें।
  2. नरम लिथोग्राफी (साफ कमरे की स्थिति के तहत) द्वारा मास्टर गढ़ना।
    1. एसीटोन, मेथनॉल और आइसोप्रोपेनॉल के साथ त्वरित उत्तराधिकार में एक सिलिकॉन वेफर (4 इंच) साफ करें, फिर नाइट्रोजन का उपयोग करके सूखजाएं। 5 मिन के लिए 130 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में वेफर सेंकना।
    2. एक स्पिन-कोटर के केंद्र में वेफर रखें और वेफर पर एसयू-8 फोटोरिस्पॉन डालें। 5 एस से अधिक ५०० आरपीएम तक स्पिन-कोटर की गति रैंप, और 10 एस के लिए ५०० आरपीएम पर रखने के लिए 10 एस से अधिक अंतिम गति तक रैंप और 30 एस के लिए इस गति से बनाए रखने ।
      नोट: अंतिम गति का सटीक मूल्य लक्षित कोटिंग मोटाई और उपयोग किए गए एसयू-8 पर निर्भर करता है।
    3. स्पिन-कोटिंग प्रक्रिया के बाद वेफर को 65 डिग्री सेल्सियस और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें। वेफर को कम से कम 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा होने दें।
      नोट: बेकिंग समय लक्षित मोटाई और उपयोग किए गए फोटोविरोध के प्रकार पर निर्भर करता है। एक सामान्य नियम के रूप में, हर 100 माइक्रोन लेयर के लिए वेफर को 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 45 मिन पर 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक किया जाना चाहिए।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिर्फ ब्याज के क्षेत्र को उजागर और बहुलीकृत किया गया है, वेफर पर फोटो मास्क रखें। एसयू-8 मैनुअल में अनुशंसित समय के लिए यूवी प्रकाश का पर्दाफाश करें।
      नोट: यहां, 350 एनएम की तरंगदैर्ध्य में 200 एमजे सेमी-2 की एक्सपोजर ऊर्जा के साथ, वेफर 150 एस के लिए उजागर किया गया था।
    5. एसयू-8 मैनुअल में अनुशंसित समय के लिए वेफर को 65 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
      नोट: एक सामान्य नियम के रूप में, हर 100 माइक्रोन परत के लिए वेफर को 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 45 मिन पर 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक किया जाना चाहिए।
    6. मास्टर प्राप्त करने के लिए पॉलीमेथिल मेथेक्रिलेट (पीएमएमए) डेवलपर से भरे बीकर में वेफर को विसर्जित करें। धीरे-धीरे बीकर को हिलाकर यह सुनिश्चित करें कि अपॉलीमरेज फोटोडर्को को धोया जाए। एसयू-8 लेयर को और क्रॉस-लिंक करने के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर मास्टर सेंकना।
  3. एक बीकर (यहां, 40 mL) में 10:1 अनुपात में अपने इलाज एजेंट(सामग्री की तालिका)के साथ इलास्टोमर के संयोजन से एक पॉलीडिमिथाइलसिलिक्सान (पीडीएम) मिश्रण तैयार करें। जब तक तरल सजातीय न हो जाए तब तक सख्ती से मिलाएं।
    नोट: पीडीएफएस मिश्रण अपारदर्शी दिखेगा क्योंकि मिश्रण प्रक्रिया के दौरान बुलबुले उत्पन्न होते हैं।
    सावधानी: संभावित खतरनाक रसायनों या जैविक सामग्री के संपर्क में आने वाली त्वचा को रोकने के लिए, हमेशा प्रोटोकॉल भर में एक प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल प्लास्टिक दस्ताने पहनें और सामग्री के अनुसार किसी भी विशिष्ट सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें सेफ्टी डाटा शीट (एमएसडीएस) ।
  4. आरटी में 45 मिन के लिए वैक्यूम चैंबर में पीडीएम मिश्रण को डेगास। प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, इंटरफ़ेस पर बनने वाले बुलबुले को फोड़ने के लिए समय-समय पर वैक्यूम जारी करें।
    नोट: डीगैसिंग प्रक्रिया को 1 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए ताकि पीडीएमएस मिश्रण को शुरू से इलाज तक रोका जा सके।
  5. एक दबाव क्लीनर के साथ मास्टर की सतह से धूल निकालें, तो मास्टर पर degassed PDMS मिश्रण डालना और 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सेंकना।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, रातोंरात बेकिंग (या कम से कम 12 घंटे के लिए) 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ही कठोर पीडीएफएमएस प्राप्त होगा।
  6. माइक्रोस्ट्रक्चर (लगभग 5 मिमी की दूरी पर) के चारों ओर ब्लेड से पीडीएम को काट लें और फिर मास्टर से पीडीएफको ध्यान से छील लें।
  7. पंच छेद इनलेट और माइक्रोचैनल के आउटलेट के रूप में सेवा करने के लिए (यहां, एक इनलेट और एक आउटलेट, चित्रा 1एदेखें) । सुनिश्चित करें कि कुछ भी नहीं पीडीएम के निचले चेहरे को छूता है जहां सुविधाएं स्थित हैं।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । भंडारण के दौरान धूल और अन्य कणों के संचय को रोकने के लिए माइक्रोचैनल को चिपकने वाला टेप से सील किया जाना चाहिए।
  8. एक ग्लास स्लाइड करने के लिए पीडीएफ माइक्रोचैनल बांड।
    1. साबुन, आइसोप्रोपेनॉल और डिओनाइज्ड पानी के साथ एक ग्लास स्लाइड को अच्छी तरह से साफ करें। कांच को सूखी स्लाइड दें या प्रक्रिया को गति देने के लिए संकुचित हवा का उपयोग करें।
    2. चिपकने वाला टेप के साथ भिगोकर धूल कणों को हटा दें। 2 मिन के लिए प्लाज्मा (या तो कोरोना सिस्टम या प्लाज्मा ऑक्सीजन चैंबर का उपयोग करके) के साथ दोनों सतहों का इलाज करने के तुरंत बाद, साफ ग्लास स्लाइड पर पीडीएफएमएस माइक्रोचैनल को बॉन्ड करें।
    3. ग्लास के साथ रासायनिक बंधन को मजबूत करने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर गर्म करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस रखें।

2. कई दालों के साथ प्रयोग के लिए 3डी-मुद्रित मिलीफ्लूइडिक डिवाइस का निर्माण

  1. 3डी-डिज़ाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3डी आकार डिजाइन करें और उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी प्रिंटर(चित्रा 1बी)के साथ पीडीएफ मोल्ड के लिए मास्टर प्रिंट करें।
    नोट: मास्टर बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले 3डी प्रिंटर और मोल्ड सामग्री के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. चरण 1.3−1.4 दोहराएं, फिर चिपकने वाले टेप के साथ डब िंग करके मास्टर की सतह को साफ करें। मास्टर को एक पैमाने पर रखें, फिर, मास्टर के मध्य क्षेत्र से बचते हुए, जो झिल्ली द्वारा कब्जा कर लिया जाएगा, मास्टर की ऊंचाई से मिलान करके पीडीएमएस की वांछित ऊंचाई प्राप्त करने के लिए ठीक नहीं पीडीएम मिश्रण (यहां, 23.4 ग्राम) की सही मात्रा पर डालें 0.5 मिमी)। संकुचित हवा की मदद से किसी भी शेष बुलबुले को हटा दें।
  3. कम से कम 12 घंटे के लिए बेक करने के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में मास्टर पर डाली PDMS प्लेस।
  4. एक पेट्री डिश के लिए 3 डी PDMS मोल्ड बांड ।
    1. धीरे से बैक्टीरियल निलंबन के इंजेक्शन के लिए कठोर PDMS परत और पंच इनलेट और आउटलेट छेद छील(चित्रा 1सी)।
    2. पेट्री डिश (90 मिमी x 15 मिमी) की सतह और 2 मिन के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ पीडीएम मोल्ड दोनों को सक्रिय करें। पेट्री डिश पर पीडीएम मोल्ड को बॉन्ड करें। धीरे पेट्री डिश के लिए मोल्ड दबाएं, लेकिन प्रेस नहीं है जहां सुविधाओं के रूप में यह पूछताछ कक्ष ढह सकता है स्थित हैं ।
    3. रासायनिक बांड को मजबूत करने के लिए कम से कम 12 घंटे के लिए कम से कम 12 घंटे के लिए एक ओवन में पीडीएम 3 डी मोल्ड के लिए बंधुआ पेट्री डिश रखें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  5. झिल्ली सतह कार्यात्मकता18
    1. आरटी में 1 मिन के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा चैंबर में नैनोपोरस पॉलीकार्बोनेट (पीसीटीई) झिल्ली को सक्रिय करें।
      सावधानी: प्लाज्मा सक्रियण के लिए कोरोना प्रणाली का उपयोग करने से बचें क्योंकि यह झिल्ली को नुकसान पहुंचाएगा।
    2. एक रासायनिक हुड के तहत, पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब का उपयोग करके, डिओनाइज्ड पानी में 3-अमीनोप्रोपाइल्टिथोक्सीलेन (एपीटीईएस) के वाणिज्यिक समाधान को डिओनाइज्ड पानी (यहां, 40 mL) तक पतला करें।
      सावधानी: APTES समाधान तीव्रता से विषाक्त है (MSDS स्वास्थ्य जोखिम स्कोर 3) और दस्ताने के साथ एक रासायनिक हुड के तहत विशेष रूप से चरम देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । APTES समाधान से निपटने के तुरंत बाद दस्ताने बदलें। एपीटीईएस धुएं म्यूकस झिल्ली और ऊपरी श्वसन तंत्र के लिए विनाशकारी होते हैं। APTES के लक्षित अंग नसों, जिगर और गुर्दे हैं। यदि एक धुएं का हुड उपलब्ध नहीं है, तो एक चेहरा ढाल और पूर्ण चेहरे की श्वसन यंत्र को लागू किया जाना चाहिए।
    3. पेट्री डिश में पतला एपीटीईएस समाधान स्थानांतरित करें और 20 मिन के लिए एपीटीईएस समाधान में सक्रिय झिल्ली को विसर्जित करें।
    4. चिमटी के साथ APTES समाधान से झिल्ली निकालें और सूखने के लिए एक क्लीनरूम पोंछ पर रखें।
  6. पीडीएम माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के निर्माण के लिए जो झिल्ली पर झूठ बोलेंगे और बैक्टीरियल एरिना की धुलाई की अनुमति देंगे, चरण 1.1−1.7 दोहराएं।
  7. पीडीएमएस वाशिंग चैनलों को कार्यात्मक झिल्ली में बांधें।
    1. 2 मिन के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा चैंबर के साथ पीडीएम वाशिंग चैनल और पीसीटीई झिल्ली दोनों को सक्रिय करें।
      नोट: झिल्ली, जो दो पीडीएम परतों के बीच सैंडविच किया जाएगा, PDMS वाशिंग चैनल से छोटा होना चाहिए ।
    2. प्लाज्मा उपचार के तुरंत बाद, कार्यात्मक झिल्ली और पीडीएम वाशिंग चैनल को धीरे से झिल्ली पर पीडीएम वाशिंग चैनल को दबाकर संपर्क में लाएं।
      नोट: इस स्तर पर अत्यधिक दबाव लागू न करें, क्योंकि यह चैनल की छत पर झिल्ली के (अपरिवर्तनीय) लगाव का कारण बन सकता है, चैनल को अवरुद्ध कर सकता है।
  8. सैंडविच दो पीडीएम परतों के बीच झिल्ली(चित्रा 1ई)।
    1. दोनों बंधुआ टुकड़े टुकड़े धोने चैनल−PCTE झिल्ली और 3 डी PDMS मोल्ड पहले 2 मिन के लिए एक ऑक्सीजन प्लाज्मा चैंबर के साथ पेट्री डिश के लिए बंधुआ सक्रिय करें । उन्हें संपर्क में लाएं और एक साथ दबाएं ।
    2. रासायनिक बांड को मजबूत करने के लिए कम से कम 12 घंटे के लिए कम से कम 12 घंटे के लिए एक ओवन में सैंडविच संरचना के लिए बंधुआ पेट्री डिश रखें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

3. सेल संस्कृति

  1. 30 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर (600 आरपीएम)पर 20 घंटे के लिए वी ऑर्डली (तनाव 12B09 या 12B09pGFP) की आबादी बढ़ाएं और देर से घातीय चरण में फसल कोशिकाएं। पीजीएफपी को शरण देने वाले अलग-थलग करने के लिए, प्लाज्मिड को बनाए रखने के लिए स्पेक्ट्नोमाइसिन (50 μgmL-1)जोड़ें।
  2. 3 मिन के लिए 2500 x ग्राम पर कोशिकाओं का 1 मिलीग्राम एलिकोट, सुपरनेटेंट को हटा दें और फ़िल्टर किए गए कृत्रिम समुद्री जल के 1 मिलील में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इस कदम को दोहराएं।
  3. 3 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर (600 आरपीएम) पर वी ओर्डाली की आबादी को भूखा रखते हैं।
  4. 4-मेथोक्सी-7-नाइट्रोडोलिनिल-बंदी- एल-ग्लूटामेट (एमएएनआई-बंदी-एल-ग्लूटामेट)का 10 एमएम (यहां, 1 mL) का स्टॉक कृत्रिम समुद्री जल समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: फोटोलिसिस को रोकनेके लिए परिवेश प्रकाश से MNI-बंदी-एल-ग्लूटामेट समाधान की रक्षा करें।
  5. 1 mM MNI-बंदी-एल-ग्लूटामेट के कृत्रिम समुद्री जल समाधान में भूखे कोशिकाओंको फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को 50x पतला करें।
    नोट: यह 5 x 107 मीटर-1 से कम अंतिम बैक्टीरियल एकाग्रता सुनिश्चित करेगा (सटीक मूल्य देर से घातीय में कोशिकाओं की प्रारंभिक एकाग्रता पर निर्भर करता है, जो आमतौर पर ~ 109 मिलील-1है)। 600 एनएम के ऑप्टिकल डेंसिटी (ओडी) पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके बैक्टीरियल एकाग्रता का अनुमान लगाया गया था।

4. अनकागिंग प्रोटोकॉल का अंशांकन

  1. एक बूंद (20 μL) MNI-बंदी के एक कृत्रिम समुद्री जल समाधान की जगह-एल-ग्लूटामेट20 एक एकाग्रता सी0 = 10 mM पर एक गिलास स्लाइड पर । एक परिपत्र पीडीएमएस कक्ष (व्यास डी = 5 मिमी, ऊंचाई एच = 250 माइक्रोन) के साथ इसे कवर करके बूंद को समझाएं।
  2. एक माइक्रोस्कोप चरण पर ग्लास स्लाइड रखें और एक 4x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर [एनए] = 0.13) का उपयोग करके 395 एनएम (पावर 295 मिलीआर) की तरंगदैर्ध्य पर एक एलईडी बीम के लिए 20 एमएस के लिए पूरे कक्ष का पर्दाफाश करें।
  3. पीडीएम चैंबर खोलें और यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ विश्लेषण के लिए एक बूंद (1 माइक्रोन) निकालें।
  4. 0.1 एस, 0.5 एस, 2.5 एस, 25 एस, 25 एस, 250 एस (या रासायनिक प्रतिक्रिया के संतृप्ति तक) और 0 एस (पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए) की एलईडी रोशनी की विभिन्न अवधियों के लिए चरण 4.1−4.3 दोहराएं। प्रक्रिया चरणों को दोहराएं 4.1−4.4 कम से कम 3x (यहां, 4x)।
  5. अवशोषण स्पेक्ट्रम से, 405 एनएम पर मूल्य निकालें, जो पिंजरे के अणु21के अवशोषण स्पेक्ट्रम में चोटी का प्रतिनिधित्व करता है। एलईडी एक्सपोजर14द्वारा रासायनिक अनकैगिंग प्रतिक्रिया की दर कश्मीर निर्धारित करने के लिए, प्रायोगिक डेटा17 के संख्यात्मक फिट के लिए निम्नलिखित प्रथम-आदेश गतिज समीकरण का उपयोग करें
    Equation 1
    जहां सी(टी) टी सेकंड के एक अनcaging समय के साथ 405 एनएम (पृष्ठभूमि हटाने के बाद) पर समाधान के अवशोषण स्पेक्ट्रम का मूल्य है। छोटे अनकैगिंग समय टी के लिए इस तरह के कि केटी 1, Eq. 1 रैखिक निर्माण के लिए सरल किया जा सकता है
    Equation 2

5. एकल रासायनिक-नाड़ी प्रयोग

  1. पीडीएम के भीतर गैस एकाग्रता को कम करने के लिए 20 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत माइक्रोफ्लूइडिक चैनल बनाए रखें ताकि भरने की प्रक्रिया के दौरान बुलबुले बनने की संभावना कम हो।
  2. वैक्यूम पंप से चैनल निकालें और तुरंत 1 mM MNI-बंदी मेंपतला जीवाणु निलंबन शुरू-एल-माइक्रोचैनल में कृत्रिम समुद्री जल में ग्लूटामेट धीरे एक माइक्रोपाइपेट का उपयोग करने के लिए यांत्रिक बाल काटना बलों द्वारा flagellar क्षति से बचने के लिए (यहां, पूरी भरने की प्रक्रिया 5-10 एस लिया) । बैक्टीरियल निलंबन के साथ चैनल भरने के बाद, कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त में समाधान चूसना, और सील प्रवेश और पीडीएमएस प्लग के साथ आउटलेट धीरे से उन्हें छेद में दबाने से।
    नोट: इस तरह, कक्ष में तरल पदार्थ प्रवाह को रोका जाता है।
  3. माइक्रोचैनल को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और मिड-चैनल में देखने के क्षेत्र को सेट करने के लिए स्टेज को मूव करें । 12 एफपीएस की फ्रेम दर पर फेज कंट्रास्ट (4x ऑब्जेक्टिव) में इमेजिंग करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें।
    नोट: यह मूल्य विविध हो सकता है लेकिन छवि विश्लेषण के माध्यम से बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ के पुनर्निर्माण की अनुमति देने के लिए 10 एफपीएस से कम नहीं होना चाहिए (प्रोटोकॉल अनुभाग 7 देखें)।
  4. एलईडी बीम का पिनहोल न्यूनतम अपर्चर पर सेट करें। कैमरे के एक्सपोजर समय को 5 एस में सेट करके, स्थानिक स्थान और एलईडी बीम के आकार के सटीक माप प्राप्त करने के लिए कुछ फ्रेम रिकॉर्ड करें।
    नोट: एलईडी लाइट स्रोत तरल प्रकाश गाइड कनेक्शन के माध्यम से माइक्रोस्कोप के एपि-फ्लोरेसेंस रोशनी से जुड़ता है। एलईडी बीम वीडियो कैप्चरिंग को प्रभावित नहीं करती है, क्योंकि वीडियो अधिग्रहण और एलईडी उत्तेजना सॉफ्टवेयर के माध्यम से स्वतंत्र रूप से आदेश दिए जाते हैं।
  5. 10 मिनट की कुल अवधि के लिए निरंतर इमेजिंग प्रदर्शन (सबसे बड़ी रासायनिक नाड़ी के लिए 20 मिनट), और एक साथ वांछित अवधि के लिए 395 एनएम पर केंद्रित एलईडी बीम को सक्रिय करें (इस प्रयोग में, टी = 20 एमएस, 100 एमएस, 500 एमएस) एक उपयोगकर्ता-परिभाषित समय बिंदु पर (यहां, वीडियो अधिग्रहण की शुरुआत के बाद 10 एस) माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के माध्यम से। एक ही प्रक्रिया की कई प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए, माइक्रोफ्लूइडिक चैनल के विभिन्न पदों पर बैक्टीरियल प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करने के लिए मंच को स्थानांतरित करें। एक नए माइक्रोचैनल का उपयोग करके, प्रत्येक पल्स आकार के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    नोट: अनकेजिंग प्रक्रिया एक अक्षमित बेलनाकार नाड़ी उत्पन्न करती है जो इमेजिंग विमान में रेडियनिक रूप से बाहर की ओर फैलती है।
  6. बैक्टीरिया की निष्पक्ष तैराकी गति को रिकॉर्ड करने के लिए उच्च आवर्धन (20x उद्देश्य, एनए = 0.45) पर रासायनिक अनकेगिंग के बिना अलग प्रयोग करें।

6. कई रासायनिक-नाड़ी प्रयोग

  1. 20 मिन के लिए वैक्यूम के तहत मिलीफ्लूइडिक कक्ष बनाए रखें।
  2. एक माइक्रोस्कोप चरण पर मिलीफ्लूइडिक कक्ष युक्त पेट्री डिश रखें। झिल्ली के नीचे कक्ष को पतला बैक्टीरियल निलंबन (यहां, पूरी भरने की प्रक्रिया ने 1 mM MNI-caged-एल-ग्लूटामेटसमाधान में 1m MNI-caged-L-ग्लूटामेट समाधान में GFP-फ्लोरोसेंट वी ordalii के 10−15 एस लिया। बैक्टीरियल निलंबन के साथ चैनल भरने के बाद, कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त में समाधान चूसना, और सील प्रवेश और पीडीएमएस प्लग के साथ आउटलेट धीरे से उन्हें छेद में दबाने से।
    नोट: इस तरह, कक्ष में तरल पदार्थ प्रवाह को रोका जाता है। इस सेटअप में बैक्टीरिया के बेहतर दृश्य की अनुमति देने के लिए जहां इमेजिंग नैनोपोरस झिल्ली के माध्यम से होती है, जंगली प्रकार के बजाय फ्लोरोसेंट उपभेदों का उपयोग करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है (जैसा कि एकल रासायनिक-नाड़ी प्रयोग में उपयोग किया जाता है)।
  3. 1 mM MNI-बंदी-एल-ग्लूटामेट के कृत्रिमसमुद्री जल समाधान के साथ एक सिरिंज भरें और झिल्ली के ऊपर वाशिंग चैनल के इनलेट और आउटलेट को ट्यूबिंग संलग्न करें।
  4. ट्यूबिंग को अपशिष्ट जलाशय से जोड़ें और यह सुनिश्चित करें कि दबाव दोलनों से बचने के लिए टयूबिंग पूरी तरह से तरल अपशिष्ट जलाशय में जलमग्न हो।
  5. वाशिंग चैनल में वांछित औसत प्रवाह दर प्राप्त करने के लिए सिरिंज पंप (यहां, 50 माइक्रोन मिन-1)पर उचित प्रवाह दर निर्धारित करें, जो चैनल ज्यामिति पर निर्भर करता है।
  6. झिल्ली के ऊपर वाशिंग चैनल में प्रवाह स्थापित करने के लिए सिरिंज पंप शुरू करें।
  7. विभिन्न स्थानों पर और विभिन्न तीव्रताके साथ दालों के उपयोगकर्ता-परिभाषित दृश्यों को उत्पन्न करने के लिए एलईडी बीम और माइक्रोस्कोप चरण को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर चलाएं।
    नोट: झिल्ली के ऊपर वाशिंग चैनल में 1 mM MNI-बंदी-एल-ग्लूटामेट के कृत्रिम समुद्री जल समाधान का निरंतर प्रवाह बंदी यौगिक समाधान को पार करता है और बैक्टीरियल क्षेत्र से खर्च किए गए माध्यम को धोता है।
  8. एक बड़ी सतह को कवर करने के लिए कई घंटों और कई समीपस्थ स्थानों पर नियमित समय अंतराल पर 4x उद्देश्य का उपयोग करके रिकॉर्ड वीडियो रिकॉर्ड करें (यहां, 1 सेमी x 1 सेमी, चित्रा 1एफ)।

7. छवि विश्लेषण और डेटा विश्लेषण

  1. बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ का पुनर्निर्माण
    1. 4x उद्देश्य के साथ दर्ज की गई फिल्मों से, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर17का उपयोग कर बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ का पुनर्निर्माण करें।
      नोट: ये प्रक्षेप पथ माइक्रोचैनल में 3डी बैक्टीरियल मोशन के 2डी अनुमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    2. पुनर्निर्मित बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ से, रासायनिक नाड़ी(चित्रा 2डी)के केंद्र की दिशा में अपनी तैराकी गति पेश करके प्रत्येक तैराकी व्यक्ति के रेडियल बहाव वेग का निर्धारण करें। रेडियल बहाव वेग के स्थानिक-लौकिक गतिशीलता के दृश्य के लिए, स्थानिक आकार 75 माइक्रोन x 75 माइक्रोन और 5−10 एस अंतराल की लौकिक खिड़की(चित्रा 2डी,ई)के साथ एक बिनिंग ग्रिड का उपयोग करें।
      नोट: प्रक्रिया की बेलनाकार समरूपता के कारण, डेटा का विश्लेषण ध्रुवीय निर्देशांक में किया जा सकता है और कोणीय आयाम(चित्रा 3)पर औसत किया जा सकता है।
    3. पुनर्निर्मित जीवाणु प्रक्षेप पथ से, बैक्टीरिया के वितरण की स्थानिक-लौकिक गतिशीलता निर्धारित करें क्योंकि वे रासायनिक दालों(चित्रा 2ई)का जवाब देते हैं।
    4. एकल पल्स प्रयोगों के दौरान 20x उद्देश्य के साथ दर्ज उच्च संकल्प फिल्मों से, तैराकी की गति के वितरण को निकालने और बैक्टीरियल आबादी के लिए समय चलाने के रूप में वे रासायनिक नाड़ी(चित्रा 4)का जवाब ।
  2. कीमोटैक्सिस पूरा होने के बाद बैक्टीरियल आबादी के अपव्यय गतिशीलता पर विचार करके बैक्टीरिया के प्रसार गुणांक का अनुमान लगाएं17 (यहां, टी एंड जीटी; 300 एस के लिए; चित्रा 3)।
  3. स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण लागू करके ग्लूटामेट के प्रसार गुणांक का अनुमान लगाएं
    Equation 3
    जहां अमीनो एसिड अणुओं को हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या22आरजीके साथ गोलाकार कण माना जाता है, केबी बोल्ट्ज़मान स्थिर (1.38 x 10-23 मीटर 2 किलोग्राम एस-2 K-1), टी तापमान (296 K) है, और 23 डिग्री सेल्सियस (लवणता 36 ग्रामकिलो-1)पर कृत्रिम समुद्री जल (लवणता 36 ग्राम किलो-1) की गतिशील चिपचिपाहट है

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Representative Results

हमने गतिशील पोषक तत्वों की स्थिति में बैक्टीरियल संचय प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक और मिलीफ्लूइडिक उपकरणों(चित्रा 1)का उपयोग किया। बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ को फोटोसिस द्वारा जारी रासायनिक नाड़ी(चित्रा 2 और चित्रा 3)के बाद बैक्टीरियल आबादी के संचय-अपव्यय गतिशीलता के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त रिकॉर्ड किए गए वीडियो से निकाला गया था। लाखों प्रक्षेपपथों का औसत करके, रेडियल बहाव वेग और बैक्टीरियल एकाग्रता की स्थानिक गतिशीलता प्राप्त की गई थी। रासायनिक ढाल के अभाव में तैराकी का वर्णन करने वाले आंकड़े उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प(चित्र4)के साथ अलग-अलग प्रयोगों में प्राप्त किए गए थे।

Figure 1
चित्रा 1: गतिशील पोषक तत्वों की स्थिति में बैक्टीरियल प्रयोगों के लिए माइक्रोफ्लूइडिक और मिलीफ्लूइडिक उपकरण। (A)माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का फोटोमास्क जिसका उपयोग बैक्टीरियल संचय को एक रासायनिक नाड़ी में देखने के लिए किया जाता है। (ख)मल्टी पल्स प्रयोगों के लिए मिलीफ्लूइडिक बैक्टीरियल चैंबर को धोने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स चैनल का फोटोमास्क । छोटे डॉट्स माइक्रोपिलर (आकार में 200 माइक्रोन) हैं जो झिल्ली के संबंध को पीडीएफएमएस में मदद करते हैं, और साथ ही झिल्ली को केंद्र में बकसुआ या गिरने से रोकने में मदद करते हैं। (ग)बैक्टीरियल चैंबर बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले 3डी मुद्रित मास्टर का डिजाइन। (D)बैक्टीरियल चैंबर की तर्जने के साथ पीडीएम परत। (ई)पूर्ण मिलीफ्लूइडिक डिवाइस (शीर्ष दृश्य, सफेद रंग में पीसीटीई झिल्ली)। (एफ)गतिशील पोषक तत्वों की स्थिति (साइड व्यू) की पीढ़ी के लिए मिलीफ्लूइडिक डिवाइस की योजनाबद्ध । ऑप्टिक्स रे आरेख डिवाइस के तल पर दिखाया गया है, जहां एक बैंगनी बीम (395 एनएम) कीमोआकर्षितेंट की अनकैगिंग करता है, जबकि एक (स्वतंत्र) नीली बीम (470 एनएम) का उपयोग एक एससीएमओएस कैमरे के माध्यम से फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया (पीजीएफपी को शरण देने) के अवलोकन के लिए किया जाता है, जो बैक्टीरियल घनत्व (नीचे केंद्र) को कैप्चर करता है। डिवाइस एक मोटर चालित चरण (नीचे सही) पर रखा गया है, जो एक्स-वाई विमान में स्थानांतरित करने के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित पदों पर रासायनिक दालों जारी किया जा सकता है (एनआईएस सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित, नीचे बाएं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक रासायनिक नाड़ी के लिए प्रतिनिधि जीवाणु प्रतिक्रियाएं। (ए, बी) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण एक 0.5 एस अंतराल पर बैक्टीरियल स्थिति (सफेद) दिखा, दिखाया(ए)तुरंत पीछा, और(B)पल्स रिलीज के बाद 40 एस (उद्देश्य: 4x, एनए = 0.13, पीएच 2; 12 एफपीएस पर वीडियो रिकॉर्डिंग).. । (ग)पल्स रिलीज के बाद बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ (काला) 60 एस दिखाया गया है। छायांकित क्षेत्र देखने के क्षेत्र (ब्लैक क्रॉस) के बीच में टी = 0 एस में फोटोसिस द्वारा जारी रासायनिक नाड़ी का प्रतिनिधित्व करता है, जो बाद में फैलाता है। कस्टम इन-हाउस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रक्षेप पथ ों को खंगाला गया। (D,E) देखने के क्षेत्र के केंद्र में एक पल्स रिलीज के बाद रेडियल बहाव वेग(डी)और बैक्टीरियल एकाग्रता(ई)की लौकिक गतिशीलता। पैनल डी में, बहाव वेग (नीले रंग में) के नकारात्मक मूल्यनाड़ी के केंद्र की ओर निर्देशित कीमोटैक्टिक गति के अनुरूप हैं। ब्रुमले एट अल17के बाद इस आंकड़े को संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक रासायनिक नाड़ी रिलीज के बाद रेडियल बहाव वेग और जीवाणु एकाग्रता के स्थानिक-लौकिक प्रोफाइल। (ए, बी) रेडियल बहाव वेग(ए)और बैक्टीरियल एकाग्रता(बी)एक 35 μM ग्लूटामेट पल्स के केंद्र से समय और दूरी के एक समारोह के रूप में। पैनल ए में, बहाव वेग (नीले रंग में) के नकारात्मक मूल्यनाड़ी के केंद्र की ओर निर्देशित कीमोटैक्टिक गति के अनुरूप हैं। सभी प्रक्षेप पथ ों पर औसत करके मूल्यों की गणना की गई थी। टी = 250 एस पर काले धराशायी लाइन मोटे तौर पर सक्रिय कीमोटैक्सिस (पैनल ए, क्षेत्र I में नीली छायांकन) की अवधि को डीज़ल करता है, जिसके बाद कोशिकाएं आइसोट्रॉपिकल रूप से जावक (पैनल ए, क्षेत्र II में हरी छायांकन) को फैलाती हैं। (ग)बैक्टीरियल एकाग्रता (पृष्ठभूमि बी0पर फिर से स्केल किया गया) एक डिफ्यूजिंग रासायनिक नाड़ी के निर्माण के बाद टी = 10, 30, 60 एस में दूरी के एक समारोह के रूप में। कीमोटैक्सिस के कारण नाड़ी की साइट के करीब बैक्टीरिया कुल। (D)बैक्टीरियल एकाग्रता बैक्टीरियल प्रसार द्वारा पृष्ठभूमि बी0 को आराम करने के लिए ~ 20 min लेता है। इनसेट डीबी = 165 माइक्रोन2 एस-1के प्रसार गुणांक के साथ फैलाने के फिट दिखाता है । पैनल ए, सी, और डी ब्रुमले एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: रासायनिक ढाल के अभाव में एक जीवाणु आबादी के लिए तैराकी आंकड़े । (क)प्रक्षेप पथ माइक्रोचैनल में त्रि-आयामी जीवाणु गति के द्वि-आयामी अनुमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं । एक कस्टम इन-हाउस ट्रैकिंग स्क्रिप्ट का उपयोग करके बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ निकाले जाते हैं। यहां ब्लू क्रॉस ट्रैक की शुरुआत को इंगित करता है, और लाल और हरे रंग के प्रतीक पुनर्विन्यास घटनाओं का संकेत देते हैं। डेटा 20x उद्देश्य, एनए 0.45 के साथ 50 एफपीएस पर दर्ज किया गया। (ख)गामा वितरण फिट (नीला) के साथ मापी गई बैक्टीरियल स्विमिंग स्पीड (ब्लैक) का संभावना वितरण । क्योंकि ध्यान की गहराई जब एक 20x उद्देश्य (एनए ०.४५) के साथ इमेजिंग केवल कुछ माइक्रोन24है, दर्ज प्रक्षेप पथ अनिवार्य रूप से planar और तैराकी की गति के माप प्रक्षेपण से पक्षपाती नहीं हैं । (ग)क्रमिक पुनवमुखता के बीच समय का संभावना वितरण। इन आंकड़ों को प्रभावी ढंग से एक व्यक्ति आधारित मॉडल है कि ध्यान में पुनर्विन्यास पैटर्न, तैराकी की गति के वितरण, और जीवों के पुनर्विन्यास आंकड़ों लेता है जांचना की आवश्यकता थी । इस आंकड़े को ब्रुमले एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह विधि शोधकर्ताओं को नियंत्रित, सूक्ष्म और मिलीफ्लूइडिक उपकरणों में गतिशील ढाल के तहत बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने की अनुमति देती है, जिससे प्रजनन योग्य डेटा अधिग्रहण सक्षम होता है। फोटोलिसिस द्वारा माइक्रोस्केल पर रासायनिक दालों के निकट तात्कालिक निर्माण का उद्देश्य विभिन्न स्रोतों से जंगली में बैक्टीरिया के बैक्टीरिया के रूप में आने वाले पोषक दालों के प्रकारों को पुन: पेश करना है, उदाहरण के लिए, समुद्री कणों को डूबने के पीछे पंखों का विसारक फैलना25,या लाइसेड फाइटोप्लैंकटन कोशिकाओं से फैलने वाले पोषक तत्व26।

हमने इस विधि के दो अनुप्रयोग प्रस्तुत किए: 1) एक ही रासायनिक नाड़ी की रिहाई के लिए जीवाणु संचय −अपव्यय गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक समान स्थितियों से शुरू, और 2) गैर-संतुलन पोषक तत्वों की स्थिति के तहत बैक्टीरियल संचय प्रोफाइल की विशेषता के लिए कई दालों की रिहाई। पहला आवेदन विशेष रूप से रोगाणुओं के व्यवहार प्रतिक्रियाओं की विशेषता के लिए अनुकूल है जब पहली बार पोषक तत्वों के स्रोत का सामना करना पड़ता है। ऐसी परिस्थितियों में, जिसमें कीमोएरोज़ेंट अणुओं की एकाग्रता बेहद कम होती है, कीमोटैक्सियों के प्रारंभिक चरण में कीमोएसेप्टरअणुओं की स्टोचस्टिक बाइंडिंग−अनबाध्यकारी घटनाओं का प्रभुत्व होता है। हमारी विधि, शून्य-पोषक पृष्ठभूमि में कीमोआकर्षितेंट के ज्ञात द्रव्यमान को तेजी से और ठीक से जारी करके, गतिशील परिस्थितियों27,28,29के तहत बैक्टीरियल प्रतिक्रिया की विशेषता के लिए पिछले दृष्टिकोणों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है। फायदे सभी स्थानों पर और हर समय कीमोआकर्षितेंट के पूर्ण वितरण को जानना शामिल है (चूंकि इसकी विरूपणता ज्ञात है), और तरल प्रवाह की पीढ़ी से पूरी तरह से परहेज करना जो स्वाभाविक रूप से अन्य उपकरणों से जुड़ा हुआ है, जैसे माइक्रोइंजेक्टर27 या तीन-इनलेट ज्यामिति30।

दूसरे आवेदन में, रासायनिक दालें अंतरिक्ष और समय में उपयोगकर्ता-परिभाषित अनुक्रम के अनुसार एक बड़े, अर्ध-2डी डोमेन में होती हैं जो सॉफ्टवेयर के माध्यम से पूरी तरह से अनुकूलन योग्य है, जिसका उपयोग यादृच्छिक दृश्यों या विशेष पैटर्न को लागू करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, यह विधि बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस के उच्च-रिज़ॉल्यूशन व्यवहार गतिशीलता और सेकंड के टाइमस्केल और दीर्घकालिक गतिशीलता, जैसे विकास और संभावित विकास के बीच एक शक्तिशाली कड़ी प्रदान करती है। बैक्टीरियल एरिना एक ही नाड़ी के साथ बैक्टीरिया के रासायनिक संपर्क की स्थानिक सीमा की तुलना में काफी बड़ा (2 सेमी x 2 सेमी) है (सबसे बड़ी दालों के लिए छोटी दालों के लिए सैकड़ों माइक्रोमीटर से कुछ मिलीमीटर तक)। कम रासायनिक पृष्ठभूमि के रखरखाव की कुंजी (उनकी रिहाई पर रासायनिक दालों की एकाग्रता से बहुत कम) दो पीडीएम परतों18के बीच सैंडविच नैनोपोरस पीसीटीई झिल्ली का समावेश है। डिवाइस के शीर्ष पर रखे गए माइक्रोफ्लूइडिक चैनल में तरल प्रवाह लागू करके, बैक्टीरियल क्षेत्र में अनकेज यौगिकों और खर्च किए गए मध्यम से एक निरंतर धोने को नैनोपोरस झिल्ली के माध्यम से आणविक प्रसार के माध्यम से महसूस किया जाता है, डिवाइस के परीक्षण अनुभाग में प्रवाह पैदा किए बिना जहां बैक्टीरिया स्थित हैं(चित्रा 1)।

समय, आयाम, आकार और ज्यामिति में केंद्रित एलईडी बीम को मॉड्यूल करके, फोटोरिलीज तकनीक प्रयोगकर्ता को विभिन्न प्रकार के रासायनिक वातावरण उत्पन्न करने के लिए महान लचीलेपन के साथ प्रदान करती है। साथ ही, जबकि यहां प्रस्तुत परीक्षणों को शांत परिस्थितियों में किया गया था, हमारी विधि को विभिन्न प्रवाह विन्यास के तहत बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस का परीक्षण करने के लिए और विस्तारित किया जा सकता है। वीडियो माइक्रोस्कोपी के माध्यम से बैक्टीरियल संचय गतिशीलता का ईमानदारी से पुनर्निर्माण करके, हमारी विधि बड़ी मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करती है जिसका उपयोग बैक्टीरियल व्यवहार के आंकड़ों और बैक्टीरियल कोशिकाओं द्वारा संभावित पोषक तत्व तेज का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। हमारे प्रयोगात्मक माइक्रोफ्लूइडिक दृष्टिकोण, पोषक तत्व परिदृश्य है कि बैक्टीरिया प्राकृतिक पर्यावरण की स्थिति के तहत सामना कर सकते है नकल उतार, माइक्रोबियल प्रजातियों के foraging व्यवहार के व्यवस्थित अध्ययन की अनुमति देता है कि स्थूल पैमाने पर पोषक तत्वों की साइकिल चालन में आवश्यक हैं2,3। इस प्रकार, इस पद्धति के माध्यम से उत्पन्न डेटा का प्रकार जनसंख्या तेज दरों को प्रभावी ढंग से जांचने और मेसोस्केल पारिस्थितिकी तंत्र मॉडल में पोषक तत्वों काइनेटिक्स को बेहतर ढंग से प्राप्त करने के लिए उपयोगी है।

बड़े बैक्टीरियल एरिना बनाने के लिए पीडीएम मोल्डों का निर्माण एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटिंग सेवा का उपयोग करके किया गया था। हालांकि, माइक्रोचैनल डिजाइनों की छोटी सुविधाओं को हल करने के लिए आवश्यक 50−100 माइक्रोन के संकल्प के साथ, घर में एक उच्च अंत 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके समान परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। पीडीएमएस मोल्ड के लिए 3डी-मुद्रित सामग्री की एक चिकनी सतह को कास्ट पीडीएम और डिवाइस की अन्य सतहों (यानी ग्लास, पॉलीस्टीरिन, पीडीएम) के बीच एक अच्छी बॉन्डिंग प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। हमारे आवेदन के लिए, पॉलीस्टीरिन पेट्री डिश (90 मिमी x 15 मिमी) का उपयोग क्योंकि 3 डी एरिना की निचली सतह माइक्रोफ्लूइडिक्स अध्ययनों में आमतौर पर नियोजित ग्लास स्लाइड के उपयोग पर दो फायदे प्रस्तुत करती है: पहला, यह कांच की सतह की तुलना में बैक्टीरियल कोशिकाओं के लगाव को काफी कम कर देता है (हालांकि लगाव विचाराधीन सूक्ष्म जीव के विशेष सतह गुणों पर निर्भर हो सकता है); दूसरा, यह माध्यमिक रोकथाम प्रदान करता है, जो फैल के मामले में माइक्रोस्कोपी उपकरणों पर मीडिया के रिसाव को रोका जा सकता है । पीडीएस मोल्ड इलाज प्रक्रिया आमतौर पर उच्च तापमान (70−80 डिग्री सेल्सियस) पर होती है, लेकिन इस एप्लिकेशन में प्रयोगकर्ता को काफी कम तापमान (वर्तमान मामले में 45 डिग्री सेल्सियस, सामग्री की तालिकादेखें), गर्मी विक्षेप के नीचे और मास्टर के 3डी प्रिंटिंग के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री के पिघलने के तापमान सेंकना होगा। कम बेकिंग तापमान इलाज प्रक्रिया (रात भर) को काफी लंबा करता है, लेकिन पीडीएफएम के यांत्रिक और रासायनिक गुणों को नहीं बदलता है।

यद्यपि हमारी विधि को बैक्टीरिया और कीमोआकर्षितेंट के एक विशेष संयोजन पर लागू किया गया है, कार्यप्रणाली पोषक तत्वों के तेज या एंटीबायोटिक एक्सपोजर सहित विविध जैविक प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है, और विभिन्न प्रजातियों और कीमोप्रोफेंट की मॉडल प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है, यह देखते हुए कि असंख्य अणुओं (या हो सकते हैं)8बंदी हैं। एक संभावित सीमा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बंदी यौगिकों की लागत से उत्पन्न होती है, लेकिन इन लागतों को आम तौर पर सेल व्यवहार्यता, गिनती, या इंट्रासेलुलर धुंधला के लिए जीवन विज्ञान में नियोजित आणविक जांच का उपयोग करते समय किए गए लोगों के बराबर हैं। इस संभावित सीमा के बावजूद, प्रस्तावित पद्धति जैव भौतिक और जैव चिकित्सा विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोगों को मिल सकती है, ताकि गतिशील रासायनिक ढाल के लिए एकल सेल संकल्प पर माइक्रोबियल आबादी की प्रारंभिक प्रतिक्रियाओं और अनुकूलन गतिशीलता की विशेषता हो सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक ईटीएच ज्यूरिख में पहली माइक्रोफैब्रिकेशन सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद डिस्कवरी अर्ली कैरियर शोधकर्ता पुरस्कार DE180100911 (D.R.B.), एक गॉर्डन और बेटी मूर मरीन माइक्रोबियल पहल अन्वेषक पुरस्कार GBMF3783 (आर.एस.) द्वारा समर्थित किया गया था, और एक स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 1-002745-000 (आरएस के लिए) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648 >98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube Greiner Bio-One 210261 50 ml
Centrifuge Eppendorf 5424R to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line VWR-CH 390-0384 to bake 3D master
Duster VWR-CH 16650-22 to clean the wafer and microchannels
Hot plate VWR-CH 444-0601 to bond the microchannels
Isopropanol Sigma-Aldrich W292907
LightSafe micro centrifuge tubes Sigma-Aldrich Z688312 1.5 ml
MATLAB Mathworks for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube Eppendorf 30120086 1.5 ml
Microscope glass slide VWR-CH 631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE Nikon Instruments MEA53100 with motorized stage
MNI-Glutamate Tocris Bioscience 1490 >98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment Stratasys Objet30 3D printer
Mold printing service 3D Printing Studios Custom https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W to calibrate the uncaging
NIS Elements Nikon Instruments Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line VWR-CH 466-3516 to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050 MicroChem Corp. SU8-3050
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane Sterlitech PCT0447100 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing Scientific Commodities BB31695-PE/2 I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish VWR-CH 25373-100 bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale VWR-CH 611-2605 to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla Oxford Instruments for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt Instant Ocean Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015 Dassault Systemes SolidWorks Used to design the mold
Spectra X light engine Lumencolor for LED 395 nm
Sylgard 184 Dow Corning 110-41-155 PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok) B Braun Omnifix 4616308F
Syringe Needle Agani A228 from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite Harvard Apparatus 70-4506 Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey Stratasys Dual Syringe Pump
Vortex-Genie Scientific Industries SI-0236 Mold Material

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References

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  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
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Carrara, F., Brumley, D. R., Hein, A. M., Yawata, Y., Salek, M. M., Lee, K. S., Sliwerska, E., Levin, S. A., Stocker, R. Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior. J. Vis. Exp. (155), e60589, doi:10.3791/60589 (2020).

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