Summary
Viene presentato un protocollo per la generazione di paesaggi chimici dinamici mediante fotolisi all'interno di configurazioni microfluidiche e millifluidiche. Questa metodologia è adatta per studiare diversi processi biologici, tra cui il comportamento motile, l'assorbimento di nutrienti o l'adattamento alle sostanze chimiche dei microrganismi, sia a livello di singola cellula che di popolazione.
Abstract
Dimostriamo un metodo per la generazione di impulsi chimici controllati e dinamici, dove il chemoattractant localizzato diventa improvvisamente disponibile su microscala, per creare micro-ambienti per esperimenti microbici chemiotassi. Per creare impulsi chimici, abbiamo sviluppato un sistema per introdurre le fonti di amminoacidi quasi istantaneamente mediante fotolisi di amminoacidi in gabbia all'interno di una camera microfluidica polidimetilsiloxana (PDMS) contenente una sospensione batterica. Abbiamo applicato questo metodo al batterio chemiotattico, Vibrio ordalii, che può scalare attivamente questi gradienti chimici dinamici mentre viene tracciato dalla microscopia video. Gli amminoacidi, resi biologicamente inerediti ('ingabbiati') dalla modifica chimica con un gruppo di protezione fotoriamo, sono uniformemente presenti nella sospensione ma non sono disponibili per il loro rilascio improvviso, che si verifica in punti di tempo e spazio definiti dall'utente mediante un fascio LED climatizzato vicino all'UV-A. Il numero di molecole rilasciate nell'impulso può essere determinato da una relazione di calibrazione tra il tempo di esposizione e la frazione disidratazione, dove lo spettro di assorbimento dopo la fotolisi è caratterizzato dall'utilizzo della spettroscopia UV-Vis. Una membrana in policarbonato nanoporoso (PCTE) può essere integrata nel dispositivo microfluidico per consentire la rimozione continua da parte dei composti non in gabbia e dei supporti esauriti. Un legame forte e irreversibile tra la membrana PCTE e la struttura microfluidica PDMS si ottiene rivestindo la membrana con una soluzione di 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguita dall'attivazione al plasma delle superfici da legare. Un sistema controllato dal computer può generare sequenze definite dall'utente di impulsi in luoghi diversi e con intensità diverse, in modo da creare paesaggi di risorse con prescritta variabilità spaziale e temporale. In ogni paesaggio chimico, è possibile ottenere la dinamica del movimento batterico su scala individuale e il loro accumulo a livello di popolazione, consentendo così la quantificazione delle prestazioni chemiotattiche e i suoi effetti sulle aggregazioni batteriche in ambienti ecologicamente rilevanti.
Introduction
I microbi si basano sulla chemiotassi, il processo di rilevamento dei gradienti chimici e di modifica della motilità in risposta1,per navigare nei paesaggi chimici, avvicinarsi a fonti di nutrienti e ospiti e sfuggire a sostanze nocive. Questi processi di microscala determinano la cinetica su macroscala delle interazioni tra i microbi e il loro ambiente2,3. I recenti progressi nella microfluidica e nelle tecnologie di microfabbricazione, tra cui la litografia morbida4,hanno rivoluzionato la nostra capacità di creare microambienti controllati in cui studiare le interazioni dei microbi. Ad esempio, esperimenti passati hanno studiato chemiotassi batterici generando gradienti altamente controllati e stabili di concentrazioni di nutrienti intermedi e ad alto5,6. Tuttavia, negli ambienti naturali, i gradienti chimici su microscala possono essere di breve durata, dissipati dalla diffusione molecolare, e le condizioni di fondo sono spesso altamente diluite7. Per misurare direttamente la risposta chemiotattica delle popolazioni microbiche prima esposte ad ambienti chimici instabili, abbiamo ideato e qui descritto metodi per combinare la tecnologia microfluidica con la fotolisi, imitando così i gradienti che i batteri selvatici incontrano in natura.
Uncaging technology impiega sonde sensibili alla luce che incapsulano funzionalmente le biomolecole in forma inattiva. L'irradiazione rilascia la molecola in gabbia, permettendo la perturbazione mirata di un processo biologico8. A causa del controllo rapido e preciso della chimica cellulare che lo sblocco offre9, fotolisi di composti in gabbia è stato tradizionalmente impiegato da biologi, fisiologi e neuroscienziati per studiare l'attivazione dei geni10, canali ionici11, e neuroni12. Più di recente, gli scienziati hanno sfruttato i vantaggi significativi della fotolisi per studiare la chemiotassi13, per determinare la dinamica di commutazione flagella di singole cellule batteriche esposte a uno stimolo chemioattraente passo14,15, e per studiare i modelli di motilità di singole cellule sperometrive in gradienti tridimensionali (3D)16.
Nel nostro approccio, implementiamo la fotolisi di aminoacidi in gabbia all'interno di dispositivi microfluidici per studiare la risposta comportamentale di una popolazione batterica agli impulsi chimici controllati, che diventano quasi istantaneamente disponibili attraverso il photorelease. L'uso di un obiettivo a basso ingrandimento (4x) (NA - 0,13, profondità di messa a fuoco di circa 40 m) consente sia l'osservazione della risposta aggregata a livello di popolazione di migliaia di batteri su un ampio campo visivo (3,2 mm x 3,2 mm), sia la misurazione del movimento a livello di singola cellula. Presentiamo due applicazioni di questo metodo: 1) il rilascio di un singolo impulso chimico per studiare la dinamica di accumulo batterico-dissipazione a partire da condizioni uniformi, e 2i) il rilascio di impulsi multipli per caratterizzare la dinamica di accumulo batterico in condizioni chemoaattrazionli eterogenee nel tempo. Questo metodo è stato testato sui batteri marini Vibrio ordalii che eseguono chemiotassi verso il glutammato aminoacido17, ma il metodo è ampiamente applicabile a diverse combinazioni di specie e chemioattraenti, nonché ai processi biologici oltre la chemiotassi (ad esempio, assorbimento di nutrienti, esposizione agli antibiotici, quorum sensing). Questo approccio promette di aiutare a chiarire l'ecologia e il comportamento dei microrganismi in ambienti realistici e di scoprire i compromessi nascosti che i singoli batteri affrontano durante la navigazione nei gradienti dinamici effimeri.
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Protocol
1. Fabbricazione del dispositivo microfluidico per l'esperimento singolo impulso chimico
- Progettare il canale utilizzando un software CAD (Computer-Aided Design) e stamparlo su una pellicola trasparente per creare la maschera fotografica (Figura 1A).
- Fabbricare il maestro con litografia morbida (in condizioni di camera pulita).
- Pulire un wafer di silicio (4 pollici) in rapida successione con acetone, metanolo e isopropanolo, quindi asciugare con azoto. Cuocere il wafer in forno a 130 gradi centigradi per 5 min.
- Posizionare il wafer al centro di uno spin-coater e versare su-8 photoresist sul wafer. Aumentare la velocità dello spin-coater fino a 500 rpm su 5 s, e mantenere a 500 rpm per 10 s. Rampa fino alla velocità finale su 10 s e mantenere a questa velocità per 30 s.
NOTA: Il valore esatto della velocità finale dipende dallo spessore di rivestimento mirato e dal SU-8 utilizzato. - Dopo il processo di ritocco, cuocere il wafer a 65 gradi centigradi e poi a 95 gradi centigradi. Lasciare raffreddare il wafer a temperatura ambiente (RT) per almeno 5 min.
NOTA: Il tempo di cottura dipende dallo spessore e dal tipo di fotoresist utilizzati. Come regola generale, per ogni strato di 100 m il wafer deve essere cotto per 5 min a 65 e 45 min a 95 gradi centigradi. - Posizionare la maschera fotografica sul wafer per garantire che solo la regione di interesse sia esposta e polimerizzata. Esporre alla luce UV per il tempo raccomandato nel manuale SU-8.
NOTA: Qui, con un'energia di esposizione di 200 mJ cm-2 ad una lunghezza d'onda di 350 nm, il wafer è stato esposto per 150 s. - Cuocere il wafer a 65 e 95 gradi centigradi per il tempo raccomandato nel manuale SU-8.
NOTA: Come regola generale, per ogni strato di 100 m il wafer deve essere cotto per 5 min a 65 e 45 min a 95 . - Immergere il wafer in un bicchiere pieno di colittore polimetillato (PMMA) sviluppatore al fine di ottenere il maestro. Scuotere delicatamente il becher per garantire che il fotoresist non polimerizzato venga lavato. Cuocere il master a 200 gradi centigradi per incrociare ulteriormente lo strato SU-8.
- Preparare una miscela di polidimetilsiloxane (PDMS) combinando l'elastomero con il suo agente di polimerazione (Tabella dei materiali) ad un rapporto 10:1 in un becher (qui, 40 mL). Mescolare vigorosamente fino a quando il liquido è omogeneo.
NOTA: La miscela PDMS sembrerà opaca perché le bolle vengono generate durante il processo di miscelazione.
AVVISO: Per evitare che la pelle entri in contatto con sostanze chimiche potenzialmente pericolose o materiale biologico, indossare sempre un camice da laboratorio e guanti di plastica usa e getta per tutto il protocollo e seguire eventuali protocolli di sicurezza specifici secondo il Materiale Scheda tecnica di sicurezza (MSDS). - Degas la miscela PDMS in una camera a vuoto per 45 min a RT. Per accelerare il processo, rilasciare periodicamente il vuoto per scoppiare le bolle che si formano all'interfaccia.
NOTA: Il processo di degassamento deve essere eseguito entro 1 h per evitare che la miscela PDMS inizi a curare. - Togliere la polvere dalla superficie del maestro con un detergente pressurizzato, quindi versare la miscela PDMS degassata sul master e cuocere in forno a 80 gradi per 2 ore.
NOTA: In alternativa, cuocere durante la notte (o per almeno 12 h) a 60 gradi centigradi otterrebbe lo stesso PDMS indurito. - Tagliare il PDMS con una lama intorno alle microstrutture (a una distanza di circa 5 mm) e quindi sbucciare con cura il PDMS dal master.
- Forare i fori per fungere da ingresso e presa del microcanale (qui, un ingresso e una presa, vedere Figura 1A). Assicurarsi che nulla tocchi la faccia inferiore del PDMS in cui si trovano le funzioni.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Il microcanale deve essere sigillato con nastro adesivo per evitare l'accumulo di polvere e altre particelle durante lo stoccaggio. - Legare il microcanale PDMS a uno scivolo di vetro.
- Pulire accuratamente uno scivolo di vetro con sapone, isopropanolo e acqua deionizzata. Lasciare asciugare il vetro o utilizzare aria compressa per accelerare il processo.
- Rimuovere le particelle di polvere tamponando con nastro adesivo. Legare il microcanale PDMS sul vetrino di vetro pulito, subito dopo aver trattato entrambe le superfici con plasma (utilizzando un sistema corona o una camera di ossigeno al plasma) per 2 min.
- Posizionare il dispositivo microfluidico per riscaldare su una piastra calda a 80 gradi centigradi per almeno 1 h per rafforzare il legame chimico con il vetro.
2. Fabbricazione del dispositivo Millifluidico stampato in 3D per l'esperimento con impulsi multipli
- Progettare la forma 3D utilizzando il software di progettazione 3D e stampare il master per lo stampo PDMS con una stampante 3D ad alta risoluzione (Figura 1B).
NOTA: Vedere Tabella dei materiali per la stampante 3D e il materiale di stampo utilizzato per creare la master. - Ripetete i passaggi da 1,3 a 1,4, quindi pulite la superficie del master tamponando con del nastro adesivo. Mettere il master su una scala, quindi, evitando la regione centrale del maestro che sarà occupato dalla membrana, versare l'esatta quantità di miscela PDMS non curata (qui, 23.4 g) al fine di ottenere l'altezza desiderata di PDMS abbinando l'altezza del master (qui, 0,5 mm). Rimuovere le bolle rimanenti con l'aiuto di aria compressa.
- Collocare il PDMS sul master in un forno a 45 gradi centigradi per cuocere per almeno 12 h.
- Legare lo stampo PDMS 3D a un piatto Petri.
- Togliere delicatamente lo strato PDMS indurito e punzonare i fori di presa e di uscita per l'iniezione dellasospensionebatterica ( Figura 1C).
- Attivare sia la superficie di un piatto Petri (90 mm x 15 mm) che lo stampo PDMS con plasma di ossigeno per 2 min. Premere delicatamente lo stampo per il piatto Petri, ma non premere dove si trovano le caratteristiche in quanto questo può far crollare la camera di interrogatorio.
- Mettere la piastra Petri legata allo stampo 3D PDMS in forno a 45 gradi centigradi per almeno 12 h per rafforzare il legame chimico.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
- Funzionalizzazione della superficie della membrana18
- Attivare la membrana di policarbonato nanoporoso (PCTE) in una camera al plasma di ossigeno per 1 min a RT.
AVVISO: Evitare di utilizzare un sistema corona per l'attivazione del plasma perché danneggerà la membrana. - Sotto un cofano chimico, diluire una soluzione commerciale di 3-aminopropyltriethysilane (APTES) in acqua deionizzata per 1% in volume (qui, 40 mL), utilizzando un tubo di polipropilene.
AVVISO: La soluzione APTES è acutamente tossica (MSDS punteggio di rischio per la salute 3) e deve essere gestita con estrema cura esclusivamente sotto un cappuccio chimico con guanti. Cambiare i guanti subito dopo aver maneggiato la soluzione APTES. I fumi APTES sono distruttivi per le membrane mucose e per il tratto respiratorio superiore. Gli organi bersaglio di APTES sono nervi, fegato, e rene. Se non è disponibile un cappuccio a fumi, deve essere implementato uno scudo facciale e un respiratore integrale. - Trasferire la soluzione APTES diluita in una piastra Petri e immergere la membrana attivata nella soluzione APTES per 20 min.
- Rimuovere la membrana dalla soluzione APTES con una pinzetta e posizionarla su una salvietta camera pulita per asciugare.
- Attivare la membrana di policarbonato nanoporoso (PCTE) in una camera al plasma di ossigeno per 1 min a RT.
- Per la fabbricazione dei canali microfluidici PDMS che si trovano sulla membrana e consentono il lavaggio dell'arena batterica, ripetere i passaggi 1.1.1.7.
- Legare i canali di lavaggio PDMS alla membrana funzionalizzata.
- Attivare sia il canale di lavaggio PDMS che la membrana PCTE con una camera al plasma di ossigeno per 2 min.
NOTA: La membrana, che verrà inserita tra due strati PDMS, deve essere più piccola del canale di lavaggio PDMS. - Subito dopo il trattamento al plasma, portare a contatto la membrana funzionalizzata e il canale di lavaggio PDMS premendo delicatamente il canale di lavaggio PDMS sulla membrana.
NOTA: Non applicare una pressione eccessiva in questa fase, perché potrebbe causare l'attaccamento (irreversibile) della membrana al tetto del canale, bloccando il canale.
- Attivare sia il canale di lavaggio PDMS che la membrana PCTE con una camera al plasma di ossigeno per 2 min.
- Sandwich la membrana tra due strati PDMS (Figura 1E).
- Attivare sia il canale di lavaggio PDMS laminato incollato: la membrana PCTE precedentemente legata alla parabola Petri con una camera al plasma di ossigeno per 2 minuti.
- Mettere la piastra Petri legata alla struttura a sandwich in forno a 45 gradi centigradi per almeno 12 h per rafforzare il legame chimico.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Cultura cellulare
- Far crescere una popolazione di V. ordalii (ceppo 12B09 o 12B09pGFP) durante la notte per 20 h in 2216 medio19 su uno shaker orbitale (600 giri/ ) a 30 gradi centigradi e raccogliere le cellule in fase avanzata esponenziale. Per gli isolati che ospitano la pFP, aggiungere la spettronomia (50 g mL-1) per mantenere il plasmide.
- Centrifugare un 1 mL di cellule a 2500 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e ri-sospendere le cellule in 1 mL di acqua di mare artificiale filtrata. Ripetere questo passaggio.
- Morire di fame la popolazione di V. ordalii su uno shaker orbitale (600 giri/min) a 30 gradi centigradi per 3 h.
- Preparare una soluzione di acqua di mare artificiale di 10 mM (qui, 1 mL) di 4-methoxy-7-nitrondolinyl-cinvecchiato-L-glutamate (MNI-caged-L-glutamate) e conservare a -20 gradi centigradi.
NOTA: Proteggere la soluzione MNI-caged-L-glutamate dalla luce ambientale per prevenire la fotolisi. - Diluire le cellule 50x re-suspending the amated the amated the amavedcells in an artificial seawater solution of 1 mM MNI-caged- L-glutamate.
NOTA: Questo garantirà una concentrazione batterica finale inferiore a 5 x 107 mL-1 (il valore esatto dipende dalla concentrazione iniziale delle cellule in esponenziale tardiva, che in genere è di 109 mL-1). La concentrazione batterica è stata stimata utilizzando uno spettrofotometro a densità ottica (OD) di 600 nm.
4. Calibrazione del protocollo di disfacamento
- Collocare una goccia (20 ) di una soluzione artificiale di acqua di mare di MNI-caged- L-glutamate20 ad una concentrazione C0 - 10 mM su uno scivolo di vetro. Incapsulare la goccia coprendola con una camera circolare PDMS (diametro d 5 mm, altezza h - 250 m).
- Posizionare la vetrina di vetro su uno stadio al microscopio ed esporre l'intera camera per 20 ms a un fascio LED ad una lunghezza d'onda di 395 nm (potenza 295 mW) utilizzando un obiettivo 4x (apertura numerica [NA] - 0,13).
- Aprire la camera PDMS ed estrarre una goccia (1 l) per l'analisi con uno spettrofotometro UV-Vis.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.3 per diverse durate di illuminazione a LED di 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (o fino alla saturazione della reazione chimica) e 0 s (per ottenere lo sfondo). Replicare i passaggi della procedura 4.1/4.4 almeno 3x (qui, 4x).
- Dallo spettro di assorbimento, estrarre il valore a 405 nm, che rappresentano il picco nello spettro di assorbimento della molecola gabbia21. Per determinare il tasso k della reazione chimica di disfalazione da parte dell'esposizione al LED14, utilizzare la seguente equazione di cinetica di primo ordine per l'adattamento numerico dei datisperimentali 17
dove C(t) è il valore dello spettro di assorbimento della soluzione a 405 nm (dopo la rimozione dello sfondo) con un tempo di disintazione di t secondi. Per un tempo di disintaggio ridotto t tale che kt 1, Eq. 1 può essere semplificato alla formulazione lineare
5. Esperimento a impulso chimico singolo
- Mantenere il canale microfluidico sotto vuoto per 20 min per ridurre la concentrazione di gas all'interno del PDMS in modo che le bolle siano meno propense a formarsi durante il processo di riempimento.
- Estrarre il canale dalla pompa a vuoto e introdurre immediatamente la sospensione battericadiluita in 1 mM MNI-cinvecchiato- L-glutammato in acqua di mare artificiale nel microcanale delicatamente utilizzando una micropipetta per evitare danni flagellari da parte di forze di taglio meccaniche (qui, l'intero processo di riempimento ha preso 5-10 s). Dopo aver riempito il canale con le sospensioni batteriche, aspirare la soluzione in eccesso con il tovagliolo di carta e sigillare l'ingresso e la presa con i tappi PDMS premendoli delicatamente nei fori.
NOTA: In questo modo, il flusso di liquidi nella camera è impedito. - Posizionare il microcanale su uno stadio al microscopio e spostare lo stage per impostare il campo visivo a metà canale. Impostare il microscopio per eseguire l'imaging in contrasto di fase (4x obiettivo) ad una frequenza fotogrammi di 12 fps.
NOTA: Questo valore può essere variato, ma non deve essere inferiore a 10 fps per consentire la ricostruzione delle traiettorie batteriche attraverso l'analisi delle immagini (vedere la sezione protocollo 7). - Impostare il foro stenopeico del fascio LED all'apertura minima. Impostando il tempo di esposizione della fotocamera su 5 s, registrare alcuni fotogrammi per ottenere misurazioni precise della posizione spaziale e delle dimensioni del fascio LED.
NOTA: La sorgente luminosa a LED si collega all'illuminatore di epi-fluorescenza del microscopio tramite connessione di guida a luce liquida. Il fascio LED non influisce sulla cattura video, perché l'acquisizione di video e la stimolazione LED sono comandata in modo indipendente tramite software. - Eseguire l'imaging continuo per una durata totale di 10 min (20 min per l'impulso chimico più grande) e contemporaneamente attivare il fascio LED focalizzato a 395 nm per la durata desiderata (in questo esperimento, t 20 ms, 100 ms, 500 ms) in un punto temporale definito dall'utente (qui, 10 s dopo l'inizio dell'acquisizione video) tramite il software del microscopio. Per ottenere repliche multiple dello stesso processo, spostare lo stage per registrare la risposta batterica su diverse posizioni del canale microfluidico. Replicare questa procedura per ogni dimensione dell'impulso, utilizzando un nuovo microcanale.
NOTA: il processo di disconnessione genera un impulso cilindrico assisimmetrico che si diffonde radialmente verso l'esterno nel piano di imaging. - Condurre esperimenti separati senza uncaging chimico a un ingrandimento più elevato (20x obiettivo, NA - 0,45) ad una frequenza fotogrammi più alta (50 fps) per registrare il movimento di nuoto imparziale dei batteri.
6. Esperimento multi-impulso chimico
- Mantenere la camera millifluidica sotto vuoto per 20 min.
- Posizionare il piatto Petri contenente la camera millifluidica su uno stadio al microscopio. Riempire la camera sotto la membrana con la sospensione batterica diluita (qui, l'intero processo di riempimento ha preso 10-15 s) di GFP-fluorescente V. ordalii in 1 mM MNI-caged- L-glutamate soluzione in acqua di mare artificiale. Dopo aver riempito il canale con le sospensioni batteriche, aspirare la soluzione in eccesso con il tovagliolo di carta e sigillare l'ingresso e la presa con i tappi PDMS premendoli delicatamente nei fori.
NOTA: In questo modo, il flusso di liquidi nella camera è impedito. Per consentire una migliore visualizzazione dei batteri in questa configurazione in cui l'imaging avviene attraverso la membrana nanoporosa, si consiglia vivamente di utilizzare ceppi fluorescenti invece del tipo selvaggio (come utilizzato nell'esperimento singolo impulso chimico). - Riempire una siringa con una soluzione artificiale di acqua di maredi 1 mM MNI-caged- L-glutamate e attaccare tubi per l'ingresso e la presa del canale di lavaggio sopra la membrana.
- Collegare il tubo a un serbatoio di rifiuti e assicurarsi che il tubo sia interamente immerso nel serbatoio dei rifiuti liquidi per evitare oscillazioni di pressione.
- Impostare la portata appropriata sulla pompa della siringa (qui, 50 min-1) per ottenere la portata media desiderata nel canale di lavaggio, che dipende dalla geometria del canale.
- Avviare la pompa della siringa per stabilire il flusso nel canale di lavaggio sopra la membrana.
- Eseguire il software di controllo del fascio LED e fase microscopio per generare sequenze definite dall'utente di impulsi in luoghi diversi e con intensità diverse.
NOTA: Il flusso continuo della soluzione di acqua di mareartificiale di 1 mM MNI-caged- L-glutamate nel canale di lavaggio sopra la membrana rifornisce la soluzione composta in gabbia e lava il mezzo esaurito dall'arena batterica. - Registrare video utilizzando un obiettivo 4x a intervalli di tempo regolari per un periodo di diverse ore e su più posizioni contigue per coprire una grande superficie (qui, 1 cm x 1 cm, Figura 1F).
7. Analisi delle immagini e analisi dei dati
- Ricostruzione delle traiettorie batteriche
- Dai film registrati con l'obiettivo 4x, ricostruire le traiettorie batteriche utilizzando il software di monitoraggio17.
NOTA: Queste traiettorie rappresentano le proiezioni 2D del moto batterico 3D nel microcanale. - Dalle traiettorie batteriche ricostruite, determinare la velocità di deriva radiale di ogni individuo che nuota proiettando la sua velocità di nuoto sulla direzione verso il centro dell'impulso chimico (Figura 2D). Per la visualizzazione delle dinamiche spazio-temporali della velocità di deriva radiale, utilizzare una griglia di binning con dimensione spaziale 75 x 75 m e finestra temporale di intervallo di 5x10 s (Figura 2D,E).
NOTA: a causa della simmetria cilindrica del processo, i dati possono essere analizzati in coordinate polari e mediati sulla dimensione angolare (Figura 3). - Dalle traiettorie batteriche ricostruite, determinare le dinamiche spatio-temporali della distribuzione dei batteri che rispondono agli impulsi chimici (Figura 2E).
- Dai filmati ad alta risoluzione registrati con l'obiettivo 20x durante gli esperimenti a impulso singolo, estrarre la distribuzione della velocità di nuoto e del tempo di esecuzione per la popolazione batterica in quanto rispondono all'impulso chimico (Figura 4).
- Dai film registrati con l'obiettivo 4x, ricostruire le traiettorie batteriche utilizzando il software di monitoraggio17.
- Stimare il coefficiente di diffusione dei batteri considerando la dinamica di dissipazione della popolazione batterica dopo chemiotassi è completato17 (qui, per t > 300 s; Figura 3).
- Stimare il coefficiente di diffusione del glutammato applicando l'equazione di Stokes-Einstein
dove si presume che le molecole di aminoacidi siano particelle sferiche con raggio idrodinamico22rG, kB è la costante di Boltzmann (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T è la temperatura (296 K), e s è la viscosità dinamica dell'acqua di mare artificiale (salinità 36 g kg-1) a 23 s (10-3 s23)
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Representative Results
Abbiamo usato i dispositivi microfluidici e millifluidici (Figura 1) per studiare i profili di accumulo batterico in condizioni di nutrienti dinamiche. Le traiettorie batteriche sono state estratte da video registrati acquisiti mediante microscopia a contrasto di fase della dinamica di dissipazione dell'accumulo di una popolazione batterica a seguito di un impulso chimico rilasciato dalla fotolisi (Figura 2 e Figura 3). Mediando milioni di traiettorie, sono state ottenute le dinamiche spatiotemporali della velocità di deriva radiale e della concentrazione batterica. Le statistiche che descrivono il nuoto in assenza di un gradiente chimico sono state ottenute in esperimenti separati con maggiore risoluzione spaziale e temporale (Figura 4).
Figura 1: dispositivi microfluidici e millifluidi per esperimenti batterici in condizioni di nutrienti dinamici. (A) Fotomaschera del canale microfluidico utilizzato per osservare l'accumulo batterico in un singolo impulso chimico. (B) Fotomaschera del canale microfluidico utilizzato per lavare la camera batterica millifluidica per gli esperimenti multi impulso. I piccoli punti sono micropilastri (di 200 m) che aiutano il legame della membrana al PDMS e allo stesso tempo aiutano a prevenire la deformazione o la crollazione della membrana al centro. (C) Disegno del master stampato in 3D utilizzato per creare la camera batterica. (D) Lo strato PDMS con il patterning della camera batterica. (E) Il dispositivo millifluidico completo (vista superiore, membrana PCTE in bianco). (F) Schematica del dispositivo millifluidico per la generazione di condizioni di nutrienti dinamici (vista laterale). Il diagramma a raggi ottici è mostrato nella parte inferiore del dispositivo, dove un fascio viola (395 nm) esegue lo sblocco del chemioattraente, mentre un fascio blu (indipendente) (470 nm) viene utilizzato per l'osservazione di batteri fluorescenti (harboring pGFP) attraverso una telecamera sCMOS, che cattura la densità batterica (centro inferiore). Il dispositivo è posizionato su uno stadio motorizzato (in basso a destra), che può essere spostato nel piano x-y per rilasciare impulsi chimici in posizioni definite dall'utente (controllato tramite software NIS, in basso a sinistra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risposte batteriche rappresentative a un impulso chimico. (A,B) Proiezione di intensità massima che mostra la posizione batterica (bianco) su un intervallo di 0,5 s, mostrata (A) immediatamente dopo, e (B) 40 s dopo il rilascio dell'impulso (obiettivo: 4x, NA - 0,13, Ph 2; registrazione video a 12 fps). (C) Le traiettorie batteriche (nere) hanno mostrato 60 s dopo il rilascio dell'impulso. La regione ombreggiata rappresenta l'impulso chimico rilasciato dalla fotolisi a t - 0 s al centro del campo visivo (croce nera), che successivamente si diffonde. Le traiettorie sono state ricostruite utilizzando un software interno personalizzato. (D,E) Dinamica temporale della velocità di deriva radiale (D) e della concentrazione batterica (E) a seguito di un rilascio di impulsi al centro del campo visivo. Nel pannello D, i valori negativi della velocità di deriva (in colore blu) corrispondono al movimento chemiotattico diretto verso il centro dell'impulso. Questa cifra è stata modificata dopo Brumley etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: profili Spatio-temporali della velocità di deriva radiale e della concentrazione batterica a seguito di un rilascio di impulsi chimici. (A,B) La velocità di deriva radiale (A) e la concentrazione batterica (B) in funzione del tempo e della distanza dal centro di un impulso di glutammato 35 M. Nel pannello A, i valori negativi della velocità di deriva (in colore blu) corrispondono al movimento chemiotattico diretto verso il centro dell'impulso. I valori sono stati calcolati calcolando la media su tutte le traiettorie. La linea tratteggiata nera a t - 250 s delimita approssimativamente il periodo di chemiotassi attiva (ombreggiatura blu nel pannello A, regione I), dopo di che le celle si diffondono isotropicalmente verso l'esterno (ombreggiatura verde nel pannello A, regione II). (C) Concentrazione batterica (ridimensionata sullo sfondo B0) in funzione della distanza a t : 10, 30, 60 s dopo la creazione di un impulso chimico di diffuso. I batteri si aggregano vicino al sito dell'impulso a causa della chemiotassi. (D) La concentrazione batterica impiega 20 dollari per rilassarsi sullo sfondo B0 per diffusione batterica. L'insetto mostra l'adattamento della diffusione diffusa della diffusione diffusiva con un coefficiente di diffusione di DB - 165 m2 s-1. I pannelli A, C e D sono stati modificati da Brumley etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Statistiche di nuoto per una popolazione batterica in assenza di gradienti chimici. (A) Le traiettorie rappresentano le proiezioni bidimensionali del moto batterico tridimensionale nel microcanale. Le traiettorie batteriche vengono estratte utilizzando uno script di monitoraggio interno personalizzato. Qui la croce blu indica l'inizio della traccia, e i simboli rossi e verdi indicano eventi di riorientamento. I dati sono stati registrati a 50 fps con un obiettivo 20x, NA 0.45. (B) Distribuzione di probabilità della velocità di nuoto batterica misurata (nero) insieme a una distribuzione gamma adatta (blu). Poiché la profondità di messa a fuoco durante l'imaging con un obiettivo 20x (NA 0.45) è di pochi micron24, le traiettorie registrate sono essenzialmente planari e le misurazioni della velocità di nuoto non sono distorte dalla proiezione. (C) Distribuzione probabile del tempo tra riorientamenti successivi. Questi dati sono stati necessari per calibrare efficacemente un modello basato su singoli che tiene conto del modello di riorientamento, della distribuzione della velocità di nuoto e delle statistiche di riorientamento degli organismi. Questa cifra è stata modificata da Brumley etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo metodo consente ai ricercatori di studiare la chemiotassi batterica sotto gradienti controllati e dinamici in dispositivi micro e millifluidi, consentendo l'acquisizione di dati riproducibili. La creazione quasi istantanea di impulsi chimici su microscala mediante fotolisi mira a riprodurre i tipi di legumi nutritivi che i batteri incontrano in natura da una serie di fonti, ad esempio la diffusione diffusa dei pennacchi dietro le particelle marine che affondano25, o il nutriente che si diffonde dalle cellule di fitoplancton lismizzate26.
Abbiamo presentato due applicazioni di questo metodo: 1) il rilascio di un singolo impulso chimico per studiare la dinamica di accumulo batterico-dissipazione a partire da condizioni uniformi, e 2) il rilascio di impulsi multipli per caratterizzare l'accumulo di profili batterici in condizioni di nutrienti non-equilibrio. La prima applicazione è particolarmente adatta a caratterizzare le risposte comportamentali dei microbi quando si incontra per la prima volta una fonte di nutrienti. In tali condizioni, in cui la concentrazione di molecole chemioattraenti è estremamente bassa, la prima fase della chemiotassi è dominata dagli eventi stocastici vincolanti-unbinding di molecole chemioattraenti ai chemorecettori17. Il nostro metodo, rilasciando rapidamente e con precisione una massa nota di chemioattraente in uno sfondo a base di nutrienti zero, offre vantaggi significativi rispetto agli approcci precedenti per caratterizzare la risposta batterica in condizioni dinamiche27,28,29. I vantaggi includono la conoscenza completa della distribuzione del chemioattraente in tutte le località e in ogni momento (poiché la sua diffusione è nota), ed evitare completamente la generazione di flusso di fluido che è intrinsecamente associata ad altri dispositivi, come il microiniere27 o le geometrie tridimensionali30.
Nella seconda applicazione, gli impulsi chimici si verificano in un dominio quasi-2D di grandi dimensioni secondo una sequenza definita dall'utente nello spazio e nel tempo che è completamente personalizzabile tramite software, che può essere utilizzato per imporre sequenze casuali o modelli particolari. È importante sottolineare che questo metodo fornisce un potente collegamento tra la dinamica comportamentale ad alta risoluzione della chemiotassi batterica e l'assorbimento dei nutrienti su scale temporali di secondi e dinamiche a lungo termine, come la crescita e l'evoluzione potenzialmente. L'arena batterica è notevolmente più grande (2 cm x 2 cm) della gamma spaziale di interazione chimica dei batteri con un singolo impulso (da centinaia di micrometri per gli impulsi più piccoli a pochi millimetri per i più grandi impulsi). La chiave per il mantenimento di un basso sottofondo chimico (molto inferiore alla concentrazione degli impulsi chimici al loro rilascio) è l'inclusione della membrana PCTE nanoporosa inserita tra i due strati pdMS18. Applicando un flusso fluido nel canale microfluidico posto nella parte superiore del dispositivo, un lavaggio continuo dei composti non incagliati e mezzo trascorso nell'arena batterica si realizza attraverso la diffusione molecolare attraverso la membrana nanoporosa, senza creare flusso nella sezione di prova del dispositivo in cui si trovano i batteri (Figura 1).
Modulando il fascio LED focalizzato nel tempo, l'ampiezza, le dimensioni e la geometria, la tecnologia di fotorelease conferisce allo sperimentatore una grande flessibilità per generare diversi tipi di ambienti chimici. Allo stesso tempo, mentre i test qui presentati sono stati eseguiti in condizioni quiescenti, il nostro metodo può essere ulteriormente ampliato per testare la chemiotassi batterica in diverse configurazioni di flusso. Ricostruendo fedelmente la dinamica di accumulo batterico attraverso la microscopia video, il nostro metodo genera grandi quantità di dati di alta qualità che possono essere utilizzati per stimare le statistiche del comportamento batterico e il potenziale assorbimento di nutrienti da parte delle cellule batteriche. Il nostro approccio microfluidico sperimentale, che imita i paesaggi nutritivi che i batteri potrebbero affrontare in condizioni ambientali naturali, consente di studiare sistematicamente il comportamento di foraggiamento delle specie microbiche che sono essenziali nel ciclo dei nutrienti alla scala macroscopica2,3. Di conseguenza, il tipo di dati generati attraverso questa metodologia è utile per calibrare efficacemente i tassi di assorbimento della popolazione e derivare meglio la cinetica dei nutrienti nei modelli ecosistemici mesoscala.
La fabbricazione degli stampi PDMS per realizzare la grande arena batterica è stata eseguita utilizzando un servizio di stampa 3D commerciale. Tuttavia, risultati simili possono essere ottenuti utilizzando una stampante 3D di fascia alta in casa, con una risoluzione di 50-100 m necessaria per risolvere le caratteristiche più piccole dei progetti a microcanale. Una superficie liscia del materiale stampato in 3D per lo stampo PDMS è necessaria per ottenere un buon legame tra il PDMS fuso e le altre superfici del dispositivo (ad esempio, vetro, polistirolo, PDMS). Per la nostra applicazione, l'uso di un piatto Petri in polistirolo (90 mm x 15 mm) come superficie inferiore dell'arena 3D presenta due vantaggi rispetto all'uso di uno scivolo di vetro comunemente impiegato negli studi di microfluidica: in primo luogo, riduce notevolmente l'attaccamento delle cellule batteriche rispetto a una superficie di vetro (anche se l'attacco potrebbe dipendere dalle particolari proprietà superficiali del microbo in esame); in secondo luogo, fornisce un contenimento secondario, che può prevenire la fuoriuscita di supporti su apparecchiature di microscopia in caso di fuoriuscite. Il processo di polimerazione dello stampo PDMS si verifica in genere ad una temperatura elevata (70-80 gradi centigradi), ma in questa applicazione lo sperimentatore deve cuocere lo stampo PDMS a una temperatura notevolmente inferiore (45 gradi centigradi nel caso attuale, vedi Tabella dei materiali), sotto la deflessione termica e la temperatura di fusione del materiale utilizzato per la stampa 3D del master. La temperatura di cottura più bassa allunga notevolmente il processo di stagionatura (durante la notte), ma non modifica le proprietà meccaniche e chimiche del PDMS.
Anche se il nostro metodo è stato applicato a una particolare combinazione di batteri e chemioattraenti, la metodologia è adatta per testare diversi processi biologici, tra cui l'assorbimento di nutrienti o l'esposizione agli antibiotici, e può essere applicato a sistemi modello di diverse specie e chemioattraenti, dato che una miriade di molecole sono state (o possono essere) in gabbia8. Una limitazione potenziale deriva dai costi dei composti in gabbia disponibili in commercio, ma questi costi sono paragonabili a quelli sostenuti quando si utilizzano le sonde molecolari tipicamente impiegate nelle scienze della vita per la vitalità cellulare, il conteggio o la colorazione intracellulare. Nonostante questa potenziale limitazione, la metodologia proposta può trovare ampie applicazioni nelle scienze biofisiche e biomediche, per caratterizzare le risposte iniziali e le dinamiche di adattamento delle popolazioni microbiche a risoluzione cellulare singola a gradienti chimici dinamici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la PRIMA struttura di microfabbricazione del PEE di zurighese. Questo lavoro è stato sostenuto da un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (a D.R.B.), un Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (a R.S.), e una sovvenzione della Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (a R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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