Summary
マイクロ流体およびミリ流体のセットアップ内の光の解析による動的化学景観の生成のためのプロトコルが提示されます。この方法論は、単一細胞および集団レベルの両方で、運動行動、栄養取り込み、または微生物の化学物質への適応を含む多様な生物学的プロセスを研究するのに適している。
Abstract
マイクロスケールで局所的な化学誘起物質が突然利用可能になる制御された動的化学パルスの生成方法を実証し、微生物走化実験のためのマイクロ環境を作り出す。化学パルスを作製するために、細菌懸濁液を含むポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体室内でカゲアミノ酸を光分解することで、ほぼ瞬時にアミノ酸源を導入するシステムを開発しました。この方法を走化細菌、ビブリオ・オルダリに応用し、ビデオ顕微鏡で追跡しながらこれらの動的化学勾配を積極的に登ることができる。アミノ酸は、フォトリムーバル可能な保護基による化学的修飾によって生物学的に不活性('caged')をレンダリングし、懸濁液中に均一に存在するが、ほぼUV-A焦点を当てたLEDビームによって時間と空間のユーザー定義のポイントで発生する突然の放出まで消費できない。パルスで放出される分子の数は、光分解後の吸収スペクトルがUV-Vis分光法を用いて特徴付けられる露光時間と非定率との間の較正関係によって決定することができる。ナノ多孔性ポリカーボネート(PCTE)膜をマイクロ流体デバイスに組み込み、解毒された化合物および使用済み培地の流れによる連続的な除去を可能にすることができる。PCTE膜とPDMSマイクロ流体構造との間の強く不可逆的な結合は、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の溶液で膜をコーティングし、続いて結合する表面のプラズマ活性化によって達成される。コンピュータ制御システムは、異なる場所で異なる強度を持つパルスのユーザー定義シーケンスを生成し、所定の空間的および時間的変動性を持つリソース景観を作成することができます。各化学環境において、個々のスケールでの細菌の動きのダイナミクスと集団レベルでの蓄積を得ることができるため、化学戦術性能の定量化と、生態学的に関連する環境における細菌凝集への影響が可能になる。
Introduction
微生物は、化学勾配を検出し、応答1で運動性を改変するプロセスである化学化学軸に依存して、化学景観をナビゲートし、栄養源と宿主にアプローチし、有害物質を脱出します。これらのマイクロスケールプロセスは、微生物とその環境2、3との間の相互作用のマクロスケールの動態を決定する。ソフトリソグラフィ4を含むマイクロ流体技術および微細加工技術の最近の進歩は、微生物の相互作用を研究する制御された微小環境を作り出す能力に革命をもたらしています。例えば、過去の実験では、高い栄養素濃度5、6の中間体から高い栄養濃度の高い制御、安定した勾配を生成することにより、細菌の走化を研究してきた。しかし、自然環境では、マイクロスケールの化学勾配は、分子拡散によって消失する短時間で、背景条件は高度に希釈されることが多い7である。微生物集団の化学化学反応を直接測定するために、微生物が自然界で遭遇する勾配を模倣し、微小流体技術と光流動を組み合わせる方法を考案し、ここで説明しました。
アンセジング技術は、生体分子を非アクティブな形で機能的にカプセル化する光感受性プローブを採用しています。照射は、ケージ分子を放出し、生物学的プロセスの標的摂動を可能にする8。細胞化学の迅速かつ正確な制御のために9,ケージ化合物の光分化は、伝統的に遺伝子 10 の活性化を研究する生物学者、生理学者や神経科学者によって採用されています10,イオンチャネル11,ニューロン12.最近では、科学者たちは、光化の重要な利点を利用して走化性13を研究し、段階的な化学誘引刺激刺激物14、15にさらされた個々の細菌細胞のフラグラスイッチングダイナミクスを決定し、3次元(3D)勾配16における単一精子細胞の運動パターンを調査した。
我々のアプローチでは、マイクロ流体デバイス内でケージアミノ酸の光分化を実施し、光放出を通じてほぼ瞬時に入手可能になる制御された化学パルスに対する細菌集団の行動応答を研究する。低倍率(4倍)目標(NA = 0.13、焦点深度約40μm)を使用することで、大視野(3.2 mm x 3.2 mm)にわたる数千もの細菌の集団レベルの凝集応答を観察し、単一細胞レベルでの運動の測定を可能にします。この方法の2つの用途を提示する:1)均一な条件から始まる細菌の蓄積−放散ダイナミクスを研究するための単一の化学パルスの放出、および2i)時間変動、空間的に不均一な化学誘引条件下での細菌蓄積ダイナミクスを特徴付ける複数のパルスの放出。この方法は、アミノ酸グルタミン酸17に向かって走化を行う海洋細菌ビブリオダリに対して試験されているが、この方法は、種および化学誘引物質の異なる組み合わせ、ならびに化学原性を超える生物学的プロセス(例えば、栄養取り込み、抗生物質暴露、クォーラムセンシング)に広く適用可能である。このアプローチは、現実的な環境における微生物の生態と挙動を解明し、一時的な動的勾配をナビゲートする際に個々の細菌が直面する隠れたトレードオフを明らかにすることを約束します。
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Protocol
1. 単一化学パルス実験のためのマイクロ流体装置の作製
- コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用してチャンネルを設計し、透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します(図1A)。
- 柔らかいリソグラフィー(清潔な部屋の条件下で)によってマスターを製造する。
- アセトン、メタノール、イソプロパノールでシリコンウエハ(4インチ)を連続して清掃し、窒素を使用して乾燥させます。ウエハをオーブンで130°Cで5分間焼きます。
- ウエハをスピンコーターの中心に置き、SU-8フォトレジストをウェーハに注ぎます。スピンコーターの速度を5s以上500rpmまでランプし、10sの500 rpmに保ち、10s以上の最終速度までランプアップし、30sのこの速度で維持します。
注: 最終速度の正確な値は、ターゲットコーティングの厚さと使用される SU-8 によって異なります。 - スピンコーティング処理後、ウエハを65°Cで焼き、次いで95°Cで焼きます。ウエハを室温(RT)で少なくとも5分間冷やします。
注:焼き時間は、ターゲットの厚さと使用されるフォトレジストの種類によって異なります。原則として、100 μm層ごとに、ウエハを 65 °C で 5 分間、95 °C で 45 分間焼く必要があります。 - フォトマスクをウェーハの上に置き、目的の領域だけを露出させ、重合することを確認します。SU-8マニュアルで推奨時間のためのUV光に露出。
注:ここでは、350nmの波長で200mJcm-2の露光エネルギーを用い、ウエハを150sで露光した。 - SU-8マニュアルで推奨される時間のために65°Cと95°Cでウエハを焼きます。
注: 原則として、100 μm 層ごとに、ウエハを 65 °C で 5 分間、95 °C で 45 分間焼く必要があります。 - マスターを得るために、ポリメタクリル酸(PMMA)現像剤を充填したビーカーにウエハを浸す。ビーカーを軽く振って、未重合フォトレジストを洗い流します。マスターを200°Cで焼き、SU-8層をさらにクロスリンクします。
- エラストマーと硬化剤(材料表)をビーカーで10:1の比率(ここでは40 mL)と組み合わせて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物を調製する。液体が均質になるまで激しく混ぜます。
注: 混合プロセス中に泡が生成されるため、PDMS の混合は不透明に見えます。
注意:潜在的に有害な化学物質や生物学的材料に皮膚が接触するのを防ぐために、常にプロトコル全体でラボコートと使い捨てプラスチック手袋を着用し、材料に従って特定の安全プロトコルに従ってください安全データシート (MSDS)。 - RTで45分間真空チャンバーにPDMS混合物を脱ガスする。プロセスを迅速化するには、インタフェースで形成される気泡を破裂させるために定期的に真空を解放します。
注: PDMS 混合物が硬化し始めないように、脱ガス処理は 1 時間以内に行わなければなりません。 - 加圧クリーナーでマスターの表面からほこりを取り除き、その後、脱気したPDMS混合物をマスターに注ぎ、80°Cのオーブンで2時間焼きます。
注:あるいは、60 °Cで一晩(または少なくとも12時間)焼くことは同じ硬化PDMSを達成するでしょう。 - マイクロ構造の周りに(約5mmの距離で)ブレードでPDMSを切断し、慎重にマスターからPDMSを剥がします。
- マイクロ流路の入口および出口として機能する穴をパンチします(ここでは、1つの入口と1つの出口、図1Aを参照)。機能が配置されている PDMS の下面に何も触れないようにします。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。マイクロチャネルは、保管中にほこりや他の粒子が蓄積するのを防ぐために、粘着テープで密封する必要があります。 - PDMSマイクロチャンネルをガラススライドに接着します。
- 石鹸、イソプロパノール、脱イオン水でガラススライドを十分に清掃します。ガラスを乾燥させるか、圧縮空気を使用してプロセスをスピードアップします。
- 粘着テープでダビングしてほこり粒子を取り除きます。PDMSマイクロ流路をクリーンなガラススライドに接着し、両方の表面をプラズマで処理した直後(コロナ系またはプラズマ酸素チャンバーのいずれかを使用して)2分間。
- マイクロ流体装置をホットプレート上の80°Cで少なくとも1時間加熱し、ガラスとの化学結合を強化します。
2. 複数パルスを用いた実験のための3Dプリントミリ流体デバイスの製造
- 3D 設計ソフトウェアを使用して 3D 形状を設計し、高解像度 3D プリンタで PDMS 金型用マスタを印刷します (図 1B)。
注: マスターの作成に使用する 3D プリンタおよび金型材料については、「マテリアルの表」を参照してください。 - 手順1.3-1.4を繰り返し、粘着テープでダビングしてマスターの表面を清掃します。マスターをスケールに置き、次に、膜によって占有されるマスターの中央領域を避けながら、マスターの高さを一致させることによりPDMSの所望の高さを得るために、未硬化PDMS混合物の正確な量(ここでは23.4g)を注ぎます(ここでは、 0.5 mm)。圧縮空気の助けを借りて、残りの気泡を取り除く。
- 45 °Cのオーブンでマスターに投下されたPDMSを置き、少なくとも12時間焼きます。
- 3D PDMS金型をペトリ皿に接着します。
- 硬化したPDMS層を軽く剥がし、細菌懸濁液を注入するためのパンチ入口と出口穴(図1C)。
- ペトリ皿(90 mm x 15 mm)と酸素プラズマを用いたPDMSモールドを2分間有効にします。金型をペトリ皿にそっと押し込みますが、尋問室を崩壊させる可能性がありますので、機能が置かれている場所を押しません。
- PDMS 3D型に接着したペトリ皿を、少なくとも12時間オーブンのオーブンに入れ、化学結合を強化する。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。
- 膜表面機能化18
- RTで1分間酸素プラズマ室でナノ多孔性ポリカーボネート(PCTE)膜を活性化します。
注意:プラズマの活性化には膜が損傷するため、コロナシステムを使用しないでください。 - 化学フードの下で、ポリプロピレンチューブを用いて、脱イオン水中の3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の市販液を1%分(ここでは、40mL)に希釈する。
注意: APTESソリューションは急性毒性(MSDS健康ハザードスコア3)であり、手袋付きの化学フードの下でのみ細心の注意を払って処理する必要があります。APTES ソリューションの処理後すぐに手袋を交換します。APTESの煙は粘膜および上気道に破壊的である。APTESの標的臓器は神経、肝臓、腎臓である。ヒュームフードが利用できない場合は、フェイスシールドと全面人工呼吸器を実装する必要があります。 - 希釈したAPTES溶液をペトリ皿に移し、活性化した膜をAPTES溶液に20分間浸漬します。
- ピンセットでAPTES溶液から膜を取り出し、クリーンルームワイプに入れ、乾燥させます。
- RTで1分間酸素プラズマ室でナノ多孔性ポリカーボネート(PCTE)膜を活性化します。
- 膜上に置かされ、細菌の場の洗浄を可能にするPDMSマイクロ流体チャネルの作製のために、ステップ1.1-1.7を繰り返す。
- PDMS洗浄チャネルを機能化膜に接着します。
- PDMS洗浄チャネルとPCTE膜の両方を酸素プラズマチャンバーで2分間活性化します。
注: 2 つの PDMS 層の間に挟まれる膜は、PDMS 洗浄チャネルよりも小さくする必要があります。 - 血漿処理の直後に、PDMS洗浄チャネルを膜にそっと押し込むことで、機能化された膜とPDMS洗浄チャネルを接触させます。
注: この段階では、流路の屋根に膜が(不可逆的に)付着し、チャネルがふける原因となる可能性があるため、この段階では過度の圧力をかけないでください。
- PDMS洗浄チャネルとPCTE膜の両方を酸素プラズマチャンバーで2分間活性化します。
- 2つのPDMS層の間に膜を挟み込む(図1E)。
- 結合した積層PDMS洗浄チャネル-PCTE膜と、以前にペトリ皿に結合した3D PDMSモールドを酸素プラズマチャンバーで2分間有効にします。
- サンドイッチ構造に接着したペトリ皿を、少なくとも12時間45°Cのオーブンに入れ、化学結合を強化します。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。
3. 細胞培養
- 30°Cで軌道シェーカー(600rpm)で2216培地19で20時間、後期指数相で細胞を収穫するために、V.オルダリ(株12B09または12B09pGFP株)の集団を一晩成長させる。pGFPを保持する分離株の場合は、プラスミドを維持するためにスペクチノマイシン(50 μgmL-1)を加えます。
- 3分間2500 x gで1mLの細胞アリコートを遠心分離し、上清を除去し、1 mLの濾過された人工海水で細胞を再懸濁させる。この手順を繰り返します。
- 3時間30°Cで軌道シェーカー(600rpm)でV.オルダリの集団を飢えさせる。
- 4-メトキシ-7-ニトロインドリニル-L-グルタミン酸(MNI-カゲド-L-グルタミン酸)の10mM(ここでは1mL)のストック人工海水溶液を調製し、-20°Cで保存する。
注:光の溶解を防ぐために、周囲の光からMNI-ケージL-グルタミン酸溶液を保護します。 - 1 mNI-ced-L-グルタミン酸の人工海水溶液中で飢えた細胞を再懸濁して細胞を50倍に希釈する。
注:これにより、5 x 107 mL-1未満の最終細菌濃度が保証されます(正確な値は後期指数関数の細胞の初期濃度に依存します。通常は〜109 mL-1です)。細菌濃度は、600nmの光学密度(OD)で分光光度計を用いて推定した。
4. アンケージプロトコルの校正
- MNI-caged-L-グルタミン酸20の人工海水溶液の液滴(20μL)を、ガラススライド上の濃度C0 = 10 mMに置きます。円形のPDMSチャンバーで覆って液滴をカプセル化します(直径d = 5 mm、高さh = 250 μm)。
- 顕微鏡ステージにガラススライドを置き、4倍の目的(数値開口[NA]=0.13)を使用して、395 nm(パワー295mW)の波長で20msのLEDビームにチャンバー全体を露出させます。
- PDMSチャンバーを開き、UV-Vis分光光度計で分析する液滴(1μL)を抽出します。
- 0.1 s、0.5 s、2.5 s、25 s、250 s (または化学反応が飽和するまで) および 0 s (バックグラウンドを取得する) の異なる持続時間について、ステップ 4.1-4.3 を繰り返します。手順 4.1-4.4 を少なくとも 3 倍 (ここでは 4x) に複製します。
- 吸収スペクトルから、405nmで値を抽出し、ケージ分子21の吸収スペクトルにおけるピークを表す。LED露光14による化学解光反応のレートkを求めるために、実験データ17の数値適合に対して以下の一次動力学式を用いる
ここで、C(t)は、405 nm (バックグラウンド除去後) の解液の吸収スペクトルの値で、t 秒の時間を取り除く。kt1、Eq. 1を線形製剤に簡略化することができるような小さな帯り付け時間t
5. 単一の化学パルス実験
- PDMS内のガス濃度を下げるために真空下でマイクロ流体チャネルを維持し、充填プロセス中に気泡が形成されにくくなるようにします。
- 真空ポンプから流路を抽出し、機械剪断力によるフラメラー損傷を避けるためにマイクロピペットを使用して人工海水中の1 mM MNI-カジド-L-グルタミン酸をマイクロチャネルにすぐに導入します(ここでは、充填プロセス全体が5〜10sかかりました)。管を細菌の懸濁液で満たした後、ペーパータオルで余分に溶液を吸い込み、入口と出口をPDMSプラグで密閉し、穴にそっと押し込みます。
注:このようにして、チャンバ内の流体の流れを防止します。 - マイクロチャンネルを顕微鏡のステージに置き、ステージを動かして中間チャンネルの視野を設定します。マイクロスコープをセットアップして、フレームレート 12 fps で位相コントラスト (4 倍の目的) でイメージングを行います。
注: この値は変化させることができますが、画像解析を通じて細菌の軌道を再構築できるように 10 fps 未満にしないでください(プロトコル セクション 7 を参照)。 - LEDビームのピンホールを最小開口に設定します。カメラの露光時間を5 sに設定して、数フレームを記録して、LEDビームの空間位置とサイズの正確な測定を得ます。
注:LED光源は液体のライトガイド接続によって顕微鏡の上蛍光の照光器に接続する。ビデオ集録とLED刺激はソフトウェアによって独立して命令されるため、LEDビームはビデオキャプチャに影響を与えません。 - 合計10分間(最大の化学パルスでは20分)の連続イメージングを行い、同時に、ユーザー定義の時点(ここでは、ビデオ取得開始後10秒)で、目的の持続時間(この実験ではt = 20 ms、100 ms、500ms)で395nmで集光LEDビームを活性化します。同じプロセスの複数の反復を得るために、段階を移動してマイクロ流体チャネルの異なる位置に細菌応答を記録する。新しいマイクロチャネルを使用して、パルス サイズごとにこの手順をレプリケートします。
注: このアンセアーシング プロセスは、イメージング 平面内で放射状に外側に拡散する軸対称円筒形パルスを生成します。 - 高い倍率(20倍の目的、NA = 0.45)で、細菌の偏りのない泳動を記録するために、より高いフレームレート(50 fps)で化学的に抜け出すことなく別々の実験を行います。
6. 複数の化学パルス実験
- 20分間真空下でミリ流体室を維持します。
- ミリ流体室を含むペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。膜の下のチャンバーを、人工海水中の1mM MNI-caged-L-グルタミン酸溶液中のGFP蛍光V.オルダリイの希薄な細菌懸濁液(ここでは、充填プロセス全体が10〜15秒かかった)で満たします。管を細菌の懸濁液で満たした後、ペーパータオルで余分に溶液を吸い込み、入口と出口をPDMSプラグで密閉し、穴にそっと押し込みます。
注:このようにして、チャンバ内の流体の流れを防止します。ナノ多孔膜を通してイメージングが行われるこの設定で細菌をより良く可視化するためには、野生型の代わりに蛍光株を使用することが強く推奨されます(単一の化学パルス実験で使用)。 - 1 mNi-caged-L-グルタミン酸の人工海水溶液で注射器を充填し、膜の上の洗浄チャネルの入口と出口にチューブを取り付けます。
- チューブを廃棄物貯蔵所に接続し、圧力振動を避けるためにチューブが流体廃棄物貯留槽に完全に水没していることを確認します。
- シリンジポンプに適切な流量を設定し(ここでは50 μL分-1)、チャネルジオメトリに依存する洗浄チャネルで所望の平均流量を得ます。
- シリンジポンプを開始し、膜の上の洗浄流路の流れを確立します。
- LEDビームと顕微鏡ステージを制御するソフトウェアを実行して、異なる位置で異なる強度でパルスのユーザー定義シーケンスを生成します。
注:膜上の洗浄流路における1 mM MNI-ケージ-L-グルタミン酸の人工海水溶液の連続的な流れは、ケージ化合物溶液を補充し、細菌の場から使用済み培地を洗浄します。 - 4x の目標を、数時間にわたって定期的に録画し、連続した複数の場所でビデオを録画して、大きなサーフェスをカバーします(ここでは、1 cm x 1 cm、図 1F)。
7. 画像解析とデータ解析
- 細菌の軌道の再構築
- 4xの目的で記録された映画から、トラッキングソフトウェア17を用いて細菌の軌跡を再構築する。
注: これらの軌道は、マイクロ流路における 3D 細菌の動きの 2D 投影を表します。 - 再構築された細菌の軌跡から、化学パルスの中心方向に泳ぐ速度を投影することによって、各水泳個体の半径ドリフト速度を決定します(図2D)。放射状ドリフト速度の時空間ダイナミクスの視覚化のために、空間サイズ75 μm x 75 μm のビニンググリッドと、5-10 秒間隔の時間窓を使用します (図 2D,E)。
注: プロセスの円筒対称性のため、データを極座標で解析し、角度寸法を平均化することができます(図3)。 - 再構成された細菌の軌道から、化学パルスに反応する細菌の分布の時空間的ダイナミクスを決定します(図2E)。
- 単一パルス実験中に20倍の目的で記録された高解像度の映画から、化学パルスに応答する細菌集団の泳動速度と実行時間の分布を抽出します(図4)。
- 4xの目的で記録された映画から、トラッキングソフトウェア17を用いて細菌の軌跡を再構築する。
- 走化が完了した後の細菌集団の散逸ダイナミクスを考慮して細菌の拡散係数を推定する17 (ここでは、t > 300 s;図 3を参照してください。
- ストークス-アインシュタイン方程式を適用してグルタミン酸の拡散係数を推定する
ここで、アミノ酸分子は流体力学的半径22rGの球状粒子と仮定され、kBはボルツマン定数(1.38 x 10-23 m2 kg s -2 K-1)、Tは温度(296 K)、ηは人工海水の動的粘度(塩分36gkg-1)23°C(1-Pa))である。
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Representative Results
微小流体およびミリ流体デバイス(図1)を使用して、動的栄養条件下での細菌蓄積プロファイルを研究しました。細菌の軌跡は、光熱により放出された化学パルスに続く細菌集団の蓄積・散逸ダイナミクスの位相差顕微鏡で取得した記録されたビデオから抽出した(図2および図3)。何百万もの軌道を平均化することにより、放射状流動速度および細菌濃度の時空間的ダイナミクスが得られた。化学勾配がない場合の泳泳ぎを説明する統計は、より高い空間的および時間的解像度を有する別々の実験で得られた(図4)。
図1:動的栄養条件下での細菌実験のための微小流体およびミリ流体デバイス。(A) 単一の化学パルスへの細菌の蓄積を観察するために使用されるマイクロ流体チャネルのフォトマスク。(B) マルチパルス実験のためにミリ流体細菌室を洗浄するために用いられるマイクロ流体チャネルのフォトマスク。小さなドットは、PDMSに膜の結合を助け、同時に膜が中心で座屈または崩壊するのを防ぐマイクロピラー(200 μm)です。(C) 細菌室を作るために使用される3Dプリントマスターの設計。(D) 細菌室のパターニングを有するPDMS層。(E) 完全なミリ流体装置(上図、白色のPCTE膜)。(F)動的栄養条件の生成のためのミリ流体装置の概略(側面図)。光学光線図は、バイオレットビーム(395nm)が化学誘引剤の帯断を行うデバイスの底部に示され、(独立した)青いビーム(470nm)は、細菌密度(下中央)を捉えるsCMOSカメラを通して蛍光細菌(pGFPを収容する)の観察に使用される。装置は、電動ステージ(右下)に配置され、X-y面で移動してユーザー定義の位置(NISソフトウェアを介して制御される、左下)で化学パルスを放出することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:化学パルスに対する代表的な細菌応答。(A,B)0.5秒の間隔にわたる細菌位置(白)を示す最大強度投影、(A)直後、および(B)40sパルス放出後(目的:4x、NA=0.13、Ph2;12fpsでのビデオ録画)を示す。(C) 細菌の軌跡(黒)は、パルス放出後60sを示す。シェーディング領域は、光分化によって放出される化学パルスを表し、その後、視野(黒十字)の中間にあるt = 0 sで、その後拡散します。軌道は、カスタム社内ソフトウェアを使用して再構築されました。(D,E)放射状ドリフト速度(D)および細菌濃度(E)の時間的ダイナミクスは、視野の中心にパルス放出に続く。パネルDにおいて、ドリフト速度の負の値(青色)は、パルスの中心方向に向かう方向の走化運動に対応する。この図は、Brumleyら17の後に変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:化学パルス放出後の放射状ドリフト速度および細菌濃度の時空間的プロファイル。(A,B)放射状ドリフト速度(A)と細菌濃度(B)を、35μMグルタミン酸パルスの中心からの時間と距離の関数として有する。パネルAでは、ドリフト速度の負の値(青色)は、パルスの中心に向かって方向付けられた走化運動に対応する。値は、すべての軌道を平均して計算した。t = 250 s の黒い破線は、アクティブな走化の期間(パネル A、領域 I の青シェーディング)を大まかに区切り、その後セルは等熱帯性に拡散します(パネル A、領域 II)。(C) 拡散する化学パルスを作成した後のt=10,30,60sの距離の関数としての細菌濃度(バックグラウンドB0に対して再スケールする)。細菌は、走動性のためにパルスの部位に近い集合する。(D) 細菌濃度は、細菌拡散によりB0のバックグラウンドまで緩めるのに約20分かかる。インセットは拡散拡散のフィット感をDB =165μm2s-1の拡散係数で示している。パネル A、C、および D は、ブルムリーら17.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:化学勾配がない場合の細菌集団の水泳統計量。(A)軌道は、マイクロ流路における三次元細菌運動の2次元突起を表す。細菌の軌跡は、カスタムの社内追跡スクリプトを使用して抽出されます。ここでは、青い十字がトラックの始点を示し、赤と緑の記号は方向変更イベントを示します。データは50fpsで記録され、20倍の目標であるNA 0.45が記録されました。(B) 測定した細菌水泳速度(黒)とガンマ分布適合(青)の確率分布。20x目標(NA 0.45)で撮像する場合の焦点深度はわずか24ミクロンで、記録された軌道は本質的に平面的であり、泳ぐ速度の測定は投影によって偏っていません。(C) 連続する方向転換間の時間の確率分布。これらのデータは、方向転換パターン、水泳速度の分布、および生物の方向変更統計を考慮した個々のベースモデルを効果的に較正するために必要とされた。この図は、Brumleyら17から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法により、研究者はマイクロおよびミリ流体デバイスの制御された動的勾配の下で細菌の走化を研究することができ、再現性のあるデータ収集を可能にする。光彩によるマイクロスケールでの化学パルスのほぼ瞬時の生成は、細菌が野生で遭遇する栄養パルスの種類を、例えば、沈没海洋粒子25の背後にあるプルームの拡散拡散、または、毛状細胞細胞26から広がる栄養素の拡散を再現することを目的とする。
この方法の2つの用途を提示しました:1)均一な条件から始まる細菌蓄積-散逸ダイナミクスを研究するための単一の化学パルスの放出、および2)非平衡栄養条件下で細菌蓄積プロファイルを特徴付ける複数のパルスの放出。最初のアプリケーションは、最初に栄養源に遭遇したときの微生物の行動応答を特徴付けるために特に適しています。このような条件下では、化学誘引分子の濃度が極めて低い場合、化学受容体17に対する化学誘起分子の確率結合−非結合事象によって化学化の初期相が支配される。我々の方法は、既知の化学誘引物質の塊をゼロ栄養背景に迅速かつ正確に放出することにより、動的条件下で細菌応答を特徴付ける以前のアプローチに比べて大きな利点を提供する27、28、29。利点は、すべての場所で常に(その拡散性が知られているので)すべての場所で化学誘引剤の完全な分布を知り、マイクロインジェクター27または3-インレット幾何学30のような他の装置に本質的に関連する流体流れの発生を完全に回避することが含まれる。
第2の用途では、化学パルスは、ランダムなシーケンスまたは特定のパターンを課すために使用することができるソフトウェアを介して完全にカスタマイズ可能な空間と時間のユーザー定義のシーケンスに従って、大きな準2Dドメインで発生する。重要なことに、この方法は、細菌走化の高分解能行動ダイナミクスと、成長や潜在的な進化などの長期的なダイナミクスに対する時間スケールに対する栄養素の取り込みとの間の強力なリンクを提供する。細菌のアリーナは、単一のパルス(最小パルスの数百マイクロメートルから最大のパルスの数ミリメートルまで)を持つ細菌の化学的相互作用の空間範囲よりもかなり大きい(2cm x 2 cm)。低い化学背景の維持の鍵は(放出時の化学パルスの濃度よりもはるかに低い)2つのPDMS層18の間に挟まれたナノ多孔性PCTE膜の包含である。装置上部に設置されたマイクロ流体チャネルに流体流を適用することにより、細菌場での切り離し性化合物および使用済み培地の連続的な洗浄は、細菌が配置されている装置の試験部に流れを生じることなく、ナノポーラウス膜を通る分子拡散によって実現される(図1)。
集光されたLEDビームを時間、振幅、サイズ、形状に変調させることで、フォトリリース技術は実験者にさまざまな種類の化学環境を生成する優れた柔軟性を与えます。同時に、ここで提示された試験は静止条件下で行われたが、我々の方法はさらに拡大して異なる流量構成下で細菌の走態を試験することができる。ビデオ顕微鏡で細菌蓄積ダイナミクスを忠実に再構築することで、細菌の挙動の統計と細菌細胞による潜在的な栄養素の取り込みを推定するために使用できる大量の高品質なデータを生成します。自然環境条件下で細菌が直面する可能性のある栄養素景観を模倣した実験的な微小流体アプローチにより、巨視的スケール2,3で栄養素の循環に不可欠な微生物種の採餌行動の体系的研究が可能になります。したがって、この方法論によって生成されるデータの種類は、母集団の取り込み率を効果的に較正し、メソスケール生態系モデルにおいて栄養素の動態をより良く導き出すのに役立ちます。
大規模な細菌のアリーナを作るためにPDMS金型の製造は、商業3D印刷サービスを使用して行われました。しかし、同様の結果は、マイクロチャネル設計の最小の機能を解決するために必要な50〜100 μmの分解能で、社内のハイエンド3Dプリンタを使用して達成することができます。PDMS金型用の3Dプリント材料の滑らかな表面は、鋳造PDMSとデバイスの他の表面(すなわち、ガラス、ポリスチレン、PDMS)との間の良好な結合を達成するために必要とされる。我々のアプリケーションでは、3Dアリーナの下面としてポリスチレンペトリ皿(90mm x 15mm)を使用することは、マイクロ流体学研究で一般的に使用されるガラススライドの使用に比べて2つの利点を提示する:まず、ガラス表面に比べて細菌細胞の付着を大幅に減少させる(ただし、取り付けは検討中の微生物の特定の表面特性に依存する可能性がある)。第二に、二次的な封じ込めを提供し、流出の場合に顕微鏡装置上での媒体の漏れを防ぐことができる。PDMSの金型硬化プロセスは、通常、高温(70-80°C)で発生しますが、このアプリケーションでは、実験者は、マスターの3D印刷に使用される材料の熱たわみおよび融解温度の下に、かなり低い温度(現在の場合は45°C)、材料の表を参照してください)でPDMS金型を焼く必要があります。焼成温度が低いと、硬化プロセスがかなり長くなりますが(夜間)、PDMSの機械的および化学的特性は変化しません。
我々の方法は、細菌と化学誘引物質の1つの特定の組み合わせに適用されているが、方法論は、栄養取り込みまたは抗生物質暴露を含む多様な生物学的プロセスをテストするのに適しており、無数の分子が8をケージに入れられた(または可能である)ことを考えると、異なる種および化学誘引物質のモデル系に適用することができる。市販のケージ化合物のコストから生じる可能性のある制限の1つが、これらのコストは、細胞の生存性、カウント、または細胞内染色のためにライフサイエンスで典型的に採用される分子プローブを使用する場合に発生するものと同等である。この潜在的な制限にもかかわらず、提案された方法論は、生物物理学および生物医学の広範な応用を見つけ、微生物集団の初期応答および適応ダイナミクスを動的な化学勾配に対する単一細胞分解能で特徴付ける可能性がある。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ETHチューリッヒのFIRST微細加工施設に感謝している。この研究は、オーストラリア研究評議会創立早期キャリア研究者賞DE180100911(D.R.B.へ)、ゴードンとベティムーア海洋微生物イニシアチブ調査官賞GBMF3783(R.S.へ)、スイス国立科学財団助成金によって支援されました。1-002745-000 (R.S.へ)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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