Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Создание контролируемых, динамических химических ландшафтов для изучения микробного поведения

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/60589
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5, 1, 1, 1, 6, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

Summary

Представлен протокол для генерации динамических химических ландшафтов с помощью фотолиза в микрофлюидных и миллифлюдических установках. Эта методология подходит для изучения различных биологических процессов, включая подвижное поведение, поглощение питательных веществ или адаптацию к химическим веществам микроорганизмов, как на уровне одной клетки, так и на уровне популяции.

Abstract

Мы демонстрируем метод генерации контролируемых динамических химических импульсов, при котором локализованный хемоатантант внезапно становится доступным в микромасштабе для создания микро-сред для экспериментов по микробным химиотаксисам. Для создания химических импульсов мы разработали систему для введения аминокислотных источников почти мгновенно фотолиза клетчатых аминокислот в микрофлюидной камере полиметилсилоксана (PDMS), содержащей бактериальную суспензию. Мы применили этот метод к химиотаксической бактерии, Vibrio ordalii, которые могут активно подниматься эти динамические химические градиенты, будучи отслеживается видеомикроскопией. Аминокислоты, оформляемые биологически инертными ('клетками') химической модификацией с фоторедвижутой защитной группой, равномерно присутствуют в подвеске, но не доступны для потребления до их внезапного выброса, которое происходит в определенных пользователем точках во времени и пространстве с помощью почти УФ-А сфокусированного светодиодного луча. Количество молекул, выделяемых в пульсе, может быть определено путем калибровки между временем воздействия и нестыкающейся фракцией, где спектр поглощения после фотолиза характеризуется использованием УФ-Вис спектроскопии. Нанопоросая поликарбонатная (PCTE) мембрана может быть интегрирована в микрофлюидное устройство, чтобы позволить непрерывное удаление потоком неизлечимых соединений и отработанных носителей. Сильная, необратимая связь между мембраной PCTE и микрофлюидной структурой PDMS достигается путем покрытия мембраны раствором 3-аминопропилтриэтитоксилана (APTES), за которым следует плазменная активация поверхностей, которые должны быть связаны. Управляемая компьютером система может генерировать пользовательские последовательности импульсов в разных местах и с разной интенсивностью, с тем чтобы создать ресурсные ландшафты с предписанной пространственной и временной изменчивостью. В каждом химическом ландшафте можно получить динамику бактериального движения в индивидуальном масштабе и их накопление на уровне популяции, что позволяет количественно определить химиотаксическую эффективность и ее воздействие на бактериальные агрегаты в экологически значимых средах.

Introduction

Микробы полагаются на хемотаксис, процесс обнаружения химических градиентов и изменения подвижности в ответ1, для навигации химических ландшафтов, подход источников питательных веществ и хостов, и избежать вредных веществ. Эти микромасштабные процессы определяют макромасштабную кинетику взаимодействий между микробами и их окружающей средой2,3. Последние достижения в области микрофлюитики и технологий микрофабрикации, включая мягкую литографию4,произвели революцию в нашей способности создавать управляемые микросреды, в которых можно изучать взаимодействие микробов. Например, прошлые эксперименты изучали бактериальный химиотаксис, генерируя высококонтролируемые, стабильные градиенты промежуточных и высоких концентраций питательных веществ5,6. Тем не менее, в естественной среде, микромасштабные химические градиенты могут быть недолговечными, рассеяны молекулярной диффузией, а фоновые условия часто сильно разбавляют7. Чтобы непосредственно измерить химиотаксическую реакцию микробных популяций, впервые подвергшихся воздействию нестационарной химической среды, мы разработали и здесь описали методы объединения микрофлюидной технологии с фотоизисом, тем самым имитируя градиенты, с которыми встречаются дикие бактерии в природе.

Технология uncaging использует светочувствительные зонды, которые функционально инкапсулируют биомолекулы в неактивной форме. Облучение высвобождает клетку молекулы, что позволяет целенаправленное возмущение биологического процесса8. Из-за быстрого и точного контроля клеточной химии, что uncaging дает9, фотолиза в клетке соединений традиционно используется биологами, физиологами и нейробиологами для изучения активации генов10, ионных каналов11, и нейронов12. Совсем недавно, ученые использовали значительные преимущества фотолиза для изучения химиотаксиса13, чтобы определить флагеллы переключения динамики отдельных бактериальных клеток подвергаются пошаговой химиоаттованта стимул14,15, и для изучения моделей подвижности одиночных клеток спермы в трехмерных (3D) градиентов16.

В нашем подходе мы внедряем фотоиз аминокислот в клетке в микрофлюидных устройствах для изучения поведенческой реакции бактериальной популяции на контролируемые химические импульсы, которые становятся почти мгновенно доступными с помощью фоторелиза. Использование цели с низким увеличением (4x) (NA 0.13, глубина фокусировки приблизительно 40 мкм) позволяет как наблюдать агрегационную реакцию тысяч бактерий на уровне населения на большом поле зрения (3,2 мм х 3,2 мм), так и измерение движения на одноклеточном уровне. Мы представляем два применения этого метода: 1) выпуск одного химического импульса для изучения бактериального накопления-динамики рассеивания, начиная с однородных условий, и 2i) выпуск нескольких импульсов, чтобы охарактеризовать динамику бактериального накопления в соответствии с временем-изменяющихся, пространственно неоднородных химиоаттантов условиях. Этот метод был протестирован на морских бактерий Vibrio ordalii выполнения химиотаксиса к аминокислоте глутамата17, но метод широко применим к различным комбинациям видов и хемоаттантов, а также к биологическим процессам за химиотаксис (например, поглощение питательных веществ, воздействие антибиотиков, кворум зондирования). Этот подход обещает помочь прояснить экологию и поведение микроорганизмов в реалистичной среде и раскрыть скрытые компромиссы, с которыми сталкиваются отдельные бактерии при навигации по эфемерным динамическим градиентам.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление микрожидкости для однохимическо-импульсного эксперимента

  1. Дизайн канала с помощью компьютерного дизайна (CAD) программного обеспечения и распечатать его на пленку прозрачности для создания фото маски (Рисунок 1A).
  2. Изготовить мастера с помощью мягкой литографии (в чистых условиях комнаты).
    1. Очистите кремниевую пластину (4 дюйма) в быстрой последовательности с ацетоном, метанолом и изопропанолом, затем высушите с помощью азота. Выпекать в духовке при температуре 130 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
    2. Поместите вафельку в центре спин-пальто и залить СУ-8 photoresist на вафу. Ramp скорость спин-пальто до 500 об /мин более 5 с, и держать на 500 об/мин в течение 10 с. Ramp до конечной скорости более 10 с и поддерживать на этой скорости в течение 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное значение конечной скорости зависит от толщины целевого покрытия и используемого СУ-8.
    3. После процесса спин-покрытия, выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию, а затем при температуре 95 градусов по Цельсию. Дайте вафле остыть при комнатной температуре (RT) не менее 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время выпечки зависит от целевой толщины и типа фоторезиста используется. Как правило, на каждые 100 мкм слоя пластины следует запекать в течение 5 мин при 65 градусах По цельсии и 45 мин при 95 градусах По цельсии.
    4. Поместите фото маску на вафельу, чтобы гарантировать, что только область интереса подвергается и полимеризации. Экспозиция к ультрафиолетовому свету на время, рекомендованный в руководстве СУ-8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, с энергией воздействия 200 мДж см-2 при длине волны 350 нм, пластина была выставлена на 150 с.
    5. Выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию в течение времени, рекомендованных в руководстве SU-8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на каждые 100 мкм слоя пластины должны быть запеченные в течение 5 минут при 65 градусов по Цельсию и 45 мин при 95 градусов по Цельсию.
    6. Погрузите вафельку в стакан, наполненный разработчиком полиметилметакрилата (PMMA), чтобы получить мастера. Аккуратно встряхните стакан, чтобы убедиться, что неполимеризованный фотоустойчивость вымывается. Выпекать мастера при температуре 200 градусов по Цельсию, чтобы еще больше связать слой Su-8.
  3. Подготовка полидиметилсилоксана (PDMS) смесь путем объединения эластомера с его лечебного агента (Таблица материалов) в соотношении 10:1 в стакане (здесь, 40 мл). Смешайте энергично, пока жидкость не станет однородной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь PDMS будет выглядеть непрозрачной, потому что пузырьки генерируются в процессе смешивания.
    ВНИМАНИЕ: Для предотвращения контакта кожи с потенциально опасными химическими веществами или биологическим материалом, всегда носите лабораторное пальто и одноразовые пластиковые перчатки на протяжении всего протокола и следуйте каким-либо конкретным протоколам безопасности в соответствии с Материалом Лист данных о безопасности (MSDS).
  4. Дега смесь PDMS в вакуумной камере в течение 45 минут на RT. Чтобы ускорить процесс, периодически высвобождавайте вакуум, чтобы лопнуть пузырьки, которые образуются в интерфейсе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс дегазации должен быть выполнен в течение 1 ч, чтобы предотвратить PDMS смесь от начала лечения.
  5. Удалить пыль с поверхности мастера с помощью очистителя под давлением, затем вылейте дегазированную смесь PDMS на хозяина и выпекайте в духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, выпечки на ночь (или, по крайней мере 12 ч) при 60 градусов по Цельсию будет достичь той же затвердевшей PDMS.
  6. Вырежьте PDMS лезвием вокруг микроструктур (на расстоянии около 5 мм), а затем тщательно очистить PDMS от мастера.
  7. Удар отверстия, чтобы служить в качестве впускного отверстия и выхода из микроканала (здесь, один входе и один выход, см. Рисунок 1А). Убедитесь, что ничто не касается нижней грани PDMS, где расположены объекты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Микроканал должен быть запечатан клейкой лентой, чтобы предотвратить накопление пыли и других частиц во время хранения.
  8. Скрепите микроканал PDMS к стеклянной горке.
    1. Тщательно очистите стеклянную горку с мылом, изопропанолом и деионизированной водой. Пусть стекло слайд сухой или использовать сжатый воздух, чтобы ускорить процесс.
    2. Удалите частицы пыли, вытирая клейкой лентой. Скрепите микроканал PDMS на чистом стеклянном слайде, сразу после обработки обеих поверхностей плазмой (с помощью коронарной системы или плазменной кислородной камеры) в течение 2 мин.
    3. Поместите микрофлюидное устройство для нагрева на горячей пластине при температуре 80 градусов по Цельсию, по крайней мере, 1 ч, чтобы укрепить химическую связь со стеклом.

2. Изготовление 3D-печатного Миллифлюдического устройства для эксперимента с несколькими импульсами

  1. Дизайн 3D-формы с помощью 3D-дизайна программного обеспечения и распечатать мастер для формы PDMS с высоким разрешением 3D принтера(рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу материалов для 3D-принтера и материала для плесени, используемого для создания мастера.
  2. Повторите шаги 1.3'1.4, затем очистите поверхность мастера, нажав клейкой лентой. Поставьте мастера на шкалу, а затем, избегая центральной области мастера, который будет занят мембраной, налейте на точное количество неизлечимой смеси PDMS (здесь, 23,4 г) для того, чтобы получить желаемую высоту PDMS путем сопоставления высоты мастера (здесь, здесь, 0,5 мм). Удалите все оставшиеся пузырьки с помощью сжатого воздуха.
  3. Поместите PDMS литые на мастера в духовке при температуре 45 градусов по Цельсию, чтобы испечь, по крайней мере 12 ч.
  4. Скрепите 3D форму PDMS к чашке Петри.
    1. Аккуратно снимите затвердевшие слой PDMS и пропукните отверстия для впуска бактериальной суспензии(рисунок 1C).
    2. Активируйте как поверхность чашки Петри (90 мм х 15 мм), так и форму PDMS с кислородной плазмой на 2 мин. Скрепите плесень PDMS на чашке Петри. Аккуратно нажмите плесень на чашку Петри, но не нажимать, где функции расположены, как это может разрушить камеру допроса.
    3. Поместите чашку Петри, привязали к плесени PDMS 3D, в духовке при температуре 45 градусов по Цельсию, по крайней мере, на 12 ч, чтобы укрепить химическую связь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
  5. Функционализация поверхности мембраны18
    1. Активируйте мембрану нанопористого поликарбоната (PCTE) в кислородной плазменной камере в течение 1 мин на РТ.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте использования системы короны для активации плазмы, потому что это повредит мембрану.
    2. Под химическим капотом разбавить коммерческий раствор 3-аминопропилтритетеоксизолана (APTES) в деионизированной воде до 1% по объему (здесь, 40 мл), используя полипропиленовый трубку.
      ВНИМАНИЕ: Решение APTES является остро токсичным (MSDS оценка опасности для здоровья 3) и должны быть обработаны с крайней осторожностью исключительно под химическим капюшоном с перчатками. Измените перчатки сразу после обработки решения APTES. Пары APTES разрушительны для слизистых оболочек и верхних дыхательных путей. Целевыми органами APTES являются нервы, печень и почки. Если капюшон дыма недоступен, необходимо внедрить щит для лица и респиратор с полным лицом.
    3. Перенесите разбавленный раствор APTES в чашку Петри и погрузите активированную мембрану в раствор APTES на 20 мин.
    4. Удалите мембрану из раствора APTES с помощью пинцета и поместите ее на чистую салфетку, чтобы высохнуть.
  6. Для изготовления микрофлюидных каналов PDMS, которые будут лежать на мембране и позволят промыть бактериальную арену, повторите шаги 1.1'1.7.
  7. Скрепите каналы промывки PDMS с функционализированной мембраной.
    1. Активируйте как канал промывки PDMS, так и мембрану PCTE с кислородной плазменной камерой в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана, которая будет зажата между двумя слоями PDMS, должна быть меньше, чем канал промывки PDMS.
    2. Сразу же после плазменной обработки, довести функционализированную мембрану и канал промывки PDMS в контакт, мягко нажав канал промывки PDMS на мембрану.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не применяйте чрезмерное давление на данном этапе, потому что это может привести к (необратимому) креплению мембраны к крыше канала, блокируя канал.
  8. Сэндвич мембраны между двумя слоями PDMS(Рисунок 1E).
    1. Активируйте как кабальный ламинат PDMS стиральный канал-PCTE мембраны и 3D PDMS формы ранее связаны с чашкой Петри с кислородной плазменной камерой в течение 2 мин. Принесите их в контакт и нажмите вместе.
    2. Поместите чашку Петри, прикреплящее к структуре сэндвича, в духовке при температуре 45 градусов по Цельсию, по крайней мере, на 12 ч, чтобы укрепить химическую связь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

3. Культура клеток

  1. Выращивайте популяцию V. ordalii (напряжение 12B09 или 12B09pGFP) на ночь на 20 ч в 2216 средних19 на орбитальном шейкере (600 об/мин) при 30 градусах Цельсия и собирают клетки в позднеэкспоненциальной фазе. Для изоляции укрывательство pGFP, добавить спектромицин (50 мкг мл-1) для поддержания плазмиды.
  2. Centrifuge 1 мл аликот клеток на 2500 х г в течение 3 мин, удалить супернатант и повторно приостановить клетки в 1 мл фильтрованной искусственной морской воды. Повторите этот шаг.
  3. Голодать популяции V. ordalii на орбитальной шейкер (600 об/мин) при 30 градусах по Цельсию на 3 ч.
  4. Подготовьте запас искусственного морского раствора объемом 10 мм (здесь, 1 мл) 4-метокси-7-нитроиндолин-клетки - L-глутамата (MNI-клетка -L-глутамамат) и храните при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите MNI-клетку - L-глутамат решение от окружающего света для предотвращения фотолиза.
  5. Разбавить клетки 50x путем повторного приостановки голодающих клеток в искусственный растворморской воды 1 мМ MNI-клетке - L-глутамат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит окончательную концентрацию бактерий ниже, чем 5 х 107 мл-1 (точное значение зависит от первоначальной концентрации клеток в конце экспоненциальной, которая, как правило, 109 мл-1). Концентрация бактерий оценивалась с помощью спектрофотометра при оптической плотности (OD) в 600 нм.

4. Калибровка Протокола о нерассекации

  1. Поместите капельку (20 л) искусственного морского раствора МНИ-клетки - L-глутамата20 при концентрации С0 и 10 мм на стеклянной горке. Завить каплю, покрыв ее круговой камерой PDMS (диаметр d 5 мм, высота ч 250 мкм).
  2. Поместите стеклянную горку на сцену микроскопа и подвергните всю камеру на 20 мс светодиодному лучу на длине волны 395 нм (мощность 295 мВт) с помощью 4x цели (числовая диафрагма (нумерическая диафрагма ) 0,13).
  3. Откройте камеру PDMS и извлеките капельку (1 зл) для анализа с помощью спектрофотометра УФ-Вис.
  4. Повторите шаги 4.1-4.3 для различных продолжительностей светодиодного освещения 0,1 с, 0,5 с, 2,5 с, 25 с, 250 с (или до насыщения химической реакции) и 0 с (для получения фона). Повторите процедуру шаги 4.1'4.4 по крайней мере 3x (здесь, 4x).
  5. Из спектра поглощения извлекайте значение в 405 нм, которые представляют собой пик в спектре поглощения молекулы клетки21. Для определения скорости k химической реакции uncaging светодиодной экспозицией14, используйте следующее уравнение кинетики первого порядка для численного соответствия экспериментальных данных17
    Equation 1
    где C(t)является значение абсорбционного спектра раствора на 405 нм (после снятия фона) с неприжающимся временем t секунд. Для небольшого времени неприуроченного т такого, что kt 1, Eq. 1 можно упростить до линейной формулировки
    Equation 2

5. Однохимический импульсный эксперимент

  1. Поддержание микрофлюидного канала под вакуумом в течение 20 минут, чтобы уменьшить концентрацию газа в PDMS, так что пузырьки менее вероятно, образуются в процессе заполнения.
  2. Извлеките канал из вакуумного насоса и сразу же введите разбавленную бактериальную подвеску в 1 мМ ММ МНИ-клетке - L-глутамат в искусственной морской воде в микроканал аккуратно с помощью микропипети, чтобы избежать повреждения флагелларом механическими силами стрижки (здесь весь процесс заполнения занял 5-10 с). После заполнения канала с бактериальной подвеской, сосать раствор в избытке с бумажным полотенцем, и печать входе и розетке с PDMS пробки, мягко нажав их в отверстия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, поток жидкости в камере предотвращается.
  3. Поместите микроканал на сцену микроскопа и переместите сцену, чтобы установить поле зрения в середине канала. Настройка микроскопа для выполнения визуализации в фазовом контрасте (4x цель) со скоростью кадров 12 кадров в секунду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение может быть разнообразным, но не должно быть меньше 10 кадров в секунду, чтобы позволить реконструкцию бактериальных траекторий через анализ изображения (см. раздел протокола 7).
  4. Установите пинхол светодиодного луча на минимальную диафрагму. Установив время экспозиции камеры до 5 с, запишите несколько кадров, чтобы получить точные измерения пространственного расположения и размера светодиодного луча.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиодный источник света подключается к эпифлуоресценции иллюминатор микроскопа через жидкое соединение направляющего света. Светодиодный луч не влияет на видеозахват, потому что приобретение видео и светодиодная стимуляция командовать самостоятельно с помощью программного обеспечения.
  5. Выполните непрерывную визуализацию в течение общей продолжительности 10 мин (20 минут для самого большого химического импульса) и одновременно активируйте сфокусированный светодиодный луч на уровне 395 нм для желаемой продолжительности (в этом эксперименте, т 20 мс, 100 мс, 500 мс) в установленную пользователем точку времени (здесь, 10 с после начала видеоприобретения) с помощью программного обеспечения для микроскопа. Чтобы получить несколько реплик одного и того же процесса, переместите сцену для записи бактериальной реакции на различные позиции микрофлюидного канала. Повторите эту процедуру для каждого размера импульса, используя новый микроканал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс рассеивания генерирует аксисимметричный цилиндрический импульс, который диффундирует радиально наружу в плоскости визуализации.
  6. Проведение отдельных экспериментов без химического распаковки при более высоком увеличении (20x цель, NA 0,45) на более высокой частоте кадров (50 кадров в секунду) для записи беспристрастного движения плавания бактерий.

6. Многократный химически-импульсный эксперимент

  1. Поддерживайте миллифлюдическую камеру под вакуумом в течение 20 мин.
  2. Поместите чашку Петри, содержащую миллиамфлюйную камеру, на сцену микроскопа. Заполните камеру ниже мембраны разбавленной бактериальной подвеской (здесь весь процесс заполнения занял 10–15 с) GFP-флуоресцентного V. ordalii в 1 мМ MNI-клетке - L-глутамат раствор в искусственной морской воде. После заполнения канала с бактериальной подвеской, сосать раствор в избытке с бумажным полотенцем, и печать входе и розетке с PDMS пробки, мягко нажав их в отверстия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, поток жидкости в камере предотвращается. Для лучшей визуализации бактерий в этой установке, где изображение происходит через нанопористую мембрану, настоятельно рекомендуется использовать флуоресцентные штаммы вместо дикого типа (как используется в одном химическо-импульсном эксперименте).
  3. Заполните шприц искусственным раствором морской воды 1мМ MNI-клетке - L-глутаматат и прикрепите трубку к входе и выходу стиральной канала над мембраной.
  4. Соедините трубку с резервуаром отходов и убедитесь, что трубка полностью погружена в резервуар жидких отходов, чтобы избежать колебаний давления.
  5. Установите соответствующую скорость потока на насосшного (здесь, 50 л мин-1),чтобы получить желаемую средней скорости потока в стиральной канале, которая зависит от геометрии канала.
  6. Запустите шприц насос, чтобы установить поток в канал для мытья над мембраной.
  7. Запустите программное обеспечение, контролируя светодиодный луч и микроскоп этапе для создания пользовательских определенных последовательностей импульсов в разных местах и с различной интенсивностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывный поток искусственного раствора морской воды 1мМ MNI-клетке - L-глутамат в стиральном канале над мембраной пополняет клетчатый раствор соединения и моет отработанную среду от бактериальной арены.
  8. Запись видео с использованием 4x цель на регулярной временной интервалы в течение нескольких часов и в течение нескольких смежных местах, чтобы покрыть большую поверхность (здесь, 1 см х 1 см, рисунок 1F).

7. Анализ изображений и анализ данных

  1. Реконструкция бактериальных траекторий
    1. Из фильмов, записанных с целью 4x, реконструировать бактериальные траектории с помощью программного обеспечения отслеживания17.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти траектории представляют собой 2D-проекции 3D бактериального движения в микроканале.
    2. Из реконструированных бактериальных траекторий, определить скорость радиального дрейфа каждого плавательного человека, проецируя его скорость плавания по направлению к центру химического импульса(рисунок 2D). Для визуализации пространственно-временной динамики радиальной скорости дрейфа используйте связывающую сетку с пространственным размером 75 мкм х 75 мкм и временное окно интервала 5–10 с(рисунок 2D,E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за цилиндрической симметрии процесса, данные могут быть проанализированы в полярных координатах и усреднены по угловому измерению(рисунок 3).
    3. Из реконструированных бактериальных траекторий, определить пространственно-временной динамики распределения бактерий, как они реагируют на химические импульсы(Рисунок 2E).
    4. Из фильмов с более высоким разрешением, записанных с целью 20x во время одноимпульсных экспериментов, извлечь распределение скорости плавания и запустить время для бактериальной популяции, как они реагируют на химический импульс (Рисунок 4).
  2. Оцените коэффициент диффузии бактерий, учитывая динамику рассеивания бактериальной популяции после того, как хемотаксис завершен17 (здесь, для т Рисунок 3).
  3. Оцените коэффициент диффузии глутамата, применяя уравнение Стокса-Эйнштейна
    Equation 3
    где молекулы аминокислоты, как предполагается, сферические частицы с гидродинамическим радиусом22гG, kB является постоянной Больцман (1,38 х 10-23 м2 кг-2 K-1), T является температура (296 K), и - это динамическая вязкость искусственной морской воды (salinity 36 кг-1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы использовали микрофлюидные и миллифлюдические устройства(рисунок 1)для изучения профилей накопления бактерий в динамических условиях питательных веществ. Бактериальные траектории были извлечены из записанных видео, полученных фазовой контрастной микроскопией динамики накопления-рассеивания бактериальной популяции после химического импульса, выпущенного фотоизом(рисунок 2 и рисунок 3). В среднем миллионы траекторий, пространственно-временной динамики скорости радиального дрейфа и бактериальной концентрации были получены. Статистика, описывающая плавание при отсутствии химического градиента, была получена в отдельных экспериментах с более высоким пространственным и временным разрешением(рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1: Микрофлюидические и миллифлюдические устройства для бактериальных экспериментов при динамических питательных условиях. (A) Фотомаска микрофлюидного канала используется для наблюдения бактериального накопления одного химического импульса. (B) Фотомаска канала микрофлюитики, используемой для мытья миллифлюдической бактериальной камеры для многоимпульсных экспериментов. Маленькие точки являются микропиллярами (200 мкм в размерах), которые помогают склеивание мембраны с PDMS, и в то же время помочь предотвратить мембрану от пряжки или рушится в центре. (C) Дизайн 3D печатных мастер используется для создания бактериальной камеры. (D) Слой PDMS с узором бактериальной камеры. (E) Полное миллифлюидическое устройство (вид сверху, мембрана PCTE в белом цвете). (F) Схема миллифлюдического устройства для генерации динамических условий питательных веществ (вид стороны). Диаграмма оптики лучей показана на дне прибора, где фиолетовый луч (395 nm) выполняет uncaging chemoattractant, тогда как (независимый) голубой луч (470 nm) использован для замечания флуоресцентных бактерий (harbouring pGFP) через камеру sCMOS, которая фиксирует плотность (нижний центр). Устройство помещается на моторизованной стадии (внизу справа), которые могут быть перемещены в плоскости X-Y для выпуска химических импульсов в пользовательских определенных позиций (контролируется с помощью программного обеспечения NIS, внизу слева). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель бактериальных реакций на химический импульс. (A, B) Максимальная интенсивность проекции, показывающей бактериальное положение (белый) в течение 0,5 с интервалом, показанная(A) сразу после, и (B) 40 s после высвобождения импульса (объектив: 4x, NA 0.13, Ph 2; видеозапись на 12 fps). (C) Бактериальные траектории (черные) показаны 60 s после высвобождения импульса. Затененный регион представляет собой химический импульс, выделяемый фотоизом на уровне т 0 с в середине поля зрения (черный крест), который впоследствии рассеивается. Траектории были реконструированы с использованием пользовательского программного обеспечения. (D,E) Временная динамика скорости радиального дрейфа(D)и бактериальной концентрации(E) после высвобождения импульса в центре поля зрения. В панели D отрицательные значения скорости дрейфа (в синем цвете) соответствуют направленной хемотаксическому движению к центру пульса. Эта цифра была изменена после Brumley et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Пространственно-временные профили скорости радиального дрейфа и бактериальной концентрации после высвобождения химического импульса. (A, B) Скорость радиального дрейфа(A)и бактериальная концентрация (B) как функция времени и расстояния от центра импульса глутамата 35 мкм. В панели А отрицательные значения скорости дрейфа (в синем цвете) соответствуют направленной хемотаксическому движению к центру пульса. Значения вычислялись путем усреднения по всем траекториям. Черная пунктирная линия на t 250 s примерно разграничивает период активного хемотаксиса (голубое затенение в панели A, область I), после чего клетки рассеивается изотропно наружу (зеленое затенение в панели A, область II). (C) Бактериальная концентрация (перемасштабированная на фоне B0) в качестве функции расстояния в т 10, 30, 60 с после создания диффузионного химического импульса. Бактерии агрегируются близко к месту пульса из-за хемотаксиса. (D) Бактериальная концентрация занимает 20 минут, чтобы расслабиться на фоне B0 бактериальной диффузии. Ввод показывает припадок диффузного распространения с коэффициентом диффузии DB и 165 мкм2 s-1. Панели A, C и D были изменены из Brumley et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Статистика плавания для бактериальной популяции в отсутствие химических градиентов. (A) Траектории представляют собой двумерные проекции трехмерного бактериального движения в микроканале. Бактериальные траектории извлекаются с помощью пользовательского внутридомового слежения. Здесь синий крест указывает начало трека, а красные и зеленые символы указывают на события переориентации. Данные были записаны на 50 кадров в секунду с целью 20x, NA 0.45. (B) Распределение вероятности измеренной бактериальной скорости плавания (черный) вместе с гамма-распределением подходит (синий). Потому что глубина фокусировки при визуализации с 20-кратной целью (NA 0.45) составляет всего несколько микрон24,записанные траектории по существу являются планарными и измерения скорости плавания не предвзято проекции. (C) Распределение вероятности времени между последовательными переориентациями. Эти данные были необходимы для эффективной калибровки индивидуальной модели, которая учитывает модель переориентации, распределение скорости плавания и статистику переориентации организмов. Эта цифра была изменена с Brumley et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот метод позволяет исследователям изучать бактериальный хемотаксис под контролируемыми, динамическими градиентами в микро- и миллифлюидных устройствах, что позволяет воспроизводимое получение данных. Почти мгновенное создание химических импульсов на микромасштабе путем фотолиза направлена на воспроизведение типов питательных импульсов, что бактерии сталкиваются в дикой природе из целого ряда источников, например, диффузивное распространение перьев за тонущие морские частицы25, или питательные распространяется из лисизированных клеток фитопланктона26.

Мы представили два применения этого метода: 1) выпуск одного химического импульса для изучения динамики бактериального накопления, начиная с однородных условий, и 2) выпуск нескольких импульсов для характеристики профилей бактериального накопления в условиях неравновесного питательных веществ. Первое применение особенно подходит для характеристики поведенческих реакций микробов при первом столкновении с источником питательных веществ. В таких условиях, в которых концентрация химиоаттракторных молекул крайне низка, на ранней фазе хемотаксиса преобладают стохастические связывающие-необязательные события химиоатрантов молекул к хеморецепторам17. Наш метод, быстро и точно выпустив известную массу химиоатантита в нулевом питательном фоне, предлагает значительные преимущества по сравнению с предыдущими подходами, чтобы охарактеризовать бактериальную реакцию при динамических условиях27,28,29. Преимущества включают в себя знание полного распределения химиоататтатов во всех местах и во все времена (так как его диффусивность известна), и полностью избежать генерации потока жидкости, которая по своей сути связана с другими устройствами, такими как микроинжектор27 или трех-впускной геометрии30.

Во втором приложении химические импульсы возникают в большом квази-2D домене в соответствии с определенной пользователем последовательности в пространстве и времени, которая полностью настраивается с помощью программного обеспечения, которое может быть использовано для навязывания случайных последовательностей или конкретных шаблонов. Важно отметить, что этот метод обеспечивает мощную связь между поведенческой динамикой бактериального хемотаксиса с высоким разрешением и поглощением питательных веществ в течение временных масштабов секунд и долгосрочной динамикой, такой как рост и потенциальная эволюция. Бактериальная арена значительно больше (2 см х 2 см), чем пространственный диапазон химического взаимодействия бактерий с одним импульсом (от сотен микрометров для мельчайших импульсов до нескольких миллиметров для самых больших импульсов). Ключом к поддержанию низкого химического фона (гораздо ниже, чем концентрация химических импульсов при их освобождении) является включение нанопористых мембраны PCTE зажатой между двумя слоями PDMS18. При применении потока жидкости в микрофлюидном канале, размещенном в верхней части устройства, непрерывная вымывание неизлечимых соединений и отработанной среды в бактериальной арене реализуется с помощью молекулярного диффузии через нанопористую мембрану, не создавая потока в тестовом разделе устройства, где находятся бактерии(рисунок 1).

Модулируя сфокусированный светодиодный луч во времени, амплитуду, размер и геометрию, технология фоторелиза наделяет экспериментатора большой гибкостью для создания различных типов химических сред. В то же время, в то время как тесты, представленные здесь, были проведены в потихих условиях, наш метод может быть дополнительно расширен для тестирования бактериального хемотаксиса в различных конфигурациях потока. Путем точно реконструировать бактериальную динамику накопления через видеомикроскопию, наш метод производит большие количества данных высокого качества которые можно использовать для того чтобы оценить статистик бактериального поведения и потенциальное поглощение питательных веществ бактериальными клетками. Наш экспериментальный микрофлюидный подход, имитирующий питательные ландшафты, с которыми могут столкнуться бактерии в естественных условиях окружающей среды, позволяет систематически изучать кормяческое поведение микробных видов, которые необходимы в цикле питательных веществ в макроскопической шкале2,3. Таким образом, тип данных, генерируемых с помощью этой методологии, полезен для эффективной калибровки показателей поглощения населения и более эффективного получения кинетики питательных веществ в моделях экосистем мезомасштабных.

Изготовление форм PDMS для изготовления большой бактериальной арены было выполнено с использованием коммерческой службы 3D-печати. Тем не менее, аналогичные результаты могут быть достигнуты с помощью высокого класса 3D принтера в доме, с разрешением 50 х 100 мкм, необходимых для решения мельчайших особенностей микроканального дизайна. Гладкая поверхность 3D-печатного материала для плесени PDMS необходима для достижения хорошей связи между литого PDMS и другими поверхностями устройства (т.е. стеклом, полистиролом, PDMS). Для нашего применения, использование полистирола Петри блюдо (90 мм х 15 мм) в качестве нижней поверхности 3D арене представляет два преимущества по сравнению с использованием стеклянной слайд, как обычно используется в исследованиях микрофлюитики: во-первых, это значительно снижает вложение бактериальных клеток по сравнению со стеклянной поверхностью (хотя вложение может зависеть от конкретных свойств поверхности микроба рассматривается); во-вторых, он обеспечивает вторичное сдерживание, которое может предотвратить утечку носителей по сравнению с микроскопией оборудования в случае разливов. Процесс лечения плесени PDMS обычно происходит при высокой температуре (70–80 градусов по Цельсию), но в этом приложении экспериментатор должен выпекать плесень PDMS при значительно более низкой температуре (45 градусов по Цельсию в данном случае, см. Таблица Материалов),ниже теплового отклонения и температуры плавления материала, используемого для 3D-печати мастера. Более низкая температура выпечки значительно удлиняет процесс лечения (в одночасье), но не меняет механических и химических свойств PDMS.

Хотя наш метод был применен к одной конкретной комбинации бактерий и хемоаттракторант, методология подходит для тестирования различных биологических процессов, в том числе поглощения питательных веществ или воздействия антибиотиков, и могут быть применены к модели систем различных видов и хемоатантантов, учитывая, что множество молекул были (или может быть) клетке8. Одно потенциальное ограничение возникает из-за расходов коммерчески доступных соединений в клетке, но эти расходы сопоставимы с теми, которые понесены при использовании молекулярных зондов, обычно используемых в науке о жизни для жизнеспособности, подсчета или внутриклеточного окрашивания. Несмотря на это потенциальное ограничение, предлагаемая методология может найти широкое применение в биофизических и биомедицинских науках, чтобы охарактеризовать ранние реакции и динамику адаптации микробных популяций при одноклеточном разрешении на динамические химические градиенты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят первый объект микрофабрикации в ETH Цюрихе. Эта работа была поддержана Австралийский научно-исследовательский совет Discovery Ранняя карьера Исследователь премии DE180100911 (d.R.B.), Гордон и Бетти Мур морской микробной инициативы Следователь премии GBMF3783 (в Р.С.), и Швейцарский национальный научный фонд грант 1-002745-000 (до Р.С.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648 >98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube Greiner Bio-One 210261 50 ml
Centrifuge Eppendorf 5424R to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line VWR-CH 390-0384 to bake 3D master
Duster VWR-CH 16650-22 to clean the wafer and microchannels
Hot plate VWR-CH 444-0601 to bond the microchannels
Isopropanol Sigma-Aldrich W292907
LightSafe micro centrifuge tubes Sigma-Aldrich Z688312 1.5 ml
MATLAB Mathworks for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube Eppendorf 30120086 1.5 ml
Microscope glass slide VWR-CH 631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE Nikon Instruments MEA53100 with motorized stage
MNI-Glutamate Tocris Bioscience 1490 >98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment Stratasys Objet30 3D printer
Mold printing service 3D Printing Studios Custom https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W to calibrate the uncaging
NIS Elements Nikon Instruments Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line VWR-CH 466-3516 to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050 MicroChem Corp. SU8-3050
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane Sterlitech PCT0447100 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing Scientific Commodities BB31695-PE/2 I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish VWR-CH 25373-100 bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale VWR-CH 611-2605 to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla Oxford Instruments for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt Instant Ocean Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015 Dassault Systemes SolidWorks Used to design the mold
Spectra X light engine Lumencolor for LED 395 nm
Sylgard 184 Dow Corning 110-41-155 PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok) B Braun Omnifix 4616308F
Syringe Needle Agani A228 from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite Harvard Apparatus 70-4506 Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey Stratasys Dual Syringe Pump
Vortex-Genie Scientific Industries SI-0236 Mold Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Tags

Биоинженерия Выпуск 155 клетки соединений химические импульсы химиотаксис микробная экология микрофлюиды подвижность фотолиз поликарбонатная мембрана
Создание контролируемых, динамических химических ландшафтов для изучения микробного поведения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carrara, F., Brumley, D. R., Hein,… More

Carrara, F., Brumley, D. R., Hein, A. M., Yawata, Y., Salek, M. M., Lee, K. S., Sliwerska, E., Levin, S. A., Stocker, R. Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior. J. Vis. Exp. (155), e60589, doi:10.3791/60589 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter