ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
我们描述了一种评估斑马雀的歌曲偏好的技术。女性被放置在一个双室笼中，歌曲偏好是通过在一个腔室内登陆来触发一首歌曲的播放次数来衡量的，而在第二个腔室中触发不同的歌曲。使用红外传感器计算栖息着陆。
Abstract
一个操作调理范式用于测试雌性斑马雀的歌曲偏好。Finches 被放置在一个双室笼与连接开口，并表明他们更喜欢歌曲，降落在每个房间内的栖息处。通过中断每个栖息处上方的光电传感器的红外光束，鸟通过位于笼子两侧的扬声器激活歌曲的播放。可免费的软件用于触发每个栖息处的歌曲播放。为了确定每个动物的歌曲偏好，首先通过触发歌曲播放时，她降落在每一栖息处，确定她的室内偏好。然后，将此房间首选项与她的歌曲首选项进行比较。设置最小活动阈值以确保首选项为现实。使用这种方法，我们显示配对的女性更喜欢他们伴侣的歌曲。该方法用于了解多巴胺对歌曲偏好的形成和维护的贡献。
Introduction
生物学中一个基本问题是动物如何形成亲和的纽带。特别是，这些键的产生是什么神经机制，这些基本机制在脊椎动物物种中保存？草原秃鹰为一些对双键形成很重要的神经递质系统提供了线索。特别是，多巴胺通过细胞核积液中的受体作用，可以诱导男性和女性4、5的伙伴偏好。目前还不清楚合作伙伴偏好形成和维护所依据的一般原则是否在进化上得到保护。
一夫一妻制在鸟类中比在哺乳动物中更常见。因此，将鸟类的亲和行为机制与其他物种进行比较，对于理解保存的神经基础7、8、9至关重要。一般来说，在许多品种的歌鸟，雄歌被认为是一个诚实的指标，男性健身10，11。雄性斑马雀鸣鸟唱歌以吸引配偶，影响一夫一妻制对12，13的形成。因此，歌曲可以用来确定这些鸟类的伙伴偏好。
女性对伴侣歌曲的偏好机制尚不清楚。中素，催产素的鸟类同源体，似乎在14、15年的对键形成中发挥作用。此外，多巴胺也已被证明在结对形成9，16，17，18中发挥作用。例如，在成对与非成对雀9的细胞核积液中，多巴胺水平较高。
为了研究神经递质系统在双键形成和维护中的作用，我们使用配备红外传感器的操作测试范式来测量歌曲偏好，以触发歌曲播放19。歌曲播放的比例确定了女性对男性歌曲的偏好。在操作调节任务之前，每个女性被隔离长达48小时在一个消声室与她的伴侣为"配对女性"或一个不熟悉的男性，为"未配对的女性"。为了测试多巴胺对歌曲偏好的影响，未配对的女性在与不熟悉的雄性分离时，用D2R多巴胺激动剂治疗两次。这种行为范式基于以前的研究19，20，适合本科生进行研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验都根据NIH的指导方针，得到W.M.Keck科学部机构护理和使用委员会的批准。所有使用的动物都是成年人（孵化后90天）。
1. 建造歌剧调理室
- 建立一个由两个相同腔室组成的测试保持架，每个腔室15 x 15 x 17英寸3（图1A）。在靠近栖息室的笼子一侧制作一个小门（作为每个室的入口），切出一个4.5 x 6英寸2英寸的小窗户，距离室间笼子中心2.5英寸。使用单独的搁板，使门覆盖窗口。
注：笼子是由电线搁板，壁橱，可以从任何家装商店获得。门的铰链可以用拉链做成。 - 用线切割机切割搁板，使两个腔室之间有一个 4 x 6 英寸2的开口，让鸟在腔室之间移动。
- 在每个室中，将一个栖息处在离笼子中心 11 英寸的地方，从笼子底部放置 6 英寸。使用任何适合被测试的鸟类类型且将跨越笼子宽度的栖息处。
- 将光电传感器的发射器和接收器放在栖息处两端正上方的保持架上。使用拉链将传感器连接到栖息处上方的导线上。
注：将传感器放在刚性背衬上（例如，舌压机）有助于防止传感器在电线保持架上扭曲和失调。在每次实验之前，通过手动断开红外 （IR） 光束来测试传感器的位置非常重要。如果传感器未正确对齐，鸟不会触发歌曲，或降落在栖息处可能算作多个事件。 - 将机柜下的 LED 灯放在笼子顶部，以提供足够的照明，使动物在两个侧室之间自由移动。
- 将鸟的种子和水放在每个栖息处旁边。
- 在每个房间的两端放置一个扬声器。
- 为了减少声音衍射和视听干扰，在整个笼子的周长上放置消声泡沫，为笼子门和水瓶留下孔。
- 将扬声器连接到音频放大器，并将音频放大器连接到计算机上的声音输出。
2. 传感器的连接
注：有两组红外传感器，每组都有发射器和接收器。发射器有一条带四根电线（棕色、蓝色、黑色和白色）的电缆。接收器有一根带三根电线（棕色、蓝色和黑色）的电缆。一个发射器的白线直接连接到数字 I/O 板上的输入#1。第二个发射器的白线直接连接到输入#9。交流电源输入有两根导线（通常为红色和黑色）。
- 安装数字 I/O 卡 （材料表），其驱动程序，以及相关的程序"测量和自动化"。
注：此处使用的数字 I/O 卡需要连接器块和多功能带状电缆才能完成安装。或者，USB I/O 设备不需要 PCI 卡（或所需的连接器块和带状电缆附件），可以在笔记本电脑上运行。 - 将每个发射器和接收器的两根蓝色导线连接在一起。将两根小电线连接到电源线的黑线，以便黑色电源线可以连接到每个传感器组的蓝色导线。
- 将黑色电源线和两条蓝色导线连接到一条公共导线。将此普通导线连接到连接器块上的输入#2或 9。
注：一组传感器应连接到输入#1和#2，另一组传感器应连接到输入#9和#10。 - 对于两个传感器组，将发射器和接收器的棕色导线连接在一起。对于每个传感器组，将两根棕色导线连接到红色交流电源线。
注：所有四根棕色导线都连接到红色交流电源线。光电传感器由 10–30 V 输入供电，必须连接到交流转换器（例如，120 V 至 12 V 转换器）。 - 在与数字 I/O 卡关联的测量和自动化程序中，通过选择"设备和接口"菜单确定 I/O 卡的设备 ID。
- 选择"设备引脚"选项以确定与 2.3 中的输入对应的端口和线路号。
- 使用测试面板验证 I/O 是否检测到红外光束损坏...选项。请注意每组传感器的通道和端口说明。
注：当光束的状态发生变化时，绿色指示灯将改变颜色。
3. 安装软件和硬件以计数栖息着陆
- 从http://soundanalysispro.com/下载并安装声音分析 Pro 2011 （SAP2011） 和 MySQL。
注：这是免费软件，并附带安装说明和用户手册。 - 打开 SAP 记录器.
- 要配置传感器输入，以便 SAP 可以检测栖息着陆并启动歌曲播放，请单击 SAP 记录器控制窗口中的"操作设备"选项卡。选中"启用操作培训（已安装 NI 卡）"复选框。
- 选择适当的设备 ID（端口滑块可设置为3）。对于每个探测器，从步骤 2.6 中收集的信息中指示相应的端口和线路。
注：当每个探测器的端口和线正确设置时，指示灯将从黄色变为红色。 - 在 SAP 记录器的主窗口中，点击"火车"以激活相应通道的传感器。
注：应出现黄色按钮。 - 通过选择感兴趣的通道号（按屏幕左侧的通道 1或2选项卡），并在"标识和模式"窗口中，在"名称"字段中键入鸟的标识，记录鸟名。
- 为确保向扬声器播放声音，请操作"输出选择"选项卡中的设置，以选择连接到计算机的相应设备（即扬声器）和连接到扬声器的声道。
注：其他设置信息可在声音分析专业用户手册中找到。
4. 隔离对鸟和收集男歌
- 在声衰减室中分离雄性雀和雌性雀，24-48小时。在同居期间，收集男曲，这被称为"伴侣的歌曲"。
注：成对鸟是雄性与雌鸟，它们被安置在一起至少2周。未配对的女性与男性的安置仅24-48小时。- 使用连接到音频放大器的麦克风捕获合作伙伴的歌曲。
- 使用声音分析 Pro 2011 获取歌曲，并将歌曲存储在硬盘上。
- 为了测试神经递质系统对女性歌曲偏好的影响，当配对首次放入腔室时，给女性50μL下皮注射盐水（车辆控制）或五分醇（1mg/mL，以0.9%盐水表示）。在 6~24 小时后重复注射（参见图 1B）。
- 创建歌曲以便在操作调节笼中播放。
- 创建一个 .wav 文件，该文件播放的"静默"长度与歌曲播放大致相同。
注：这可以使用任何声音编辑软件（例如，Audacity）来完成。 - 从搭档男性中剪下一首代表歌曲（2⁄3个图案）。
- 从不熟悉的男性中剪下一首代表歌曲（2⁄3 个图案）。
注：在所有实验中使用相同的陌生男曲。 - 从 300 Hz 到 10 kHz 过滤歌曲。
- 调整音量，使歌曲以 +70 dB 播放（行为室中扬声器在歌曲持续时间内的平均振幅）。
注：歌曲的音量使用放置在栖息处的声音压力计进行测试。
- 创建一个 .wav 文件，该文件播放的"静默"长度与歌曲播放大致相同。
5. 在配对女性中测试歌曲首选项
- 确定女性的侧室偏好。
- 在行为测试之前，将雌鸟放在测试笼中，让她有时间在笼子上调整至少1小时。
- 在"声音分析 Pro"中，选择"播放"选项卡，然后在主窗口中选择"声音"按钮。
- 从文件室 1 和腔室 2 中选择音频 .wav 文件以播放"静音"。
- 返回"主"，然后点击右侧框顶部的"重置"。
- 适应期结束后，按"开始"。
- 在会议结束时，按"停止"。记下每个栖息处的触发器数，这些触发器显示在蓝色框中。
注：数据将保存到 MySQL 数据库中。具有最少的触发器数来计数试验，以确保女性足够活跃（例如，总共 12 个或更多栖息）。
- 确定歌曲首选项。
- 重复第 5.1 节中的步骤，但选择合作伙伴的歌曲从具有最少栖息触发器（非首选侧）的侧室播放，从侧室中选择一首不熟悉的歌曲，其中具有最多的栖息触发器（首选侧）。
注：在静默播放期间，伴军的歌曲从侧室播放，触发数最少（非首选的一侧）。 - 在开始播放歌曲之前按"重置"。
- 通过将播放合作伙伴歌曲的侧室上的触发器数除以触发次数来计算会议厅和歌曲首选项。
- 重复第 5.1 节中的步骤，但选择合作伙伴的歌曲从具有最少栖息触发器（非首选侧）的侧室播放，从侧室中选择一首不熟悉的歌曲，其中具有最多的栖息触发器（首选侧）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
按照协议，我们发现配对的女性更喜欢伴侣的歌曲（图2A）。沉默期间的侧室偏好与歌曲播放期间的侧室偏好有显著差异（t-test针对多个比较进行了更正;p = 0.004;t = 3.35，df = 16）。因此，与陌生男性的歌曲相比，女性优先触发了伴侣的歌曲。
与一个陌生男性配对24-48小时，并给予盐水注射的女性没有偏好他的歌曲，而不是另一个陌生的男性的歌曲。也就是说，与触发歌曲（针对多个比较的 t 检验已更正;p = 0.726;t = 0.357，df = 16）相比，在触发静音的栖息处的侧室偏好之间没有区别。因此，女性与男性居住不到48小时没有形成对他的歌曲的偏好。
在表明我们可以利用行为范式来测试女性雀的歌偏好后，我们使用检测来测试多巴胺对歌曲偏好形成的影响。在这种情况下，一个天真的女性被安置在一个陌生的男性24-48小时，并给予两个皮下注射多巴胺2受体激动剂五氯（图1B，2B）。总体而言，给予五分位的女性更喜欢她与男性的歌曲只有24-48小时（t测试纠正了多重比较;p <0.001;t = 5.25;df = 18）。在所示的示例中，其中两名女性没有表现出对伴侣歌曲的偏好（图 2A）。在一个案例中，女性年龄较大（超过5年）。不清楚为什么第二位女性没有形成偏好。一种可能性是，女性可能没有给予药物完全剂量。
为了确保治疗组之间的女性总活动没有差异，可以解释歌曲偏好的差异，我们比较了栖息触发器的总数（图2B）。栖息触发的总数是女性在 1 小时测试期间在两个栖息处降落以进行静默或歌曲播放的次数。任何治疗中的鸟类的总活性都相似（方差分析，p = 0.436）。
图1：操作调节笼的原理图和实验的时间线。（A） 保持架有两个大小相等的腔室，开口连接两个侧室。一对对立的光电传感器被放置在跨越腔室宽度的每个栖息处上方。当一只鸟降落在栖息处时，她会从传感器上断开红外光束，从而触发离栖息点最近的扬声器播放歌曲。除了栖息的放置外，还显示保持架的尺寸。（B） 实验的时间轴.这个数字是从Day等人21日修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：女性歌曲偏好的代表性数据。（A） 在操作测试期间，栖息触发器的比例表明对同特男性创作的歌曲的偏好。每个女性的歌曲偏好被比较与她的侧室偏好，其中没有歌曲（沉默）触发时，她降落在栖息。在每种情况下，伴侣的歌曲播放时，她降落在非首选房间的栖息。连接点是每个人的首选项。这个数字是从Day等人21日修改的。（B） 所有条件下，笼子每个侧室的栖息总数。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们描述了一种测试斑马雀的歌曲偏好的方法。我们用这个测定来测试配对女性对她伴侣的歌曲的偏好。此外，该测定用于测试多巴胺对天真女性歌曲偏好诱导的影响。这种方法相对便宜，由本科生设计使用，是学生很好的培训工具。其他几项研究已经测试了几种歌曲的偏好，使得这种方法对许多研究鸟类听觉偏好的研究者有用。
这种行为范式基于听觉识别测试系统，ArTsy，首先由Gess等人19描述。这些作者使用类似的系统来测试鸟类的歌曲歧视。我们修改了系统，以测试女性对一首歌曲比另一首歌曲的偏好。我们修改了 Gess 等人19中描述的协议，使用 SAP2011 播放歌曲和收集数据，而不是 MATLAB 中的自定义脚本。我们发现，对于数据采集而言，这种变化更易于使用，本科生更容易获得。操作播放也可以触发使用栖息作为开关24。
我们发现此处描述的协议导致的数据比使用类似方法更易于分析。例如，Woolley 和 Doupe20测量了女性在被动播放不同歌曲类型期间在笼子每一侧花费的时间长度，以确定歌曲偏好。与另一个房间相比，量化一个腔室的时间需要拍摄鸟类，而它们则不是必需的，这是此处描述的协议所必需的。同样，其他人也把回应男曲的女性电话数量计算在内，以衡量她偏好25，26。这需要使用手动或半自动计数的女性呼叫。此处描述的歌曲偏好的量化要简单得多，因为软件会自动跟踪栖息着陆的次数。
使用这里描述的协议，我们发现配对的女性总是选择听他们伴侣的歌曲。任务不测试女性的合作伙伴偏好，只测试她的歌曲偏好。未来的实验应该检查伴侣偏好以及歌曲偏好13，16，27。该协议可用于测试其他神经递质系统对歌曲偏好形成的影响，以比较许多脊椎动物所共有的社会行为网络背后的保守进化机制。例如，未来的实验可以直接针对大脑中的特定区域，而动物正在学习访问社会行为背后的神经回路的任务。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢佩特拉·格鲁齐克建造行为笼，托马斯·博罗夫斯基博士帮助设计实验，斯蒂芬妮·怀特博士给予她慷慨的支持。HHMI本科暑期研究补助金（HHMI #30052007536到D.S.和L.H.） 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Quinpirole | sigmaaldrich | Q102 | |
| acoustic foam | Coulbourn Instruments, Allentown, PA | H10-24A | |
| audio amplifier - 2 channel | Amazon | Pyle PCAU46A | any small audio amplifier should work |
| Banner Engineering Q08 Series, emitter. SO60-Q08 | https://www.alliedelec.com | Stock #:70659809 | photoelectric sensor |
| Banner Engineering Q08 series, receiver. EO60-Q08-AN6X | https://www.alliedelec.com | Stock #:70699384 | photoelectric sensor |
| Car stereo speakers | Amazon | Pioneer TS - F1643R | |
| Digital I/O card | National Instruments | PCI-6503 or USB-6501 | |
| LED lights - under-counter | Amazon | ||
| multifunctional ribbon cable | National Instruments | 180524-20 | |
| sound pressure level meter | Amazon | ||
| terminal block | National Instruments | 777101-1 |
References
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Young, K. A., Gobrogge, K. L., Liu, Y., Wang, Z. The neurobiology of pair bonding: Insights from a socially monogamous rodent. Frontiers in Neuroendocrinology. 32 (1), 53-69 (2011).
- Young, L. J., Wang, Z. The neurobiology of pair bonding. Nature Neuroscience. 7 (10), 1048-1054 (2004).
- Aragona, B. J., Liu, Y., Curtis, J. T., Stephan, F. K., Wang, Z. A critical role for nucleus accumbens dopamine in partner-preference formation in male prairie voles. Journal of Neuroscience. 23 (8), 3483-3490 (2003).
- Lippert, R. N., et al. Time-dependent assessment of stimulus-evoked regional dopamine release. Nature Communications. 10 (1), 336 (2019).
- Lack, D. L. Ecological adaptations for breeding in birds. , (1968).
- O'Connell, L. A., Hofmann, H. A. The vertebrate mesolimbic reward system and social behavior network: a comparative synthesis. Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3599-3639 (2011).
- O'Connell, L. A., Hofmann, H. A. Genes, hormones, and circuits: an integrative approach to study the evolution of social behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 32 (3), 320-335 (2011).
- Banerjee, S. B., Dias, B. G., Crews, D., Adkins-Regan, E. Newly paired zebra finches have higher dopamine levels and immediate early gene Fos expression in dopaminergic neurons. European Journal of Neuroscience. 38 (12), 3731-3739 (2013).
- Gil, D., Gahr, M. The honesty of bird song: multiple constraints for multiple traits. Trends in Ecology & Evolution. 17 (3), 133-141 (2002).
- Tomaszycki, M. L., Adkins-Regan, E. Experimental alteration of male song quality and output affects female mate choice and pair bond formation in zebra finches. Animal Behaviour. 70 (4), 785-794 (2005).
- Woodgate, J. L., Mariette, M. M., Bennett, A. T. D., Griffith, S. C., Buchanan, K. L. Male song structure predicts reproductive success in a wild zebra finch population. Animal Behaviour. 83 (3), 773-781 (2012).
- Zann, R. Reproduction in a Zebra Finch Colony in South-eastern Australia: the Significance of Monogamy, Precocial Breeding and Multiple Broods in a Highly Mobile Species. Emu. 94 (4), 285-299 (1994).
- Klatt, J. D., Goodson, J. L. Oxytocin-like receptors mediate pair bonding in a socially monogamous songbird. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280 (1750), 20122396 (2013).
- Pedersen, A., Tomaszycki, M. L. Oxytocin antagonist treatments alter the formation of pair relationships in zebra finches of both sexes. Hormones and Behavior. 62 (2), 113-119 (2012).
- Adkins-Regan, E. Neuroendocrinology of social behavior. Ilar Journal. 50 (1), 5-14 (2009).
- Goodson, J. L., Kabelik, D., Kelly, A. M., Rinaldi, J., Klatt, J. D. Midbrain dopamine neurons reflect affiliation phenotypes in finches and are tightly coupled to courtship. Proceedings of the National Academy of Sciences the United States of America. 106 (21), 8737-8742 (2009).
- Iwasaki, M., Poulsen, T. M., Oka, K., Hessler, N. A. Sexually dimorphic activation of dopaminergic areas depends on affiliation during courtship and pair formation. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (210), (2014).
- Gess, A., Schneider, D. M., Vyas, A., Woolley, S. M. Automated auditory recognition training and testing. Animal Behavior. 82 (2), 285-293 (2011).
- Woolley, S. C., Doupe, A. J. Social context-induced song variation affects female behavior and gene expression. PLoS Biology. 6 (3), 62 (2008).
- Day, N. F., et al. D2 dopamine receptor activation induces female preference for male song in the monogamous zebra finch. Journal of Experimental Biology. 222, Pt 5 (2019).
- Hahn, A. H., et al. Discrimination of male black-capped chickadee songs: relationship between acoustic preference and performance accuracy. Animal Behaviour. 126, 107-121 (2017).
- Leitão, A., ten Cate, C., Riebel, K. Within-song complexity in a songbird is meaningful to both male and female receivers. Animal Behaviour. 71 (6), 1289-1296 (2006).
- Day, N. F., Hobbs, T. G., Heston, J. B., White, S. A. Beyond Critical Period Learning: Striatal FoxP2 Affects the Active Maintenance of Learned Vocalizations in Adulthood. eNeuro. 6 (2), (2019).
- Chen, Y., Clark, O., Woolley, S. C. Courtship song preferences in female zebra finches are shaped by developmental auditory experience. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1855), 20170054 (2017).
- Heston, J. B., White, S. A. Behavior-linked FoxP2 regulation enables zebra finch vocal learning. Journal of Neuroscience. 35 (7), 2885-2894 (2015).
- Adkins-Regan, E., Tomaszycki, M. Monogamy on the fast track. Biological Letters. 3 (6), 617-619 (2007).
- Young, R. L., et al. Conserved transcriptomic profiles underpin monogamy across vertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
Tags
行为， 发行 154， 歌鸟， 一夫一妻制， 配对债券， 社交， 伴侣偏好， 多巴胺Erratum
Formal Correction: Erratum: Operant Conditioning Task to Measure Song Preference in Zebra Finches
Posted by JoVE Editors on 02/18/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Operant Conditioning Task to Measure Song Preference in Zebra Finches. An affiliation was updated.
One of the affiliations was updated from:
W.M. Keck Science Department, Clarmont McKenna College – Pitzer College – Scripps College
to:
W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna College – Pitzer College – Scripps College
