Summary
In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.
Abstract
Ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel vereist een nauwkeurige coördinatie van complex cellulair gedrag en interacties. Het gebruik van hoge resolutie in vivo beeldvormingstechnieken kan een duidelijk venster geven op deze processen in het levende organisme. Bijvoorbeeld, delen cellen en hun nakomelingen kan worden gevolgd in real time als het zenuwstelsel vormen. In de afgelopen jaren hebben de technische ontwikkelingen in veelkleurige technieken de soorten vragen die kunnen worden onderzocht, uitgebreid. De multicolor Brainbow aanpak kan worden gebruikt om niet alleen onderscheid te maken tussen zoals cellen, maar ook om kleur-code meerdere verschillende klonen van verwante cellen die elk afkomstig zijn uit een voorloper cel. Dit zorgt voor een multiplex lineage analyse van veel verschillende klonen en hun gedrag tegelijkertijd tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen te visualiseren over real-time binnen het zich ontwikkelende zebravis zenuwstelsel. Dit is vooral handig voor het volgen van cellulaire interacties tussen dergelijke cellen, die moeilijk differentieel te labelen met behulp van traditionele promotor-gedreven kleuren. Onze aanpak kan worden gebruikt voor het bijhouden van afstammingsrelaties tussen meerdere verschillende klonen tegelijk. De grote datasets gegenereerd met behulp van deze techniek bieden rijke informatie die kwantitatief kan worden vergeleken met genetische of farmacologische manipulaties. Uiteindelijk kunnen de gegenereerde resultaten helpen om systematische vragen te beantwoorden over hoe het zenuwstelsel zich ontwikkelt.
Introduction
In de vroege ontwikkelingsfasen delen poelen van gespecialiseerde voorlopercellen zich herhaaldelijk in proliferative zones, waardoor verschillende arrays van dochtercellen worden geproduceerd. De cellen geboren tijdens deze ontwikkelingsperiode zal dan differentiëren en reizen naar de ontluikende organen te vormen. In het zenuwstelsel, voorouders zoals radiale glia aanleiding geven tot onrijpe neuronen in ventriculaire zones. Als neuronen migreren uit de buurt van ventrikels en volwassen, het uitdijende weefsel vormt uiteindelijk de zeer complexe structuren van de hersenen1,2,3,4,5,6. De coördinatie tussen de verdeling van de voorouders en differentiatie en migratie van neuronen zal de uiteindelijke grootte, vorm en dus functie van de hersenen bepalen, die direct gedragbeïnvloeden 7,8,9,10. Hoewel strakke controle over deze processen duidelijk cruciaal is voor de normale ontwikkeling van de hersenen, zijn de globale mechanismen die deze dynamiek reguleren niet goed begrepen. Hier beschrijven we een hulpmiddel om de ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen met een cellulaire resolutie, waardoor onderzoekers voorlopercellen en neuronen in vivo in het zich ontwikkelende zebravisbrein met Brainbow kunnen visualiseren en hun gedrag in de loop van de tijd kunnen volgen via time-lapse confocale microscopie11. De aanpak kan ook worden aangepast om andere delen van het zich ontwikkelende embryo te visualiseren.
Om cellen in het zich ontwikkelende zebravisbrein te observeren en te onderscheiden, hebben we de Brainbow cellabelingtechniek11aangepast. Brainbow maakt gebruik van de willekeurig bepaalde, combinatorische expressie van drie verschillende fluorescerende eiwitten (FPs) om een populatie van cellen te labelen. Terwijl de standaardexpressie voor Brainbow-expressie de rode FP dTomato is, resulteert recombinatie door het enzym Cre recombinase in expressie van mCerulean (cyaan fluorescerend eiwit, GVB) of geel fluorescerend eiwit (YFP)12,13. De gecombineerde hoeveelheid van elke FP uitgedrukt in een cel geeft het een unieke tint, waardoor duidelijk visueel onderscheid van naburige cellen. Bovendien, wanneer een voorloper cel verdeelt, zal elke dochtercel erven de kleur van zijn moedercel, producerenkleurgecodeerde klonen en waardoor onderzoekers celafstamming11,,14traceren . Terwijl oorspronkelijk gebruikt om neuronale circuits bij muizen12te analyseren, is Brainbow sindsdien uitgedrukt in een breed scala van modelorganismen, waaronder zebravis15.
Onze techniek bouwt voort op eerdere multicolor labeling en imaging methoden om direct beeld meerdere kleurgecodeerde klonen na verloop van tijd in levende zebravissen. Vanwege hun optische transparantie als embryo's, zebravissen zijn zeer geschikt voor beeldvorming experimenten16, en eerdere studies hebben brainbow gebruikt in zebravissen om een verscheidenheid van weefsels te bestuderen, met inbegrip van het zenuwstelsel11,15,17,19,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. De mogelijkheid om direct beeld in het levende organisme, samen met hun snelle ex-utero ontwikkeling, maken zebravissen een waardevol model van gewervelde ontwikkeling. In tegenstelling tot de zoogdierhersenen is de gehele proliferative zone van de zebravisachterbrein direct beschikbaar voor beeldvorming zonder verstoring van zijn endogene omgeving6. Hierdoor kunnen experimenten worden uitgevoerd in het levende organisme, in plaats van in vitro of vaste weefselpreparaten. In tegenstelling tot vaste beeldvormingsexperimenten maken in vivo studies een longitudinale ontwerp mogelijk, waardoor uren aan gegevens worden geproduceerd die kunnen worden geanalyseerd op patronen, waardoor de kans op het waarnemen van relatief zeldzame gebeurtenissen toeneemt. Afhankelijk van de snelheid en lengte van de gebeurtenissen van belang, onderzoekers kunnen ervoor kiezen om korte (1-2 uur) of lange (tot ~ 16 uur) time-lapse imaging experimenten uit te voeren. Door het gebruik van de zebrafish heat shock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow expressie kan tijdelijk worden gecontroleerd28,29. Bovendien, de mozaïek uitdrukking geïnduceerd door deze promotor is zeer geschikt voor etikettering en het bijhouden van vele klonen11.
De mogelijkheid om visueel te identificeren meerdere klonen in de levende hersenen is een voordeel van deze methode. Belangrijke eerdere studies die de rol van klonen binnen de ontwikkeling van het zenuwstelsel onderzocht gebruikt retrovirale vectoren om een enkele voorloper cel en zijn nakomelingen label met behulp van een enkele FP of andere gemakkelijk gevisualiseerde eiwitten. Een dergelijke etikettering stelt onderzoekers in staat om in de loop van de tijd één kloon te observeren, hetzij in vitro , hetzij in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. In tegenstelling tot methoden om het gedrag van cellen in één kloon te volgen, stellen de verschillende kleuren van Brainbow onderzoekers in staat om dynamiek onder klonen te observeren. Bovendien, door brainbow te gebruiken om vele klonen binnen de hersenen te etiketteren, worden de extra gegevens over clonal gedrag verzameld met betrekking tot technieken die één enkele kloonetiket1. Belangrijk is dat de hier beschreven benaderingen kunnen worden uitgebreid om ontwikkelingsvergelijkingen te genereren tussen vissen die verschillende genetische of farmacologische manipulaties hebben ondergaan18. Over het algemeen maken deze voordelen time-lapse in vivo confocale beeldvorming van Brainbow-uitdrukkende zebravissen ideaal voor onderzoekers die de ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel onderzoeken, met name diegenen die geïnteresseerd zijn in de rol van klonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Het Lewis & Clark College.
1. Micro-injectie van zebravisembryo's
- Zet wilde type, volwassen zebravissen in geslacht gescheiden paring tanks de middag voorafgaand aan het uitvoeren van micro-injecties39,40.
- Bereid de DNA-oplossing voor in de ochtend van de micro-injecties. Verdun hsp:Zebrabow11 plasmide DNA tot een concentratie van ~10 ng/μL in 0,1 mM KCl, samen met 2,5% fenolrood en 3,75 U Cre recombinase enzym.
- Voer micro-injecties van DNA-oplossing uit in eencellige zebravisembryo's binnen 45 min van bevruchting39,41. Injecteer ongeveer 4,2 nL van deze oplossing in elk embryo, gelijk aan ~42 pg plasmilaat-DNA.
LET OP: De micro-injectie stap kan worden weggelaten als een transgene, Brainbow-expressing zebrafish lijn in plaats daarvan wordt gedekt, zoals Tg (ubi:Zebrabow)15 en Tg (neurod: Zebrabow)18. Het uitvoeren van micro-injecties kan voordelig zijn omdat het onderzoekers in staat stelt om het kopieernummer en de etiketteringsdichtheid te titreren. Bovendien kan een tweede DNA-constructie die een specifiek genproduct tagt of manipuleert, indien gewenst naast Brainbow worden geïnjecteerd (bijvoorbeeld een veelrood fluorescerend eiwit dat brainbow18aanvult). - Bewaar geïnjecteerde embryo's in petrischaaltjes van E3 medium39 in een 28 °C incubator gedurende 24 uur.
2. Hitteschok om Brainbow Expression te induceren
LET OP: Als het plasmide DNA geïnjecteerd of het transgene uitgedrukt maakt geen gebruik van de hsp70 promotor om de expressie te rijden, de hitte schok stap kan worden overgeslagen, en gezonde embryo's moeten onmiddellijk worden overgedragen aan fenylthiourea (PTU) op 24 uur na bevruchting (hpf).
- Bij 24 pkf, ruim dode en misvormde embryo's uit de groep geïnjecteerde embryo's. Breng vervolgens de gezonde embryo's over naar een buis van 50 mL, met maximaal 20 embryo's/buis.
- Vul de buizen met 10 mL E3. Plaats een dop op de top van elke buis, maar niet goed sluiten.
- Plaats het buisrek met de 50 mL buizen rechtop in een waterbad van 37 °C. Zorg ervoor dat het waterniveau in het bad hoger is dan het niveau van de E3 in de buizen en laat ze 80 tot 90 min.
- Haal het smeerrek met de embryo's uit het waterbad en keer rechtop terug naar de couveuse van 28 °C. Laat de E3 tot 1 uur afkoelen en de embryo's komen geleidelijk aan aan de temperatuur. Breng vervolgens de embryo's over naar petrischalen van 0,2 mM PTU in E3 opgewarmd in de couveuse om pigmentatie van embryo's te voorkomen.
LET OP: PTU is een giftige chemische stof die met zorg moet worden behandeld en op de juiste manier moet worden verwijderd. Het dragen van handschoenen wordt voorgesteld.
3. Screening Embryo's voor Brainbow Expression
- Onderzoek de embryo's na de hitteshock om 2 tot 4 uur na de hitteshock onder een standaard fluorescentiedissectiemicroscoop voor expressie van GVB of YFP, wat duidt op een succesvolle Brainbow-recombinatie (uit standaardexpressie van dTomato).
LET OP: Als er meerdere fluorescentiefilteropties beschikbaar zijn, is screening op GVB de meest efficiënte manier om goed gehercombineerde vissen te identificeren. Als GVB- en YFP-filters niet beschikbaar zijn, kan YFP ook slecht worden gevisualiseerd onder groene fluorescerende eiwitfilters (GFP) vanwege de overlap in hun spectrale profielen. - Selecteer embryo's met robuuste FP-expressie en breng over op een apart gerecht met PTU. Afbeelding embryo's op 1 dag na de bevruchting (dpf; 28 hpf of later) of onderhouden van embryo's in PTU en beeld op 2 of 3 dpf.
4. Embryo's monteren voor in vivo beeldvorming
-
Bereid voorafgaand aan de dag van het experiment de beeldkamer en het embryomanipulatie-gereedschap voor.
- Bereid de beeldkamer voor door een kunststof ring voorzichtig te superlijmen in het midden van een petrischaal van 60 mm.
- Bereid eventueel een op maat gemaakte embryomanipulator voor om embryo's in de schotel te verplaatsen en embryo's te oriënteren tijdens het monteren. Bouw de manipulator door supergluing een kleine lengte van nylon vislijn (~ 1 / 2 in, ~ 6 pond) aan het einde van een houten wattenstaafje stok die is gesneden tot een ~ 4 in lengte.
- Indien nodig (d.w.z. beeldvorming bij 2 dpf of eerder), alvorens de embryo's te dechorionaat met behulp van spuiten onder een dissectiemicroscoop te monteren.
-
Verdoven zezebravissen embryo's.
- Vul een 60 mm petrischaal halverwege met E3 en voeg 5-6 druppels van 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S toe aan een uiteindelijke concentratie van ~0,2 mM. Wervel om te mengen.
LET OP: Tricaine moet met zorg worden behandeld en op de juiste manier worden verwijderd. - Breng embryo's van de PTU over naar de tricaine-oplossing, zodat er zo min mogelijk PTU wordt overgedragen. Terwijl visreflexen na 1-2 min moeten ophouden, laat de embryo's in tricaine voor maximaal 10 min om een grondige verdoving voor time-lapse imaging experimenten te garanderen.
- Bevestig dat de embryo's goed verdoofd zijn. Beoordeel de schrikreflex door de embryostaarten voorzichtig aan te raken met de embryomanipulator. Als een reflexbeweging wordt waargenomen, voeg een extra druppel tricaine aan de schotel zo ver mogelijk van de embryo's mogelijk en wervelen om te mengen. Let op de embryohartslag onder een dissectiebereik. Als het abnormaal traag is, voeg extra druppels E3 toe aan de schotel om de tricaineconcentratie te verminderen.
- Vul een 60 mm petrischaal halverwege met E3 en voeg 5-6 druppels van 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S toe aan een uiteindelijke concentratie van ~0,2 mM. Wervel om te mengen.
-
Zet verdoofde embryo's in agarose.
- Breng de vis naar het midden van de plastic ring in de beeldkamer en verwijder zoveel mogelijk overtollige E3 met behulp van een fijn-getipte overdracht pipet.
- Bedek met een schone overdrachtpipet de vis met 1,0% laagsmelte agarose (LMA) in E3, opgeslagen bij 42 °C en vul de hele plastic ring met een dun laagje agarose. Gebruik een transfer pipet om voorzichtig trek de embryo's in de pipet tip en terug in de agarose zonder de invoering van luchtbellen.
- Voordat de agarose verhardt, gebruik snel een embryo manipulator om de vis op de juiste manier te oriënteren. Als beeldvorming met een rechtopstaande microscoop, plaats de embryo's zo dicht mogelijk bij het bovenste oppervlak van de agarose mogelijk. Plaats de embryo's parallel aan de bodem van de beeldkamer met de staart recht.
LET OP: Voor beeldvorming in de achterhersenen kunnen de embryo's in een dorsale of sagittale weergave worden geplaatst. Zorg ervoor dat ervoor wordt gezorgd dat de hoofden van de embryo's niet zinken terwijl de agarose nog vloeibaar is. Andere oriëntaties kunnen geschikt zijn om andere zich ontwikkelende weefsels voor beeldvorming te richten. Voor omgekeerde microscopen, montage zou anders worden gedaan, meestal positionering van de vis dicht bij de bodem van een glazen bodem Petri schaal.
- Wacht tot de agarose uithardt en vul de beeldkamer met E3. Voeg zoveel Mogelijk E3 toe om rekening te houden met de verdamping in de loop van de beeldvorming.
5. Time-lapse Confocalimaging of Developing Zebrafish Hindbrain
-
Plaats de beeldkamer op de confocale microscoop ter voorbereiding van de beeldvorming.
- Plaats de beeldkamer met de vis en E3 op de confocale microscoop.
- Selecteer een doelstelling met een hoog numeriek diafragma en een lange werkafstand, zoals een doelstelling van 20x wateronderdompeling (1.0 NA).
- Zoek een regio met de juiste dichte en heldere etikettering van het celtype(s) van belang.
LET OP: Een temperatuurgestuurd stadium/apparaat op de microscoop kan ook worden gebruikt om temperatuur en vochtigheid te regelen tijdens lange beeldvormingssessies. Dit kan de verdamping verminderen.
-
Stel de acquisitieparameters in voor Brainbow imaging.
- Beeld elk FP-kanaal opeenvolgend. Bij gebruik van een commerciële software (bijvoorbeeld Zen-software), wordt dit gedaan door het voorbereiden van drie "tracks". Gebruik een Argon-laser om GVB op te wekken bij 458 nm en YFP op 514 nm. Gebruik een DPSS 561 nm laser om dTomato op te winden. Verzamel emissies tussen 463-509 nm voor GVB, 519-555 nm voor YFP en 566-691 nm voor dTomato.
- Voor het scherm display, code GVB zo blauw, YFP als geel, en dTomato als rood.
LET OP: Deze instellingen variëren afhankelijk van welke laserlijnen en andere functies beschikbaar zijn op de confocale microscoop. Om de snelheid van beeldvorming te verhogen, kunnen GVB- en dTomato-kanalen tegelijkertijd worden weergegeven zonder merkbare bleed-through. Als er ook een aparte FP wordt afgebeeld, zoals een veelrode FP, kan dit achtereenvolgens of gelijktijdig met YFP worden weergegeven. - Stel de algemene beeldparameters in om 16-bits afbeeldingen te maken met een resolutie van ten minste 1024 x 1024 en gemiddeld twee keer. Pas de zoom aan afhankelijk van het gebied en het celtype van de rente (d.w.z. voor hindbrain-beeldvorming met een doelstelling van 20x zal de zoom variëren van 1,0-2,5). Maximaliseer het gezichtsveld om de groei van de vis in de loop van de tijd mogelijk te maken.
- Het bekijken van een track tegelijk (en het uitschakelen van andere lasers om fotobleekte te voorkomen), het optimaliseren van de acquisitie-instellingen voor elke FP individueel (bijvoorbeeld, laserkracht, pinhole grootte, photomultiplier buis te krijgen, enz.).
- Selecteer Z-stackbereik op afbeelding.
LET OP: Houd er bij lange imagingsessies (>2 h) rekening mee dat de vis in de loop van de beeldvorming zal blijven groeien, dus zowel het XY-veld als het Z-stack-assortiment moeten dit met extra ruimte in de weg staan. Als beeldvorming van de achterhersenen, ruimte in het veld voor het weefsel te bewegen rostrally tijdens de beeldvorming periode. Er moet ook ruimte worden opgenomen voor groei in de Z-dimensie. Neem in de afbeelding ongeveer 10-20 μm boven het gebied van belang, of de vis is gepositioneerd voor sagittale of dorsale weergave.
-
Stel parameters in voor time-lapse imaging.
- Selecteer een tijdsinterval. Intervallengte varieert tussen 10-30 min om mitotische en apoptotische gebeurtenissen in de zich ontwikkelende achterhersenen te volgen. Intervallengte is afhankelijk van de snelheid van de gebeurtenissen van belang en de totale tijd die nodig is om een enkele Z-stack vast te leggen.
- Selecteer de lengte van de beeldvormingssessie. Time-lapse imaging sessies komen over het algemeen 's nachts voor en kunnen minstens 16 uur duren.
-
Voer het experiment uit.
OPMERKING: De vis kan onmiddellijk na beeldvorming worden geëuthanaseerd of zorgvuldig worden ontleed uit de agarose met behulp van spuiten en teruggestuurd naar E3 om te herstellen. Teruggewonnen vis kan dan opnieuw worden afgebeeld op een later tijdstip, hoewel de celpositie en diepte in deze periode zullen verschuiven als gevolg van de algehele groei.
6. Time-lapse Bestandsbeheer
-
Importeer het afbeeldingsbestand in de analysesoftware.
- Als u Zen-software gebruikt, slaat u het bestand op in de CZI-indeling zodra de afbeeldingsacquisitie is voltooid. Zorg ervoor dat u ruwe gegevens opslaat in een indeling die compatibel is met Fiji42 en/of andere software.
- Importeren in Fiji-software met behulp van BioFormats Importer.
LET OP: Time-lapse-bestanden zullen groot zijn en kunnen aanzienlijke hoeveelheden tijd en geheugen nodig hebben om te openen voor analyse. Het is dus nuttig om strategisch te zijn in hoe ze worden opgeslagen en geopend. Het kan handig zijn om een versie van lagere kwaliteit op te slaan die gemakkelijker kan worden geopend om te zoeken naar gebeurtenissen die van belang zijn voor het oog.
- Als u Fiji gebruikt, maakt u kleinere, beter beheerbare subsets van time-lapse-bestanden. Deelverzamelingen genereren, bijvoorbeeld door de volledige Z-stack op het eerste tijdspunt te bekijken) of door diepte (bijvoorbeeld de eerste 50 Z-secties op elk tijdstip weer te geven) door op Afbeeldingte klikken | Stapels| Instrumenten| Substack maken.
7. Kwantitatieve kloonkleuranalyse van Brainbow Images
- Meet de gemiddelde rode, groene en blauwe (RGB) intensiteitswaarden voor de cellen van belang in Fiji.
OPMERKING: Deze instructies zijn specifiek voor beeldanalyse in Fiji. Echter, onderzoekers kunnen de voorkeur aan gemiddelde RGB intensiteit waarden te verkrijgen in een alternatief softwareprogramma.- Zorg ervoor dat het bestand correct is bijgesneden, zodat er geen zwarte ruimte is rond de randen van de afbeelding. De zwarte ruimte zal kunstmatig de minimale intensiteitsmetingen verlagen die voor de analyse nodig zijn. Als het bestand moet worden bijgesneden, selecteert u de knop Rechthoekselectie en tekent u een interessegebied (ROI) rond het gezichtsveld, met uitzondering van alle zwarte ruimte. Klik op Afbeelding| Gewas.
- Stel het meetgereedschap in om gemiddelde, minimale en maximale metingen met de grijze waarde te nemen. Klik op Analyseren| Stel metingen in. Controleer of de selectievakjes voor Min en Max Grijswaarde en Gemiddelde grijswaarde zijn geselecteerd.
- Als u de ruwe gegevensbestanden of subsetted Z-stacks in Fiji bekijkt, worden cellen gevonden die van belang zijn voor kloonkleuranalyse. In de achterhersenen kunnen vermeende klonen visueel worden geïdentificeerd door hun gedeelde tint en hun radiale oriëntatie. Selecteer geen cellen die in nauw contact staan met, en dus moeilijk op te lossen van, naburige cellen van een andere kleur. Het kan moeilijk zijn om hun tint te kwantificeren.
- Zoek het midden Z-vlak van de cel van belang met behulp van de Z-scrollbar. Klik met de rechtermuisknop op de knop Ovaal selecteren en selecteer de knop Elliptische selectie. Andere selectietools zijn geschikt voor verschillende celtypen. Teken een elliptische ROI rond de centrale ~ 2 / 3 van de cel lichaam.
- Selecteer met de C-scrollbarhet rode (dTomato)-kanaal. Neem de gemiddelde intensiteitsmeting voor dit kanaal door Analyserente selecteren | Maatregel. Herhaal dit met dezelfde ROI en het brandpuntsvlak voor de groene (YFP) en blauwe (GVB) kanalen en sla alle gemiddelde intensiteitswaarden op.
- Klik ergens op de afbeelding om de elliptische ROI in de cel van belang te verwijderen.
- Als u achtergrondniveaus voor normalisatie wilt meten, gebruikt u de C-scrollbar en selecteert u het rode kanaal (dTomato). Neem de minimale intensiteitsmeting voor het hele veld in dit kanaal door Analyserente selecteren | Maatregel. Herhaal dit met hetzelfde brandpuntsvlak voor de groene (YFP) en blauwe (GVB) kanalen en sla alle minimumintensiteitswaarden op.
- Bereken relatieve RGB-kanaalgewichten voor de cellen van belang.
OPMERKING: De berekening van relatieve RGB-kanaalgewichten op basis van deze intensiteitswaarden kan worden uitgevoerd in verschillende softwareprogramma's, zoals Microsoft Excel of R43.- Normaliseer de gemiddelde intensiteitsmeting van de cel-ROI voor elk kanaal door de minimale intensiteit af te trekken van het hele veld in dat kanaal en het brandpuntsvlak.
- Som de genormaliseerde gemiddelde RGB-intensiteitswaarden van elk kanaal op om de totale genormaliseerde RGB-intensiteit voor de cel te vinden.
- Bereken het relatieve kanaalgewicht voor elk kanaal door de genormaliseerde gemiddelde intensiteitswaarde voor dat kanaal te delen door de totale genormaliseerde RGB-intensiteit.
- Geef relatieve RGB-kanaalgewichten weer als ternaire plots met behulp van het Ternaire-pakket voor R43,44. Ternaire plots zijn handig om de clustering van vergelijkbare kleuren in 3D RGB-ruimte te visualiseren.
- Bereken de kleurspreidingscoëfficiënt om het verschil tussen celkleuren te kwantificeren.
- Bereken de Euclidische afstand tussen de twee kleuren in 3D RGB-ruimte met de volgende vergelijking:
waarbij R, G en B de relatieve RGB-kanaalgewichten zijn, berekend in punt 7.2. - Voor het gemak van begrip, normaliseren van de kleur afstand door te delen door √2, de maximaal mogelijke afstand tussen kleuren, om een kleur spreiding coëfficiënt tussen 0 en 1 te verkrijgen, waar 0 geeft precies dezelfde kleur en 1 geeft volledig verschillende kleuren (bijvoorbeeld, puur rood en puur blauw).
- Bereken de Euclidische afstand tussen de twee kleuren in 3D RGB-ruimte met de volgende vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van de in vivo multicolor time-lapse imaging aanpak die hier wordt beschreven. We tonen aan dat Brainbow kleurgecodeerde klonen van cellen in de proliferative venricular zone van de zich ontwikkelende zebravis achterhersenhelft14 (Figuur 1).
Typisch, toen Brainbow-gelabelde cellen werden gerangschikt langs een bepaalde radiale vezel, ze deelden dezelfde kleur (Figuur 1D), die kan worden gekwantificeerd als de relatieve RGB-kanaal gewichten (Figuur 1E). Dit suggereert dat deze radiale groepen klonen van delende cellen waren en dat hun vergelijkbare kleur kan worden gebruikt om ze te identificeren als zijnde klonaal gerelateerd, zoals waargenomen in eerdere studies bij zebravissen, muis en kuiken14,15. Wanneer Brainbow etikettering dichtheid is relatief schaars, deze kleur-codering kan worden gebruikt om duidelijk te visualiseren en te volgen veel verschillende radiale klonen binnen proliferative regio's van de levende gewervelde hersenen.
Een kwantitatieve kleuranalyse toonde aan dat dochtercellen dezelfde kleur uitdrukten als hun moeder (voorloper) cel (Figuur 1F), maar dat naburige radiale clusters van cellen van elkaar kunnen worden onderscheiden11 (Figuur 1E). Dit betekent dat talrijke klonen van verwante cellen gelijktijdig kunnen worden gevolgd gedurende uren in vivo (Figuur 2), waardoor een multiplex lijnanalyse en -vergelijking mogelijk is. Kwantificering van kleurexpressie bij klonen bij 2 dpf en vervolgens weer bij 3 dpf (figuur 2A-B) toonde aan dat Brainbow expressie ook relatief constant bleef van 2-3 dagen in vivo11. Individuele cellen kunnen dus gedurende relatief lange tijd tijdens de ontwikkeling in real time worden geïdentificeerd en bijgehouden.
Time-lapse beeldvorming bleek tal van cellen ondergaan interkinetische nucleaire migratie en celdeling tijdens de periode van 1-2 dpf (Figuur 2C-F)11, waardoor studie van de celcyclus. Met behulp van een time-lapse interval van 30 min, hebben we niet altijd vangen de mitotische figuur tijdens de celdeling. Dit introduceerde een potentiële fout van maximaal 30 min aan de toegewezen tijd van celdeling. Daarnaast zagen we dat sommige klonen twee voorlopercellen (bijvoorbeeld figuur 2F)zouden bevatten. Binnen deze beperkingen kan de lengte van de celcyclus worden gemeten. Door individuele brainbow-gelabelde voorouders in de loop van de tijd te volgen, berekenden we een gemiddelde celcyclus van 8,4 ± 1,5 uur, vergelijkbaar met eerdere metingen bij zebravissen1,45,46. Bovendien konden we met behulp van de Brainbow time-lapse imaging techniek ook individuele cellen observeren die de stereotiepe morfologische veranderingen ondergaan die gepaard gaan met apoptose (figuur 3)11, zoals membraanblebbing en celfragmentatie47,48.
Figuur 1: Brainbow gelabeld kloongerelateerde clusters van delende cellen in de zich ontwikkelende zebravis achterhersenhelft. (A) Schematisch van hsp:Zebrabow (Brainbow) DNA van voorbijgaande aard uitgedrukt in kleurcode klonen. bB) In vivo uitgezonden lichtbeelden van de ontwikkeling van zebravissen op 1 en 2 dpf; pijlen geven het algemene achterhersengebied aan dat is gericht op beeldvorming. Doorschijnendheid van de embryo's wordt aangetoond door een micrometer die onder elke vis wordt geplaatst. Experimentele tijdlijn met injecties in een cel stadium, hitteschok (GS) op 24 hpf, en beeldvorming van 1-3 dpf. (C) Dorsale mening van 29 pkf zebrafish achterhersenen geëtiketteerd met Brainbow. Het uitgezonden lichtkanaal toonde de morfologie van de achterhersenen en de ventrikel bedekt met maximale intensiteitprojectie van Brainbow-gelabelde klonen die 165 μm vertegenwoordigen. Rostral is op. dD) In vivo Brainbow-expressie in de achterhersenen, weergegeven in projecties met een maximale intensiteit die 41 μm vertegenwoordigen in een dun gelabelde 51 pkf-zebravis (D1) en 81 μm in 63,5 pkfzebravissen (D2). In beide panelen, dorsale is up en rostral is aan de linkerkant. (E) De kleur van de cellen in D1 en D2 werd gekwantificeerd als relatieve kanaalgewichten in overeenkomstige ternaire percelen (n = 54 cellen E1; 461 cellen E2). (F) Celkleur bleef relatief constant in dochtercellen na celdeling. Reeks tijdpunten die in vivo mitotische gebeurtenissen in de achterhersenen van 29 pkf Brainbow-geëtiketteerde zebravissen meer dan 1 h (F1, maximumintensiteitsprojecties, 30 μm diepte) tonen. De kleur van moeder- en dochtercellen, aangegeven door de zwarte vakken in F1,wordt weergegeven als relatieve kanaalgewichten in het ternaire perceel in F2. De set toont een zoom van dezelfde plot om strak geclusterde celkleuren weer te geven (M is moeder; D1 en D2 zijn dochters op 30 min/vierkanten, en 60 min/driehoeken). Schaalbalken = 30 μm (C), 20 μm (D1),16 μm (D2)en 5 μm (F1). In C, D en F is dTomato gecodeerd als rood, YFP is gecodeerd als groen en GVB is gecodeerd als blauw. Beelden herdrukt met toestemming van Brockway et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Time-lapse in vivo imaging in combinatie met Brainbow kleurcodering onderscheidde meerdere naburige klonen van cellen die interkinetische nucleaire migratie en verdeling ondergaan. (A) Kleurgecodeerde radiale clusters met het label in de achteraard van een vis die Brainbow uitdrukken bij 2 dpf (55 pkf; Een1) en 3 dpf (71 pkf; A2); maximale intensiteitsprojecties van respectievelijk 62 μm en 47 μm. Drie kleurgecodeerde radiale clusters worden geïdentificeerd met pijlpunten op elk moment. bB) De kleur van alle Brainbow-gelabelde cellen in A1 en A2 werd gekwantificeerd als relatieve kanaalgewichten in de overeenkomstige ternaire percelen in B1 en B2 (n = 106 cellen, 119 cellen). ( C) Zebrafish achterhersenen bij 35 pkf gelabeld met Brainbow (maximale intensiteit projectie met 24 μm); begin aangegeven met gestippelde witte doos is de eerste keer punt weergegeven in D. (D) Reeks tijdstippen genomen op 30 minuten intervallen in de achterhersenen van C. Er wordt een periode van >9,5 uur weergegeven. De gelabelde cellen ondergingen interkinetische nucleaire migratie; witte pijlpunten geven een cel aan op het apicale oppervlak. Afronding van de celsoma aan het apicale oppervlak en een overeenkomstige toename van het kloongetal (bijvoorbeeld rode cel bij 5,5 uur en vervolgens 8 uur) werd beschouwd als een mitotische gebeurtenis. (E) Dorsolaterale weergave van zebravissen achterhersenhelft op 30,5 pkf gelabeld met Brainbow, waar de witte stippellijn toont de geschatte grens van het hoofd, en de witte stippeldoos geeft de begintijd weergegeven in de eerste tijd punt van F. (F) Reeks tijdstippen genomen op 30 min intervallen in de achterhersenen van E. Over een periode van 1,5 uur, twee blauwe cellen aangegeven door de witte pijlpunten kunnen worden waargenomen verplaatsen naar het apicale oppervlak en het ondergaan van mitose, wat wijst op een kloon met twee voorlopercellen. Schaalbalk = 20 μm (A), 25 μm (C) en 20 μm (F). In A-D, dorsale is up en rostral is aan de linkerkant. In E en F, rostral is aan de linkerkant. In alle afbeeldingen is dTomato gecodeerd als rood, YFP is gecodeerd als groen en GVB is gecodeerd als blauw. Beelden herdrukt met toestemming van Brockway et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Time-lapse Brainbow imaging toont cellen in de ventriculaire zone ondergaan celdood in vivo. (A) Zebrafish achterhersenen bij 31 pkf gelabeld met Brainbow (maximale intensiteit projectie die 36 μm). Wit gestippeld vak geeft de begintijd aan die in het eerste tijdpunt in B.(B) Reeks tijdpunten met achterhersenen in A met intervallen van 30 minuten wordt weergegeven. Witte pijlpunt in het eerste paneel toont een lavendelcel die apoptose onderging zoals getoond in latere panelen, aangegeven door celfragmentatie, gevolgd door geleidelijke klaring van apoptotische lichamen. Naburige gelabelde cellen leken overal gezond. Dorsal is omhoog en rostral is aan de linkerkant. Schaalbalk = 20 μm (B). In alle afbeeldingen is dTomato gecodeerd als rood, YFP is gecodeerd als groen en GVB is gecodeerd als blauw. Beelden herdrukt met toestemming van Brockway et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode om klonen van voorlopercellen en neuronen in de zich ontwikkelende zebravis achterhersens te visualiseren en ze in vivo te volgen met behulp van Brainbow en time-lapse confocale microscopie11. Het grote voordeel van dit protocol in vergelijking met in vitro of ex vivo studies is de mogelijkheid om de proliferative zone van de gewervelde hersenen in zijn natuurlijke omgeving in de loop van de tijd direct te observeren. Deze techniek bouwt voort op eerdere studies die een enkele kloon gelabeld met behulp van retrovirale vectoren. In tegenstelling, het gebruik van de hsp:Zebrabow constructie kleur-codes veel klonen tegelijk, waardoor multiplex lineage tracing en een focus op dynamiek onder klonen11. Dit protocol kan worden aangepast om zich te concentreren op de ontwikkeling in andere systemen of celtypen. Zo kunnen verschillende Brainbow-constructies worden uitgedrukt in zebravisembryo's. Gebruik van de zebravis hsp70 promotor in hsp:Zebrabowzal resulteren in mozaïek etikettering van een verscheidenheid van celtypes na hitteshock, met inbegrip van neurale voorouders en neuronen11, en geeft onderzoekers tijdelijke controle over genexpressie29. Opgemerkt moet worden dat het gebruik van de warmteschokpromotor consequent kleurgecodeerde klonen labelt, terwijl andere promotors op deze manier niet duidelijk celafstamming kunnen afgebaken. Wanneer de kloonidentiteit geen factor van belang is, kunnen de construeren gebruikend andere promotors worden gebruikt om specifieke celtypes te etiketteren. Bijvoorbeeld, de neuroD promotor kan worden gebruikt om onrijpe neuronen label18,49. Bovendien, in plaats van het uitvoeren van micro-injecties, onderzoekers kunnen ervoor kiezen om transgene Brainbow zebravissen te gebruiken, met inbegrip van lijnen zoals Tg (ubi:Zebrabow)15 en Tg (neurod: Zebrabow)18. In dit geval produceren kruisen naar lijnen die Cre recombinase uitdrukken, zoals Tg(hsp:Crea134)15, ongeïnjecteerde embryo's produceren die op dezelfde manier worden verzameld en onderhouden. Hoewel dit protocol is ontworpen om vis beeld tussen 1-3 dpf, om samen te vallen met de belangrijkste periode van ontwikkelingsneurogenese50, zebravissen kunnen worden gehandhaafd voor langer, afhankelijk van de ontwikkelingsfase van belang. Hitteschok om Brainbow-expressie vóór 24 pkf te veroorzaken, kan echter schadelijker zijn voor embryo's51. Afhankelijk van de leeftijd en het weefsel van belang, zullen verschillende montagestrategieën aangewezen zijn om het gerichte weefsel correct georiënteerd te hebben.
Er zijn een aantal stappen waarvoor mogelijk problemen moeten worden opgesteld, met name als er wijzigingen worden aangebracht in het protocol. De concentratie van DNA, bolus grootte geïnjecteerd, en de totale hoeveelheid DNA geleverd per embryo kan allemaal worden aangepast als Brainbow expressie is zwak of schaars of als embryo's niet gezond lijken. Bovendien kunnen de lengte en timing van de schokdemperstap worden gewijzigd als de gewenste expressie niet wordt bereikt. De acquisitieparameters die in beeldvorming worden gebruikt, variëren afhankelijk van de beschikbare laserlijnen en filters, evenals de helderheid van expressie, montage en gewenste analyse. Bovendien moeten de time-lapse parameters worden aangepast, afhankelijk van de snelheid van de gebeurtenissen van belang en de tijd die nodig is om een enkele Z-stack te verwerven. Een van de meest kritische stappen in het protocol is de juiste montage van de vis in agarose: als de hoek van de vis niet geschikt is of als de vis wordt bedekt door te veel agarose, zal optimale beeldvorming niet mogelijk zijn. Het optimaliseren van deze techniek kan enige oefening vergen. Bovendien is het vaak handig om meerdere vissen te monteren voorafgaand aan beeldvorming, omdat het moeilijk kan zijn om vast te stellen of montage geschikt is voordat u FP-expressie op de confocale microscoop zelf bekijkt. Een extra kritische stap is de screening en selectie van de specifieke vissen die in beeld moeten worden gebracht. Als het uitvoeren van micro-injecties, helderheid, etikettering dichtheid, en Brainbow kopie nummer kan allemaal aanzienlijk variëren tussen vissen. Afbeeldingen die zijn gemaakt in vissen met dimlabeling, overdreven dichte etikettering of een laag kopieernummer, wat resulteert in weinig kleuren, kan moeilijker te analyseren zijn.
Met dit protocol hebben we levende zebravis tot 16 uur 11 uur continu in beeld kunnenbrengen. Deze tijdsduur kan worden beperkt door E3-verdamping uit de beeldkamer, de groei van de vis uit het beeldvlak, de dood of de beweging van de vis, of gebruikersbeperkingen op de confocale microscooptijd. Verdamping kan worden verminderd door het gebruik van een temperatuurgestuurd accessoire op het microscoopstadium. Opgemerkt moet worden dat de 5D-datasets gegenereerd met behulp van deze aanpak hebben de neiging om grote bestanden die aanzienlijke harde schijf ruimte (bijvoorbeeld, tot ~ 100 GB voor een 's nachts time-lapse) en voldoende rekenkracht te analyseren vereisen.
Dit protocol begeleidt onderzoekers om kleurgecodeerde klonen te visualiseren binnen een populatie van neurale voorouders en dochterneuronen in de zich ontwikkelende zebravishersenen en hun dynamiek in de loop van de tijd te volgen. Een mogelijke uitbreiding is de combinatie van Brainbow time-lapse beeldvorming met veelrode FP tagging om de rol van specifieke genen in ontwikkeling te beoordelen18. Op deze manier kunnen klonen die gemanipuleerde genen uitdrukken, worden gevisualiseerd in een aparte kleur, in de loop van de tijd worden bijgehouden en vergeleken met Brainbow-gelabelde, niet-gemanipuleerde naburige klonen. In vivo kan veelkleurige beeldvorming worden gebruikt om belangrijke mechanistische vragen over hoe het zenuwstelsel zich vormt en functioneert aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Y. A. Pan, J. Livet en Z. Tobias voor technische en intellectuele bijdragen. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (Award 1553764) en de M.J. Murdock Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL transfer pipette (fine tip) | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5 mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 42 °C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28 °C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
