מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Summary

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

Abstract

פיתוח מערכת העצבים של בעלי החוליות דורש תיאום מדויק של התנהגויות סלולר מורכבות ואינטראקציות. השימוש ברזולוציה גבוהה בטכניקות הדמיה vivo יכול לספק חלון ברור לתוך תהליכים אלה באורגניזם החי. לדוגמה, ניתן לעקוב אחר תאים וצאצאים שלהם בזמן אמת כטופסי מערכת העצבים. בשנים האחרונות, פיתוחים טכניים בטכניקות ריבוי צבעים הרחיבו את סוגי השאלות שניתן לחקור. את הגישה ססגוניות במחקר ניתן להשתמש כדי לא רק להבדיל בין תאים כמו, אלא גם כדי לצבוע את הצבעים שיבוטים שונים מרובים של תאים הקשורים כי כל אחד מהם שואבים תא מחולל קדמון אחד. זה מאפשר ניתוח שושלת היוחסין של שיבוטים רבים והתנהגויות שלהם בו זמנית במהלך הפיתוח. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות מתויג תאים על בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח. הדבר שימושי במיוחד לאחר האינטראקציות הסלולריות בין תאים, שקשה לתייג בצורה מסובכת באמצעות צבעים מונחי-מיזם מסורתיים. הגישה שלנו יכולה לשמש למעקב אחר קשרי השושלת בין מספר שיבוטים שונים בו זמנית. ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו באמצעות טכניקה זו מספקות מידע עשיר שניתן להשוותו באמצעות מניפולציות גנטיות או תרופתי. בסופו של דבר התוצאות שנוצרו יכולים לעזור לענות על שאלות סיסטמטית על איך מערכת העצבים מתפתחת.

Introduction

בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, בריכות של תאים מיוחדים המקצועית לחלק שוב ושוב באזורים מתרבים, הפקת מערכים מגוונים של תאים ביתי. התאים שנולדו במהלך תקופה התפתחותית זו לאחר מכן להבדיל ולנסוע כדי ליצור את האיברים המתהווה. במערכת העצבים, כגון ושלתי glia להצמיח נוירונים בוגרים באזורים חדרית. כמו נוירונים לנדוד הרחק מן החדרים ובוגרים, הרקמה המתרחב בסופו של דבר יוצר את המבנים מורכבים מאוד של המוח^1,2,3,4,5,6. התיאום בין חלוקת ושלתי ובידול והגירה של נוירונים יקבעו את הגודל, הצורה והתפקוד של המוח בסופו של דבר, משפיעה ישירות על התנהגות^7,8,9,10. למרות ששליטה הדוקה על תהליכים אלה חיונית באופן ברור להתפתחות המוח הרגילה, המנגנונים הגלובליים המווסתים את הדינמיקה הזאת אינם מובנים היטב. כאן אנו מתארים כלי לחקר פיתוח מערכת העצבים ברזולוציה התאית, המאפשר לחוקרים להמחיש תאים מחולל קדמון ונוירונים ב vivo המוח המתפתח מתפתח עם ברייקשת ולעקוב אחר התנהגותם לאורך זמן דרך הזמן לשגות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד¹¹. הגישה יכולה גם להיות מותאמת לדמיין חלקים אחרים של העובר המתפתח.

כדי להתבונן ולהבחין בין תאים במוח מתפתח דג זברה, יש לנו להתאים את טכניקת התיוג תא במוח¹¹. ברייבוו bow מנצל באופן אקראי, ביטוי קומבינטורית של שלושה חלבונים פלורסנט ברורים (FPs) כדי לסמן אוכלוסיה של תאים. בעוד ביטוי ברירת המחדל של ביטוי המוח הוא אדום FP, שילוב מחדש על ידי היצורים האנזים recombinase תוצאות ביטוי של mCerulean (חלבון פלורסנט ציאן, CFP) או חלבון פלורסנט צהוב (yfp)^12,13. הסכום המשולב של כל FP מבוטא בתא נותן לו גוון ייחודי, המאפשר הבחנה חזותית ברורה מתאים שכנים. בנוסף, כאשר תא מקדמון מתחלק, כל תא בת יהיה לרשת את הצבע מתא האם, הפקת שיבוטים מקודד צבע ומאפשר לחוקרים לעקוב אחר שושלת היוחסין^11,14. בזמן ששימש במקור לניתוח המעגלים העצביים בעכברים¹², המוח כבר ביטא במגוון רחב של אורגניזמים מודל, כולל דג זברה¹⁵.

הטכניקה שלנו בונה על תיוג ססגוניות הקודם ושיטות הדמיה לתמונה ישירה שיבוטים מקודד בצבעים לאורך זמן בחיים zebrafish. בשל שקיפות אופטית שלהם העוברים, דג דג זברה מתאים גם ניסויים הדמיה¹⁶, ומחקרים קודמים יש מנוצל המוח באמצעות בראבפיש כדי ללמוד מגוון של רקמות, כולל מערכת העצבים^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. היכולת לדמות במישרין אל תוך האורגניזם החי, יחד עם התפתחות הרחם המהירה שלהם לשעבר, לעשות דג זברה מודל יקר ערך של פיתוח בעלי חוליות. בניגוד למוח היונקים, האזור המתרבים כולו של המוח המלא של הדגים הוא זמין להדמיה ללא הפרעה לסביבה אנדוגניים שלה⁶. הדבר מאפשר לערוך ניסויים באורגניזם החי, ולא בהכנות מחוץ לגוף או ברקמה קבועה. בניגוד לניסויים הדמיה קבועה, במחקרים vivo לאפשר עיצוב האורך, הפקת שעות של נתונים שניתן לנתח עבור דפוסי, ובכך להגדיל את הסבירות להתבוננות אירועים נדירים יחסית. בהתאם למהירות ולאורך של האירועים המעניינים, החוקרים יכולים לבחור לבצע קצר (1 – 2 h) או ארוך (עד ~ 16 h) זמן הדמיה של ניסויים. באמצעות החום דג זברה מיזם ההלם 70 (hsp70, hsp), ביטוי המוח יכול להיות מבוקרת באופן זמני^28,29. בנוסף, ביטוי הפסיפס הנגרמת על ידי מקדם זה מתאים גם לתיוג ומעקב אחר שיבוטים רבים¹¹.

היכולת לזהות באופן חזותי שיבוטים מרובים בתוך המוח החי הוא יתרון של שיטה זו. חשוב מחקרים קודמים שחקרו את התפקיד של שיבוטים בתוך פיתוח של מערכת העצבים מנוצל וקטורים retroviral יעיל לסמן תא מחולל קדמון יחיד וצאצאו באמצעות בודד FP או אחרים בחלבון דמיינו. תיוג כזה מאפשר לחוקרים להתבונן שיבוט יחיד לאורך זמן, או בתוך מבחנה או בvivo^{2,30,31,32,33,34,35,36,37,38}. בניגוד לשיטות לעקוב אחר ההתנהגות של התאים בתוך שיבוט אחד, הצבעים ברורים של המוח לאפשר לחוקרים להתבונן הדינמיקה בין שיבוטים. בנוסף, על ידי שימוש בברקידה כדי לתייג שיבוטים רבים בתוך המוח, נתונים נוספים על התנהגות שבטיים נאסף ביחס לטכניקות התווית שיבוט יחיד¹¹. וחשוב מכך, ניתן להרחיב את הגישות המתוארות כאן כדי ליצור השוואות התפתחותיות בין דגים שעברו מניפולציות גנטיות או פרמקולוגית שונות¹⁸. בסך הכל, יתרונות אלה לגרום לפקיעה זמן ב vivo קונפוקלית יקוד הדמיה של הברקשת-ביטוי דג זברה אידיאלי עבור חוקרים לחקור את הפיתוח של מערכת העצבים בעלי חוליות, במיוחד אלה המעוניינים בתפקיד של שיבוטים.

Protocol

הליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) ב לואיס & קלארק קולג '.

1. הזרקת מיקרובדג עוברי

1. להגדיר סוג פראי, בוגרים דג זברה הפרדה מין טנקים הזיווג אחר הצהריים לפני ביצוע מיקרו זריקות^39,40.
2. הכן את פתרון הדנ א. בבוקר המיקרוזריקות לדלל hsp: zebrabow¹¹ ה-DNA פלמיד לריכוז של ~ 10 ng/Μl ב 0.1 mM kcl, יחד עם 2.5% פנול אדום ו 3.75 u מrecombinase האנזים.
3. בצע מיקרוזריקות של פתרון ה-DNA לתא אחד של העוברים דג זברה בתוך 45 מינימום של הפריה^39,41. הכנס כ 4.2 nL של פתרון זה לתוך העובר כל, שווה ערך ל ~ 42 pg של DNA פלמיד.
   הערה: השלב המיקרו-הזרקה יכול להיות מושמט אם הטרנסגניים, קו הבארבי-ביטוי הביטוי הוא הזדווג במקום, כגון tg (ubi: דג זברה)¹⁵ ו Tg (neurod: דג זברה)¹⁸. ביצוע זריקות מיקרו יכול להיות יתרון כי זה מאפשר לחוקרים נכייל מספר העתק וצפיפות תוויות. יתר על כן, בונה ה-DNA השני שתגים או מניפולציה מוצר גנטי מסוים ניתן להזריק לצד ברייבוו במידת הצורך (למשל, חלבון פלורסנט הרבה אדום המשלים את ברייבוו¹⁸).
4. שמור עוברים מוזרק בצלחות פטרי של E3 בינוני³⁹ בחממה 28 ° c עבור 24 שעות.

2. זעזוע חום כדי לגרום לביטוי ברייקד

הערה: אם ה-DNA מוזרק או המזריקו התבטא אינו מנצל את היזם hsp70 כדי לכונן את הביטוי, את הצעד הלם חום ניתן לדלג, עוברים בריאים יש להעביר מיד phenylthiourea (PTU) ב 24 h הפריה פוסט (hpf).

1. ב 24 hpf, cull מתים עוברים מעוותים מהקבוצה של עוברים מוזרק. אז, להעביר את העוברים בריאים לצינור 50 mL, עם עד 20 עוברים/צינור.
2. ממלאים את הצינורות עם 10 מ"ל של E3. מניחים כובע על גבי כל צינור, אבל לא סוגרים היטב.
3. מניחים את מתלה הצינורית המכילה את צינורות 50 mL זקוף באמבט מים 37 ° c. ודא כי רמת המים באמבט גבוהה יותר מאשר רמת E3 בצינורות ולהשאיר אותם 80 כדי 90 דקות.
4. הסירו את מתלה הצינורית עם העוברים מאמבט המים וחזרו לחממה הזקופה ב -28 ° c. אפשר עד 1 h ל-E3 להתקרר והעוברים מחדש בהדרגה את האקלים לטמפרטורה. ואז, להעביר את העוברים לצלחות פטרי של 0.2 mM PTU ב E3 מחומם בחממה כדי למנוע פיגמנטציה של עוברים.
   זהירות: PTU הוא כימיקל רעיל, כי יש לטפל בזהירות ולהיפטר כראוי. . לבישת כפפות זה מוצע

3. הקרנת עוברים לביטוי ברייבוו

1. ב 2 כדי 4 h לאחר ההלם החום, לבחון את העוברים תחת מיקרוסקופ רגיל לניתוח פלואורסצנטית עבור ביטוי של CFP או YFP, אשר מצביע על שילוב מוצלח בריינרד ברייקד (מביטוי ברירת המחדל של dTomato).
   הערה: אם זמינות מספר אפשרויות מסנן פלואורסצנטית, ההקרנה עבור CFP היא הדרך היעילה ביותר לזיהוי דגים משולבים היטב. אם מסנני CFP ו-YFP אינם זמינים, YFP יכול להיות במעומעם גם תחת חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מסננים עקב חפיפה בפרופילים ספקטרלו שלהם.
2. לבחור עוברים עם ביטוי FP חזק לאורך ולהעביר למנה נפרדת עם PTU. עוברי תמונה ביום 1 הפריה הודעה (dpf; 28 hpf או מאוחר יותר) או לשמור על העוברים PTU ו התמונה ב 2 או 3 dpf.

4. עוברים התקנה עבור ב Vivo הדמיה

1. לפני יום הניסוי, להכין את הכלי מניפולציה לחדר הדמיה והעובר.
   1. הכן את חדר ההדמיה על ידי הדבקת בזהירות טבעת פלסטיק למרכז של צלחת פטרי 60 מ"מ.
   2. באופן אופציונלי, להכין מניפולטור מותאם אישית העובר כדי להעביר עוברים בתוך הצלחת העוברים האוריינט תוך כדי הרכבה. בניית מניפולטור על ידי הדבקת אורך קטן של קו דיג ניילון (~ 1/2 בתוך, ~ 6 ליברות) עד לסופו של מקל כותנה עץ לנקות כי כבר נחתך ~ 4 אורך.
2. אם יש צורך (כלומר, הדמיה ב 2 dpf או מוקדם יותר), לפני טעינת העוברים deורורonate באמצעות מזרקים תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
3. . מורדם מאוד עוברי דגים
   1. מילוי צלחת פטרי 60 מ"מ בחצי הדרך עם E3 ולהוסיף 5 – 6 טיפות של 4 מ"ג/mL MS-222 Tricaine-S לריכוז הסופי של ~ 0.2 mM. . מערבולת לערבב
      זהירות: Tricaine צריך להיות מטופל בזהירות ולהיפטר כראוי.
   2. העברת עוברים מ PTU אל פתרון tricaine, להבטיח כמו PTU קטן מועבר ככל האפשר. בעוד הרפלקסים דגים צריך לחדול לאחר 1 – 2 דקות, להשאיר את העוברים בטריקיין עד 10 דקות כדי להבטיח ההרדמה יסודית עבור ניסויים הדמיה זמן.
   3. ודא כי העוברים מורדם כראוי. העריכו את רפלקס ההבהיל על ידי נגיעה זנבות העובר בעדינות עם העובר מניפולטור. אם התנועה הרפלקס נצפתה, להוסיף טיפה נוספת של tricaine לצלחת רחוק ככל האפשר ומערבולת לערבב. התבוננו בקצב לב העובר תחת טווח החיתוך. אם הוא איטי באופן חריג, להוסיף טיפות נוספות של E3 לצלחת כדי להפחית את הריכוז tricaine.
4. . בסדר.
   1. להעביר את הדג למרכז הטבעת פלסטיק בתוך חדר ההדמיה ולהסיר את העודף E3 ככל האפשר באמצעות העברה משופעת בצנרת.
   2. באמצעות פיפטה העברה נקייה, לכסות את הדג עם 1.0% נמוך להמיס agarose (LMA) ב E3 מאוחסן ב 42 ° c ולמלא את טבעת הפלסטיק כולה עם שכבה דקה של העלה. השתמש בפיפטה העברה כדי למשוך בעדינות את העוברים לתוך הקצה הצינורות ובחזרה לתוך הצמח מבלי להציג בועות אוויר.
   3. לפני שעלה מתקשה, להשתמש במהירות העובר מניפולטור כדי לכוון את הדגים כראוי. אם הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, הצב את העוברים קרוב למשטח העליון של הצמח ככל האפשר. הצב את העוברים במקביל לתחתית חדר ההדמיה עם הזנב ישר.
      הערה: עבור הדמיה מוחית מראש, ניתן למקם את העוברים בתצוגה ממשונן. יש לנקוט את הטיפול כדי לוודא שראשיהם של העוברים אינם טובעים בעוד האגקם עדיין נוזלי. כיוונים אחרים עשויים להיות מתאימים למקד רקמות אחרות המתפתחות להדמיה. עבור מיקרוסקופים הפוכים, הרכבה ייעשה באופן שונה, בדרך כלל מיקום הדג קרוב לתחתית צלחת פטרי זכוכית.
5. המתינו עד שהוא הרדן, ואז למלא את חדר ההדמיה עם E3. הוסף E3 ככל האפשר כדי להסביר את האידוי במהלך ההדמיה.

5. זמן פקיעה הדמיה Confocal וקד של פיתוח דג Zebrafish המוח

1. מניחים את חדר ההדמיה על המיקרוסקופ הקונטואני כהכנה להדמיה.
   1. מניחים את חדר ההדמיה עם הדג ו-E3 על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
   2. בחר מטרה עם צמצם מספרי גבוה מרחק עבודה ארוך, כגון מטרה טבילה 20x מים (1.0 NA).
   3. מצא אזור עם תיוג צפוף ובהיר כראוי של סוג התא (ים) של עניין.
      הערה: מערכת טמפרטורה מבוקרת/מכשיר על המיקרוסקופ עשוי לשמש גם כדי להסדיר את הטמפרטורה והלחות במהלך הפעלות הדמיה ארוכה. זה יכול להקטין את האידוי.
2. הגדר את פרמטרי הרכישה. להדמיה בבררכיל
   1. תמונה כל ערוץ FP ברציפות. אם אתה משתמש בתוכנה מסחרית (למשל, תוכנה זן), זה נעשה על ידי הכנת שלושה "מסלולים". השתמש לייזר ארגון להלהיב CFP ב 458 nm ו YFP ב 514 nm. השתמש DPSS 561 לייזר ננומטר לרגש Dעגבניה. איסוף פליטות בין 463-509 nm עבור CFP, 519 – 555 nm עבור YFP, ו 566 – 691 nm עבור dTomato.
   2. עבור תצוגה על המסך, הקוד CFP ככחול, YFP כצהוב, ו-dTomato כאדום.
      הערה: הגדרות אלה ישתנו בהתאם לקווי לייזר ותכונות אחרות זמינים במיקרוסקופ קונפוקלית וקד. כדי להגדיל את מהירות ההדמיה, הערוצים CFP ו-dTomato יכולים להיות מובחנות בו מבלי לעבור בגלישה ניכרת. אם מתבצע גם הדימות של FP נפרד, כגון FP בצבע אדום-הרבה, ניתן להבחין בתמונה זו ברצף או בו ב-YFP.
   3. הגדר את פרמטרי ההדמיה הכלליים כדי לקחת תמונות של 16 סיביות עם רזולוציה של לפחות 1024 x 1024 ובממוצע פעמיים. כוונן את הזום בהתאם לאזור ואת סוג התא של עניין (כלומר, עבור הדמיה המוח החודש עם מטרה 20x הזום יהיה נע בין 1.0-2.5). למקסם את שדה התצוגה כדי לאפשר צמיחה של הדג לאורך זמן.
   4. צפייה ברצועה אחת בכל פעם (וביטול לייזרים אחרים כדי למנוע photobleaching לבנה), למטב את הגדרות הרכישה עבור כל FP בנפרד (למשל, כוח לייזר, גודל חריר, לצבור שפופרת פוטוליטיפייר, וכו ').
   5. בחר את טווח מחסנית Z לתמונה.
      הערה: עבור הפעלות הדמיה ארוכה (> 2 h), לקחת בחשבון כי הדג ימשיך לצמוח במהלך הדמיה, ובכך גם את השדה XY ו-Z מחסנית טווח צריך להסביר את זה עם חדר נוסף. אם הדמיה המוח החודש, כוללים שטח בשדה עבור הרקמה לעבור rostrally במהלך תקופת ההדמיה. יש לכלול גם מקום לגידול בממד Z. כלול בתמונה כ-10 – 20 יקרומטר מעל לאזור העניין, אם הדגים ממוקמים לתצוגה משונן או מועלת.
3. כוונן פרמטרים עבור דימות בזמן הדמיה.
   1. בחר מרווח זמן. אורך מרווח נע בין 10 – 30 דקות לעקוב אחר mitotic ו האפוטוטיים האירועים במוח המתפתח מתפתח. אורך מרווח ישתנה בהתאם למהירות האירועים המעניינים והזמן הכולל שנדרש כדי ללכוד מחסנית Z אחת.
   2. בחר את אורך הפעלת ההדמיה. הפעלות הדמיה זמן בדרך כלל להתרחש בלילה והוא יכול להימשך לפחות 16 h.
4. . תריץ את הניסוי
   הערה: הדגים יכולים להיות מורדמים מיד לאחר הדמיה או גזור בקפידה מן agarose באמצעות מזרקים וחזר ל E3 להתאושש. הדגים ששוחזרו לאחר מכן ניתן לשחזר שוב בשלב מאוחר יותר, אף מיקום התא ועומק יהיה משמרת במהלך תקופה זו בשל הצמיחה הכוללת.

6. ניהול קבצים בזמן קפיצה

1. יבא את קובץ התמונה לתוך תוכנת הניתוח.
   1. אם נעשה שימוש בתוכנת Zen, שמור את הקובץ בתבנית. czi לאחר השלמת רכישת התמונה. הקפד לשמור נתונים גולמיים בתבנית תואמת פיג'י⁴² ו/או תוכנות אחרות.
   2. יבא לתוך תוכנת פיג'י באמצעות BioFormats יבואן.
      הערה: קבצים בזמן הקפיצה יהיו גדולים ועשויים לדרוש כמויות משמעותיות של זמן וזיכרון לפתיחה לצורך ניתוח. לכן, מועיל להיות אסטרטגי באופן שבו הם נשמרים ונפתחים. זה יכול להיות שימושי כדי לשמור גירסה באיכות נמוכה יותר, כי ניתן לפתוח בקלות רבה יותר כדי לחפש אירועים של עניין על ידי עין.
2. אם אתה משתמש בפיג, צור קבוצות מערכות קטנות וניהול יותר של קבצי מעבר זמן. צור קבוצות מערכות בין אם בזמן (למשל, הצגת מחסנית Z מלאה בנקודת הזמן הראשונה) או בעומק (למשל, הצגת הראשון 50 Z-סעיפים בכל פעם) על ידי לחיצה על תמונה| ערימות| כלים| בצע מחסנית משנה.

7. שבטים כמותיים ניתוח צבע של תמונות במוח

1. למדוד את ערכי העוצמה האדום, הירוק והכחול (RGB) עבור תאי העניין בפיג.
   הערה: הוראות אלה הן ספציפיות לניתוח תמונות בפיג. עם זאת, החוקרים עשויים להעדיף להשיג ערכי עוצמת RGB מתכוון בתוכנית תוכנה חלופית.
   1. ודא שהקובץ נחתך כהלכה כך שאין רווח שחור מסביב לקצות התמונה. החלל השחור יוריד באופן מלאכותי את מדידות העוצמה המינימליות הדרושות לניתוח. אם יש צורך לחתוך את הקובץ, בחר בלחצן בחירה מלבן וצייר אזור מעניין (ROI) סביב שדה התצוגה, למעט כל השטח השחור. לחץ על תמונה| חיתוך.
   2. הגדר את כלי המדידה כדי לקחת מידות משמעות, מינימום ומקסימום של ערך אפור. לחץ על נתח| קבע מדידות. ודא שתיבות הסימון עבור מינימום &Amp; ערך אפור מירבי וערך אפור ממוצע שתיהן נבחרו.
   3. הצגת קבצי הנתונים הגולמיים או תת-הערימות Z בפיג, מצא תאים מעניינים לניתוח צבע שבטים. במוח החלק האחר, המשובטים שיבוטים ניתן לזהות חזותית על ידי הגוון המשותף שלהם, כמו גם את האוריינטציה הרדיאלי שלהם. אין לבחור תאים הנמצאים בקשר קרוב, ולכן קשה לפתור אותם מתאים שכנים בצבע אחר. . זה עלול להיות קשה לכמת את הגוון שלהם
   4. חפש את מרכז Z של תא העניין באמצעות פס הגלילה z. לחץ לחיצה ימנית על לחצן בחירה אליפטית ובחר בלחצן בחירה אליפטית. כלי בחירה אחרים יתאימו לסוגי תאים שונים. צייר ROI אליפטי סביב המרכז ~ 2/3 של גוף התא.
   5. באמצעות פס גלילה C, בחר את הערוץ האדום (dtomato). קח את המדידה בעוצמה מרושעת עבור ערוץ זה על ידי בחירת ניתוח| . תמדודאת זה חזור עם אותו ההחזר ומישור מוקד עבור הערוצים הירוקים (YFP) וכחול (CFP) ושמור את כל ערכי העוצמה הממוצע.
   6. לחץ במקום כלשהו בתמונה כדי להסיר את ההחזר האליפטי של תא הריבית.
   7. למדידת רמות רקע לנורמליזציה, השתמש בפס הגלילה C ובחר בערוץ האדום (dtomato). קח את מדידת האינטנסיביות המינימלית עבור השדה כולו בערוץ זה על-ידי בחירה באפשרות ' נתח' | . תמדודאת זה חזור על אותו מישור מוקד עבור הערוצים הירוקים (YFP) וכחול (CFP) ושמור את כל ערכי העוצמה המינימלית.
2. חישוב משקולות ערוץ RGB יחסיים לתאי הריבית.
   הערה: ניתן לבצע חישוב של משקולות ערוץ RGB יחסיים מערכי אינטנסיביות אלה במגוון של תוכניות תוכנה, כגון Microsoft Excel או R⁴³.
   1. לנרמל את מדידת העוצמה הממוצע של ה-ROI של התא עבור כל ערוץ על-ידי הפחתת העוצמה המינימלית מהשדה כולו באותו ערוץ ומישור מוקד.
   2. סכם את ערכי עוצמת ה-RGB המנורמל הממוצע מכל אחד מהערוצים כדי לאתר את עוצמת ה-RGB המנורמלת הכוללת עבור התא.
   3. חשב את משקל הערוץ היחסי עבור כל אחד מהערוצים על-ידי חלוקת ערך העוצמה המנורמל הממוצע עבור אותו ערוץ לפי עוצמת ה-RGB המנורמלת הכוללת.
3. הצגת משקולות ערוץ RGB יחסי כחלקות טרנארי באמצעות חבילת טרנארי עבור R^43,44. חלקות טרנארי שימושיות כדי להמחיש את האשכולות של צבעים דומים במרחב RGB תלת-ממדי.
4. לחשב את מקדם התפשטות הצבע כדי לכמת את ההפרש בין צבעי תא.
   1. חשב את המרחק האוקלידי בין שני הצבעים במרחב RGB תלת-ממדי באמצעות המשוואה הבאה:
      
      כאשר R, G ו-B הם משקלי ערוץ ה-RGB היחסי המחושב ב-7.2.
   2. כדי להקל על ההבנה, לנרמל את מרחק הצבע על ידי חלוקה על ידי √ 2, המרחק המקסימלי האפשרי בין צבעים, כדי לקבל מקדם התפשטות צבע בין 0 ו-1, כאשר 0 מציין בדיוק את אותו צבע ו 1 מציין צבעים שונים לחלוטין (למשל, אדום טהור וכחול טהור).

Representative Results

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג באמצעות vivo הדמיה מרובת הצבעים בגישה להדמיה המתוארת כאן. אנו מראים כי בראיקשת צבע מקודד שיבוטים של תאים באזור החדרית ההתרבות של הפיתוח דג זברה המוח¹⁴ (איור 1).

בדרך כלל, כאשר התאים שכותרתו המוח המסומנים היו מסודרים לאורך סיבים רדיאליים מסוימים, הם חלקו את אותו צבע (איור 1D), אשר ניתן לכמת כמו משקולות ערוץ RGB היחסי (איור 1d). זה מרמז כי קבוצות מוקדי אלה היו שיבוטים של חלוקת תאים וכי צבע דומה שלהם יכול לשמש כדי לזהות אותם כמו להיות clonally הקשורים, כפי שנצפה במחקרים קודמים ב zebrafish, עכבר, ואפרוח^14,15. כאשר צפיפות תיוג המוח הוא דליל יחסית, זה קידוד צבע ניתן להשתמש כדי להמחיש בבהירות ומעקב רבים שיבוטים רדיאליים שונים בתוך אזורים מתרבים של המוח בעלי חוליות חיים.

ניתוח צבע כמותי הראה כי התאים הבת ביטא את אותו צבע כמו אמא שלהם (מחולל) תא (איור 1F), אבל אשכולות מוקדי שכנים של תאים ניתן להבדיל אחד את השני¹¹ (איור 1f). משמעות הדבר היא כי שיבוטים רבים של תאים קשורים יכול לבוא בו זמנית במשך שעות vivo (איור 2), המאפשר ניתוח שושלת היוחסין והשוואה. קוונפיקציה של ביטוי צבע ב שיבוטים ב 2 dpf ולאחר מכן שוב ב 3 dpf (איור 2א-ב) הראו כי הביטוי בריינרד נותר גם קבוע יחסית מ 2 – 3 ימים ב vivo¹¹. תאים בודדים יכולים ובכך להיות מזוהים ומסומנים בזמן אמת לפרקי זמן ארוכים יחסית במהלך הפיתוח.

זמן הדמיה ההדמיה חשף תאים רבים שעברו הגירה גרעינית הבינקינטית חלוקת התא במהלך התקופה בין 1 – 2 dpf (איור 2C–F)¹¹, המתיר לימוד של מחזור התא. באמצעות מרווח זמן הפקיעה של 30 דקות, אנחנו לא תמיד ללכוד את הדמות mitotic במהלך חלוקת התא. הדבר הציג שגיאה פוטנציאלית של עד 30 דקות עד לזמן חלוקת התאים המוקצה. בנוסף, הבחנו בכמה שיבוטים המופיעים להכיל שני תאים מחולל קדמון (למשל, איור 2F). באילוצים אלה, ניתן למדוד את אורך מחזור התא. על-ידי מעקב אחר המוח הבודד המסומן ושלתי לאורך זמן אנו מחושבים מחזור התא הממוצע של 8.4 ± 1.5 h, המקבילה המידות הקודמות ב דג זברה^1,45,46. יתר על כן, באמצעות המוח לשגות זמן הדמיה טכניקה, היינו גם מסוגלים להתבונן בתאים בודדים שעברו את השינויים הסטריאוטיפית מורפולוגית הקשורים אפופטוזיס (איור 3)¹¹, כגון ממברנה לברעת ופיצול התא^47,48.

איור 1: המוח במחקר שכותרתו אשכולות הקשורים clonally של בתאי חלוקת תאים בפיתוח המוח החוצה. (א) סכימטי של hsp: זברנוב (ברייבטד) באמצעות דנ א ביטוי באמצעות שיבוטים קוד צבע. (ב) ב vivo המשודר תמונות אור של התפתחות דג דג זברה ב 1 ו-2 dpf; חיצים מציינים את אזור המוח הכללי המיועד לדימות. Translucency של העוברים מוצג על ידי מיקרומטר ממוקם מתחת לכל דג. ציר זמן ניסיוני המציג זריקות בשלב אחד תא, הלם חום (HS) ב 24 hpf, והדמיה מ 1 – 3 dpf. (ג) לצפות מראש של 29 hpf דג מתחת למוח מתויג עם ברייבוו. ערוץ האור המשודר הראה את המבנה של המוח השטרם והחדר מצופה בעוצמה מקסימלית של שיבוטים בריינרד התווית המייצגים 165 μm. . Rostral. (ד) ב vivo הביטוי המוח במוחו, המוצג התחזיות אינטנסיביות מקסימלית המייצג 41 יקרומטר ב בדלילות בעלי תווית 51 hpf דג (d₁), ו 81 יקרומטר ב 63.5 hpf דג (d₂). בשני הפאנלים, הrostral מעלה. והוא שמאלה (ה) צבע התאים ברה₁ ו-d₂ היה ככמת כמשקולות ערוץ יחסי בחלקות טרנארי המקביל (n = 54 תאים e₁; 461 תאים e₂). (ו) צבע התא נשאר קבוע יחסית בתאי הבת לאחר חלוקת התא. סדרה של נקודות זמן המציגות באירועים vivo mitotic במוח החודש של 29 hpf ברייברכיו-מתויג דג זברה מעל 1 h (F₁, עוצמה התחזיות המרבי, 30 יקרומטר עומק). הצבע של תאי האם והבת, המצוין על-ידי התיבות השחורות ב-F₁, מיוצג כמשקולות ערוץ יחסיות בעלילה הטרארי ב- f₂. ההזחה מראה מרחק של אותה מחלקה כדי להציג צבעי תא באשכולות באופן הדוק (M היא אמא; D₁ ו-d₂ הם בנות 30 דקות/ריבועים, ו 60 דקות/משולשים). קנה מידה ברים = 30 יקרומטר (C), 20 יקרומטר (d₁), 16 יקרומטר (D₂) ו-5 יקרומטר (F₁). ב C, D, ו-F, dTomato מקודד כמו אדום, YFP הוא מקודד כמו ירוק, ו-CFP הוא מקודד כחול. תמונות מודפס באישור מברודרך ואח '¹¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זמן לשגות הדמיה vivo בשילוב עם ברייקשת צבע קידוד מכובד שיבוטים השכנות מרובים של תאים שעברו הגירה גרעינית אינטרקינטית וחילוק. (א) צבע-אשכולות רדיאליים המסומנים במוח האחרון של דג אחד המבטא ברייבוו ב 2 dpf (55 hpf; A₁) ו-3 dpf (71 hpf; A₂); התחזיות עוצמה מקסימלית המייצג 62 יקרומטר ו 47 יקרומטר בהתאמה. שלושה אשכולות רדיאליים מסומנים בצבעים מזוהים עם ראשי חץ בכל נקודה. (ב) הצבע של כל התאים בעלי התווית במוח ב₁ ו-₂ היתה ככמת כמו משקולות ערוץ יחסי בחלקות טרנארי המקביל ב₁ ו b₂ (n = 106 תאים, 119 תאים). (ג) zebrafish המוח ב 35 hpf עם תווית ברייבקשן (הקרנת אינטנסיביות מקסימלית מראה 24 μm); שיבוץ המצוין עם תיבה לבנה מקווקו היא נקודת הזמן הראשונה המוצגת D. (ד) סדרה של נקודות זמן שצולמו בתוך 30 דקות מרווחי במוח הקודם מ-C. מוצגת תקופה של > 9.5 ח'. התאים המסומנים עברו הגירה גרעינית בין-קינטית; ראשי חץ לבנים מצביעים על תא במשטח הקודקוד. עיגול של הסומה התא על פני השטח הרשמי ואת העלייה המקבילה מספר שיבוט (g., תא אדום ב 5.5 h ולאחר מכן 8 h) נחשב אירוע mitotic. (ה) dorsolateral השקפה של דג זברה העורף ב 30.5 hpf עם תווית המוח, שם לבן מקווקו-ו-מנוקד הקו מראה את הגבול המשוער של הראש, ואת התיבה מקווקו לבן מציין את ההזחה המוצגת בנקודת הזמן הראשונה של f. (f) סדרה של נקודות זמן שצולמו בתוך 30 דקות ב במשך תקופה של 1.5 h, שני תאים כחולים שצוין על ידי ראשי החץ הלבנים יכול להיות נצפתה נע אל פני השטח האפילי ועובר מיטוזיס, מציע שיבוט המכיל שני תאים מחולל קדמון. סרגל קנה מידה = 20 יקרומטר (A), 25 יקרומטר (C) ו-20 יקרומטר (F). ב-A – D, הrostral הוא למעלה והוא שמאלה. ב-E ו-F, הrostral משמאל. בכל התמונות, dTomato הוא מקודד כמו אדום, YFP הוא מקודד כמו ירוק, ו-CFP מקודד כחול. תמונות מודפס באישור מברודרך ואח '¹¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זמן-פקיעה דימות המוח מראה תאים באזור חדרית עוברים מוות תאים בvivo. (א) zebrafish המוח ב -31 hpf עם תווית ברייבקשן (הקרנתעוצמה מקסימלית המייצג 36 μm). תיבה מקווקוות לבנה מציינת הזחה המוצגת בנקודת הזמן הראשונה ב-B. (ב) סדרה של נקודות זמן המציגות את המוח בתוך 30 דקות במרווחי זמן. ראש חץ לבן בפאנל הראשון מראה תא לבנדר שעברו אפופטוזיס כפי שמוצג בלוחות הבאים, המצוין על ידי פיצול התא ואחריו הסיווג הדרגתי של גופים אפוטוטיים. תאים שכנים עם תוויות הופיעו בריאים לאורך. . למעלה, וrostral משמאל סרגל קנה מידה = 20 יקרומטר (ב). בכל התמונות, dTomato הוא מקודד כמו אדום, YFP הוא מקודד כמו ירוק, ו-CFP מקודד כחול. תמונות מודפס באישור מברודרך ואח '¹¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחיש שיבוטים של תאים מחולל קדמון ונוירונים בפתח המוח המתפתח ולעקוב אחריהם בvivo באמצעות ברייבוו ומיקרוסקופיה מיקרוסקופית הזמן¹¹. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה בהשוואה ללימודי חוץ גופית או לשעבר vivo היא היכולת להתבונן ישירות באזור ההתרבות של המוח בעלי החוליות בסביבתו הטבעית לאורך זמן. טכניקה זו בונה על המחקרים הקודמים שכותרתו שיבוט יחיד באמצעות וקטורים retroviral יעיל. לעומת זאת, השימוש hsp: zebrabow לבנות את הצבע קודים שיבוטים רבים במקביל, המאפשר לעקוב אחר השושלת היוחסין מיקוד הדינמיקה בין שיבוטים¹¹. ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי להתמקד בפיתוח במערכות אחרות או בסוגי תאים אחרים. לדוגמה, שונים המוח מבנים יכול להיות מבוטא עוברי דג דג זברה. השימוש של היזם hsp70 דג זברה ב hsp: דג זברה יביא תוויות פסיפס של מגוון סוגי תאים בעקבות הלם חום, כולל ושלתי עצביים ונוירונים¹¹, ומעניקה לחוקרים שליטה הטמפורלית על הביטוי הגן²⁹. יש לציין כי השימוש של מקדם הלם חום בעקביות תוויות שיבוטים מקודד צבע, בעוד היזמים אחרים לא יכול בבירור להתוות שושלת התאים באופן זה. כאשר זהות שבטיים אינה גורם מעניין, בנייה העושה שימוש ביזמים אחרים עשויה לשמש לתוויות של סוגי תאים ספציפיים. לדוגמה, מקדם נוירוd ניתן להשתמש כדי לתייג נוירונים¹⁸בלתי^{מפותחים 18,49}. בנוסף, במקום לבצע הזרקות מיקרו, החוקרים יכולים לבחור להשתמש ברגניים ברייברכידג בראצאג, כולל קווים כמו Tg (ubi: zebrafish)¹⁵ ו Tg (Neurod: zebrafish)¹⁸. במקרה זה, חוצה לקווים המבטאים את היצורים הrecombinase, כגון Tg (hsp:^a134)¹⁵, מייצרים עוברים לא מוזרקים שנאספים ונשמרים באופן דומה. בעוד פרוטוקול זה נועד לדמות דגים בין 1 – 3 dpf, כדי להיות חופפים עם התקופה העיקרית של נוירוגנזה⁵⁰התפתחותית, דג דג זברה עשוי להישמר זמן רב יותר תלוי בשלב ההתפתחותי של עניין. עם זאת, הלם חום לגרום הביטוי ברייבוו לפני 24 hpf עלול להיות מזיק יותר עוברים⁵¹. בהתאם לגיל ורקמות של עניין, אסטרטגיות הרכבה שונים יהיה מתאים לקבל את רקמת ממוקדות מונחה כראוי.

קיימים מספר שלבים שעשויים לדרוש פתרון בעיות, במיוחד אם נעשים שינויים בפרוטוקול. הריכוז של דנ א, גודל בולוס הוזרק, וכמות מוחלטת של דנ א לעובר יכול להיות מותאם אם הביטוי בריינרד הוא עמום או דליל או אם העוברים אינם מופיעים בריאים. בנוסף, האורך והתזמון של שלב ההלם התרמי עשוי להיות שונה אם הביטוי הרצוי אינו מושג. פרמטרי הרכישה המשמשים בהדמיה ישתנו בהתאם לקווי הלייזר והמסננים הזמינים, כמו גם את בהירות הביטוי, ההרכבה וסוג הניתוח הרצוי. בנוסף, יש לכוונן את הפרמטרים בזמן הפקיעה בהתאם למהירות האירועים המעניינים ולזמן הדרוש לרכישת מחסנית Z אחת. אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא ההרכבה המתאימה של הדג ב-agarose: אם זווית הדג אינה מתאימה או אם הדג מכוסה ביותר מדי, הדמיה אופטימלית לא תהיה אפשרית. מיטוב טכניקה זו עשויה לקחת קצת תרגול. בנוסף, הוא שימושי לעתים קרובות כדי לטעון דגים מרובים לפני הדמיה כפי שהוא יכול להיות קשה לברר אם הרכבה מתאים לפני הצגת ביטוי FP על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד עצמו. צעד קריטי נוסף הוא ההקרנה והבחירה של הדג הספציפי לדימות. אם ביצוע מיקרוזריקות, בהירות, צפיפות תיוג, מספר העתק המוח יכול להשתנות באופן משמעותי בין דגים. תמונות שצולמו דגים עם תוויות עמום, תיוג צפוף מדי, או מספר עותק נמוך וכתוצאה מכך כמה צבעים עשוי להיות קשה יותר לנתח.

עם הפרוטוקול הזה, הצלחנו ברציפות תמונה חיה דג זברה עד 16 h¹¹. פרק זמן זה יכול להיות מוגבל על ידי E3 אידוי מחדר ההדמיה, צמיחת הדג מתוך מישור של הדמיה, מוות או תנועה של הדג, או להגביל את המשתמש על זמן המיקרוסקופ קונפוקלית וקד. אידוי יכול להיות ירד על ידי שימוש של אביזר טמפרטורה מבוקרת על במת המיקרוסקופ. יצוין כי הנתונים 5D מגדיר שנוצר באמצעות גישה זו נוטים להיות קבצים גדולים הדורשים שטח משמעותי בכונן הקשיח (g., עד ~ 100 GB עבור אחד לילה לשגות הזמן) וכוח המחשוב המתאים לנתח.

פרוטוקול זה מדריך חוקרים להמחיש שיבוטים מקודד בצבע בתוך אוכלוסייה של ושלתי נוירונוירונים ובתי במוח בפיתוח מוחי דג זברה לעקוב אחר הדינמיקה שלהם לאורך זמן. אחת התרחבות אפשרית היא שילוב של הדמיה המוח זמן ההדמיה עם תיוג FP הרבה אדום להעריך את התפקידים של גנים ספציפיים בפיתוח¹⁸. בדרך זו, שיבוטים המבטא גנים מניפולציות יכול להיות דמיינו בצבע ברור, מעקב לאורך זמן, ולעומת המוח מתויג, לא מניפולציות שיבוטים השכנה. ב vivo הדמיה ססגוניות ניתן להשתמש כדי לטפל בשאלות מכניסטיות חשוב על איך טפסים ופונקציות של מערכת העצבים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL transfer pipette (fine tip)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes	Corning	352070	For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line	SecureLine	NMT250	For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	For E3
Cotton swabs	Puritan	867-WC NO GLUE	For making embryo manipulators
Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Digital dry bath	Genemate	490016-616	Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubator	Forma Scientific	3158	To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp water bath	Fisher Scientific	2320	For heat shocking embryos
KCl	AMRESCO	0395	For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)	AMRESCO	J234
Mating tanks	Aquaneering, Inc.	ZHCT100
Methylene blue	Sigma	M9140	For E3
MgSO4	Sigma	9397	For E3
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaine-S	Western Chemical, Inc.		Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl	J.T. Baker	4058-01	For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red	Sigma	P0290
Soft stitch ring markers	Clover Needlecraft, Inc.	354	For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)	Loctite	1363589	For making embryo manipulators
Syringe needles	Beckton Dickinson	BD329412	For dechorionating embryos