Summary
L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.
Abstract
Lo sviluppo del sistema nervoso dei vertebrati richiede una coordinazione precisa dei comportamenti cellulari complessi e delle interazioni. L'uso di tecniche di imaging in vivo ad alta risoluzione può fornire una chiara finestra in questi processi nell'organismo vivente. Ad esempio, la divisione delle cellule e la loro progenie può essere seguita in tempo reale man mano che il sistema nervoso si forma. Negli ultimi anni, i progressi tecnici nelle tecniche multicolore hanno ampliato i tipi di domande che possono essere studiate. L'approccio multicolore Brainbow può essere utilizzato non solo per distinguere tra come le cellule, ma anche per codificare a colori più cloni diversi di cellule correlate che derivano ciascuna da una cellula progenitrice. Ciò consente un'analisi di lignaggio multiplex di molti cloni diversi e dei relativi comportamenti contemporaneamente durante lo sviluppo. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo. Ciò è particolarmente utile per seguire le interazioni cellulari tra le cellule simili, che sono difficili da etichettare in modo differenziale utilizzando i colori tradizionali guidati dal promotore. Il nostro approccio può essere utilizzato per tracciare contemporaneamente le relazioni di lignaggio tra più cloni diversi. I grandi set di dati generati utilizzando questa tecnica forniscono informazioni dettagliate che possono essere confrontate quantitativamente tra manipolazioni genetiche o farmacologiche. In definitiva, i risultati generati possono aiutare a rispondere a domande sistematiche su come si sviluppa il sistema nervoso.
Introduction
Nelle prime fasi di sviluppo, i pool di cellule progenitrici specializzate si dividono ripetutamente in zone proliferanti, producendo diverse matrici di cellule figlie. Le cellule nate durante questo periodo di sviluppo si differenziano e viaggiano per formare gli organi nascenti. Nel sistema nervoso, progenitori come la glia radiale danno origine a neuroni immaturi in zone ventricolari. Come i neuroni migrano lontano dai ventricoli e matura, il tessuto in espansione alla fine forma le strutture altamente complesse del cervello1,2,3,4,5,6. Il coordinamento tra la divisione dei progenitori e la differenziazione e la migrazione dei neuroni determinerà la dimensione, la forma e quindi la funzione del cervello, influenzando direttamente il comportamento7,8,9,10. Mentre uno stretto controllo su questi processi è chiaramente cruciale per il normale sviluppo del cervello, i meccanismi globali che regolano queste dinamiche non sono ben compresi. Qui descriviamo uno strumento per studiare lo sviluppo del sistema nervoso a una risoluzione cellulare, permettendo ai ricercatori di visualizzare le cellule progenitrici e neuroni in vivo nel cervello di pesce zebra in via sviluppo con Brainbow e monitorare il loro comportamento nel tempo attraverso la microscopia confocale time-lapse11. L'approccio può anche essere adattato per visualizzare altre parti dell'embrione in via di sviluppo.
Per osservare e distinguere tra le cellule nel cervello del pesce zebra in via di sviluppo, abbiamo adattato la tecnica di etichettatura delle cellule di Brainbow11. Brainbow utilizza l'espressione combinatoria determinata casualmente di tre distinte proteine fluorescenti (FP) per etichettare una popolazione di cellule. Mentre l'espressione predefinita per l'espressione Brainbow è il rosso FP dTomato, la ricombinazione da parte dell'enzima Cre ricombinasi risultati in espressione di mCerulean (proteina fluorescente ciana, CFP) o proteina fluorescente gialla (YFP)12,13. La quantità combinata di ogni FP espresso in una cella gli conferisce una tonalità unica, consentendo una chiara distinzione visiva dalle celle vicine. Inoltre, quando una cellula progenitrice si divide, ogni cellula figlia erediterà il colore dalla sua cellula madre, producendo cloni codificati a colori e permettendo ai ricercatori di tracciare il lignaggio cellulare11,14. Mentre originariamente utilizzato per analizzare i circuiti neuronali nei topi12, Brainbow è stato da allora espresso in una vasta gamma di organismi modello, tra cui il pesce zebra15.
La nostra tecnica si basa su precedenti metodi di etichettatura e imaging multicolore per creare direttamente più cloni codificati a colori nel tempo nel pesce zebra vivente. Grazie alla loro trasparenza ottica come embrioni, i pesci zebra sono adatti agli esperimenti di imaging16, e studi precedenti hanno utilizzato Brainbow nel pesce zebra per studiare una varietà di tessuti, tra cui il sistema nervoso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. La capacità di immagine direttamente nell'organismo vivente, insieme al loro rapido sviluppo ex utero, rendono il pesce zebra un prezioso modello di sviluppo dei vertebrati. A differenza del cervello dei mammiferi, l'intera zona proliferare del cervello posteriore del pesce zebra è prontamente disponibile per l'imaging senza interruzioni al suo ambiente endogeno6. Ciò consente di condurre esperimenti nell'organismo vivente, piuttosto che in preparati in vitro o in tessuto fisso. A differenza degli esperimenti di imaging fissi, gli studi in vivo consentono una progettazione longitudinale, producendo ore di dati che possono essere analizzati per modelli, aumentando così la probabilità di osservare eventi relativamente rari. A seconda della velocità e della durata degli eventi di interesse, i ricercatori possono scegliere di eseguire brevi (1–2 h) o lunghi (fino a 16 h) esperimenti di imaging time-lapse. Utilizzando il promotore di scosse di calore di pesce zebra 70 (hsp70, hsp), espressione Brainbow può essere controllato temporalmente28,29. Inoltre, l'espressione mosaico indotta da questo promotore è adatta per etichettare e tracciare molti cloni11.
La capacità di identificare visivamente più cloni all'interno del cervello vivente è un vantaggio di questo metodo. Importanti studi precedenti che hanno studiato il ruolo dei cloni all'interno dello sviluppo del sistema nervoso utilizzavano vettori retrovirali per etichettare una singola cellula progenitrice e la sua progenie utilizzando un singolo FP o altra proteina facilmente visualizzabile. Tale etichettatura consente ai ricercatori di osservare un singolo clone nel tempo, sia in vitro che in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. In contrasto con i metodi per monitorare il comportamento delle cellule all'interno di un clone, i colori distinti di Brainbow consentono ai ricercatori di osservare la dinamica tra i cloni. Inoltre, utilizzando Brainbow per etichettare molti cloni all'interno del cervello, vengono raccolti dati aggiuntivi sul comportamento clonale rispetto alle tecniche che etichettano un singolo clone11. È importante sottolineare che gli approcci qui descritti possono essere ampliati per generare confronti di sviluppo tra pesci che hanno subito diverse manipolazioni genetiche o farmacologiche18. Nel complesso, questi vantaggi rendono l'imaging confocale in vivo in vivo del pesce zebra che esprime Barcobaleno ideale per i ricercatori che esplorano lo sviluppo del sistema nervoso dei vertebrati, in particolare quelli interessati al ruolo dei cloni.
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Protocol
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Lewis & Clark College.
1. Microiniezione di embrioni di pesce zebra
- Impostare il tipo selvaggio, pesce zebra adulto in serbatoi di accoppiamento segregati dal sesso il pomeriggio prima di eseguire microiniezioni39,40.
- Preparare la soluzione del DNA la mattina delle microiniezioni. Diluire hsp:DNA plasmide di zebrebow 11 a una concentrazione di 10 ng/L in KCl da 0,1 mm, insieme al 2,5% di fenolo rosso e a un enzima ricombinano 3,75U Cre.
- Eseguire microiniezioni di soluzione di DNA in embrioni di pesce zebra a una cellula entro 45 min di fecondazione39,41. Iniettare circa 4,2 nL di questa soluzione in ogni embrione, equivalente a 42 pg di DNA plasmide.
NOT: La fase di microiniezione può essere omessa se invece viene accoppiata una linea di pesci zebra transgenica che esprime Brainbow, come Tg(ubi:zebrabow)15 e Tg(neurod:zebrabow)18. L'esecuzione di microiniezioni può essere vantaggiosa perché consente ai ricercatori di titrate il numero di copia e la densità di etichettatura. Inoltre, un secondo costrutto di DNA che etichetta o manipola un prodotto genetico specifico può essere iniettato insieme a Brainbow se lo si desidera (ad esempio, una proteina fluorescente di gran lunga rossa che integra Brainbow18). - Mantenere gli embrioni iniettati nei piatti Petri di medie39 E3 in un'incubatrice a 28 gradi centigradi per 24 ore.
2. Shock di calore per indurre l'espressione Brainbow
NOT: Se il DNA plasmide iniettato o il transgene espresso non utilizza il promotore hsp70 per guidare l'espressione, la fase di shock termico può essere saltato e gli embrioni sani devono essere immediatamente trasferiti alla fenilthiourea (PTU) a 24 h dopo la fecondazione (hpf).
- A 24 hf, abbattono embrioni morti e deformati dal gruppo di embrioni iniettati. Quindi, trasferire gli embrioni sani in un tubo da 50 mL, con un massimo di 20 embrioni/tubi.
- Riempire i tubi con 10 mL di E3. Posizionare un tappo sopra ogni tubo, ma non chiudere strettamente.
- Posizionare il rack dei tubi contenente i tubi da 50 mL in posizione verticale in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi. Assicurarsi che il livello dell'acqua nella vasca da bagno è superiore al livello della E3 nei tubi e lasciarli per 80 a 90 min.
- Rimuovere il rack tubo con gli embrioni dal bagno d'acqua e tornare all'incubatrice 28 .C in posizione verticale. Lasciare raffreddare fino a 1 h e raffreddare gradualmente gli embrioni alla temperatura. Quindi, trasferire gli embrioni ai piatti Petri di 0,2 m PTU in E3 riscaldato nell'incubatrice per prevenire la pigmentazione degli embrioni.
ATTENZIONE: La PTU è una sostanza chimica tossica che deve essere maneggiata con cura e smaltita in modo appropriato. Si consiglia di indossare guanti.
3. Screening degli embrioni per Brainbow Expression
- A 2 a 4 h dopo lo shock termico, esaminare gli embrioni sotto un microscopio di dissezione a fluorescenza standard per l'espressione di CFP o YFP, che indica la ricombinazione Di successo Brainbow (dall'espressione di default di dTomato).
NOT: Se sono disponibili più opzioni di filtro a fluorescenza, lo screening per la PCP è il modo più efficiente per identificare i pesci ben ricombinati. Se i filtri CFP e YFP non sono disponibili, YFP può anche essere visualizzato demente sotto i filtri gFP (Green Fluorescent protein) a causa della sovrapposizione nei loro profili spettrali. - Selezionare gli embrioni con una robusta espressione FP in tutto e trasferire in un piatto separato con PTU. Image embryos at 1 day post fecondazione (dpf; 28 hpf o versioni successive) o mantenere gli embrioni in PTU e immagine a 2 o 3 dpf.
4. Montaggio di embrioni per in vivo imaging
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Prima del giorno dell'esperimento, preparare la camera di imaging e lo strumento di manipolazione degli embrioni.
- Preparare la camera di imaging superando con cura un anello di plastica al centro di un piatto Petri da 60 mm.
- Facoltativamente, preparare un manipolatore di embrioni su misura per spostare gli embrioni all'interno del piatto e orientare gli embrioni durante il montaggio. Costruisci il manipolatore superglundo una piccola lunghezza di filo da pesca in nylon (1/2 in, 6 libbre) fino alla fine di un bastoncino di cotone di legno che è stato tagliato a una lunghezza di 4 dollari.
- Se necessario (ad es. imaging a 2 dpf o versioni precedenti), prima di montare gli embrioni dechorionati utilizzando siringhe al microscopio di dissezione.
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Anestesizzare gli embrioni di pesce zebra.
- Riempire un piatto Petri da 60 mm a metà con l'E3 e aggiungere 5-6 gocce di 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S ad una concentrazione finale di 0,2 mM. Swirl per mescolare.
ATTENZIONE: La tricaina deve essere maneggiata con cura e smaltita in modo appropriato. - Trasferire gli embrioni dal PTU alla soluzione di tricaina, assicurando che venga trasferito il meno PTU possibile. Mentre i riflessi dei pesci dovrebbero cessare dopo 1–2 min, lasciare gli embrioni in tricaina fino a 10 minuti per garantire un'anestesizzazione approfondita per esperimenti di imaging time-lapse.
- Verificare che gli embrioni siano adeguatamente anestesizzati. Valutare il riflesso spaventato toccando delicatamente le code dell'embrione con il manipolatore dell'embrione. Se si osserva un movimento riflesso, aggiungere un'ulteriore goccia di tricaina al piatto il più lontano possibile dagli embrioni e vortice di mescolare. Osservare la frequenza cardiaca dell'embrione sotto un ambito di dissezione. Se è anormalmente lento, aggiungere ulteriori gocce di E3 al piatto per ridurre la concentrazione di tricaina.
- Riempire un piatto Petri da 60 mm a metà con l'E3 e aggiungere 5-6 gocce di 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S ad una concentrazione finale di 0,2 mM. Swirl per mescolare.
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Montare embrioni anestesizzati in agarose.
- Trasferire il pesce al centro dell'anello di plastica all'interno della camera di imaging e rimuovere il maggior eccesso di E3 possibile utilizzando una pipetta di trasferimento con punta fine.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento pulito, coprire il pesce con agarose a bassa fusione dell'1,0% in E3 conservato a 42 gradi centigradi e riempire l'intero anello di plastica con un sottile strato di agarose. Utilizzare una pipetta di trasferimento per tirare delicatamente gli embrioni nella punta della pipetta e di nuovo nell'agarose senza introdurre bolle d'aria.
- Prima che l'agarose si indurisca, utilizzare rapidamente un manipolatore di embrione per orientare il pesce in modo appropriato. Se si fa l'imaging con un microscopio verticale, posizionare gli embrioni il più vicino possibile alla superficie superiore dell'agarose. Posizionare gli embrioni parallelamente alla parte inferiore della camera di imaging con la coda dritta.
NOT: Per l'imaging del cervello posteriore, gli embrioni possono essere posizionati in una visione dorsale o sagittale. Occorre prestare attenzione affinché le teste degli embrioni non sprofondino mentre l'agarose è ancora liquido. Altri orientamenti possono essere appropriati per indirizzare altri tessuti in via di sviluppo per l'imaging. Per i microscopi invertiti, il montaggio sarebbe fatto in modo diverso, in genere posizionando il pesce vicino al fondo di una parabola Petri con fondo di vetro.
- Attendere che l'agarose si indurisca, quindi riempire la camera di imaging con E3. Aggiungere quanto più E3 possibile per tenere conto dell'evaporazione nel corso dell'imaging.
5. Immagini confocali time-lapse di sviluppo del pesce zebra Hindbrain
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Posizionare la camera di imaging sul microscopio confocale in preparazione per l'imaging.
- Posizionare la camera di imaging con il pesce ed E3 al microscopio confocale.
- Selezionare un obiettivo con un'apertura numerica elevata e una lunga distanza di lavoro, ad esempio un obiettivo di immersione in acqua 20x (1,0 NA).
- Trova una regione con un'etichettatura opportunamente densa e luminosa dei tipi di cellule di interesse.
NOT: Uno stadio/apparato a temperatura controllata al microscopio può essere utilizzato anche per regolare la temperatura e l'umidità durante lunghe sessioni di imaging. Questo può diminuire l'evaporazione.
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Impostare i parametri di acquisizione per brainbow imaging.
- Immagine di ogni canale FP in sequenza. Se si utilizza un software commerciale (ad es. software zen), questo viene fatto preparando tre "tracce". Utilizzare un laser Argon per eccitare CFP a 458 nm e YFP a 514 nm. Utilizzare un laser DPSS 561 nm per eccitare dTomato. Raccogliere le emissioni tra 463-509 nm per CFP, 519-555 nm per YFP e 566–691 nm per dTomato.
- Per la visualizzazione su schermo, codice CFP in blu, YFP come giallo e dTomato in rosso.
NOT: Queste impostazioni variano a seconda delle linee laser e di altre caratteristiche disponibili al microscopio confocale. Per aumentare la velocità di imaging, i canali CFP e dTomato possono essere visualizzati contemporaneamente senza sanguinamento apprezzabile. Se viene imageta anche un FP separato, ad esempio un FP molto rosso, è possibile crearne un'immagine in sequenza o contemporaneamente a YFP. - Impostare i parametri di imaging generali per acquisizione di immagini a 16 bit con una risoluzione di almeno 1024 x 1024 e una media due volte. Regolare lo zoom in base alla regione e al tipo di area di interesse (ad esempio, per l'imaging del cervello posteriore con un obiettivo 20x lo zoom sarà compreso tra 1,0 e 2,5). Massimizzare il campo visivo per consentire la crescita del pesce nel tempo.
- Visualizzazione di una traccia alla volta (e disattivazione di altri laser per impedire il fotosbiancamento), ottimizzare le impostazioni di acquisizione per ogni FP singolarmente (ad esempio, potenza laser, dimensione del foro stenopeico, guadagno del tubo fotomoltiplicatore, ecc.).
- Selezionate l'intervallo di impilamento z per l'immagine.
NOT: Per le lunghe sessioni di imaging (>2 h), prendere in considerazione che il pesce continuerà a crescere nel corso dell'imaging, quindi sia il campo XY che la gamma di stack z dovrebbero tenere conto di questo con spazio in più. Se si immagina il cervello posteriore, includere lo spazio nel campo affinché il tessuto si muova di sontralto durante il periodo di imaging. Lo spazio deve anche essere incluso per la crescita nella dimensione . Includere nell'immagine circa 10-20 m sopra la regione di interesse, sia che il pesce sia posizionato per la vista sagittale o dorsale.
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Impostare i parametri per l'imaging time-lapse.
- Selezionare un intervallo di tempo. Intervallo di lunghezza intervallo tra 10-30 min per monitorare gli eventi mitotici e apoptotici nel cervello posteriore in via di sviluppo. La lunghezza dell'intervallo varia a seconda della velocità degli eventi di interesse e del tempo totale necessario per acquisire un singolo stack di z.
- Selezionare la durata della sessione di imaging. Le sessioni di imaging time-lapse si verificano generalmente durante la notte e possono durare almeno 16 h.
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Eseguire l'esperimento.
NOTA: Il pesce può essere eutanasia subito dopo l'imaging o accuratamente sezionato dall'agarose usando le siringhe e restituito all'E3 per recuperare. I pesci recuperati possono quindi essere ripresi in un secondo momento, anche se la posizione e la profondità delle cellule si sposteranno durante questo periodo a causa della crescita complessiva.
6. Gestione dei file time-lapse
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Importare il file di immagine nel software di analisi.
- Se si utilizza il software zen, salvare il file in formato .czi una volta completata l'acquisizione dell'immagine. Assicurarsi di salvare i dati grezzi in un formato compatibile con Fiji42 e/o altri software.
- Importare nel software Fiji utilizzando BioFormats Importer.
NOT: I file time-lapse saranno di grandi dimensioni e possono richiedere una notevole quantità di tempo e memoria per l'apertura per l'analisi. Pertanto, è utile essere strategici nel modo in cui vengono salvati e aperti. Può essere utile salvare una versione di qualità inferiore che può essere aperta più facilmente per cercare eventi di interesse per occhio.
- Se si utilizza Fiji, creare sottoinsiemi più piccoli e più gestibili di file time-lapse. Generare sottoinsiemi in base al tempo (ad es., visualizzando lo stack completo al primo momento) o in base alla profondità (ad esempio, visualizzando le prime 50 sezioni z in ogni punto temporale) facendo clic su Immagine. Proprietà Stacks. Proprietà Tools (Strumenti) Crea sottopila.
7. Analisi quantitativa dei colori clonali delle immagini di Brainbow
- Misurare i valori di intensità media rosso, verde e blu (RGB) per le celle di interesse nelle Figi.
NOTA: queste istruzioni sono specifiche per l'analisi delle immagini nelle Figi. Tuttavia, i ricercatori possono preferire di ottenere i valori medi di intensità RGB in un programma software alternativo.- Assicurarsi che il file venga ritagliato correttamente in modo che non vi sia spazio nero intorno ai bordi dell'immagine. Lo spazio nero riduce artificialmente le misure di intensità minima necessarie per l'analisi. Se il file deve essere ritagliato, selezionare il pulsante di selezione rettangolo e disegnare un'area di interesse (ROI) intorno al campo visivo, escluso tutto lo spazio nero. Fare clic su Immagine. Ritagliare.
- Impostare lo strumento di misurazione in modo che esetra le misure dei valori di grigio medi, minimi e massimi. Fare clic su Analizza. Impostare Misure. Assicurarsi che le caselle di controllo Per Valore grigio Min & Max e Valore grigio medio siano entrambe selezionate.
- Se si visualizzano i file di dati grezzi o gli stack a z sottoinsiemi nelle Figi, è possibile trovare celle di interesse per l'analisi dei colori clonali. Nel cervello posteriore, i cloni putativi possono essere identificati visivamente dalla loro tonalità condivisa e dal loro orientamento radiale. Non selezionare celle che sono a stretto contatto con, e quindi difficile da risolvere, le celle vicine di un altro colore. Può essere difficile quantificare la loro tonalità.
- Trovare il piano centrale della cella di interesse utilizzando la barra di scorrimento z. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante di selezione ovale e selezionare il pulsante di selezione ellittico. Altri strumenti di selezione saranno appropriati per diversi tipi di celle. Disegnate un ROI ellittico intorno al corpo centrale di 2/3 del corpo cellulare.
- Utilizzando la barra di scorrimento C, selezionare il canale rosso (dTomato). Prendere la misura dell'intensità media per questo canale selezionando Analizza Misurare. Ripetere con lo stesso ROI e il piano focale per i canali verde (YFP) e blu (CFP) e salvare tutti i valori di intensità media.
- Fare clic in un punto qualsiasi dell'immagine per rimuovere il ROI ellittico nella cella di interesse.
- Per misurare i livelli di sfondo per la normalizzazione, utilizzare la barra di scorrimento C e selezionare il canale rosso (dTomato). Prendere la misura di intensità minima per l'intero campo in questo canale selezionando Analizza Misurare. Ripetere con lo stesso piano focale per i canali verde (YFP) e blu (CFP) e salvare tutti i valori di intensità minima.
- Calcolare i pesi del canale RGB relativo per le celle di interesse.
NOTA: il calcolo dei pesi dei canali RGB relativi da questi valori di intensità può essere eseguito in una varietà di programmi software, come Microsoft Excel o R43.- Normalizzare la misurazione dell'intensità media del ROI della cella per ogni canale sottraendo l'intensità minima dall'intero campo in quel canale e piano focale.
- Sommare i valori di intensità RGB media normalizzati di ciascun canale per trovare l'intensità RGB normalizzata totale per la cella.
- Calcolare il peso relativo del canale per ogni canale dividendo il valore di intensità media normalizzato per tale canale per l'intensità RGB normalizzata totale.
- Visualizzare i pesi dei canali RGB relativi come grafici ternari utilizzando il pacchetto Ternario per R43,44. I grafici ternari sono utili per visualizzare il raggruppamento di colori simili nello spazio RGB 3D.
- Calcolare il coefficiente di diffusione del colore per quantificare la differenza tra i colori delle celle.
- Calcolare la distanza euclidea tra i due colori nello spazio RGB 3D utilizzando la seguente equazione:
dove R, G e B sono i pesi del canale RGB relativi calcolati in 7.2. - Per facilitare la comprensione, normalizzare la distanza del colore dividendo per 2, la distanza massima possibile tra i colori, per ottenere un coefficiente di diffusione del colore compreso tra 0 e 1, dove 0 indica esattamente lo stesso colore e 1 indica colori completamente diversi (ad esempio, rosso puro e blu puro).
- Calcolare la distanza euclidea tra i due colori nello spazio RGB 3D utilizzando la seguente equazione:
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Representative Results
Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti utilizzando l'approccio di imaging time-lapse multicolore in vivo descritto qui. Mostriamo che Brainbow cloni codificati a colori di cellule nella zona ventricolare proliferale del pesce zebra in via di sviluppo cervello posteriore14 (Figura 1).
In genere, quando le celle etichettate brainbow erano disposte lungo una particolare fibra radiale, condividevano lo stesso colore (Figura 1D), che poteva essere quantificato come i pesi del canale RGB relativo (Figura 1E). Ciò suggerisce che questi gruppi radiali erano cloni di cellule divisorie e che il loro colore simile potrebbe essere utilizzato per identificarli come correlati clonalmente, come osservato negli studi precedenti nel pesce zebra, nel topo e nel pulcino14,,15. Quando la densità di etichettatura di Brainbow è relativamente scarsa, questa codifica dei colori può essere utilizzata per visualizzare e tracciare chiaramente molti cloni radiali distinti all'interno delle regioni proliferanti del cervello dei vertebrati viventi.
Un'analisi quantitativa del colore ha mostrato che le cellule figlie esprimevano lo stesso colore della loro cellula madre (progenitrice) (Figura 1F), ma che gli ammassi radiali vicini di cellule possono essere distinti l'uno dall'altro11 (Figura 1E). Ciò significa che numerosi cloni di celle correlate possono essere seguiti contemporaneamente per ore in vivo (Figura 2), consentendo un'analisi e un confronto di derivazione multiplex. La quantificazione dell'espressione del colore nei cloni a 2 dpf e poi di nuovo a 3 dpf (Figura 2A-B) ha mostrato che l'espressione Brainbow è rimasta relativamente costante da 2-3 giorni in vivo11. Le singole cellule possono quindi essere identificate e tracciate in tempo reale per periodi di tempo relativamente lunghi durante lo sviluppo.
L'imaging time-lapse ha rivelato numerose cellule sottoposte a migrazione nucleare intercinetica e divisione cellulare durante il periodo da 1 a 2 dpf (Figura 2C–F)11, permettendo lo studio del ciclo cellulare. Utilizzando un intervallo time-lapse di 30 min, non abbiamo sempre catturato la figura mitotica durante la divisione cellulare. Questo ha introdotto un potenziale errore fino a 30 min al tempo assegnato di divisione cellulare. Inoltre, abbiamo osservato alcuni cloni che sembrano contenere due cellule progenitrici (ad esempio, Figura 2F). All'interno di questi vincoli, la lunghezza del ciclo cellulare può essere misurata. Tracciando i singoli progenitori etichettati Brainbow nel tempo, abbiamo calcolato un ciclo cellulare medio di 8,4 x 1,5 h, paragonabile alle precedenti misurazioni nel pesce zebra1,,45,46. Inoltre, utilizzando la tecnica di imaging time-lapse di Brainbow, siamo stati anche in grado di osservare singole cellule sottoposte ai cambiamenti morfologici stereotipati associati all'apoptosi (Figura 3)11, come il blebbing della membrana e la frammentazione cellulare47,48.
Figura 1: Brainbow ha etichettato cluster correlati clonalmente di cellule divisorie nel cervello posteriore del pesce zebra in via di sviluppo. (A) Schematica del DNA di hsp:'e'ebrabow (Brainbow) estemporaneamente espresso ai cloni del codice a colori. (B) In vivo ha trasmesso immagini luminose dello sviluppo di pesci zebra a 1 e 2 dpf; le frecce indicano la regione generale del cervello posteriore mirata per l'imaging. La traslucenza degli embrioni è dimostrata da un micrometro posto sotto ogni pesce. Sequenza temporale sperimentale che mostra iniezioni in uno stadio cellulare, shock termico (HS) a 24 hpf e immagini da 1 a 3 dpf. (C) Vista dorsale del cervello posteriore di 29 hpf di pesce zebra etichettato con Brainbow. Il canale luminoso trasmesso ha mostrato la morfologia del cervello posteriore e del ventricolo sovrapposti con la proiezione massima di intensità di cloni etichettati Brainbow che rappresentano 165 m. Rostral è in piedi. (D) Espressione Brainbow in vivo nel cervello posteriore, indicata nelle proiezioni di massima intensità che rappresentano 41 m nel pesce zebra da 51 hpf (D1) e 81 m in 63,5 hpf di pesce zebra (D2). In entrambi i pannelli, la dorsale è su e rostrale è a sinistra. (E) Il colore delle cellule in D1 e D2 è stato quantificato come pesi di canale relativi nei grafici ternari corrispondenti (n - 54 celle E1; 461 celle E2). (F) Il colore delle cellule è rimasto relativamente costante nelle cellule figlie dopo la divisione cellulare. Serie di punti temporali che mostrano eventi mitotici in vivo nel cervello posteriore del pesce zebra etichettato Brainbow da 29 hpf su 1 h (F1, proiezioni di intensità massima, 30 m di profondità). Il colore delle cellule madre e figlia, indicato dalle caselle nere in F1, è rappresentato come pesi di canale relativi nel complotto ternario in F2. L'inset mostra uno zoom dello stesso grafico per mostrare i colori delle celle strettamente raggruppate (M è madre; D1 e D2 sono figlie a 30 min/squares e 60 min/triangoli). Barre di scala : 30 m (C), 20 m (D1), 16 m (D2) e 5 m (F1). In C, D e F, dTomato è codificato come rosso, YFP è codificato come verde e CFP è codificato come blu. Immagini ristampate con il permesso di Brockway et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'imaging in vivo time-lapse combinato con la codifica del colore di Brainbow distingue più cloni vicini di cellule sottoposte a migrazione e divisione nucleare intercinetica. (A) Gruppi radiali codificati a colori etichettati nel cervello posteriore di un pesce che esprime Brainbow a 2 dpf (55 hpf; A)e 3 dpf (71 hpf; A2); proiezioni di intensità massima che rappresentano rispettivamente 62 m e 47 m. Tre cluster radiali codificati a colori sono identificati con punte di freccia in ogni punto temporale. (B) Il colore di tutte le celle etichettate brainbows in A1 e A2 è stato quantificato come pesi di canale relativi nei corrispondenti appezzamenti ternari in B1 e B2 (n : 106 celle, 119 celle). (C) Il cervello posteriore del pesce zebra a 35 hpf etichettato con Brainbow (proiezione di intensità massima che mostra 24 m); rientro indicato con scatola bianca tratteggiata è il primo punto temporale visualizzato in D. (D) Serie di punti temporali presi a intervalli di 30 min nel cervello posteriore da C. Viene visualizzato un periodo di >9.5 h. Le cellule etichettate sono sottoposte a migrazione nucleare intercinetica; le punte di freccia bianche indicano una cella sulla superficie apicale. L'arrotondamento del soma cellulare sulla superficie apicale e un corrispondente aumento del numero di cloni (ad esempio, la cella rossa a 5,5 h e poi 8 h) è stato considerato un evento mitotico. (E) Vista dorsolaterale del pesce zebra hbrain a 30,5 cvf etichettato con Brainbow, dove la linea bianca tratteggiata e punteggiata mostra il limite approssimativo della testa, e la scatola tratteggiata bianca indica l'inset indicato nel primo punto temporale di F. (F) Serie di punti temporali presi a intervalli di 30 min nel cervello posteriore da E. Per un periodo di 1,5 h, due cellule blu indicate dalle punte di freccia bianche potrebbero essere osservate muoversi sulla superficie apicale e subire la mitosi, suggerendo un clone contenente due cellule progenitrici. Barra della scala: 20 m (A), 25 m (C) e 20 m (F). In A-D, dorsale è su e rostrale è a sinistra. In E e F, rostral è a sinistra. In tutte le immagini, dTomato è codificato come rosso, YFP è codificato come verde e CFP è codificato come blu. Immagini ristampate con il permesso di Brockway et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'imaging Brainbow time-lapse mostra che le cellule nella zona ventricolare subiscono la morte cellulare in vivo. (A) Il cervello posteriore del pesce zebra a 31 hpf etichettato con Brainbow (proiezione di intensità massima che rappresenta 36 m). La casella tratteggiata bianca indica l'insetto indicato nel primo punto temporale in B. (B) Serie di punti temporali che mostrano il cervello posteriore in A a intervalli di 30 min. La punta della freccia bianca nel primo pannello mostra una cellula di lavanda che ha subito l'apoptosi come mostrato nei pannelli successivi, indicata dalla frammentazione cellulare seguita da una graduale rimozione dei corpi apoptotici. Le cellule etichettate vicine sembravano sane in tutto. Dorsale è su e rostrale è a sinistra. Barra della scala: 20 m (B). In tutte le immagini, dTomato è codificato come rosso, YFP è codificato come verde e CFP è codificato come blu. Immagini ristampate con il permesso di Brockway et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare i cloni delle cellule progenitrici e neuroni nel cervello posteriore del pesce zebra in via di sviluppo e seguirli in vivo utilizzando Brainbow e microscopia confocale time-lapse11. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto agli studi in vitro o ex vivo è la capacità di osservare direttamente la zona proliferale del cervello vertebrato nel suo ambiente naturale nel tempo. Questa tecnica si basa su studi precedenti che hanno etichettato un singolo clone utilizzando vettori retrovirali. Al contrario, l'uso del hsp:zeesp costruisce codici di colore molti cloni contemporaneamente, consentendo la tracciatura del lignaggio multiplex e un focus sulla dinamica tra i cloni11. Questo protocollo può essere modificato per concentrarsi sullo sviluppo in altri sistemi o tipi di cellule. Ad esempio, diversi costrutti Brainbow possono essere espressi in embrioni di pesce zebra. L'uso del promotore di pesce zebra hsp70 in hsp:zebrebow si tradurrà in un'etichettatura mosaica di una varietà di tipi di cellule in seguito a shock termico, inclusi progenitori neurali e neuroni11, e dà ai ricercatori il controllo temporale sull'espressione genica29. Va notato che l'uso del promotore di urti di calore etichetta costantemente cloni codificati a colori, mentre altri promotori potrebbero non delineare chiaramente il lignaggio cellulare in questo modo. Quando l'identità clonale non è un fattore di interesse, i costrutti che utilizzano altri promotori possono essere utilizzati per etichettare tipi di celle specifici. Ad esempio, il promotore neuroD può essere utilizzato per etichettare neuroni immaturi18,49. Inoltre, invece di eseguire microiniezioni, i ricercatori possono scegliere di utilizzare il pesce zebra Brainbow transgenico, comprese le linee come Tg(ubi:zebrabow)15 e Tg(neurod:zebrebow)18. In questo caso, le croci a linee che esprimono la Ricombinasi Cre, come Tg(hsp:Crea134)15, producono embrioni non iniettati che vengono raccolti e mantenuti in modo simile. Mentre questo protocollo è progettato per l'immagine di pesci tra 1-3 dpf, al fine di coincidere con il periodo maggiore della neurogenesi dello sviluppo50, il pesce zebra può essere mantenuto più a lungo a seconda dello stadio di sviluppo di interesse. Tuttavia, shock termico per indurre l'espressione Brainbow prima di 24 hpf può essere più dannoso per gli embrioni51. A seconda dell'età e del tessuto di interesse, diverse strategie di montaggio saranno appropriate per avere il tessuto mirato orientato correttamente.
Esistono diversi passaggi che possono richiedere la risoluzione dei problemi, in particolare se vengono apportate modifiche al protocollo. La concentrazione di DNA, le dimensioni dei bolus iniettati e la quantità totale di DNA somministrato per embrione possono essere tutte regolate se l'espressione di Brainbow è fioca o scarsa o se gli embrioni non appaiono sani. Inoltre, la lunghezza e la temporizzazione della fase di shock termico possono essere modificate se non viene raggiunta l'espressione desiderata. I parametri di acquisizione utilizzati nell'imaging variano a seconda delle linee laser e dei filtri disponibili, nonché della luminosità dell'espressione, del montaggio e del tipo di analisi desiderata. Inoltre, i parametri time-lapse devono essere regolati in base alla velocità degli eventi di interesse e al tempo necessario per acquisire un singolo stack z. Uno dei passaggi più critici del protocollo è il montaggio appropriato del pesce in agarose: se l'angolo del pesce è inappropriato o se il pesce è coperto da troppe agarose, l'imaging ottimale non sarà possibile. L'ottimizzazione di questa tecnica può richiedere una certa pratica. Inoltre, è spesso utile montare più pesci prima dell'imaging in quanto può essere difficile accertare se il montaggio è appropriato prima di visualizzare l'espressione FP sul microscopio confocale stesso. Un ulteriore passo critico è lo screening e la selezione del pesce specifico da immaginare. Se si eseguono microiniezioni, la luminosità, la densità di etichettatura e il numero di copia di Brainbow possono variare in modo significativo tra i pesci. Immagini scattate in pesci con etichettatura fioca, etichettatura eccessivamente densa o un numero di copie basso che causa pochi colori possono essere più difficili da analizzare.
Con questo protocollo, siamo stati in grado di immagine continuamente pesce zebra vivente fino a 16 h11. Questo periodo di tempo può essere limitato dall'evaporazione di E3 dalla camera di imaging, dalla crescita del pesce dal piano di imaging, dalla morte o dal movimento del pesce o dai vincoli dell'utente al tempo del microscopio confocale. L'evaporazione potrebbe essere diminuita dall'uso di un accessorio a temperatura controllata sullo stadio del microscopio. Va notato che i set di dati 5D generati utilizzando questo approccio tendono ad essere file di grandi dimensioni che richiedono uno spazio significativo sul disco rigido (ad esempio, fino a 100 GB per un time-lapse durante la notte) e una potenza di calcolo adeguata per l'analisi.
Questo protocollo guida i ricercatori a visualizzare cloni codificati a colori all'interno di una popolazione di progenitori neurali e neuroni figlia nel cervello del pesce zebra in via di sviluppo e tenere traccia delle loro dinamiche nel tempo. Una possibile espansione è la combinazione dell'imaging Brainbow time-lapse con l'etichettatura FP di gran lunga rossa per valutare i ruoli di geni specifici nello sviluppo18. In questo modo, i cloni che esprimono geni manipolati possono essere visualizzati in un colore distinto, tracciati nel tempo e confrontati con cloni vicini etichettati da Brainbow e non manipolati. L'imaging multicolore in vivo può essere utilizzato per affrontare importanti domande meccanicistiche su come il sistema nervoso si forma e funziona.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Y. A. Pan, J. Livet e Tobias per il contributo tecnico e intellettuale. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (Award 1553764) e dal M.J. Murdock Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL transfer pipette (fine tip) | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5 mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 42 °C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28 °C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
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