Summary
本文介绍了生成、纯化和量化卡内哈卜迪炎细胞外囊泡的方法。
Abstract
将小膜结合囊泡分泌到外部环境是所有细胞的基本生理过程。这些细胞外囊泡（EV）在细胞外发挥作用，通过在组织之间转移蛋白质、核酸、代谢物和脂质来调节全球生理过程。EV反映其原细胞的生理状态。电动汽车在人类健康的几乎每一个方面都发挥着基础性作用。因此，EV蛋白和遗传货物正越来越多地被分析为健康和疾病的生物标志物。然而，EV领域仍然缺乏一种可处理的无脊椎动物模型系统，可以研究EV货物成分。C. elegans非常适合 EV 研究，因为它主动将身体外部的 EV 分泌到外部环境中，从而允许容易的隔离。本文提供了生成、纯化和量化这些环境分泌的 C. elegans EV 所需的所有信息，包括如何定量地处理大量年龄同步蠕虫、纯化 EV，以及直接测量纯化样品中完整 EV 数量的流式细胞学方案。因此，可用于C.elegans研究的遗传试剂库可用于研究遗传途径和生理过程对EV货物组合的影响。
Introduction
膜结合细胞外囊泡（EV）的分泌通过主动在细胞1之间运输特定蛋白质、核酸、代谢物和脂质货物，促进全球生理过程。细胞分泌的EV，其大小范围从2μm或更大到小至20nm2不等。小型EV（<200 nm）由于在病理过程中的影响，包括代谢紊乱、癌症、心血管疾病和神经退行性疾病33、4、5，4,5因此越来越受到研究。这些病理也已被证明影响小EV货物的EV蛋白和遗传成分。因此，通过诸如LC-MS-MS,和RNA酶体6、7、8、97,等EV货物发现方法，不断发现病理学的生物标志物6特征。89
C. elegans是一个有用的无脊椎动物模型，用于识别进化保护的 EV 信令通路。例如，一个C.elegans翻转酶首次被显示诱导EV生物发生在C.elegans胚胎，和人类同源作用显示影响EV释放在人类细胞10，11。10,11据报道，Elegans EV 携带了角质体发育所必需的刺猪信号。刺猪和其他形态原的传递表明对EV具有重要的发育作用，在斑马鱼、小鼠和人类中保存着12、13、14、15。12,13,14,15C. elegans非常适合 EV 生物标志物的发现，因为它分泌在身体外的 EV，在动物与动物的通信中发挥作用16，,17 （图1A）。然而，通过以前的研究建立的方法不能使用，因为线虫的大肠杆菌食物来源也分泌EV18。在这种方法中，大多数样品由大肠杆菌污染组成，限制了蛋白酶或RNA酶酶的功率，从而发现C.elegans EV货物。本文描述的方法旨在以典型细胞培养实验的丰度水平产生高纯C.elegane EV，从而促进EV生物标志物的发现。
需要大量的蠕虫来生成足够数量的电动汽车进行货物分析。因此，还列入了对大量发育同步的C.elegan进行定量培养的方法。通常，当实验需要大量的蠕虫时，它们被培养在液体介质中。虽然这能有效产生大量蠕虫，但动物的生理与在线虫生长介质（NGM）阿加板的标准条件下培育的蠕虫有很大不同。在液体中培养的动物生长得更慢，更薄，表现出发育异质性，并受到高度的批次变异性。因此，我们提出了一种简单而有效的方法，用于使用10厘米高生长板定量培养大量发育同步的C.elegan。高生长板的介质成分比普通NGM板多的肽，由大肠杆菌菌株NA22播种，比OP50生长更强劲。
流式细胞学技术（FACS）的进步使得对单个EV20、21,21有了直接分析，从而可以量化电动汽车，而不需要其他方法的固有限制。先前的研究表明，蛋白质不是EV丰度的有用代理，因为不同的纯化方法导致EV蛋白比22明显不同。极其纯的EV分数含有相对较少的蛋白质，因此很难用BCA或库马西凝胶来量化样品。西方分析可以识别单个蛋白质的相对差异，但不能识别样本中有多少 EV。通过纳米粒子跟踪分析对EV数进行强强量化，其信号噪声范围狭窄，无法区分EV和固体聚合体，以及不同规格的仪器之间缺乏可转移性的方法23。因此，本文还包含一种可通用的流细胞测量过程，用于区分和量化电动汽车。
Protocol
1. 准备
- 将 2 克明胶加入 100 mL 的 dH2O，并在微波炉中加热，直到开始沸腾。然后搅拌，让它冷却20分钟。
- 通过 0.22 μm 过滤器将溶液送至无菌管中。在使用前立即使用明胶处理移液器提示，通过移液和排出明胶溶液。处理后的小窍门可以立即使用或存储。
- 从无菌盖过滤器中切出膜。
- 湿20厘米平方的5μm尼龙网织物，并放置在无菌帽过滤器的顶部。用几个厚的橡皮筋固定它。
注意：仔细检查织物，确保没有褶皱。这些使空气间隙阻碍吸力。
2. 计算大量蠕虫（图1A）
- 涡流和移液器 10 μL 的蠕虫悬浮液悬浮到蠕虫培养板盖或玻璃滑道上。重复此过程 3 倍。记录每次掉落的动物数量。
- 将蠕虫悬浮液调整到每 μL 两只动物。
- 在滑道或板盖上涡旋悬架和移液器九滴 （10 μL）。手动计算动物数量。记录每次掉落的动物数量。
- 计算平均值 （S.E.M.） 的平均值和标准误差，作为每个蠕虫群的百分比。
- 计算每个种群的动物总数，将平均值除以10 μL，然后乘以蠕虫悬浮在μL中的总体积。
图 1：用于生成、量化和纯化C. elegans EV 的过程概述。（A） 计算大量动物的示意图。（B） 用于收集电动汽车的蠕虫的示意图。（C） 净化EUV的原理图。请点击此处查看此图形的较大版本。
3. 培养用于EV净化的C.elegan
- 产生大量开发同步的C.elegans。为此，请按照以下步骤操作。
- 在6厘米的正常生长介质板上加入一只动物。孵育两代人，然后将动物洗到两个高生长的中等板上。
- 孵化，直到蠕虫耗尽食物。
- 在步骤 1.4 中制备 5 μm 尼龙网的过滤 L1 蠕虫。将螺杆盖放在无菌瓶上，启动真空，并将蠕虫倒在过滤器上。将介质的相同体积传递到筛选器上的蠕虫聚合。
- 量化蠕虫并计算总数（参见步骤 2）。最近饿死（<24 h）蠕虫生长在高生长板上，导致约80，000L1幼虫。
- 离心L1幼虫在2，000 x g下3分钟。重新悬浮到每mL100，000只动物。
- 每块高生长板放置50，000只动物。在20°C下培育动物，直到它们成为肉汁成人（约72小时）。
- 通过标准方法漂白重力成人，并允许胚胎以2.5μg/mL胆固醇在10 mL的S基底溶液中孵化。
- 量化L1幼虫（参见步骤2），然后在每个高生长板中添加50，000个蠕虫。
- 在20°C下培养盘子，直到动物是年轻的成年人。
- 为秘密生成准备C.elegan。
- 在每个高生长板中加入15 mL无菌M9，加入50μg/mL卡贝尼辛，从板中清洗蠕虫。让饱和板坐5分钟。通过绕着盘子圈缓冲器来驱赶蠕虫。避免晃动。将缓冲器从每个板倒入单独的 50 mL 锥形管中。重复洗涤步骤 2 倍以上，每板共 45 mL 缓冲液。
- 让蠕虫沉淀15分钟，将上清液浸结，并将50 mL的新鲜M9缓冲液添加到管子中。总共重复 4 次。
- 浮动蠕虫在30%蔗糖阶梯梯度的顶部，并在S基萨尔溶液24恢复动物。
- 在15mL的冰冷100mNaCl中短暂重新悬浮蠕虫，加入15 mL的冰冷60%蔗糖，并反转混合。用玻璃移液器轻轻层 5 mL 的冰冷 100 mM NaCl 在蔗糖混合物的顶部。
- 在1，500 x g的离心机5分钟。蠕虫将集中在NaCl和蔗糖之间的接口。
- 轻轻地将动物从界面移出，放入新的50mL锥形管中。将 S 基底溶液添加到 50 mL。让蠕虫沉降 5 分钟。
- 去刺激上清液，并添加新鲜的50 mL的S基底溶液。至少重复 3 次。
- 量化步骤 2 中描述的蠕虫数量。
- 用含有2.5微克/mL胆固醇和50μM的卡贝尼林的无菌S基底溶液将蠕虫重新悬浮到每μL一只动物的密度。
- 要准备分泌剂生成样品，将多达 400 mL 的悬浮液添加到无菌 2 L 底部糊解瓶中。
- 将烧瓶放在圆形旋转器上，以 100 rpm 的速度在 20°C 培养箱中放置 24 小时。
4. EV 纯化
- 收获和分馏
- 从培养箱中取出2L瓶蠕虫，将动物用50mL锥形小瓶（500 x g，2分钟）中颗粒。
- 通过 0.22 μm 真空过滤器倒出上清液，以清除任何颗粒碎屑。
注：此时，含有分泌物和囊泡的过滤上清剂可以储存在-80°C。 - 计算步骤 2 中描述的动物数量。
- 通过将一滴悬浮蠕虫放在细菌草坪上，确定蠕虫的生存能力。等待15分钟，然后评分动物为移动，瘫痪，或死亡。
- 使用再生的硝基纤维素10 kDa过滤单元将0.22μm过滤上清液浓缩到700μL。加入150 μL S基底溶液，然后在过滤器和涡流上加入移液器。重复 2 倍。
- 在4°C下将浓缩上清液在18，000 x g下离心20分钟，并将上清液转移到新管中。此步骤可清除处理过程中可能积聚的任何潜在碎屑或较大颗粒。
- 根据制造商的说明添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒 + EDTA。
注：此时，含有分泌物和囊泡的浓缩上清液可储存在-80°C。
- 大小排除色谱
- 将 80×200 μm 阿加罗斯树脂（孔径分馏范围为 70，000 至 40，000，000 kDa 用于球状蛋白）倒入空重力流柱盒中。流 S 基底溶液，直到树脂床以 10 mL 的最终体积包装。
注：如果将过多的树脂倒入柱盒中，则分散柱的顶部，然后用移液器去除多余的。 - 通过柱通过 40 mL 的无菌过滤 S 基底溶液，让它在重力动。
注意：检查树脂是否未受到干扰。 - 让缓冲器流动，直到树脂顶部不浸没，然后盖住柱盒的底部。在列下方放置一个收集管。
- 取下放在墨盒上的盖。将步骤 2.1 中获得的浓缩分泌层按滴添加到柱床顶部。移液器 1 mL S 基底溶液下降。在柱下放置一个新鲜的收集管。
- 用 5 mL S 基底溶液缓慢填充上柱储液，以免干扰树脂。收集前2 mL的液化，然后快速更换管，并收集下一个4 mL。这是为电动汽车富集的分数。
- 用再生的硝基纤维素10 kDa分子量切断（MWCO）过滤器将液化酶浓缩到300μL，并将转位重新转移到低结合微离心管。
- 通过涡旋 20 s 和将缓冲液移液移过过滤器，使用 100 μL S 基底溶液清洗滤膜 2 倍。添加到初始样品中，最终体积为 500 μL。
- 根据制造商的说明添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
- 立即执行下游实验（RNAEeq、LC-MS-MS、GC-MS-MS、西、FACS等），或储存在-80°C。
- 将 80×200 μm 阿加罗斯树脂（孔径分馏范围为 70，000 至 40，000，000 kDa 用于球状蛋白）倒入空重力流柱盒中。流 S 基底溶液，直到树脂床以 10 mL 的最终体积包装。
5. EV丰度流细胞测量定量
- 染料制备
- 使用新鲜的 DMSO 制备 10 mM 的 DI-8-ANEPPS 库存。分配到10μL等号，并储存在-20°C。
- 通过在具有 10 μL 染料库存的管中加入 90 μL 无菌过滤 PBS，制备 1 mM 工作溶液。
- 实验样品制备
- 将 840 μL 的 S 基底溶液添加到微离心管中。然后加入第4.2节和涡旋中产生的纯化EV的60μL。
- 将样品的300μL报价成两个新的微离心管。现在有一套实验性的三管，每个管子含有300μL的稀释性EV。标记管#1+3。样品#2，#3加入5.1.2制备的DI-8-ANEPPS库存的7μL。然后加入7 μL的1%Triton-X 100到管#3。通过涡旋混合每个管。
- 通过将声波器尖端置于样品中间，并在 20% 功率 30% 的占空比下脉冲 10 次，从而#3声波样品。
注意：确保声波器探头的尖端位于样品中间，以便将泡沫生成保持在最低水平。泡沫可能导致电动汽车聚集，从而影响样品。 - 将 300 μL 的 S 基底溶液添加到两个微离心管中。将步骤 5.1 中制备的 DI-8-ANNEPS 工作试剂的 7 μL 添加到第二管，并标注"仅染料"。标记另一管"仅限缓冲器"。
注：仅准备染料和缓冲器仅控制样本和实验样品与相同的S基底源。 - 将样品从直接光和室温下孵育1小时。
- 进行 FACS 实验。
- 将 FACS 激励滤清器设置为 488 nm（蓝色），将排放滤清器设置为 605 nm（橙色）。将流速设置为 1.5 μL/分钟。
- 运行纳米珠 FACS 校准组合（可选但建议）。
- 在 FACS 机器上运行每个样品 3 分钟（180 秒）。注意以秒为单位的确切运行时间。
- 分析 FACS 数据。
- 使用 FACS 分析软件打开文件。
- 通过单击"轴"，从下拉菜单中选择 Y 轴切换到488-Org（区域）。
- 设置从绘图顶部开始的矩形门，从 SALS 级别 102到 10 4（<300 nm 大小的粒子） 跨越。4向下扩展门，直到它包含总事件的 2.5%。将门命名为"DI-8-ANEPPS+"事件。
-
样品EV丰度量化
- 复制此门并将其粘贴到实验集中的其他两个样本以及"仅缓冲区"和"仅染料"控件上。将分析导出到电子表格。
- 如果 FACS 样本未在建议的 3 分钟（180 s）内运行，则将样本中的所有事件计数规范化为每 180 秒的事件。例如，如果样本运行为 250 s，DI-8-ANEPPS® 事件编号将缩放为 250 s/180 s。
- 通过从样品#2中减去"仅染料"控件中的 DI-8-ANEPPS® 事件数来删除染料背景事件。
- 通过减去示例#1中的 DI-8-ANEPPS® 事件数来删除等值型背景事件。
- 通过减去样品#3中的 DI-8-ANEPPS® 事件数来消除对洗涤剂不敏感的事件。此值是真实 EV 的数量。
- 计算样品1 μL中的EV数，方法是将步骤 5.5.5 中计算的值除以 μL 分析的体积（如步骤 5.3 中所述，4.5 μL 分析），再乘以稀释系数（步骤 2.5 中所述的 10 倍）。将此值乘以 EV 制备中剩余 μL 的数量。这是可用于下游分析的 EV 数量。
图2：流式细胞测定样品制备原理图，量化EV丰度。（A） EV 制备分为三个相同的样本。样本 # 1 是无染料负控件。然后，DI-8-ANEPPS 被添加到样品#2和#3。然后，Triton-X 100 将添加到示例#3。绿色箭头表示只有样品#3随后声波。来自流量的数据有助于确定 FACS 样品中洗涤剂敏感 EV 的绝对数量，然后计算总制备中电动汽车的丰度。确定染料阳性事件的大门设置与样品#1，其中不包含染料。电子表格数据上的红色书写是为了说明从洗涤剂处理的样品中减去染料阳性事件。（B） 用于量化 FACS 中 EV 的方程分析了样本并计算样本中 EV 的总数。请点击此处查看此图形的较大版本。
Representative Results
图 1显示了生成和纯化电动汽车所需的过程的示意图。完成每个步骤所需的典型时间显示在下方。图 2显示了使用 DI-8-ANEPPS（图 2A）准备用于 FACS 分析的样本的示意图，以及估计样本中 EV 总数所需的计算（图2B）。
图3A显示了10个生物复制的代表性结果。复制之间的变异性并不显著，并且典型的S.E.M.的人口大小略高于10%（图3B）。过滤蠕虫和培育新鲜高生长板将产生大量适合漂白同步的肉汁成年人。以这种方式加工的单一饥饿板可以产生1 x 106或更多同步后代的实验种群，因为每个肉汁成人将包含大约10个卵子。通过过滤卵和幼虫，通过40μm过滤器从较老的动物那里获得EV，可以维持大量发育同步种群。保留的成年人被转移到新鲜的高生长板，密度为每板20，000只动物。此过程每 2 天重复一次。图3C显示了三个通过三个板块转移移动的蠕虫种群的生物复制。动物在板之间的转移导致大约10%的动物损失（图3C），而大约20%的动物在蔗糖浮选步骤中丢失（图3D）。
图3：用于EV分析的大量C.elegan的定量。（A） 从最近饿死（<24 h）高生长板分离的L1幼虫数量的比较。绘制了 10 个生物复制器中每个值。10个复制中所有数据点的总和也作为小提琴情节和带S.E.M.的条形表示。这表明，一盘最近饿死的蠕虫将产生+80，000 L1幼虫阶段蠕虫。（B） A 面板中 15 个不同板块总体测量的 S.E.M. 绘制为单个点。一般来说，S.E.M. 略高于 10%。（C） 每4小时在两个板块间转移后，估计有3个蠕虫种群的生物复制。这种在板块间转移的动物并没有导致种群规模的显著减少。这表明这里提出的移动蠕虫的方法不会导致动物的重大损失。（D） 沿三次EV实验复制过程进行的人口测量：最初开始实验的L1幼虫估计的动物数量、从蔗糖漂浮物中恢复并准备24小时孵育期的年轻成年动物的数量、从EV制备中计数的动物数量。在L1幼虫阶段的初始种群估计和后来的动物是年轻人之间，人口规模略有下降，但幅度不大，但幅度不大。平均 L1 总体测量被指定为 100%，所有其他测量值均按其与此值的关系进行缩放。误差条 S.E.M. = = p 值 < 0.05，N.S. = 参数化配对 t 检验中不显著。请点击此处查看此图形的较大版本。
蛋白质与动物比是描述EV制剂的有用指标。此指标可以提供确定 EV 准备之间的一致性的快速方法。平均而言，1000种野生类型的年轻成年动物会将1μg大于10kDa的蛋白质分泌到他们的环境中（图4A）。当该分数通过尺寸排除色谱进一步分离时，总蛋白质洗脱轮廓显示在 2-6 mL 之间的小蛋白峰值和 8 mL 后的大峰值。EV 包含在列的前 5 mL 中（图 4B）。纳米粒子跟踪分析柱渗流的前5 mL含有一个小、±150 nm EV的单分散种群（图4C）。大小排除分数的传输电子显微镜显示，在2~6 mL的elue分数中，但不在后来的渗离体积中，有丰富的EV。EV 以类似杯子的形状而闻名，因此很容易从在负染色条件下制备时显示为双关光点的固体颗粒区分（图 4D）。
图4：从总分泌生物量中纯化C.elegans EV。（A） 绘制了大于 10 kDa 的总蛋白质与制备 10 种生物复制时孵育的蠕虫数量的比率。大多数制剂每1000只动物含有1微克蛋白质。（B） 蛋白质洗脱轮廓从10 mL树脂柱加载1 mL浓缩分泌。在进一步分析中合并的分数被化为组。（C） 合并树脂的纳米颗粒跟踪分析 2~6 mL。95% 置信区间为灰色。（D） 合并树脂洗脱分数的 TEM 分析。起始材料既有囊泡状颗粒，也有非囊泡颗粒。结合2~6 mL洗脱分数被浓缩为很少的非囊泡颗粒的囊泡。7~11 mL 的合并分数含有很少的囊泡状颗粒，但许多非囊泡颗粒。12~15 mL 洗脱分数仅包含非囊泡颗粒。所有显微图的放大倍率都显示。刻度条 = 200 nm。请点击此处查看此图形的较大版本。
为了直接比较C.elegans和人类EV之间的流动细胞测量特性，我们用这种方法从人类神经元细胞培养的调节介质中纯化了EV。流式细胞学基于光散射分离粒子。小角度光散射 （SALS） 大致与尺寸相关，长角光散射 （LALS） 与内部膜结构相关。来自细胞培养和C.elegans EV制剂的大多数样本事件都紧密地集中在以103个SALS和104 LALS为中心的集群中（图5A）。由SALS排序的C.elegans EV样本事件的直方图显示，所有制剂的峰值为+103（图5B）。
图5：Elegans EV 由其光散射特性明确定义。（A） 在C. elegans EV 的三个生物复制中 SALS 事件的直方图。*80%的总样本事件包含在一个紧密、明确定义的总体中。与纳米粒子跟踪分析类似，表明C.elegans EV的大小分布是单分散的。显示了用于稀释样本的S基底缓冲液的直方图进行比较。（B） 与本文所述方法比较了C.elegans的折射特性和人类细胞培养EV。两种 EV 类型始终具有可比的短角度和长角度光散射分布 （SALS 和 LALS）。请点击此处查看此图形的较大版本。
DI-8-ANEPPS 可有力地标记C. elegans EV，始终突出C. elegan 和细胞培养派生样本中的大部分总事件。校准珠和对照组如图 6 Figure 6A所示。从从20万只动物（#1）和从50万只动物制备的两种动物（图6B）制备的C.elegans样本中显示了各自的FACS散射图。还分析了来自100 mL（#1）或200 mL（#2，3）细胞培养的EV（图6C）。C. elegans和细胞培养衍生样本都显示出丰富的荧光事件，在0.05%Triton-X 100和光声波处理时消失。这表明标记的事件是洗涤剂阴脂磷脂结构（囊泡），而不是对洗涤剂不敏感的固体脂蛋白聚集物。EV 丰度计算为 DI-8-ANEPPS® 门中没有洗涤剂 （-） 的分数与洗涤剂 （+） 之间的事件数减去"仅染料"控制中的事件之间的差异。为清楚起见，图 6B和图 6C中单独显示的数据汇总为图6D和图 6E中的条形图。纯化EV的丰度在C.elegan和细胞培养衍生制剂之间没有显著差异（图6F）。
图 6：用于计算 EV 丰度的流式细胞测量数据示例。（A） 为了确保在样本之间可以直接比较事件数，仅缓冲区和仅缓冲区和染料控件需要以与 EV 样本分数相同的流速和收集时间运行。DI-8-ANEPPS 门中很少有事件。（B） DI-8-ANEPPS 和洗涤剂处理协议的代表性结果来自C. elegans。显示了三个生物复制。生物复制#1是从20万只动物中制备的，而#2和#3则从50万只动物中制备。所有情况下，使用洗涤剂处理的EV消失情况显而易见。（C） 使用人体细胞培养条件介质的DI-8-ANEPPS和洗涤剂处理协议的代表性结果。生物复制#1和#2是从200mL的有条件介质中制备的，而生物复制#3则从100 mL制备。（D） 从C. elegans EV 的三个生物复制中收集的数据的条形图。误差条 = S.E.M. 在治疗之间配对双尾 t 测试。= p 值 < 0.001。（E） 从细胞培养衍生的EV的三个生物复制中收集的数据的条形图。在治疗之间配对的双尾t测试。= p 值 < 0.001 （F） 每 μL 的染料标记洗涤剂敏感事件的数量计算为C. elegans和细胞培养的所有生物复制。两个 EV 样本源之间的值没有显著差异。在治疗 p 值 = 0.685 之间配对的双尾 t 测试。请点击此处查看此图形的较大版本。
表 1包含所分析的每个样品类型的完整 4.5 μL 的原始实验值。从50万只动物中纯化的EV分数收集的事件总数是缓冲区仅收集粒子的背景数的10-20倍，而从20万只动物中纯化的零度则包含大约2倍于缓冲量的事件。每个示例还显示 DI-8-ANEPPS® 门内的事件数。这些指标可以导入电子表格，以计算上述染料阳性、对洗涤剂敏感的 EV 的数量。例如，显示的第一个C. elegans生物复制中 1 mL 中的 EV 数将计算如下：
（18，974 = 3，853 - 1，487） x （10/4.5） x 1，000 = 30，297，778。
表 1：表式流细胞测量数据。图 6中显示的数据显示为电子表格。每个示例将显示总事件和 DI-8-ANEPPS® 门控事件。每个生物复制按协议#1+3的样品顺序排列。这些指标显示，从从50万只动物或200mL细胞培养条件培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养培养基的C.elegans样本中采集的事件总数比缓冲区仅收集粒子的背景数多10-20倍，而从20万只动物身上采集的生物复制，其总事件数量约为缓冲区的2倍。每个示例还显示 DI-8-ANEPPS® 门内的事件数。这些指标可以导出到电子表格中，以计算 EV 的总数。请点击此处查看此表（右键单击以下载）。
Discussion
EV 场的一个基本挑战是分离各种 EV 子类型2。这里描述的方法使用过滤、差分离心和大小排除色谱法来产生纯小EV，因为100纳米EV以前被证明分泌到外部环境中，并在生理相关的通信途径中发挥作用16。通过大小排除色谱法纯化的EV可能仍然是外泌体和小微囊的混合物，因为这些EV子类的大小相似。脊椎动物EV子类通常通过免疫沉淀分离，因为这种方法通过结合选择性膜蛋白标记物分离EV。所述方法有助于识别C.elegans EV膜标记蛋白。因此，将来有可能通过类似的免疫沉淀方法进一步分离小EV子类。理论上，免疫沉淀可以分离出EEv与喂养良好的蠕虫，因为大肠杆菌EV不应该与抗体相互作用。有兴趣识别较大EV亚类（>200 nm）的蛋白质和遗传货物的研究人员可以通过跳过0.22μm过滤步骤，然后分析颗粒而不是上清液来做到这一点。发现大型EV的蛋白质和遗传货物丰度，将建立一个更全面的理解生理过程，通过C.elegans分泌物发挥作用。除了被分泌到环境中外，C. elegans EV 在组织之间内部传输。因此，这些方法仅隔离总C. elegans EV 的子集。但是，由于没有将 EV 与被分离蠕虫分离的方法，因此无法发现内部 EV。这种外部分泌的EV子集的货物分析提供了一种识别能够标记内部EV的潜在通用EV蛋白标记的方法。
EV制备的规模将取决于实验的要求。共有 500，000 名年轻人提供了足够的 EV，用于同时进行流细胞测量、LC-MS-MS 和 RNAseq 分析。根据实验需求，可以放大或缩小此数字。扩展的最大实际因素是所需的 10 厘米高生长板的数量。高生长板制备的500μL20倍浓缩过夜NA22培养物将支持从L1幼虫阶段到成年第一天50，000名成年人。因此，要对50万成年人进行实验，需要13个高生长板：一个板产生L1的人口，两个板产生成人的漂白，10个板用于实验动物的生长。这些指标取决于高生长板的播种和细菌生长条件。因此，建议以标准化的方式制作所有板，然后用已知数量的动物进行校准。
蠕虫在种植过程中分为两个阶段：1）在盘上播种蠕虫之前，2）在产生条件介质之前。动物养殖密度已被证明会影响行为、发育和压力反应15、16、17、18，,17,18因此也可能影响电动汽车货物。15,因此，为了一致的培养密度，有必要准确估计蠕虫种群。在九滴中量化蠕虫的数量，可以统计人口估计的信心。必须单独处理每个滴，在每个滴之间涡旋，并将移液器插入相同的距离到蠕虫悬浮液中。采取这些预防措施将确保S.E.M.值占总人口的±5-10%。如果蠕虫种群的S.E.M.高于20%，那么事情就出了问题。
在24小时无细菌潜伏期后，年轻的野生C型Elegans在加入细菌草坪后立即爬行。这表明孵化不会严重影响他们的健康。然而，这一步确实影响动物的生理，因此可能会影响EV货物的组成。因此，当与病得很重的基因型或较老的动物一起工作时，在孵育步骤后必须检查生存能力。如果所有动物在孵育中不能存活，则增加实验种群规模并缩短孵育时间。当使用大量有条件介质时，使用具有再生硝基纤维素过滤器的搅拌细胞集中器更为实用。EV 与其他过滤器类型14的不如这种滤芯的化学特性紧密相连。
从条件介质中回收的总蛋白质与孵化用于制备的动物数量的比率是一个有用的指标。如果这个比例比预期高得多，那么有可能人口估计被关闭，或者动物在有条件的媒体上死亡和恶化。如果这个比例比预期低得多，那么在浓缩过程中，过滤器上可能丢失了一些蛋白质。虽然 FACS 方法将直接量化制备中的 EV，但此指标非常有用，因为它可以在流程的早期突出显示样本异常。另一种验证EV制备质量的有用方法是传输电子显微镜，如图4D所示。虽然由于长度的原因，传输电子显微镜的协议没有正式列入该方法，但可以通过标准方法进行。建议至少最初对FACS进行此类分析，作为评估电动汽车准备质量的免费方法。为获得最佳效果，请使用新鲜排出的形态-碳网格，用2%磷酸代替醋酸的醋酸对样品进行染色。
DI-8-ANEPPS之所以被选中，是因为它已被证明能定量地标记EV膜，优于其他一般EV染料，具有人类活检样本和脂质体25。测量速度很快，每个样品只需 3 分钟的收集时间。对洗涤剂敏感的EV的定量具有直接的功能意义，因为它利用了电动汽车和固体脂蛋白聚合物之间的基本物理区别。重要的是，这种方法不受总蛋白质量或非EV聚合体数量的影响，因此可以不偏不倚的方式量化通过不同纯化方法获得的EV。我们在这里描述的 FACS 验证的 EV 指标对于证明纯化 EV 的生理影响的研究特别有用。将 FACS 方法确立为通用指标，以便在整个研究中直接比较绝对 EV 丰度，也有利于 EV 领域。活力染料也可以标记C. elegans EV，但它们不像标有 Di-8-ANEPPS 的 EV 那样明亮。
这种纯化方法利用了在完整活虫尸体外的EV的主动分泌。这使得C.elegans EV能够从细胞培养的可比纯度和丰度下分离出来，这些规格足以通过LC-MS-MS和RNA分析26来识别数百种蛋白质和RNA货物。因此，可用于C.elegans研究的大型试剂库可用于研究遗传和生理扰动对EV货物成分的影响。
Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感激地感谢尼克·特佐普洛斯的蠕虫板和试剂;国家卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）的Caenorhabdis遗传学中心（CGC）用于N2线虫线;Lucia Vojtech 博士，协助纳米粒子跟踪分析;杰西卡·杨博士和玛丽·克莱尔，医学博士，博士，用于hiPSC衍生的神经元条件细胞培养基;伟鹏协助TEM成像。这项工作得到了NIH授予MkP30AG013280的支持，NIH向JCR授予AG054098。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
| 1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05% to lyse EVs |
| 10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
| 2 L bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
| 40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
| 5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
| 6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
| Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
| ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
| DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
| Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
| HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
| Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
| S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
| Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |
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