Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

Published: March 31, 2020 doi: 10.3791/60596
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Washington

Summary

Denne artikel præsenterer metoder til at generere, rense og kvantificere Caenorhabditis elegans ekstracellulære vesikler.

Abstract

Udskillelse af små membran-bundet vesikler i det ydre miljø er en grundlæggende fysiologisk proces af alle celler. Disse ekstracellulære vesikler (EL) fungerer uden for cellen for at regulere globale fysiologiske processer ved at overføre proteiner, nukleinsyrer, metabolitter og lipider mellem væv. Eldrevne køretøjer afspejler den fysiologiske tilstand af deres celler af oprindelse. Eldrevne køretøjer er involveret i at have grundlæggende roller i stort set alle aspekter af menneskers sundhed. Ev protein og genetiske laster bliver således i stigende grad analyseret for biomarkører for sundhed og sygdom. Ev-feltet mangler dog stadig et system med hvirvelløse hvirvelløse dyr, der gør det muligt at studere ev-lastsammensætningen. C. elegans er velegnet til EV forskning, fordi det aktivt udskiller elbiler uden for sit organ i sit ydre miljø, der tillader letlalet isolation. Denne artikel indeholder alle de nødvendige oplysninger til at generere, rense og kvantificere disse miljømæssigt udskilles C. elegans ELBILER, herunder hvordan man arbejder kvantitativt med meget store populationer af alderssynkroniserede orme, rensende elbiler, og en flow cytometri protokol, der direkte måler antallet af intakte elbiler i den rensede prøve. Således kan det store bibliotek af genetiske reagenser til rådighed for C. elegans forskning udnyttes til at undersøge virkningerne af genetiske veje og fysiologiske processer på EV last sammensætning.

Introduction

Udskillelse af membranbundne ekstracellulære vesikler (EL) letter de globale fysiologiske processer ved aktivt at transportere specifikt protein, nukleinsyre, metabolit og lipidlaster mellem cellerne1. Celler udskiller eldrevne køretøjer, der spænder over et kontinuum af størrelser fra 2 μm eller derover til så lille som 20 nm2. Små elbiler (<200 nm) studeres i stigende grad på grund af deres implikationer i patologiske processer, herunder stofskiftesygdomme, kræft, hjerte-kar-sygdomme og neurodegenerative sygdomme3,4,5. Disse patologier har også vist sig at påvirke protein og genetiske sammensætning af eldrevne køretøjer laster af små elbiler. Derfor afdækkes biomarkørsignaturer af patologien i stigende grad ved hjælp af ev-lastopdagelsesmetoder såsom LC-MS-MS og RNAseq6,7,8,9.

C. elegans har været en nyttig hvirvelløse model til at identificere evolutionært bevarede EV signalering veje. For eksempel, en C. elegans flippase blev først vist sig at fremkalde EV biogenese i C. elegans embryoner, og den menneskelige homolog viste sig at påvirke EV frigivelse i humane celler10,11. C. elegans EL'er blev rapporteret til at bære Pindsvin signaler er nødvendige for neglebånd udvikling. Leveringen af pindsvin og andre morfogener viste sig at spille en stor udviklingsrolle af elbiler, og det er bevaret i zebrafisk, mus og mennesker12,13,14,15. C. elegans er velegnet til EV biomarkør opdagelse, fordi det udskiller elbiler uden for sin krop, der fungerer i dyr-til-dyr kommunikation16,17 (Figur 1A). Den metode, der blev fastlagt ved en tidligere undersøgelse, kan imidlertid ikke anvendes, fordi nematodernes E. coli-fødekilde også udskiller elbiler18. I denne metode består størstedelen af prøven af E. coli-kontaminering, hvilket begrænser styrken af proteomiske eller RNAseq-tilgange til opdagelse af C. elegans EV-laster. De metoder, der er beskrevet her, blev udviklet til at give meget rene C. elegans ELBILER på tæthedsniveauer, der er karakteristiske for typiske cellekultureksperimenter, og dermed lette omkyndelighedsmetoder ne til ev-biomarkøropdagelse.

Store populationer af orme er nødvendige for at generere et tilstrækkeligt antal eldrevne køretøjer til lastanalyse. Derfor er metoder til gennemførelse af kvantitativ dyrkning af store populationer af udviklingssynkroniserede C. elegans også inkluderet. Typisk, når et stort antal orme er nødvendige for eksperimenter, er de dyrkes i flydende medier. Mens dette er effektivt til at generere store populationer af orme, er dyrenes fysiologi betydeligt forskellig fra orme, der dyrkes under standardbetingelser på nematodevækstmedium (NGM) agarplader. Dyr dyrket i flydende vokse langsommere, er tyndere, viser udviklingsmæssige heterogenitet, og udsættes for en høj grad af batch variation. Derfor præsenterer vi et simpelt, men effektivt middel til kvantitativ dyrkning af store populationer af udviklingssynkroniserede C. elegans ved hjælp af 10 cm høj vækstplader. Mediernesammensætning af høj vækst plader omfatter mere peptone end almindelige NGM plader og er seedet med E. coli stamme NA22, som vokser mere robust end OP50.

Fremskridt inden for flowcytometriteknologi (FACS) har gjort det muligt at foretage en direkte analyse af de enkelte eldrevne køretøjer20,21, hvilket gør det muligt at kvantificere eldrevne køretøjer uden de iboende begrænsninger i andre metoder. Tidligere arbejde har vist, at protein ikke er en nyttig proxy for EV overflod, fordi forskellige rensningsmetoder resulterei betydeligt forskellige EV-til-protein nøgletal22. Ekstremt rene EV fraktioner indeholder relativt lidt protein, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere prøver med BCA eller Coomassie geler. Vestlig analyse kan identificere relative forskelle mellem de enkelte proteiner, men kan ikke identificere, hvor mange elbiler der er i prøven. Robust kvantificering af ev-nummer ved nanopartikelsporingsanalyse hæmmes af dets snævre signal-til-støj-område, manglende evne til at skelne mellem eldrevne køretøjer og faste aggregater og den manglende overførsel af metoder mellem instrumenter med forskellige specifikationer23. Derfor indeholder denne artikel også en generaliserbar flowcytometrisk procedure til diskriminering og kvantificering af eldrevne køretøjer.

Protocol

1. Forberedelse

  1. Der tilsættes 2 g gelatine til 100 ml dH2O og opvarmes i mikrobølgeovnen, indtil den begynder at koge. Rør derefter rundt og lad det køle af i 20 min.
  2. Opløsningen hældes gennem et filter på 0,22 μm og hældes i sterile rør. Brug pipettespidserne med gelatine umiddelbart før brug ved at pipettere og udstøde gelatineopløsningen. Behandlede tips kan enten bruges med det samme eller opbevares.
  3. Skær membranen ud fra et sterilt hættefilter.
  4. Våd en 20 cm kvadrat på 5 μm nylon mesh stof og sted omkring toppen af en steril hætte filter. Fastgør den med flere tykke elastikker.
    FORSIGTIG: Undersøg stoffet omhyggeligt for at sikre, at der ikke er folder. Disse gør luft huller, der hindrer suge.

2. Beregning af store populationer af orme (Figur 1A)

  1. Vortex og pipette 10 μL af ormen suspension på en orm dyrkning plade låg eller et glas dias. Gentag denne proces 3x. Der registreres antallet af dyr i hver dråbe.
  2. Ormesuspensionen justeres til to dyr pr. μL.
  3. Vortex suspensionen og pipette ni dråber (10 μL) på et dias eller en plade låg. Tæl antallet af dyr manuelt. Der registreres antallet af dyr i hver dråbe.
  4. Middel- og standardfejl for middelværdien (S.E.M.) beregnes som en procentdel af hver ormpopulation.
  5. Det samlede antal dyr i hver population beregnes ved at dividere middelværdien med 10 μL og derefter gange med det samlede volumen af ormesuspensionen i μL.

Figure 1
Figur 1: Procedureoversigter til generering, kvantificering og rensning af F-udskede køretøjer fra C. eleganer. AA) Skema til optælling af store populationer af dyr. (B) Skema til generering af orme til høst af elbiler. (C) Skematiske for rensning af elbiler fra C. elegans supernatent. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Dyrkning Af C. elegans til EV Rensning

  1. Generer en stor population af udviklingssynkroniserede C. elegans. Det kan du gøre ved at følge nedenstående trin.
    1. Tilføj et enkelt dyr på en 6 cm normal vækst medieplade. Inkuber i to generationer og vask derefter dyrene på to højvækstmediumplader.
    2. Inkuber indtil ormene har opbrugt maden.
    3. Filter L1 orme med 5 μm nylonmaske fremstillet i trin 1.4. Anbring skruehætten på den sterile flaske, start vakuumet, og hæld orme over filteret. Før den samme mængde af mediet over ormen aggregater på filteret.
    4. Kvantificer ormene, og beregn det samlede antal (se trin 2). Nyligt udsultede (<24 h) orme dyrket på en høj vækst plade resultere i omkring 80.000 L1 larver.
    5. Der centrifugeres L1-larver ved 2.000 x g i 3 min. Resuspender til ~100.000 dyr pr. ml.
    6. Placer ~ 50.000 dyr pr høj vækst plade. Dyr, der dyrkes ved 20 °C, indtil de er voksne (ca. 72 timer).
    7. Blege de gravide voksne ved standardmidler og lad embryonerne klækkes i 10 ml S Basal opløsning med 2,5 μg/ml kolesterol.
    8. Kvantificer L1-larverne (se trin 2), og tilsættes derefter 50.000 orme til hver højvækstplade.
    9. Der dyrkes plader ved 20 °C, indtil dyrene er unge voksne.
  2. Forbered C. elegans til sekretommer generation.
    1. Orme vaskes af pladerne ved at tilsætte 15 ml steril M9 med 50 μg/ml carbenicillin til hver højvækstplade. Lad de mættede plader sidde i 5 min. Løsgør orme ved at cirkle bufferen rundt om pladen. Undgå at slosehing. Hæld bufferen fra hver plade i et separat 50 ml konisk rør. Vasktrinlet 2x mere gentages for i alt 45 ml buffer pr. plade.
    2. Lad ormene nøjes med 15 min. Dekanter supernatanten og tilsæt 50 ml frisk M9 buffer til røret. Gentag i alt 4x.
    3. Flyd ormene på toppen af en 30% saccharose trin-gradient og gendan dyrene i S Basal opløsning24.
      1. Resuspender kortvarigt ormene i 15 ml iskold 100 mM NaCl, tilsæt 15 ml iskold 60% saccharose og inverterer til mix. Med en glaspipette lag5 ml iskold 100 mM NaCl på toppen af saccharoseblandingen.
      2. Centrifugeres ved 1.500 x g i 5 min. Orme vil blive koncentreret ved grænsefladen mellem NaCl og saccharosen.
      3. Forsigtigt pipette ud dyrene fra grænsefladen i en ny 50 ml konisk rør. Tilføj S Basal opløsning til 50 ml. Tillad orme at bosætte 5 min.
      4. Supernatanten dekanterer og tilsæt frisk 50 ml S Basal-opløsning. Gentag dette mindst 3x.
    4. Kvantificer antallet af orme som beskrevet i trin 2.
    5. Resuspender ormene til en massefylde af et dyr pr. μL med steril S Basalopløsning indeholdende 2,5 μg/ml kolesterol og 50 μM karbenicillin.
    6. For at forberede prøven til sekretolær generering, tilsættes op til 400 ml af suspensionen til en steril 2 L bundforvirret kolbe.
    7. Kolber anbringes på den cirkulære rotator i en 20 °C-inkubator ved 100 omdrejninger i 24 timer.

4. Rensning af ev

  1. Høst og fraktionering
    1. 2L kolbe af orme fjernes fra rugemaskinen, og dyrene pelleteres i koniske hætteglas på 50 ml (500 x g i 2 min).
    2. Supernatanten hældes gennem et vakuumfilter på 0,22 μm for at fjerne eventuelt partikelaffald.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan det filtrerede supernatant, der indeholder sekredet og vesiklerne, opbevares ved -80 °C.
    3. Tæl antallet af dyr som beskrevet i trin 2.
    4. Bestemme levedygtigheden af orme ved at placere en dråbe suspenderet orme på en bakteriel græsplæne. Vent i 15 minutter og derefter score dyr som bevæger sig, lammet, eller død.
    5. 0,22 μm filtreret supernatant koncentreres til 700 μL ved hjælp af regenererede nitrocellulose 10 kDa-filterenheder. Der tilsættes 150 μL S Basalopløsning, og derefter pipettes over filteret og vortex. Gentag 2x.
    6. Det koncentrerede supernatant centrifugeres ved 18.000 x g i 20 minutter ved 4 °C, og supernatanten overføres til et nyt rør. Dette trin fjerner eventuelt snavs eller større partikler, der kan have akkumuleret under håndteringen.
    7. Tilsæt protease hæmmer cocktail + EDTA pr producentens anvisninger.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan det koncentrerede supernatant, der indeholder sekredet og vesiklerne, opbevares ved -80 °C.
  2. Størrelseudelukkelseskromatografi
    1. Hæld 80-200 μm agarose harpiks (pore størrelse fraktionering interval på 70.000 til 40.000.000 kDa for kugleformede proteiner) i en tom tyngdekraft flow kolonne patron. Flow S Basalopløsning, indtil harpikssengen er pakket med et endeligt volumen på 10 ml.
      BEMÆRK: Hvis der hældes for meget harpiks i søjlepatronen, skal du sprede toppen af kolonnen og fjerne det overskydende med en pipette.
    2. 40 ml sterilfiltreret S Basal opløsning gennem kolonnen og lad den flyde under tyngdekraften.
      FORSIGTIG: Kontroller, at harpiksen ikke forstyrres.
    3. Lad bufferflowet flyde, indtil toppen af harpiksen ikke er nedsænket, og dæk derefter bunden af søjlepatronen. Anbring et opsamlingsrør under kolonnen.
    4. Tag hætten på patronen. Tilsæt det koncentrerede sekreom opnået i trin 2.1 dropwise til toppen af søjlesengen. Pipette 1 ml S Basal opløsning dropwise. Anbring et nyt opsamlingsrør under kolonnen.
    5. Fyld langsomt beholderen med 5 ml S Basal for ikke at forstyrre harpiksen. Saml de første 2 ml eluat eluat derefter hurtigt skifte rør og indsamle de næste 4 ml. Dette er den fraktion, der er beriget for elbiler.
    6. Eluatet koncentreres til 300 μL med et regenereret nitrocellulose 10 kDa-filter afskåret (MWCO) og overførselsretenetat til et mikrocentrifugerør med lav binding.
    7. Filtermembranen 2x med 100 μL S Basal opløsning vaskes ved at vortexing i 20 s og pipettere bufferen hen over filteret. Der til den første prøve til et endeligt volumen på 500 μL.
    8. Tilføj protease hæmmer cocktail pr producentens anvisninger.
    9. Udfør straks downstream-forsøgene (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS osv.) eller opbevares ved -80 °C.

5. Flow Cytometri kvantificering af EV Abundance

  1. Tilberedning af farvestof
    1. Forbered et 10 mM lager af DI-8-ANEPPS ved hjælp af frisk DMSO. Fordeles i 10 μL aliquots og opbevares ved -20 °C.
    2. Der fremstilles en arbejdsløsning på 1 mM ved at tilsætte 90 μL sterilt filtreret PBS til et rør med 10 μL farvestof.
  2. Forberedelse af forsøgsprøver
    1. Der tilsættes 840 μL S Basalopløsning i et mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes 60 μL af de rensede elbiler genereret i punkt 4.2 og vortex.
    2. Aliquot 300 μL af prøven i to nye mikrocentrifugerør. Der er nu et eksperimentelt sæt af tre rør, der indeholder 300 μL fortyndede elbiler hver. Mærk rørene #1-3. Til prøver #2 og #3 tilsættes 7 μL af DI-8-ANEPPS-bestanden, der er fremstillet i 5.1.2. Derefter tilsættes 7 μL af 1% Triton-X 100 til rør #3. Bland hvert rør ved vortexing.
    3. Sonikere prøve #3 ved at placere sonikere spidsen i midten af prøven og pulserende 10 gange ved 20% magt 30% arbejdscyklus.
      FORSIGTIG: Sørg for, at spidsen af sonikeringssonden er midt i prøven, så skumdannelsen holdes på et minimum. Skum kan kompromittere prøven ved at få elbilerne til at samle sig.
    4. 300 μL S Basal opløsning tilsættes til to mikrocentrifugerør. Der tilsættes 7 μL af det Arbejdsreagens DI-8-ANNEPS, der er fremstillet i trin 5.1, til det andet rør og etiketten "Kun farvestof". Mærk det andet rør "Kun buffer".
      BEMÆRK: Seprøverne kun farvestof og buffer kun og forsøgsprøver med samme S Basal-kilde.
    5. Prøverne inkuberes væk fra det direkte lys og ved stuetemperatur i 1 time.
  3. Udfør FACS eksperimenter.
    1. FACS excitationsfilteret indstilles til 488 nm (blåt) og emissionsfilteret til 605 nm (orange). Strømningshastigheden indstilles til 1,5 μL pr. min.
    2. Kør nanoperle FACS kalibreringmix (valgfrit, men anbefales).
    3. Hver prøve køres på en FACS-maskine i 3 min. (180 s). Bemærk de nøjagtige køretider i sekunder.
  4. Analysér FACS-dataene.
    1. Åbn filerne med FACS-analysesoftware.
    2. Skift Y-aksen til 488-Org (Område) ved at klikke på aksen, vælge i rullemenuen.
    3. Indstil en rektangulær port, der starter øverst på observationsområdet, og spænder fra SALS-niveau 102 til 104 (<300 nm mellemstore partikler). Udvid porten nedad, indtil den indeholder 2,5% af de samlede hændelser. Navngiv porten til "DI-8-ANEPPS+".
  5. Kvantificering af ev-forekomst af prøve
    1. Kopier denne port og indsæt den på de to andre prøver i dit eksperimentelle sæt samt bufferen kun og Dye Only kontrollerer. Eksporter analysen til et regneark.
    2. Hvis FACS-prøverne ikke blev kørt i de anbefalede 3 min (180 s), normaliseres alle hændelsestællinger i prøven til hændelser pr. 180 s. Hvis en prøve for eksempel blev kørt i 250 s, skaleres Hændelsesnummeret DI-8-ANEPPS+ med 250 s/180 s.
    3. Fjern farvestofbaggrundshændelserne ved at trække antallet af DI-8-ANEPPS+-hændelser i kontrolkontrolelementet Dye Only fra hændelserne i stikprøven #2.
    4. Fjern isotype-baggrundshændelser ved at trække antallet af DI-8-ANEPPS+-hændelser i eksempel#1.
    5. Fjern hændelser, der ikke er følsomme over for vaskemiddel, ved at trække antallet af DI-8-ANEPPS+-hændelser i prøve#3. Denne værdi er antallet af ægte elbiler.
    6. Antallet af elbiler i 1 μL prøve beregnes ved at dividere den værdi, der er beregnet i trin 5.5.5, med den mængde, der analyseres i μL (4,5 μL analyseret som beskrevet i trin 5.3), og multiplicere med fortyndingsfaktoren (10x som beskrevet i trin 2.5). Multiplicer denne værdi med det antal μL, der er tilbage i EV-præparatet. Dette er antallet af eldrevne køretøjer, der er til rådighed for downstream-analyser.

Figure 2
Figur 2: Skematisk for præparatet til flowcytometriprøve til kvantificering af ev-tæthed. AA) Ev-præparatet er opdelt i tre identiske prøver. Eksempel # 1 er No Dye negativ kontrol. DI-8-ANEPPS tilsættes derefter til prøver #2 og #3. Triton-X 100 tilsættes derefter til en prøve #3. Den grønne pil angiver, at kun prøve #3 efterfølgende sonikeres. Dataene fra flowet er med til at bestemme det absolutte antal vaske- og rengøringsmidlers følsomme elbiler i FACS-prøverne og beregner derefter mængden af elbiler i det samlede præparat. Porten til bestemmelse af farvestofpositive hændelser er indstillet med prøve #1, som ikke indeholder farvestof. Den røde skrift på regnearksdataene er at illustrere, at farvestoffer-positive hændelser fra den vaskemiddelbehandlede prøve trækkes fra prøven med farvestof. (B) Ligninger til kvantificering af eldrevne køretøjer i en FACS-analyseret stikprøve og beregning af det samlede antal eldrevne køretøjer i stikprøven. Klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

Figur 1viser en skematisk for de processer , der er nødvendige for at generere og rense eldrevne køretøjer . De typiske tidspunkter, der kræves for at fuldføre hvert trin, vises nedenunder. Figur 2 viser en skematisk til fremstilling af prøver til FACS-analyse ved hjælp af DI-8-ANEPPS (figur 2A) samt de beregninger, der er nødvendige for at anslå det samlede antal eldrevne køretøjer i en prøve (figur 2B).

Repræsentative resultater fra 10 biologiske replikater er vist i figur 3A. Variabiliteten mellem replikater er ikke signifikant, og den typiske S.E.M. af befolkningens størrelse er lidt over 10% (Figur 3B). Filtrering af orme og dyrke på den friske høj vækst plader vil generere en stor befolkning af gravide voksne egnet til blegemiddel synkronisering. En enkelt udsultet plade forarbejdet på denne måde kan producere en eksperimentel befolkning på 1 x 106 eller mere synkroniseret afkom, fordi hver gravid voksen vil indeholde omkring 10 æg. Det er muligt at opretholde store populationer af udviklingssynkroniserede populationer ved at filtrere æg og larver gennem et filter på 40 μm for at få el-køretøjer fra ældre dyr. Tilbageholdte voksne overføres til friske højvækstplader med en massefylde på 20.000 dyr pr. plade. Denne proces blev gentaget hver 2. Figur 3C viser tre biologiske replikater af ormpopulationer, der flyttes på tværs af tre pladeoverførsler. Overførsel af dyr mellem plader ne medfører et tab på ca. 10 % dyr (figur 3C), mens ca. 20 % af dyrene går tabt i saccharoseflotationstrinnet (figur 3D).

Figure 3
Figur 3: Kvantificering af store populationer af C. elegans til EV-analyse. (A) En sammenligning af antallet af L1 larve trin orme isoleret fra en enkelt nyligt udsultet (<24 h) høj vækst plade. Værdierne for hver af 10 biologiske replikater afbildes. Opsummeringen af alle datapunkter i de 10 replikater præsenteres også som et violinplot og en bar med S.E.M. Dette viser, at en enkelt plade af nyligt udsultede orme vil give ~ 80.000 L1 larve fase orme. (B) S.E.M. af de 15 forskellige pladepopulationsmålinger i panel A afbildet som individuelle punkter. Generelt er S.E.M. lidt større end 10%. (C) Trebiologiske replikater af ormepopulationer blev anslået efter hver af to overførsler mellem pladerne hver 4. Denne overførsel af dyr mellem pladerne resulterede ikke i et betydeligt fald i populationens størrelse. Dette tyder på, at den metode, der præsenteres her for bevægelige orme, ikke medfører et betydeligt tab af dyr. (D) Populationsmålinger foretaget i løbet af tre EV-forsøgsreplikater: Antallet af dyr, der blev anslået for de oprindelige L1-larver, der startede forsøget, antallet af unge voksne dyr, der er genvundet fra saccharoseflyderen og klar til inkubationstiden på 24 timer, antallet af dyr, der blev regnet fra ev-præparatet ved genvinding af sekretogen. Der er et lille, men ikke signifikant fald i populationsstørrelsen mellem det oprindelige populationsskøn på L1-larvestadiet og senere, når dyrene er unge voksne. Den gennemsnitlige L1-populationsmåling blev udpeget som 100 %, og alle andre målinger blev skaleret ud fra deres forhold til denne værdi. Fejllinjer S.E.M. * = p-værdi < 0,05, N.S. = ikke signifikant i en parametrisk parret t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Forholdet mellem protein og dyr er en nyttig metrikværdi til at karakterisere et EV-præparat. Denne måling kan være et hurtigt middel til at bestemme sammenhængen mellem ev-præparater. I gennemsnit vil 1.000 vilde unge voksne dyr udskille 1 μg proteiner større end 10 kDa i deres omgivelser (figur 4A). Når denne fraktion yderligere adskilles af størrelsesudelukkelseskromatografien, viser den samlede proteineluningsprofil en lille proteintop på mellem 2-6 ml og en stor top efter 8 ml. Eldrevne køretøjer er indeholdt i de første 5 ml i kolonneneeluat (figur 4B). Nanopartikelsporingsanalyse de første 5 ml af kolonnens eluat indeholder en monospredning population af små, ~150 nm ELBILER (Figur 4C). Transmission elektron mikroskopi af størrelse udelukkelse fraktioner afslører rigelige elbiler i 2-6 ml fraktion af eluate, men ikke i de senere eluatmængder. Eldrevne køretøjer er kendt for deres kop-lignende form og er derfor nemme at diskriminere fra faste partikler, der vises som punktformig lyse prikker, når de er forberedt under de negative farvningsforhold (Figur 4D).

Figure 4
Figur 4: Rensning af C. elegans-eldrevne køretøjer fra total udskilt biomasse. (A) Forholdet mellem de samlede proteiner på over 10 kDa og antallet af orme inkuberet i præparatet til 10 biologiske replikater blev afbildet. De fleste præparater indeholdt 1 μg protein pr. 1.000 dyr. (B) Proteinelueringsprofil fra en 10 ml harpikssøjle fyldt med 1 ml af det koncentrerede sekretom. De brøker, der er konsolideret i yderligere analyser, er nedtonet i grupper. (C) Nanopartikel sporingsanalyse af den konsoliderede harpiks eluted fraktioner 2-6 ml. Konfidensintervallet på 95 % er nedtonet gråt. (D) TEM-analyse af de konsoliderede harpikselierede fraktioner. Udgangsmaterialet havde både vesikellignende partikler og ikke-vesikelpartikler. Den konsoliderede 2-6 ml elueringfraktion blev beriget for vesikler med få ikke-vesikelpartikler. De 7-11 ml konsoliderede fraktioner indeholdt få vesikellignende partikler, men mange ikke-vesikelpartikler. De 12-15 ml elueringfraktioner indeholdt kun ikke-vesikelpartikler. Alle mikrografer vises ved samme forstørrelse. Skalabar = 200 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

For direkte at sammenligne flow cytometri egenskaber mellem C. elegans og humane elbiler, vi renset elbiler fra de betingede medier af cellekulturer af menneskelige neuroner med denne metode. Flow cytometri adskiller partikler baseret på lys spredning. Den lille vinkel lys spredning (SALS) nogenlunde korrelerer med størrelsen, og den lange vinkel lys spredning (LALS) korrelerer med indre membran struktur. Størstedelen af de samlede prøvehændelser fra både cellekultur og C. elegans EV-præparater er tæt fokuseret i en klynge centreret omkring 103 SALS og 104 LALS (Figur 5A). Et histoggram af C. elegans EV-prøvehændelser sorteret efter SALS viser, at alle præparater topper ved ~103 (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: C. elegans-eldrevne køretøjer er klart defineret ved deres lysspredningsegenskaber. (A) Histogram af SALS-hændelser i tre biologiske replikater af C. elegans-eldrevne køretøjer. ~80 % af de samlede prøvehændelser er indeholdt i en tæt, klart defineret population. I lighed med nanopartikel sporing analyse, det viser, at størrelsen fordelingen af C. elegans ELBILER er monodisperse. Histogrammet på S Basal bufferen, der anvendes til at fortynde prøverne, vises til sammenligning. (B) Sammenligning af brydningsegenskaber af C. elegans og humane cellekultur EVs renset med de metoder, der er beskrevet i denne tekst. Begge EV-typer præsenterer konsekvent sammenlignelige lysspredningsfordelinger med kort og lang vinkel (SALS og LALS). Klik her for at se en større version af dette tal.

DI-8-ANEPPS mærker c. elegans-elbiler og fremhæver konsekvent størstedelen af de samlede hændelser i både C. elegans og cellekulturudledte prøver. Kalibreringsperlerne og -kontrollerne er angivet i figur 6A. De enkelte FACS-spredningsområder er vist fra en C. elegans-prøve fremstillet af 200 000 dyr (#1) og to tilberedt e.m.(figur 6B). Eldrevne køretøjer fra enten 100 ml (#1) eller 200 ml (#2,3) af cellekultur blev også analyseret (Figur 6C). Både C. elegans og cellekultur afledte prøver viste rigelige fluorescerende hændelser, der forsvandt, når de behandles med 0,05% Triton-X 100 og lys sonikering. Dette viser, at de mærkede begivenheder er vaskemiddel labile fosfolipid strukturer (vesikler) snarere end vaskemiddel-ufølsomme fast lipoprotein aggregater. EV-tætheden beregnes som forskellen mellem antallet af hændelser i DI-8-ANEPPS+-porten mellem fraktionerne uden vaskemiddel (-) og med vaskemiddel (+) minus hændelserne i kontrolelementet Dye Only. Af hensyn til klarheden er de data, der præsenteres individuelt i figur 6B og figur 6C, sammenfattet som søjlediagrammer i figur 6D og figur 6E. De rensede eldrevne køretøjers tæthed var ikke signifikant forskellig mellem C. elegans og de cellekulturafledte præparater (figur 6F).

Figure 6
Figur 6: Eksempler på flowcytometridata, der bruges til at beregne EV-tæthed. (A) For at sikre, at antallet af hændelser kan sammenlignes direkte mellem prøver, skal bufferonly-kontrollerne og buffer- og farvestofkontrollerne køres med samme strømningshastighed og indsamlingstid som ev-stikprøvefraktionerne. Der er meget få begivenheder i DI-8-ANEPPS gate. bB) Repræsentative resultater af DI-8-ANEPPS- og vaskemiddelbehandlingsprotokollen fra C. elegans. Tre biologiske replikater vises. Biologisk replikat #1 blev fremstillet af 200.000 dyr, mens #2 og #3 blev fremstillet af 500.000 dyr. Det er i alle tilfælde klart, at eldrevne køretøjer forsvinder med behandling af vaske- og rengøringsmidler. (C) Repræsentative resultater af DI-8-ANEPPS og vaskemiddelbehandling protokol ved hjælp af humane cellekultur konditionerede medier. Biologiske replikater #1 og #2 blev fremstillet af 200 ml konditionerede medier, mens biologisk replikat #3 blev fremstillet af 100 ml. (D)Søjlegraf over de data, der er indsamlet fra de tre biologiske replikater af C. elegans-eldrevne køretøjer. Fejllinjer = S.E.M. Parret to-tailed t-test mellem behandlinger. = p-værdi < 0,001. (E) Søjlegraf over de data, der er indsamlet fra de tre biologiske replikater af cellekulturafledte eldrevne køretøjer. Parret to-tailed t-test mellem behandlinger. = p-værdi < 0,001 (F) Antallet af farvestofmærkede vaskemiddelfølsomme hændelser pr. μL blev beregnet for alle de biologiske replikater af C. elegans og cellekultur. Værdierne mellem de to ev-prøvekilder er ikke væsentligt forskellige. Parret to-tailed t-test mellem behandlinger p værdi = 0,685. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1 indeholder de rå forsøgsværdier for hele 4,5 μL for hver analyserede prøvetype. Det samlede antal hændelser indsamlet fra EV fraktioner renset fra 500.000 dyr var 10-20x over baggrundsantallet af partikler indsamlet af buffer alene, mens fraktionen renset fra 200.000 dyr indeholdt omkring 2x så mange begivenheder som buffer alene. Antallet af hændelser inden for DI-8-ANEPPS+-porten vises også for hver prøve. Disse målinger kan importeres til et regneark for at beregne antallet af farvestofpositive, vaskemiddelfølsomme elbiler som beskrevet ovenfor. F.eks. beregnes antallet af eldrevne køretøjer i 1 ml af de første viste C. elegans biologiske replikater på denne måde:

(18.974 – 3.853 - 1.487) x (10/4,5) x 1.000 = 30.297.778.

Tabel 1: Tabel 1. Dataene i figur 6 præsenteres som et regneark. For hver prøve vises de samlede hændelser og DI-8-ANEPPS+ gated events. Hver biologisk replikat er arrangeret i den rækkefølge, prøver #1-3 i protokollen. Disse målinger viser, at det samlede antal hændelser indsamlet fra C. elegans prøver fremstillet af 500.000 dyr eller 200 ml cellekultur konditionerede medier var 10-20x over baggrundsantallet af partikler indsamlet af buffer alene, mens den biologiske replikere renset fra 200.000 dyr indeholdt omkring 2x så mange samlede hændelser som buffer alene. Antallet af hændelser inden for DI-8-ANEPPS+-porten vises også for hver prøve. Disse målinger kan eksporteres til et regneark for at beregne det samlede antal elbiler. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Discussion

En grundlæggende udfordring for ev-området er at adskille de mange forskellige ev-undertyper2. De metoder, der er beskrevet her, bruger filtrering, differentialcentrifugering og størrelsesudelukkelseskromatografi til at generere en ren population af små elbiler, fordi ~100 nm-elbiler tidligere blev vist sig at være udskilles i det ydre miljø og fungerer i fysiologisk relevante kommunikationsveje16. Eldrevne køretøjer renset gennem størrelsesudelukkelsekromatografi kan stadig være en blanding af exosomer og små mikrovesikler, fordi disse EV-underklasser er af samme størrelse. Hvirveldyr EV underklasser er almindeligt adskilt af immunudfældning, fordi denne metode isolerer ELBILER gennem binding til selektive membran protein markører. De beskrevne metoder letter identifikationen af C. elegans EV membran markør proteiner. Derfor kan det i fremtiden være muligt at adskille små EV-underklasser yderligere ved hjælp af analoge immunudfældningsmetoder. I teorien kan immunudfældning isolere elbiler fra velnærede orme, fordi E. coli EVs ikke bør interagere med antistoffet. Forskere interesseret i at identificere protein og genetiske laster af større EV underklasser (> 200 nm) kan gøre det ved at springe 0,22 μm filtrering trin og derefter analysere pellet snarere end supernatant. Afdækning af protein og genetiske last overflod af store elbiler vil etablere en mere omfattende forståelse af de fysiologiske processer, der fungerer gennem C. elegans sekretil. Ud over at blive udskilt i miljøet overføres C. elegans-elbiler internt mellem væv. Derfor isolerer disse metoder kun en delmængde af c. elegans-eldrevne køretøjer. Det er dog ikke muligt at finde interne elbiler, fordi der ikke findes nogen metode til at adskille elbiler fra lysed orme. Cargo analyse af denne eksternt udskilles EV delmængde giver et middel til at identificere potentielle generelle EV protein markører i stand til mærkning interne elbiler så godt.

Omfanget af ev-forberedelsen vil afhænge af eksperimentets krav. I alt 500.000 unge voksne giver nok eldrevne køretøjer til at udføre flowcytometri, LC-MS-MS og RNAseq-analyse parallelt. Dette tal kan skaleres op eller ned afhængigt af forsøgsbehovene. Den største praktiske faktor til opskalering er antallet af nødvendige 10 cm høje vækstplader. Høj vækst plader tilberedt med 500 μL af 20x koncentreret natten NA22 kultur vil støtte en befolkning på ~ 50.000 voksne fra L1 larve fase indtil den første dag i voksenalderen. Derfor, at gennemføre et eksperiment med 500.000 voksne, 13 høj vækst plader er nødvendige: en plade til at generere befolkningen af L1s, to plader til at generere de voksne til blegning, og 10 plader til vækst af forsøgsdyr. Disse målinger er betinget af såning og bakteriel vækst betingelser for den høje vækst plader. Det anbefales derfor at lave alle plader på en standardiseret måde og derefter kalibrere med kendte mængder dyr.

Orme tælles i to faser under dyrkningsprocessen: 1) før såning orme på plader og 2) før generering af konditionerede medier. Dyredyrkningstæthed har vist sig at påvirke adfærd, udvikling og stress respons15,16,17,18 og kan derfor også påvirke EV laster. Derfor, for konsekvent dyrkning tæthed er det nødvendigt præcist at vurdere orm populationer. Kvantificering af antallet af orme i ni dråber giver statistisk tillid til befolkningsestimater. Det er vigtigt at behandle hver dråbe individuelt, vortexing mellem hver dråbe og indsætte pipette samme afstand i ormen suspension. At tage disse forholdsregler vil sikre S.E.M. værdier på ~ 5-10% af den samlede befolkning. Hvis S.E.M. for en orm befolkning er højere end 20%, så noget gik galt.

Efter den 24 h bakteriefri inkubationsperiode kravler unge, vilde type C. elegans straks efter udløbet til en bakterieplæne. Dette indikerer, at inkubationen ikke alvorligt påvirker deres helbred. Dette trin påvirker imidlertid dyrenes fysiologi og kan derfor påvirke sammensætningen af EV-lasterne. Når der arbejdes med meget syge genotyper eller ældre dyr, er det derfor vigtigt at kontrollere levedygtigheden efter inkubationstrinnet. Hvis alle dyr ikke overlever inkubationen, derefter øge den eksperimentelle befolkningstørrelse og mindske tidspunktet for inkubation. Når du arbejder med store mængder af konditionerede medier, er det mere praktisk at bruge en omrørt celle koncentrator med et filter lavet af regenereret nitrocellulose. Eldrevne køretøjer binder sig ikke så kraftigt til denne filterkemi som andre filtertyper14.

Forholdet mellem det samlede protein, der genvindes fra de konditionerede medier, og antallet af dyr, der er inkuberet for at fremstille præparatet, er en nyttig metrikværdi. Hvis dette forhold er meget højere end forventet, er det muligt, at befolkningsestimaterne var slukket, eller at dyrene døde og forværredes i de konditionerede medier. Hvis dette forhold er meget lavere end forventet, så nogle protein kan være gået tabt på filtrene under koncentrationsprocessen. Selv om FACS-metoderne direkte vil kvantificere eldrevne køretøjer i forberedelsen, er denne måling nyttig, fordi den kan fremhæve stikprøveanomalier tidligt i processen. En anden nyttig metode til kontrol af kvaliteten af EV-præparatet er transmissionelektronmikroskopi, som vist i figur 4D. Selv om protokollen for transmission elektron mikroskopi ikke formelt er inkluderet i denne metode artikel på grund af længde, kan det udføres ved hjælp af standardmetoder. Det anbefales at foretage denne type analyse, i det mindste i første omgang, som en supplerende metode til FACS til vurdering af kvaliteten af ev-præparater. For de bedste resultater bruge frisk udledes formvar-carbon gitre og plette prøverne med 2% fosfotungsticsyre i stedet for uranyl acetat.

DI-8-ANEPPS blev valgt, fordi det har vist sig at kvantitativt mærke EV membraner, udkonkurrerer andre generelle EV farvestoffer med humane biopsi prøver og liposomer25. Målingerne er hurtige og tager kun 3 minutters indsamlingstid for hver prøve. Kvantificeringen af vaskemiddelfølsomme eldrevne køretøjer har direkte funktionel betydning, fordi det udnytter en grundlæggende fysisk sondring mellem eldrevne køretøjer og faste lipoproteinaggregater. Det er vigtigt, at denne metode ikke påvirkes af mængden af det samlede protein eller antallet af ikke-EV-aggregater og kan derfor kvantificere eldrevne køretøjer, der er opnået ved forskellige rensningsmetoder, på en upartisk måde. Den FACS-verificerede EV metrik, vi beskriver her ville være særligt nyttigt for undersøgelser, der viser fysiologiske virkninger af rensede elbiler. Det kunne også være til gavn for ev-området generelt at etablere en FACS-metode som en universel metrikværdi, således at absolutte ev-tætheder kan sammenlignes direkte på tværs af undersøgelser. Vitale farvestoffer kan også mærke C. elegans elbiler, men de er ikke så lyse som elbiler mærket med DI-8-ANEPPS.

Denne rensning tilgang udnytter den aktive sekresion af elbiler uden for ligene af intakte, levende orme. Dette gør det muligt c. elegans eldrevne køretøjer at blive isoleret ved sammenlignelige renhed og overflod som fra cellekultur, specifikationer, der er tilstrækkelige til at identificere hundredvis af protein og RNA laster via LC-MS-MS og RNAseq analyse26. Således kan det store bibliotek af reagenser til rådighed for C. elegans forskning udnyttes til at undersøge indflydelsen af den genetiske og fysiologiske forstyrrelser på EV last sammensætning.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt Nick Terzopoulos for ormplader og reagenser; Caenorhabditis Genetics Center (CGC) på NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) for N2 nematodelinjen Lucia Vojtech, ph.d., for hjælp med nanopartikel sporing analyse; Jessica Young, ph.d., og Marie Claire, MD, ph.d., for hiPSC-afledte neuronal konditioneret celle medier; Wai Pang for at få hjælp med TEM-billedbehandling. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskudP30AG013280 til MK og NIH-tilskudAG054098 til JCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05% to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2 L bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
  3. Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
  4. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
  5. Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).
  6. Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589 (2013).
  7. Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
  8. Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  9. Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
  10. Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
  11. Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069 (2019).
  12. Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
  13. Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
  14. Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
  15. Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
  16. Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
  17. Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
  18. Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
  20. Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502 (2016).
  21. Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940 (2016).
  22. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  23. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  24. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
  25. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
  26. Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).

Tags

Biologi flow cytometri DI-8-ANEPPS størrelse udelukkelse kromatografi flow cytometri stor befolkning C. elegans vedligeholdelse
Rensning og analyse af <em>Caenorhabditis elegans</em> Ekstracellulære Vesicles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Russell, J. C., Postupna, N.,… More

Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter