Summary
Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.
Abstract
De afscheiding van kleine membraangebonden blaasjes in de externe omgeving is een fundamenteel fysiologisch proces van alle cellen. Deze extracellulaire blaasjes (EV's) functioneren buiten de cel om wereldwijde fysiologische processen te reguleren door eiwitten, nucleïnezuren, metabolieten en lipiden tussen weefsels over te brengen. EV's weerspiegelen de fysiologische toestand van hun cellen van oorsprong. EV's zijn betrokken om fundamentele rollen te hebben in vrijwel elk aspect van de menselijke gezondheid. Zo worden EV-eiwit en genetische ladingen steeds vaker geanalyseerd op biomarkers van gezondheid en ziekte. Het EV-veld mist echter nog steeds een hardnekkig ongewerveld modelsysteem dat de studie van ev-ladingsamenstelling mogelijk maakt. C. elegans is zeer geschikt voor EV-onderzoek omdat het actief EV's buiten zijn lichaam in zijn externe omgeving scheidt, waardoor facile isolatie mogelijk is. Dit artikel biedt alle nodige informatie voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van deze milieuvriendelijke c. elegans EV's, waaronder hoe kwantitatief te werken met zeer grote populaties van leeftijdsgesynchroniseerde wormen, zuiverende EV's, en een flow cytometrie protocol dat direct meet het aantal intacte EV's in de gezuiverde steekproef. Zo kan de grote bibliotheek van genetische reagentia beschikbaar voor C. elegans onderzoek worden aangeboord voor het onderzoeken van de effecten van genetische paden en fysiologische processen op EV lading samenstelling.
Introduction
De afscheiding van membraangebonden extracellulaire blaasjes (EV's) vergemakkelijkt de wereldwijde fysiologische processen door actief specifieke eiwitten, nucleïnezuur, metaboliet en lipideladingen tussen cellen1te transporteren. Cellen scheiden EV's af die een continuüm van grootte sen van 2 μm of groter tot zo klein als 20 nm2. Kleine EV's (<200 nm) worden steeds vaker bestudeerd vanwege hun implicaties in pathologische processen, waaronder stofwisselingsstoornissen, kanker, hart- en vaatziekten en neurodegeneratieve ziekten3,4,5. Deze pathologieën hebben ook aangetoond dat ze de eiwit- en genetische samenstelling van EV's-ladingen van kleine EV's beïnvloeden. Daarom worden biomarker-handtekeningen van de pathologie steeds vaker blootgelegd via EV-ladingsdetectiemethoden zoals LC-MS-MS en RNAseq6,7,8,9.
C. elegans is een nuttig ongewerveld model voor het identificeren van evolutionair geconserveerde EV signalering seinen trajecten. Bijvoorbeeld, een C. elegans flippase werd voor het eerst aangetoond dat de EV biogenese induceren in C. elegans embryo's, en de menselijke homolog bleek te beïnvloeden EV release in menselijke cellen10,11. C. elegans EV's werden gemeld aan Egel signalen die nodig zijn voor cuticula ontwikkeling te dragen. De levering van Egel en andere morfogenen werd getoond om een belangrijke ontwikkelingsrol van EV's te spelen, en het wordt bewaard in zebravissen, muizen, en mensen12,13,14,15. C. elegans is zeer geschikt voor EV biomarker ontdekking omdat het scheidt EV's buiten zijn lichaam die functie in dier-tot-dier communicatie16,17 (Figuur 1A). De methode die in het licht van een eerdere studie is vastgesteld, kan echter niet worden gebruikt omdat de e. coli-voedselbron van de aaltjes ook EV's18 scheidt. Bij deze methode bestaat het grootste deel van het monster uit E. coli-besmetting, waardoor de kracht van proteomische of RNAseq-benaderingen voor de ontdekking van C. elegans EV-ladingen wordt beperkt. De hier beschreven methoden werden ontwikkeld om zeer zuivere C. elegans EV's op overvloedniveaus te leveren die kenmerkend zijn voor typische celkweekexperimenten en zo omics benaderingen voor EV biomarker ontdekking te vergemakkelijken.
Grote populaties wormen zijn nodig om een voldoende aantal EV's te genereren voor ladinganalyse. Daarom zijn ook methoden voor het uitvoeren van kwantitatieve teelt van grote populaties ontwikkelingss gesynchroniseerde C. elegans opgenomen. Typisch, wanneer een groot aantal wormen nodig zijn voor experimenten, worden ze gekweekt in vloeibare media. Hoewel dit effectief is voor het genereren van grote populaties wormen, is de fysiologie van de dieren aanzienlijk anders dan wormen die onder standaardomstandigheden op nematodengroeimedium (NGM) agarplaten worden gekweekt. Dieren gekweekt in vloeistof groeien langzamer, zijn dunner, vertonen ontwikkelingsheterogeniteit en worden onderworpen aan een hoge mate van batchvariabiliteit. Daarom presenteren we een eenvoudig maar effectief middel voor de kwantitatieve teelt van grote populaties ontwikkelingss gesynchroniseerde C. elegans met behulp van 10 cm hoge groeiplaten. De mediasamenstelling van hoge groeiplaten omvat meer pepton dan gewone NGM-platen en is ingezaaid met de E. coli-stam NA22 die robuuster groeit dan OP50.
De vooruitgang in de technologie van de stroomcytometrie (FACS) heeft de directe analyse van individuele EV's20,21, mogelijk gemaakt om EV's te kwantificeren zonder de inherente beperkingen in andere methoden. Eerder werk heeft aangetoond dat eiwit is niet een nuttige proxy voor EV overvloed, omdat verschillende zuivering methoden resulteren in aanzienlijk verschillende EV-to-protein ratio's22. Extreem zuivere EV-breuken bevatten relatief weinig eiwitten, waardoor het moeilijk is om monsters te kwantificeren met BCA- of Coomassiegels. Westerse analyse kan relatieve verschillen van individuele eiwitten identificeren, maar kan niet identificeren hoeveel EV's er in het monster zitten. Robuuste kwantificering van ev-aantal door nanodeeltjestrackinganalyse wordt belemmerd door het smalle signaal-naar-ruisbereik, het onvermogen om onderscheid te maken tussen EV's en vaste aggregaten, en het gebrek aan overdraagbaarheid van methoden tussen instrumenten met verschillende specificaties23. Daarom bevat dit artikel ook een generalizable flow cytometrische procedure voor het discrimineren en kwantificeren van EV's.
Protocol
1. Voorbereiding
- Voeg 2 g gelatine toe aan 100 mL dH2O en verwarm in de magnetron tot het begint te koken. Roer vervolgens en laat het 20 min afkoelen.
- Geef de oplossing door een 0,22 μm filter en laat u in steriele buizen vallen. Behandel pipettips met gelatine onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik door de gelatineoplossing op te pisen en uit te zetten. Behandelde tips kunnen onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen.
- Knip het membraan uit een steriel dopfilter.
- Maak een vierkant van 20 cm van 5 μm nylon mesh-stof nat en plaats rond de bovenkant van een steriel dopfilter. Zet het vast met verschillende dikke elastiekjes.
LET OP: Onderzoek de stof zorgvuldig om ervoor te zorgen dat er geen plooien zijn. Deze maken luchtgaten die de zuigkracht belemmeren.
2. Berekening van grote populaties wormen (figuur 1A)
- Vortex en pipet 10 μL van de wormsing op een deksel van de wormteeltplaat of een glazen glijbaan. Herhaal dit proces 3x. Noteer het aantal dieren in elke druppel.
- Pas de wormsuspensie aan op twee dieren per μL.
- Draai de vering en pipetteer negen druppels (10 μL) op een schuif of een plaatdeksel. Tel handmatig het aantal dieren. Noteer het aantal dieren in elke druppel.
- Bereken de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.) als percentage van elke wormpopulatie.
- Bereken het totale aantal dieren in elke populatie door de gemiddelde waarde te delen door 10 μL en vervolgens te vermenigvuldigen met het totale volume van de wormsuspensie in μL.
Figuur 1: Procedureoverzichten voor het genereren, kwantificeren en zuiveren van C. elegans EV's. (A) Schematisch voor het tellen van grote populaties dieren. bB) Schematisch voor het genereren van wormen voor het oogsten van EV's. (C) Schematisch voor het zuiveren van EV's van C. elegans supernatent. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
3. Cultiveren C. elegans voor EV Zuivering
- Het genereren van een grote populatie van ontwikkelings-gesynchroniseerde C. elegans. Volg hiervoor de onderstaande stappen.
- Voeg een enkel dier op een 6 cm normale groeimediaplaat. Incubeer twee generaties en was de dieren vervolgens op twee hooggroeimedium platen.
- Incubeer totdat de wormen het voedsel hebben uitgeput.
- Filter L1 wormen met 5 μm nylon gaas bereid in stap 1.4. Plaats de schroefdop op de steriele fles, start het vacuüm en giet wormen over het filter. Geef hetzelfde volume van het medium over de wormaggregaten op het filter.
- Kwantificeer de wormen en bereken het totale aantal (zie stap 2). Onlangs uitgehongerde (<24 uur) wormen geteeld op een hoge groei plaat resulteren in ongeveer 80.000 L1 larven.
- Centrifugeer L1 larven op 2.000 x g voor 3 min. Resuspend tot ~100.000 dieren per mL.
- Plaats ~50.000 dieren per hoge groeiplaat. Cultiveren van de dieren op 20 °C totdat ze gravid volwassenen (ongeveer 72 uur).
- Bleek de gravid volwassenen met standaardmiddelen en laat embryo's uitkomen in 10 mL van S Basal oplossing met 2,5 μg/mL cholesterol.
- Kwantimeer L1 larven (zie stap 2) en voeg vervolgens 50.000 wormen toe aan elke hoge groeiplaat.
- Verwaarborden bij 20 °C tot de dieren jongvolwassenen zijn.
- Bereid C. elegans voor secretome generatie.
- Was wormen van platen door 15 mL steriele M9 met 50 μg/mL carbenicillin aan elke hoge groeiplaat toe te voegen. Laat de verzadigde platen zitten voor 5 min. Verjagen wormen door cirkelen de buffer rond de plaat. Vermijd klotsen. Giet de buffer van elke plaat in een aparte conische buis van 50 mL. Herhaal de wasstap 2x meer voor een totaal van 45 mL buffer per plaat.
- Laat de wormen genoegen nemen met 15 min. Decant de supernatant en voeg 50 mL verse M9 buffer toe aan de buis. Herhaal dit voor een totaal van 4x.
- Drijf de wormen op de top van een 30% sacharose stap-gradiënt en recupereren dieren in de S Basale oplossing24.
- Kort resuspend de wormen in 15 mL van ijskoude 100 mM NaCl, voeg 15 mL van ijskoude 60% sacharose, en omkeren te mengen. Met een glazen pipet laag voorzichtig 5 mL ijskoud 100 mM NaCl op de top van het sacharose mengsel.
- Centrifuge op 1.500 x g voor 5 min. Wormen worden geconcentreerd op de interface tussen de NaCl en de sacharose.
- Pipetteer de dieren voorzichtig van de interface in een nieuwe 50 mL kegelbuis. Voeg S Basal oplossing toe aan 50 mL. Laat wormen 5 min zich vestigen.
- Decanteer de supernatant en voeg verse 50 mL S Basal oplossing toe. Herhaal dit minstens 3x.
- Kwantificeren van het aantal wormen zoals beschreven in stap 2.
- Smeer de wormen opnieuw op tot een dichtheid van één dier per μL met steriele S Basal-oplossing die 2,5 μg/mL cholesterol en 50 μM carbenicillin bevat.
- Om het monster voor te bereiden op de secretoomgeneratie, voegt u tot 400 mL van de suspensie toe aan een steriele 2 L bodem-verbijsterde kolf.
- Plaats kolven op de cirkeldraaier in een couveuse van 20 °C bij 100 tpm gedurende 24 uur.
4. EV Zuivering
- Oogsten en fractionering
- Verwijder de 2L-kolf met wormen uit de couveuse en pellet de dieren in conische flacons van 50 mL (500 x g voor 2 min).
- Giet de supernatant door een vacuümfilter van 0,22 μm om roetdeeltjes te verwijderen.
OPMERKING: Op dit punt kan de gefilterde supernatant met het secretoom en de blaasjes worden opgeslagen bij -80 °C. - Tel het aantal dieren zoals beschreven in stap 2.
- Bepaal de levensvatbaarheid van de wormen door het plaatsen van een druppel zwevende wormen op een bacteriële gazon. Wacht 15 min en scoor dieren als bewegend, verlamd of dood.
- Concentraat de 0,22 μm gefilterde supernatant tot 700 μL met behulp van geregenereerde nitrocellulose 10 kDa filtereenheden. Voeg 150 μL S Basale oplossing toe en pipet over het filter en de vortex. Herhaal 2x.
- Centrifugeer de geconcentreerde supernatant op 18.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C en breng de supernatant over op een nieuwe buis. Deze stap verwijdert eventuele resten of grotere deeltjes die zich tijdens het hanteren kunnen hebben opgehoopt.
- Voeg de proteaserremremcocktail + EDTA toe volgens de instructies van de fabrikant.
LET OP: Op dit punt kan de geconcentreerde supernatant met het secretoom en de blaasjes worden opgeslagen bij -80 °C.
- Grootte uitsluiting chromatografie
- Giet 80-200 μm agarosehars (poriegrootte fractionatiebereik van 70.000 tot 40.000.000 kDa voor bolvormige eiwitten) in een lege zwaartekrachtstroomkolomcartridge. Flow S Basale oplossing tot het harsbed is verpakt op een eindvolume van 10 mL.
OPMERKING: Als er te veel hars in de kolomcartridge wordt gegoten, verspreid dan de bovenkant van de kolom en verwijder het teveel met een pipet. - Passeer 40 mL steriele gefilterde S Basale oplossing door de kolom en laat deze stromen onder zwaartekracht.
LET OP: Controleer of de hars niet wordt verstoord. - Laat de buffer stromen totdat de bovenkant van de hars niet onder water is gezet en sluit vervolgens de bodem van de kolomcartridge af. Plaats een verzamelbuis onder de kolom.
- Verwijder de dop die op de cartridge is geplaatst. Voeg het geconcentreerde secretome verkregen in stap 2.1 dropwise toe aan de bovenkant van het kolombed. Pipetteer 1 mL van S Basale oplossing dropwise. Plaats een verse inzamelbuis onder de kolom.
- Vul langzaam het bovenste kolomreservoir met 5 mL S Basal oplossing om de hars niet te verstoren. Verzamel de eerste 2 mL eluate en wissel snel van buis en verzamel de volgende 4 mL. Dit is de fractie die is verrijkt voor EV's.
- Concentraat het eluaat tot 300 μL met een geregenereerde nitrocellulose 10 kDa moleculair gewicht afgesneden (MWCO) filter en de overdracht retentaat naar een laag bindende microcentrifuge buis.
- Was filtermembraan 2x met 100 μL S Basal oplossing door vortexing voor 20 s en pipetteren van de buffer over het filter. Voeg aan het eerste monster toe voor een eindvolume van 500 μL.
- Voeg proteaseremmercocktail toe volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer de downstream experimenten onmiddellijk uit (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, enz.) of bewaar op -80 °C.
- Giet 80-200 μm agarosehars (poriegrootte fractionatiebereik van 70.000 tot 40.000.000 kDa voor bolvormige eiwitten) in een lege zwaartekrachtstroomkolomcartridge. Flow S Basale oplossing tot het harsbed is verpakt op een eindvolume van 10 mL.
5. Flow Cytometry Quantification van EV Overvloed
- Bereiding van kleurstof
- Bereid een voorraad di-8-ANEPPS van 10 mM op met verse DMSO. Verdeel in 10 μL aliquots en bewaar op -20 °C.
- Bereid een werkoplossing van 1 mM voor door 90 μL steriele gefilterde PBS toe te voegen aan een buis met 10 μL kleurstof.
- Experimentele monstervoorbereiding
- Voeg 840 μL S Basaaloplossing toe in een microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 60 μL toe van de gezuiverde EV's gegenereerd in sectie 4.2 en vortex.
- Aliquot 300 μL van het monster in twee nieuwe microcentrifugebuizen. Er is nu een experimentele set van drie buizen met elk 300 μL verdunde EV's. Label de buizen #1–3. Voeg aan monsters #2 en #3 voeg 7 μL van de DI-8-ANEPPS-voorraad toe die in 5.1.2 is bereid. Voeg vervolgens 7 μL van 1% Triton-X 100 toe aan buis#3. Meng elke buis door vortexing.
- Sonicate monster #3 door het plaatsen van de sonicator tip in het midden van het monster en pulseren 10 keer op 20% macht 30% duty cycle.
LET OP: Zorg ervoor dat de punt van de sonicatorsonde zich in het midden van het monster bevindt, zodat de schuimproductie tot een minimum wordt beperkt. Schuim kan het monster in gevaar brengen doordat de EV's worden samengevoegd. - Voeg 300 μL S Basaaloplossing toe aan twee microcentrifugebuizen. Voeg 7 μL van het DI-8-ANNEPS werkende reagens bereid in stap 5.1 toe aan de tweede buis en label "Dye Only". Label de andere buis "Buffer Only".
OPMERKING: Bereid de dye only en buffer only controle monsters en de experimentele monsters met dezelfde S Basal bron. - Incubeer de monsters uit de buurt van het directe licht en bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Facs-experimenten uitvoeren.
- Stel het FACS excitatiefilter in op 488 nm (blauw) en het emissiefilter op 605 nm (oranje). Stel de stroomsnelheid in op 1,5 μL per min.
- Voer nanobead FACS kalibratie mix (optioneel, maar aanbevolen).
- Voer elk monster op een FACS-machine gedurende 3 min (180 s). Let op de exacte looptijden in seconden.
- Analyseer de FACS-gegevens.
- Open de bestanden met FACS-analysesoftware.
- Schakel de Y-as over naar 488-org (gebied) door op de aste klikken en te selecteren in het vervolgkeuzemenu.
- Stel een rechthoekige poort vanaf de bovenkant van het perceel, variërend van SALS niveau 102 tot 104 (<300 nm formaat deeltjes). Verleng de poort naar beneden tot het 2,5% van de totale gebeurtenissen bevat. Noem de gate "DI-8-ANEPPS+" evenementen.
-
Kwantificering van monster EV overvloed
- Kopieer deze poort en plak deze op de andere twee monsters in je experimentele set, evenals de Buffer Only en Dye Only controles. Exporteer de analyse naar een spreadsheet.
- Als de FACS-monsters niet zijn uitgevoerd voor de aanbevolen 3 min (180 s), normaliser alle gebeurtenistellingen in het monster tot gebeurtenissen per 180 s. Als een voorbeeld bijvoorbeeld is uitgevoerd voor 250 s, wordt het gebeurtenisnummer DI-8-ANEPPS+ geschaald met 250 s/180 s.
- Verwijder de achtergrondgebeurtenissen van de kleurstof door het aantal DI-8-ANEPPS+-gebeurtenissen in het besturingselement Dye Only af te trekken van die in voorbeeld#2.
- Verwijder isotypeachtergrondgebeurtenissen door het aantal DI-8-ANEPPS+-gebeurtenissen in voorbeeld#1 af te trekken.
- Verwijder niet-gevoelige voorvallen door het aantal DI-8-ANEPPS+-gebeurtenissen in voorbeeld#3 af te trekken. Deze waarde is het aantal bonafide EV's.
- Bereken het aantal EV's in 1 μL monster door de waarde berekend in stap 5.5.5 te delen door het in μL geanalyseerde volume (4,5 μL geanalyseerd zoals beschreven in stap 5.3) en te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (10x zoals beschreven in stap 2.5). Vermenigvuldig deze waarde met het aantal μL dat nog in de EV-voorbereiding zit. Dit is het aantal EV's dat beschikbaar is voor downstream-analyse.
Figuur 2: Schematisch van de voorbereiding van de stroomcytometrieom ingewantie om EV-overvloed te kwantificeren. (A) De EV-voorbereiding is verdeeld in drie identieke monsters. Monster # 1 is de No Dye negatieve controle. DI-8-ANEPPS wordt vervolgens toegevoegd aan monsters #2 en #3. Triton-X 100 wordt vervolgens toegevoegd aan #3. De groene pijl geeft aan dat alleen monster #3 vervolgens wordt gesoniceerd. De gegevens uit de stroom helpen bij het bepalen van het absolute aantal wasmiddelgevoelige EV's in de FACS-monsters en berekenen vervolgens de overvloed aan EV's in het totale preparaat. De poort voor het bepalen van kleurstof-positieve gebeurtenissen wordt geplaatst met monster #1, die geen kleurstof bevat. Het rode schrijven op de spreadsheetgegevens moet illustreren dat de kleurstof-positieve gebeurtenissen van het wasmiddel-behandelde steekproef van het monster met kleurstof worden afgetrokken. bB) Vergelijkingen voor het kwantificeren van EV's in een facs-steekproef en het berekenen van het totale aantal EV's in de steekproef. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Representative Results
Een schema voor de processen die nodig zijn voor het genereren en zuiveren van EV's wordt weergegeven in figuur 1. De typische tijden die nodig zijn om elke stap te voltooien worden hieronder weergegeven. Figuur 2 toont een schema voor het voorbereiden van monsters voor FACS-analyse met di-8-ANEPPS (figuur 2A) en de berekeningen die nodig zijn om het totale aantal EV's in een steekproef te schatten (figuur 2B).
Representatieve resultaten van 10 biologische replicaties worden weergegeven in figuur 3A. De variabiliteit tussen de replicaties is niet significant en de typische S.E.M. van de bevolkingsgrootte is iets meer dan 10% (Figuur 3B). Het filteren van de wormen en het cultiveren op de verse hoge groeiplaten zal een grote populatie van gravid volwassenen die geschikt zijn voor bleekmiddel synchronisatie te genereren. Een enkele uitgehongerde plaat verwerkt op deze manier kan produceren een experimentele populatie van 1 x 106 of meer gesynchroniseerde nakomelingen, omdat elke gravid volwassene zal ongeveer 10 eieren bevatten. Het is mogelijk om grote populaties ontwikkelingsgeïsoleerde populaties te behouden door eieren en larven te filteren via een 40 μm filter om EV's van oudere dieren te verkrijgen. Behouden volwassenen worden overgebracht naar verse hoge groeiplaten met een dichtheid van 20.000 dieren per plaat. Dit proces werd elke 2 dagen herhaald. Figuur 3C toont drie biologische replica's van wormpopulaties die over drie plaatoverdrachten worden verplaatst. Het overbrengen van dieren tussen platen resulteert in ongeveer 10% verlies van dieren (figuur 3C) terwijl ongeveer 20% van de dieren verloren gaat in de sacharose flotatiestap (Figuur 3D).
Figuur 3: Kwantificering van grote populaties C. elegans voor EV-analyse. (A) Een vergelijking van het aantal L1 larve stadium wormen geïsoleerd van een enkele onlangs uitgehongerde (<24 uur) hoge groei plaat. De waarden van elk van de 10 biologische replica's is uitgezet. De optelsom van alle gegevenspunten in de 10 replica's wordt ook gepresenteerd als een viool plot en bar met S.E.M. Dit toont aan dat een enkele plaat van onlangs uitgehongerde wormen zal opleveren ~ 80.000 L1 larve stadium wormen. (B) De S.E.M. van de 15 verschillende plaatpopulatiemetingen in paneel A uitgezet als afzonderlijke punten. Over het algemeen is de S.E.M. iets groter dan 10%. (C) Drie biologische replica's van wormpopulaties werden geschat na elk van de twee overdrachten tussen platen om de 4 uur. Deze overdracht van dieren tussen platen heeft niet geleid tot een aanzienlijke afname van de populatiegrootte. Dit geeft aan dat de hier gepresenteerde methode voor het verplaatsen van wormen niet leidt tot een significant verlies van dieren. (D) Populatiemetingen in de loop van drie EV-experimentele replica's: het aantal dieren dat werd geschat voor de oorspronkelijke L1-larven die met het experiment zijn begonnen, het aantal jonge volwassen dieren dat is teruggevonden uit de sacharosevlotter en klaar is voor de incubatieperiode van 24 uur, het aantal dieren dat bij herstel van het secretome van EV-preparaat werd geteld. Er is een kleine maar niet significante afname van de bevolkingsomvang tussen de initiële bevolkingsschatting in het L1-larvestadium en later wanneer de dieren jonge volwassenen zijn. De gemiddelde L1-bevolkingsmeting werd aangeduid als 100% en alle andere metingen werden geschaald door hun verhouding tot deze waarde. Foutbalken S.E.M. * = p-waarde < 0,05, N.S. = niet significant in een parametrische gekoppelde t-test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Eiwit-tot-dier verhouding is een nuttige statistiek voor het karakteriseren van een EV voorbereiding. Deze statistiek kan een snelle manier bieden om de consistentie tussen EV-preparaten te bepalen. Gemiddeld zullen 1.000 wilde volwassen dieren 1 μg eiwitten groter dan 10 kDa in hun omgeving afscheiden(figuur 4A). Wanneer deze fractie verder wordt gescheiden door de grootte uitsluiting chromatografie, het totale eiwit elutie profiel toont een kleine eiwit piek tussen 2-6 mL en een grote piek na 8 mL. De EV's bevinden zich in de eerste 5 mL van de kolomel (Figuur 4B). Nanoparticle tracking analyse van de eerste 5 mL van de kolom eluaat bevat een monodisperse bevolking van kleine, ~ 150 nm EV's (Figuur 4C). Transmissie elektronenmicroscopie van grootte uitsluiting fracties onthult overvloedige EV's in de 2-6 mL fractie van eluaat, maar niet in de latere eluaat volumes. EV's staan bekend om hun cup-achtige vorm en zijn daarom gemakkelijk te onderscheiden van vaste deeltjes die verschijnen als punctate heldere stippen wanneer bereid onder de negatieve kleuring voorwaarden (Figuur 4D).
Figuur 4: Zuivering van C. elegans EV's uit totaal uitgescheiden biomassa. (A) De verhouding tussen de totale eiwitten groter dan 10 kDa en het aantal wormen dat in het preparaat voor 10 biologische replicaties is geïncubeerd, is vastgesteld. De meeste preparaten bevatten 1 μg eiwit per 1.000 dieren. bB) eiwitelutieprofiel van een harskolom van 10 mL geladen met 1 mL van het geconcentreerde secretome. De fracties die worden geconsolideerd in verdere analyses worden in groepen gearceerd. (C) Nanodeeltjes tracking analyse van de geconsolideerde hars geëlueerde fracties 2-6 mL. Het betrouwbaarheidsinterval van 95% is grijs gearceerd. dD) TEM-analyse van de geconsolideerde harsgelude breuken. Het uitgangsmateriaal had zowel blaasachtige deeltjes als niet-blaasjes. De geconsolideerde 2-6 mL elutiefractie werd verrijkt voor blaasjes met weinig niet-blaasjes. De geconsolideerde fracties van 7 tot 11 mL bevatten weinig blaasdeeltjes, maar veel niet-blaasdeeltjes. De 12-15 mL elutiefracties bevatten alleen niet-blaasjes. Alle micrografen worden getoond op dezelfde vergroting. Schaalbalk = 200 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Om de eigenschappen van de stromingscytometrie tussen C. elegans en menselijke EV's direct te vergelijken, gezuiverden we EV's uit de geconditioneerde media van celculturen van menselijke neuronen met deze methode. Flow cytometrie scheidt deeltjes op basis van licht verstrooiing. De small-angle lichtverstrooiing (SALS) correleert ruwweg met de grootte, en de lange hoek licht verstrooiing (LALS) correleert met interne membraanstructuur. De meerderheid van de totale steekproef gebeurtenissen uit zowel celcultuur en C. elegans EV voorbereidingen zijn strak gericht in een cluster gecentreerd rond 103 SALS en 104 LALS (Figuur 5A). Een histogram van C. elegans EV monster gebeurtenissen gesorteerd door SALS blijkt dat alle voorbereidingen piek op ~ 103 (Figuur 5B).
Figuur 5: C. elegans EV's worden duidelijk gedefinieerd door hun lichtverstrooiingseigenschappen. (A) Histogram van SALS gebeurtenissen in drie biologische repliceert van C. elegans EV's. ~80% van de totale steekproefgebeurtenissen zijn opgenomen binnen een strakke, duidelijk gedefinieerde populatie. Vergelijkbaar met nanodeeltjes tracking analyse, het toont aan dat de grootte verdeling van C. elegans EV's is monodisperse. Het histogram van de S Basal buffer die wordt gebruikt om de monsters te verdunnen wordt ter vergelijking getoond. (B) Vergelijking van refractieve eigenschappen van C. elegans en menselijke celcultuur EV's gezuiverd met de methoden beschreven in deze tekst. Beide EV-types presenteren consequent vergelijkbare korte en lange hoek lichtverstrooiingsverdelingen (SALS en LALS). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De DI-8-ANEPPS labelt c. elegans EV's robuust en benadrukt consequent een meerderheid van de totale gebeurtenissen in zowel de C. elegans als de celcultuur afgeleide monsters. De kalibratiekralen en -besturingselementen worden gepresenteerd in figuur 6A. De afzonderlijke FACS-strooipercelen zijn afkomstig uit een C. elegansmonster bereid van 200.000 dieren (#1) en twee bereid uit 500.000 dieren(figuur 6B). EV's van 100 mL (#1) of 200 mL (#2,3) van de celcultuur werden ook geanalyseerd (Figuur 6C). Zowel C. elegans en celcultuur afgeleide monsters toonde overvloedige fluorescerende gebeurtenissen die verdwenen wanneer behandeld met 0,05% Triton-X 100 en licht sonicatie. Dit toont aan dat de gelabelde gebeurtenissen wasmiddel laloomische fosfolipidenstructuren (blaasjes) zijn in plaats van detergentia-ongevoelige vaste lipoproteïneaggregaten. De EV overvloed wordt berekend als het verschil tussen het aantal gebeurtenissen in de DI-8-ANEPPS + poort tussen de fracties zonder wasmiddel (-) en met wasmiddel (+) minus de gebeurtenissen in de Dye Only controle. Voor de duidelijkheid worden de gegevens die afzonderlijk in figuur 6B en figuur 6C worden gepresenteerd, samengevat als staafgrafieken in figuur 6D en figuur 6E. De overvloed van de gezuiverde EV's was niet significant verschillend tussen de C. elegans en de celcultuur afgeleide preparaten (Figuur 6F).
Figuur 6: Voorbeelden van stroomcytometriegegevens die worden gebruikt om ev-overvloed te berekenen. (A) Om ervoor te zorgen dat het aantal gebeurtenissen direct kan worden vergeleken tussen monsters, moeten de buffer only- en de buffer- en dye only-besturingselementen worden uitgevoerd met dezelfde stroomsnelheid en de inzameltijd als de EV-monsterfracties. Er zijn zeer weinig gebeurtenissen in de DI-8-ANEPPS poort. bB) Representatieve resultaten van het DI-8-ANEPPS- en wasmiddelbehandelingsprotocol van C. elegans. Drie biologische replica's worden getoond. Biologische repliceren #1 werd bereid uit 200.000 dieren, terwijl #2 en #3 werden bereid uit 500.000 dieren. Het verdwijnen van EV's met de behandeling van wasmiddelen is in alle gevallen duidelijk. (C) Representatieve resultaten van het DI-8-ANEPPS- en wasmiddelbehandelingsprotocol met behulp van geconditioneerde media voor menselijke celkweek. Biologische repliceert #1 en #2 werden bereid vanaf 200 mL geconditioneerde media, terwijl biologische repliceren #3 werd bereid vanaf 100 mL. dD) staafdiagram van de gegevens die zijn verzameld uit de drie biologische replica's van C. elegans EV's. Foutbalken = S.E.M. Gekoppelde tweezijdige t-tests tussen de behandelingen. = p-waarde < 0,001. (E) Staafgraaf van de gegevens die zijn verzameld uit de drie biologische replica's van afgeleide EV's uit de celkweek. Gekoppelde tweezijdige t-tests tussen de behandelingen. = p-waarde < 0,001 (F) Het aantal met kleurstof gelabelde wasmiddelgevoelige gebeurtenissen per μL werd berekend voor alle biologische replica's van C. elegans en celkweek. De waarden tussen de twee EV-monsterbronnen verschillen niet significant. Gekoppelde tweezijdige t-tests tussen behandelingen p-waarde = 0,685. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1 bevat de ruwe experimentele waarden voor de volledige 4,5 μL van elk geanalyseerd monstertype. Het totale aantal gebeurtenissen verzameld uit de EV-fracties gezuiverd van 500.000 dieren was 10-20x over de achtergrond aantal deeltjes verzameld door buffer alleen, terwijl de fractie gezuiverd van 200.000 dieren bevatte ongeveer 2x zoveel gebeurtenissen als buffer alleen. Het aantal gebeurtenissen binnen de DI-8-ANEPPS+ poort wordt ook getoond voor elk voorbeeld. Deze statistieken kunnen worden geïmporteerd in een spreadsheet om het aantal kleurstof-positieve, wasmiddelgevoelige EV's te berekenen zoals hierboven beschreven. Bijvoorbeeld, het aantal EV's in 1 mL van de eerste C. elegans biologische repliceren getoond zou worden berekend als volgt:
(18.974 – 3.853 - 1.487) x (10/4,5) x 1.000 = 30.297.778.
Tabel 1: Tabel 1: Tabelgetuleerde stroomcytometriegegevens. De gegevens in figuur 6 worden gepresenteerd als een spreadsheet. Voor elk voorbeeld worden de totale gebeurtenissen en DI-8-ANEPPS+ gated-gebeurtenissen weergegeven. Elke biologische replicatie is gerangschikt in de volgorde van de monsters #1-3 in het protocol. Deze statistieken blijkt dat het totale aantal gebeurtenissen verzameld uit de C. elegans monsters bereid van 500.000 dieren of 200 mL van de cel cultuur geconditioneerde media was 10-20x over de achtergrond aantal deeltjes verzameld door buffer alleen, terwijl de biologische repliceren gezuiverd van 200.000 dieren bevatte ongeveer 2x zoveel totale gebeurtenissen als buffer alleen. Het aantal gebeurtenissen binnen de DI-8-ANEPPS+ poort wordt ook getoond voor elk voorbeeld. Deze statistieken kunnen worden geëxporteerd naar een spreadsheet om het totale aantal EV's te berekenen. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Discussion
Een fundamentele uitdaging van het EV-veld is het scheiden van de grote verscheidenheid aan EV-subtypes2. De hier beschreven methoden gebruiken filtratie, differentiële centrifugatie en grootte-uitsluitingchromatografie om een zuivere populatie van kleine EV's te genereren, omdat ~100 nm EV's eerder werden afgescheiden in de externe omgeving en functioneren in fysiologisch relevante communicatietrajecten16. EV's gezuiverd door middel van grootte-uitsluiting chromatografie kan nog steeds een mengsel van exosomen en kleine microvesicles, omdat deze EV subklassen zijn even groot. Gewervelde EV-subklassen worden vaak gescheiden door immunoneerslag omdat deze methode EV's isoleert door binding aan selectieve membraaneiwitmarkers. De beschreven methoden vergemakkelijken de identificatie van C. elegans EV membraan marker eiwitten. Daarom kan het in de toekomst mogelijk zijn om kleine EV-subklassen verder te scheiden door middel van analoge immunoneerslagmethoden. In theorie kan immunoneerslag EV's isoleren van goed gevoede wormen omdat E. coli EV's niet met het antilichaam zouden moeten communiceren. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van de eiwit- en genetische ladingen van grotere EV-subklassen (>200 nm) kunnen dit doen door de 0,22 μm filtratiestap over te slaan en vervolgens de pellet te analyseren in plaats van de supernatant. Het blootleggen van de eiwit- en genetische ladingsovervloed van grote EV's zal een uitgebreider begrip van de fysiologische processen die functioneren via de C. elegans secretome. Naast het feit dat ze in de omgeving worden uitgescheiden, worden De elegans EV's intern tussen weefsels overgedragen. Daarom isoleren deze methoden alleen een subset van de totale C. elegans EV's. Het ontdekken van lading van interne EV's is echter niet mogelijk omdat er geen methode is om EV's te scheiden van lysed wormen. Cargo analyse van deze extern geheime EV subset biedt een middel om potentiële algemene EV eiwit markers kunnen labelen interne EV's ook te identificeren.
De omvang van de EV voorbereiding zal afhangen van de eisen van het experiment. Een totaal van 500.000 jonge volwassenen biedt genoeg EV's voor het uitvoeren van flow cytometrie, LC-MS-MS, en RNAseq analyse parallel. Dit aantal kan worden opgeschaald of omlaag, afhankelijk van de experimentele behoeften. De grootste praktische factor voor het opschalen is het aantal benodigde 10 cm hoge groeiplaten. Hoge groeiplaten bereid met 500 μL van 20x geconcentreerde 's nachts NA22 cultuur zal een bevolking van ~ 50.000 volwassenen te ondersteunen van de L1 larve stadium tot de eerste dag van volwassenheid. Daarom zijn er 13 hooggroeiplaten nodig om een experiment uit te voeren met 500.000 volwassenen: één plaat om de populatie L1's te genereren, twee platen om de volwassenen te laten bleken en 10 platen voor de groei van de proefdieren. Deze statistieken zijn afhankelijk van de zaai- en bacteriële groeiomstandigheden van de hoge groeiplaten. Daarom wordt aanbevolen om alle platen op een gestandaardiseerde manier te maken en vervolgens te kalibreren met bekende hoeveelheden dieren.
Wormen worden geteld in twee stadia tijdens het teeltproces: 1) voor het zaaien van wormen op platen en 2) voordat het genereren van de geconditioneerde media. De dichtheid van de dierlijke cultuur is getoond om gedrag, ontwikkeling, en spanningsreacties15,16,17,,18 te beïnvloeden en kan daarom ook EV ladingen beïnvloeden., Daarom is het voor een consistente teeltdichtheid noodzakelijk om wormpopulaties nauwkeurig te schatten. Het kwantificeren van het aantal wormen in negen druppels geeft statistisch vertrouwen van bevolkingsschattingen. Het is essentieel om elke druppel individueel te behandelen, vortexing tussen elke druppel en het invoegen van de pipet dezelfde afstand in de worm schorsing. Het nemen van deze voorzorgsmaatregelen zal ervoor zorgen S.E.M. waarden van ~ 5-10% van de totale bevolking. Als de S.E.M. voor een wormpopulatie hoger is dan 20%, dan ging er iets mis.
Na de 24 uur bacterievrije incubatietijd kruipen jonge, wilde type C. elegans onmiddellijk bij toevoeging aan een bacterieel gazon. Dit geeft aan dat de incubatie geen ernstige gevolgen heeft voor hun gezondheid. Deze stap heeft echter wel invloed op de fysiologie van de dieren en kan daarom de samenstelling van de EV-ladingen beïnvloeden. Daarom is het bij het werken met zeer zieke genotypen of oudere dieren essentieel om de levensvatbaarheid na de incubatiestap te controleren. Als alle dieren de incubatie niet overleven, verhoog dan de experimentele populatiegrootte en verklein de incubatietijd. Bij het werken met grote hoeveelheden geconditioneerde media is het praktischer om een geroerde celconcentrator te gebruiken met een filter gemaakt van geregenereerde nitrocellulose. EV's binden zich niet zo sterk aan deze filterchemie als andere filtertypen14.
De verhouding tussen het totale eiwit dat uit de geconditioneerde media wordt teruggewonnen met het aantal dieren dat is geïncubeerd om het preparaat te maken, is een nuttige statistiek. Als deze verhouding veel hoger is dan verwacht, dan is het mogelijk dat de bevolkingsschattingen waren uitgeschakeld of dat dieren stierven en verslechterden in de geconditioneerde media. Als deze verhouding veel lager is dan verwacht, dan kan sommige eiwitten verloren zijn gegaan op de filters tijdens het concentratieproces. Hoewel de FACS-methoden de EV's in de voorbereiding direct zullen kwantificeren, is deze statistiek nuttig omdat deze afwijkingen in het proces in een vroeg stadium kan markeren. Een andere nuttige methode voor het verifiëren van de kwaliteit van het EV-preparaat is transmissieelektronenmicroscopie, zoals blijkt uit figuur 4D. Hoewel het protocol voor transmissie elektronenmicroscopie is niet formeel opgenomen in deze methoden artikel als gevolg van lengte, het kan worden uitgevoerd door standaard methoden. Het wordt aanbevolen om dit soort analyses uit te voeren, althans in eerste instantie, als een gratis methode voor FACS voor de beoordeling van de kwaliteit van EV-preparaten. Voor de beste resultaten gebruik maken van vers geloosde formvar-carbon roosters en vlek de monsters met 2% fosforwolfraamzuur in plaats van uranyl acetaat.
DI-8-ANEPPS werd gekozen omdat het is aangetoond dat het kwantitatief label EV membranen, beter dan andere algemene EV kleurstoffen met menselijke biopsie monsters en liposomen25. De metingen zijn snel, waarbij slechts 3 min van de inzameltijd voor elk monster. De kwantificering van wasmiddelgevoelige EV's heeft een directe functionele betekenis omdat het inspeelt op een fundamenteel fysiek onderscheid tussen EV's en vaste lipoproteïneaggregaten. Belangrijk is dat deze methode niet wordt beïnvloed door de hoeveelheid totale eiwitten of het aantal niet-EV aggregaten en kan daarom EV's die via verschillende zuiveringsmethoden worden verkregen op een onbevooroordeelde manier kwantificeren. De FACS-geverifieerde EV-statistiek die we hier beschrijven zou vooral nuttig zijn voor studies die fysiologische effecten van gezuiverde EV's aantonen. Het zou ook ten goede kunnen komen aan het EV-veld in het algemeen om een FACS-methodologie vast te stellen als een universele statistiek, zodat absolute EV-overvloeden direct kunnen worden vergeleken tussen studies. Vitale kleurstoffen kunnen ook C. elegans EV's labelen, maar ze zijn niet zo helder als EV's gelabeld met Di-8-ANEPPS.
Deze zuiveringsaanpak speelt in op de actieve afscheiding van EV's buiten het lichaam van intacte, levende wormen. Hierdoor kunnen C. elegans EV's worden geïsoleerd bij vergelijkbare zuiverheid en overvloed als uit celcultuur, specificaties die voldoende zijn voor het identificeren van honderden eiwit- en RNA-ladingen via LC-MS-MS en RNAseq-analyse26. Zo kan de grote bibliotheek van reagentia beschikbaar voor C. elegans onderzoek worden benut voor het onderzoeken van de invloed van de genetische en fysiologische verstoring op EV lading samenstelling.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Wij erkennen Nick Terzopoulos dankbaar voor wormplaten en reagentia; het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) van het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) voor de N2 nematodelijn; Lucia Vojtech, PhD, voor hulp bij de nanodeeltjes tracking analyse; Jessica Young, PhD, en Marie Claire, MD, PhD, voor hiPSC-afgeleide neuronale geconditioneerde celmedia; Wai Pang voor hulp met TEM beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door NIH grant P30AG013280 aan MK en NIH grant AG054098 aan JCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
| 1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05% to lyse EVs |
| 10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
| 2 L bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
| 40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
| 5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
| 6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
| Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
| ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
| DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
| Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
| HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
| Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
| S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
| Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |
References
- Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
- Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
- Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).
- Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589 (2013).
- Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
- Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
- Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
- Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069 (2019).
- Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
- Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
- Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
- Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
- Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
- Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
- Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
- Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502 (2016).
- Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
- de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
- Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).
