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Biology

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक्सिटेलर वेसिकल्स का शुद्धिकरण और विश्लेषण

Published: March 31, 2020 doi: 10.3791/60596
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Washington

Summary

यह लेख कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक्सेलर्युलर वेसिकल्स को उत्पन्न करने, शुद्ध करने और मात्रा देने के तरीके प्रस्तुत करता है।

Abstract

बाहरी वातावरण में छोटे झिल्ली से बंधे वेसिकल्स का स्राव सभी कोशिकाओं की एक मौलिक शारीरिक प्रक्रिया है। ये बाह्य वेसिकल्स (ईवीएस) ऊतकों के बीच प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, मेटाबोलाइट्स और लिपिड स्थानांतरित करके वैश्विक शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए सेल के बाहर कार्य करते हैं। ईवीएस मूल की अपनी कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति को दर्शाते हैं। EVs मानव स्वास्थ्य के लगभग हर पहलू में मौलिक भूमिकाओं के लिए फंसाया जाता है । इस प्रकार, ईवी प्रोटीन और आनुवंशिक कार्गो स्वास्थ्य और रोग के बायोमार्कर के लिए तेजी से विश्लेषण किया जा रहा है । हालांकि, ईवी फील्ड में अभी भी एक ट्रैक्टेबल अकशेरुकी मॉडल सिस्टम का अभाव है जो ईवी कार्गो संरचना के अध्ययन की अनुमति देता है। सी elegans अच्छी तरह से EV अनुसंधान के लिए अनुकूल है क्योंकि यह सक्रिय रूप से अपने बाहरी वातावरण में अपने शरीर के बाहर EVs स्राव, फेसियल अलगाव की अनुमति । यह लेख इन पर्यावरण की दृष्टि से स्रावित सी एलिगेंस ईवीएस को उत्पन्न करने, शुद्ध करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सभी आवश्यक जानकारी प्रदान करता है जिसमें उम्र-सिंक्रोनाइज्ड कीड़े की बहुत बड़ी आबादी के साथ मात्रात्मक रूप से काम करना, ईवी को शुद्ध करना और एक प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल शामिल है जो सीधे शुद्ध नमूने में अक्षुण्ण ईवीएस की संख्या को मापता है। इस प्रकार, सी एलिगेंस अनुसंधान के लिए उपलब्ध आनुवंशिक अभिकर्मकों की बड़ी लाइब्रेरी को ईवी कार्गो संरचना पर आनुवंशिक रास्तों और शारीरिक प्रक्रियाओं के प्रभावों की जांच के लिए टैप किया जा सकता है।

Introduction

झिल्ली से बंधे बाह्य वेसिकल्स (ईवीएस) का स्राव कोशिकाओं1के बीच विशिष्ट प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, मेटाबोलाइट और लिपिड कार्गो को सक्रिय रूप से परिवहन करके वैश्विक शारीरिक प्रक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है। कोशिकाएं ईवीएस को स्रावित करती हैं जो 2 माइक्रोन या उससे अधिक से लेकर 20 एनएम2तक के आकारों के सातत्य तक फैली हुई हैं। मेटाबोलिक विकारों, कैंसर, हृदय रोग, और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग3,4,4,5सहित रोग प्रक्रियाओं में उनके निहितार्थ के कारण छोटे ईवीएस (<200 एनएम) का तेजी से अध्ययन किया जाता है। इन विकृतियों को छोटे ईवीएस के ईवीएस कार्गो के प्रोटीन और आनुवंशिक संरचना को प्रभावित करने के लिए भी दिखाया गया है। इसलिए, पैथोलॉजी के बायोमार्कर हस्ताक्षर तेजी से ईवी कार्गो खोज विधियों जैसे एलसी-एमएस-एमएस और RNAseq6,,7,,8,,9के माध्यम से खुला किया जा रहा है।

सी elegans विकासवादी संरक्षित EV सिग्नलिंग रास्तों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी अकशेरुकी मॉडल रहा है । उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस फ्लिपपास को सबसे पहले सी एलिगेंस भ्रूण में ईवी बायोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था, और मानव होमोलॉग को मानव कोशिकाओं10,,11में ईवी रिलीज को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। सी elegans EVs को छल्ली विकास के लिए आवश्यक हेजहॉग संकेतों को ले जाने के लिए सूचित किया गया था । हेजहॉग और अन्य मॉर्फोन्स की डिलीवरी को ईवीएस की एक प्रमुख विकासात्मक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया था, और इसे जेब्राफिश, चूहों और मनुष्यों12,,13,,14,,15में संरक्षित किया गया है। सी elegans ईवी बायोमार्कर खोज के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि यह अपने शरीर के बाहर EVs स्राव करता है जो पशु-से-पशु संचार16,,17 (चित्रा 1ए)में कार्य करता है। हालांकि, पिछले अध्ययन के माध्यम से स्थापित पद्धति का उपयोग नहीं किया जा सकता है क्योंकि सूत्रकृमि ' ई कोलाई खाद्य स्रोत भी EVs18स्रावित करता है । इस विधि में, अधिकांश नमूने में ई कोलाई संदूषण शामिल है, जो सी एलिगेंस ईवी कार्गो की खोज के लिए प्रोटेओमिक या आरएनएसईक्यू दृष्टिकोणकी शक्ति को सीमित करता है। यहां वर्णित तरीकों को विशिष्ट सेल संस्कृति प्रयोगों की विशेषता के बहुतायत स्तरों पर अत्यधिक शुद्ध सी एलिगेंस ईवीएस उपज के लिए विकसित किया गया था और इस प्रकार ईवी बायोमार्कर खोज के लिए ओमिक्स दृष्टिकोण की सुविधा प्रदान की गई थी।

कार्गो विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में ईवी उत्पन्न करने के लिए कीड़े की बड़ी आबादी की आवश्यकता होती है। इसलिए, विकासात्मक रूप से सिंक्रोनाइज्ड सी एलिगेंस की बड़ी आबादी की मात्रात्मक खेती करने के तरीके भी शामिल हैं। आमतौर पर, जब प्रयोगों के लिए बड़ी संख्या में कीड़े की आवश्यकता होती है, तो उन्हें तरल मीडिया में सुसंस्कृत किया जाता है। हालांकि यह कीड़े की बड़ी आबादी पैदा करने के लिए प्रभावी है, जानवरों की शरीर विज्ञान सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) आगर प्लेटों पर मानक शर्तों के तहत खेती की कीड़े से काफी अलग है । तरल में सुसंस्कृत पशु अधिक धीरे-धीरे बढ़ते हैं, पतले होते हैं, विकासात्मक विषमता दिखाते हैं, और उच्च स्तर के बैच परिवर्तनशीलता के अधीन होते हैं। इसलिए, हम 10 सेमी उच्च विकास प्लेटों का उपयोग करके विकासात्मक रूप से सिंक्रोनाइज्ड सी एलिगेंस की बड़ी आबादी की मात्रात्मक खेती के लिए एक सरल लेकिन प्रभावी साधन प्रस्तुत करते हैं। उच्च विकास प्लेटों की मीडिया संरचना में नियमित एनजीएम प्लेटों की तुलना में अधिक पेप्टोन शामिल है और ई कोलाई स्ट्रेन NA22 के साथ वरीयता प्राप्त है जो OP50 की तुलना में अधिक मजबूती से बढ़ता है।

प्रवाह साइटोमेट्री प्रौद्योगिकी (एफएसीएस) में प्रगति ने अन्य तरीकों में अंतर्निहित सीमाओं के बिना ईवीएस के परिमाणीकरण की अनुमति देते हुए व्यक्तिगत ईवीएस20,,21के प्रत्यक्ष विश्लेषण को सक्षम किया है। पहले के काम से पता चला है कि प्रोटीन ईवी बहुतायत के लिए एक उपयोगी प्रॉक्सी नहीं है क्योंकि विभिन्न शुद्धि पद्धतियों के परिणामस्वरूप काफी अलग EV-से-प्रोटीन अनुपात22। बेहद शुद्ध ईवी अंशों में अपेक्षाकृत कम प्रोटीन होता है, जिससे बीसीए या कूमासी जैल के साथ नमूनों की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। पश्चिमी विश्लेषण व्यक्तिगत प्रोटीन के सापेक्ष मतभेदों की पहचान कर सकते हैं, लेकिन पहचान नहीं कर सकते कि कितने EVs नमूने में हैं । नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा ईवी संख्या का मजबूत मात्राकरण इसके संकीर्ण सिग्नल-टू-शोर रेंज, ईवीएस और ठोस समुचेय के बीच अंतर करने में असमर्थता और विभिन्न विनिर्देशों23के साथ उपकरणों के बीच तरीकों की हस्तांतरणीयता की कमी से बाधित होता है। इसलिए, इस लेख में ईवीएस के भेदभाव और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सामान्यीकृत प्रवाह साइटोमेट्रिक प्रक्रिया भी शामिल है।

Protocol

1. तैयारी

  1. डीएच2ओ के 100 मिलीग्राम में जिलेटिन के 2 ग्राम जोड़ें और माइक्रोवेव में गर्मी जब तक यह उबलना शुरू हो जाए। फिर हलचल और यह 20 min के लिए शांत करते हैं ।
  2. 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान पास करें और बाँझ ट्यूबों में बांटें। जिलेटिन समाधान को पाइपकर और निष्कासित करके उपयोग से तुरंत पहले जिलेटिन के साथ पिपेट युक्तियों का इलाज करें। इलाज युक्तियों या तो तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या संग्रहीत।
  3. एक बाँझ टोपी फिल्टर से झिल्ली को काट लें।
  4. 5 माइक्रोन नायलॉन जाल कपड़े का 20 सेमी वर्ग गीला और एक बाँझ टोपी फिल्टर के शीर्ष के चारों ओर जगह है। इसे कई मोटी रबर बैंड के साथ सुरक्षित करें।
    सावधानी: यह सुनिश्चित करने के लिए कपड़े की सावधानीपूर्वक जांच करें कि कोई क्रीज नहीं है। ये हवा के अंतराल बनाते हैं जो सक्शन में बाधा डालते हैं ।

2. कीड़े की बड़ी आबादी की गणना(चित्रा 1ए)

  1. भंवर और पिपेट एक कीड़ा की खेती प्लेट ढक्कन या एक गिलास स्लाइड पर कीड़ा निलंबन के 10 μL । इस प्रक्रिया को 3x दोहराएं। प्रत्येक बूंद में जानवरों की संख्या रिकॉर्ड करें।
  2. प्रति माइक्रोन दो जानवरों के लिए कीड़ा निलंबन समायोजित करें।
  3. भंवर निलंबन और एक स्लाइड या एक थाली ढक्कन पर नौ बूंदें (10 μL) पिपेट । मैन्युअल रूप से जानवरों की संख्या की गणना करें। प्रत्येक बूंद में जानवरों की संख्या रिकॉर्ड करें।
  4. प्रत्येक कृमि आबादी के प्रतिशत के रूप में मतलब (एसईएम) के मतलब और मानक त्रुटि की गणना करें।
  5. प्रत्येक आबादी में जानवरों की कुल संख्या की गणना 10 μL द्वारा मतलब मूल्य विभाजित करके और फिर μL में कीड़ा निलंबन की कुल मात्रा से गुणा ।

Figure 1
चित्रा 1: सी एलिगेंस ईवीएस को उत्पन्न करने, मात्रा बनाने और शुद्ध करने के लिए प्रक्रिया अवलोकन। (क)जानवरों की बड़ी आबादी की गिनती के लिए योजनाबद्ध । (ख)ईवीएस की कटाई के लिए कीड़े पैदा करने के लिए योजनाबद्ध । (ग) सी एलिगेंस सुपरनाटेंट से ईवीएस को शुद्ध करने के लिए योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. ईवी शुद्धि के लिए सी एलिगेंस की खेती

  1. विकासात्मक रूप से सिंक्रोनाइज्ड सी एलिगेंसकी एक बड़ी आबादी उत्पन्न करें। ऐसा करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. 6 सेमी सामान्य विकास मीडिया प्लेट पर एक ही जानवर जोड़ें। दो पीढ़ियों के लिए इनक्यूबेट और फिर दो उच्च विकास मध्यम प्लेटों पर जानवरों को धोने ।
    2. इनक्यूबेट जब तक कीड़े भोजन समाप्त हो गया है।
    3. चरण 1.4 में तैयार 5 माइक्रोन नायलॉन जाल के साथ L1 कीड़े फ़िल्टर करें। बाँझ बोतल पर स्क्रू कैप रखें, वैक्यूम शुरू करें, और फिल्टर पर कीड़े डालें। फिल्टर पर कीड़ा समुचित पर माध्यम की एक ही मात्रा पास।
    4. कीड़े की मात्रा निर्धारित करें और कुल संख्या की गणना करें (चरण 2 देखें)। हाल ही में भूखे (<24 h) कीड़े एक उच्च विकास प्लेट पर उगाए गए कीड़े लगभग 80,000 एल1 लार्वा में परिणामी हैं।
    5. 3 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज एल1 लार्वा। प्रति एमएम एल ~ 100,000 जानवरों को फिर से सस्पेंड करें।
    6. उच्च विकास प्लेट प्रति ~ 50,000 जानवरों को रखें। जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस पर तब तक खेती करें जब तक कि वे ग्राविद वयस्क (लगभग 72 घंटे) न हों।
    7. मानक साधनों से gravid वयस्कों ब्लीच और भ्रूण २.५ μg/mL कोलेस्ट्रॉल के साथ एस बेसल समाधान के 10 mL में हैच करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    8. L1 लार्वा की मात्रा (चरण 2 देखें) और फिर प्रत्येक उच्च विकास प्लेट में 50,000 कीड़े जोड़ें।
    9. 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की खेती जब तक जानवरयुवा वयस्क हैं।
  2. स्राव पीढ़ी के लिए सी एलिगेंस तैयार करें।
    1. प्रत्येक उच्च विकास प्लेट में ५० μg/mL कार्बेनिकलिन के साथ बाँझ M9 के 15 मिलीग्राम जोड़कर प्लेटों से कीड़े धोएं । सैचुरेटेड प्लेटों को 5 मिन के लिए बैठने दें। प्लेट के चारों ओर बफर का चक्कर लगाकर कीड़े उखाड़ फेंकें। स्लोशिंग से बचें। प्रत्येक प्लेट से बफर को एक अलग 50 मिलील शंकुट्यूब में डालें। प्रति प्लेट बफर के कुल 45 मीटर के लिए वॉश स्टेप 2x को और दोहराएं।
    2. कीड़े 15 min के लिए व्यवस्थित करते हैं । अधिनेत को डिडेंट करें और ट्यूब में ताजा M9 बफर का 50 मीटर जोड़ें। कुल 4x के लिए दोहराएं।
    3. एक 30% सुक्रोज कदम ढाल के शीर्ष पर कीड़े फ्लोट और एस बेसल समाधान24में जानवरों को ठीक ।
      1. संक्षेप में बर्फ के 15 मिलीएल में कीड़े को फिर से निलंबित-ठंडा १०० mM NaCl, बर्फ के 15 मिलील-ठंडा ६०% सुक्रोज जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए उलटा । एक ग्लास पिपेट धीरे परत के साथ 5 मिलीएल बर्फ की ठंड 100 मीटर NaCl सुक्रोज मिश्रण के शीर्ष पर।
      2. 5 मिन के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। कीड़े नासीएल और सुक्रोज के बीच इंटरफेस पर केंद्रित होंगे।
      3. धीरे से एक नया 50 mL शंकु ट्यूब में इंटरफ़ेस से जानवरों को बाहर पिपेट। एस बेसल समाधान को 50 मीटर में जोड़ें। कीड़े को 5 मिन व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
      4. अधिनेता को डिडेंट करें और एस बेसल समाधान के ताजा 50 एमएल जोड़ें। इसे कम से कम 3x दोहराएं।
    4. चरण 2 में वर्णित कीड़े की संख्या की मात्रा निर्धारित करें।
    5. कीड़े को प्रति माइक्रोन एक पशु के घनत्व में फिर से निलंबित करें जिसमें बाँझ एस बेसल समाधान होता है जिसमें कोलेस्ट्रॉल का 2.5 μg/mL और 50 माइक्रोन कार्बेनिकलिन होता है।
    6. स्राव पीढ़ी के लिए नमूना तैयार करने के लिए, निलंबन के 400 मिलीएल तक एक बाँझ 2 एल नीचे चकित फ्लास्क करने के लिए जोड़ें।
    7. 24 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में परिपत्र रोटेटर पर फ्लास्क रखें।

4. ईवी शुद्धि

  1. कटाई और अंशीकरण
    1. इनक्यूबेटर से कीड़े के 2L फ्लास्क निकालें और 50 मिलीग्राम शंकुई शीशियों (2 मिन के लिए 500 x ग्राम) में जानवरों को गोली दें।
    2. किसी भी कण मलबे को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर के माध्यम से अधिनेत करें।
      नोट: इस बिंदु पर, स्रावऔर वेसिकल्स युक्त फ़िल्टर किए गए सुपरनेटेंट को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. चरण 2 में वर्णित जानवरों की संख्या गिनें।
    4. एक जीवाणु लॉन पर निलंबित कीड़े की एक बूंद रखकर कीड़े की व्यवहार्यता निर्धारित करें। 15 मिन के लिए प्रतीक्षा करें और फिर चलती, झोले के मारे, या मृत के रूप में जानवरों स्कोर ।
    5. 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर सुपरनेटेंट को पुनर्जीवित नाइट्रोसेल्यूलोस 10 केडीए फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके 700 माइक्रोन को केंद्रित करें। 150 माइक्रोन एस बेसल सॉल्यूशन जोड़ें और फिर फिल्टर और भंवर पर पिपेट करें। 2x दोहराएं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 18,000 x ग्राम पर केंद्रित सुपरनेटेंट को केंद्रित करें और सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह कदम किसी भी संभावित मलबे या बड़े कणों को हटा देता है जो हैंडलिंग के दौरान जमा हो सकते हैं।
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल + EDTA जोड़ें।
      नोट: इस बिंदु पर स्राव और वेसिकल्स युक्त केंद्रित अधिनेता -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी
    1. एक खाली गुरुत्वाकर्षण प्रवाह कॉलम कारतूस में 80-200 माइक्रोन अगारोज रेसिन (गोलाकार प्रोटीन के लिए 70,000 से 40,000,000 केडीए की पोर आकार आंशिकन रेंज) डालें। प्रवाह एस बेसल समाधान जब तक रेसिन बिस्तर 10 मीटर की अंतिम मात्रा में पैक किया जाता है।
      नोट: यदि कॉलम कारतूस में बहुत अधिक रेसिन डाला जाता है, तो कॉलम के शीर्ष को तितर-बितर करें और एक पिपेट के साथ अतिरिक्त को हटा दें।
    2. कॉलम के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर एस बेसल समाधान के 40 मिलीएल पास और यह गुरुत्वाकर्षण के तहत प्रवाह करते हैं।
      सावधानी: जांच लें कि रेसिन परेशान न हो।
    3. बफर प्रवाह को तब तक प्रवाहित होने दें जब तक कि रेसिन का शीर्ष जलमग्न न हो जाए और फिर कॉलम कारतूस के नीचे को कैप करें। कॉलम के नीचे एक संग्रह ट्यूब रखें।
    4. कारतूस पर रखी टोपी निकालें। कॉलम बिस्तर के शीर्ष पर चरण 2.1 ड्रॉपवाइज में प्राप्त केंद्रित स्राव जोड़ें। एस बेसल समाधान ड्रॉपवाइज का पिपेट 1 एमएल। कॉलम के नीचे एक ताजा संग्रह ट्यूब रखें।
    5. धीरे-धीरे ऊपरी स्तंभ जलाशय को 5 एमएल एस बेसल समाधान से भरें ताकि रेसिन को परेशान न किया जा सके। एल्यूएट के पहले 2 mL ले लीजिए तो जल्दी से ट्यूबों को बदलने और अगले 4 mL इकट्ठा। यह वह अंश है जो ईवीएस के लिए समृद्ध है।
    6. एक पुनर्जीवित नाइट्रोसेल्यूलोस 10 केडीए आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) फिल्टर के साथ 300 μL के लिए एल्यूएट केंद्रित करें और स्थानांतरण एक कम बाध्यकारी माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के लिए retentate।
    7. 20 एस के लिए भंवर और फिल्टर भर में बफर pipetting द्वारा एस बेसल समाधान के 100 μL के साथ फिल्टर झिल्ली 2x धोएं। 500 μL की एक अंतिम मात्रा के लिए प्रारंभिक नमूने में जोड़ें।
    8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल जोड़ें।
    9. डाउनस्ट्रीम प्रयोगों को तुरंत करें (आरएनएसईक्यू, एलसी-एमएस-एमएस, जीसी-एमएस-एमएस, वेस्टर्न, एफएसीएस आदि) या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. ईवी बहुतायत के प्रवाह साइटोमेट्री क्वांटिफिकेशन

  1. उप तैयारी
    1. नए सिरे से डीएमएसओ का उपयोग करके डीआई-8-एनईपीएस का 10 एमएम स्टॉक तैयार करें। 10 μL aliquots में वितरित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. बाँझ फ़िल्टर पीबीएस के 90 माइक्रोन को एक ट्यूब में जोड़कर 1 एमएम वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें जिसमें 10 माइक्रोन ऑफ दनी स्टॉक है।
  2. प्रायोगिक नमूना तैयारकरना
    1. एक माइक्रोसेंट्राइज ट्यूब में एस बेसल समाधान के 840 माइक्रोन जोड़ें। इसके बाद सेक्शन 4.2 और भंवर में उत्पन्न शुद्ध ईवीएस के 60 माइक्रोन जोड़ें।
    2. अलीकोट नमूने के 300 माइक्रोसेन्ट्राइज ट्यूबमें 300 माइक्रोनली। अब तीन ट्यूबों का एक प्रयोगात्मक सेट है जिसमें पतला ईवीएस का 300 माइक्रोन है। ट्यूबों को #1-3 लेबल करें। नमूनों के लिए #2 और #3 5.1.2 में तैयार डीआई-8-ANEPPS स्टॉक के 7 μL जोड़ें । इसके बाद ट्यूब #3 में 1% ट्राइटन-एक्स 100 के 7 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब को भंवर से मिलाएं।
    3. सोनीकेट सैंपल के बीच में सोनिकेटर टिप रखकर और 20% पावर 30% ड्यूटी साइकिल पर 10 बार स्पंदन करके सैंपल #3।
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि सोनिकेटर जांच की नोक नमूने के बीच में है ताकि फोम उत्पादन को न्यूनतम रखा जा सके। फोम ईवीएस को एकत्रित करके नमूने से समझौता कर सकता है।
    4. दो माइक्रोसेंट्राइज ट्यूबों में एस बेसल समाधान के 300 माइक्रोन जोड़ें। डीआई-8-एएनईपीएस वर्किंग रिएजेंट के 7 माइक्रोन जोड़ें जो चरण 5.1 में दूसरी ट्यूब में तैयार किया गया है और "केवल डाइ" लेबल है। अन्य ट्यूब "बफर केवल" लेबल करें।
      नोट: केवल डीईई और बफर केवल नियंत्रण नमूनों और एक ही एस बेसल स्रोत के साथ प्रयोगात्मक नमूने तैयार करें।
    5. नमूनों को सीधे प्रकाश से दूर और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. FACS प्रयोगों का संचालन करें।
    1. 488 एनएम (नीला) और उत्सर्जन फिल्टर को 605 एनएम (नारंगी) पर एफएसीएस उत्तेजना फिल्टर सेट करें। प्रवाह दर को 1.5 माइक्रोन प्रति मिन में सेट करें।
    2. नैनोबीड FACS अंशांकन मिश्रण (वैकल्पिक लेकिन अनुशंसित) चलाएं।
    3. प्रत्येक नमूने को 3 मिन (180 एस) के लिए एक FACS मशीन पर चलाएं। सेकंड में सटीक रनिंग टाइम नोट करें।
  4. FACS डेटा का विश्लेषण करें।
    1. FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फ़ाइलों को खोलें।
    2. ड्रॉप-डाउन मेनू से चयन करके एक्सिसपर क्लिक करके वाई-एक्सिस को 488-Org (क्षेत्र) पर स्विच करें।
    3. प्लॉट के शीर्ष पर शुरू होने वाला आयताकार गेट सेट करें, जो साल्स स्तर 102 से 104 (<300 एनएम आकार के कण) तक फैले हुए हैं। गेट को नीचे की ओर बढ़ाएं जब तक कि इसमें कुल घटनाओं का 2.5% न हो। गेट "DI-8-ANEPPS+" घटनाओं का नाम।
  5. नमूना ईवी बहुतायत का परिमाणीकरण
    1. इस गेट को कॉपी करें और इसे अपने प्रायोगिक सेट में अन्य दो नमूनों पर चिपकादें और साथ ही बफर केवल और उप केवल नियंत्रण करें। विश्लेषण को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
    2. यदि FACS नमूने अनुशंसित 3 मिन (180 एस) के लिए नहीं चलाए गए थे, तो नमूने में सभी घटना की गिनती को सामान्य करें प्रति 180 एस की घटनाओं के लिए। उदाहरण के लिए, यदि एक नमूना 250 एस के लिए चलाया गया था, DI-8-ANEPPS + घटना संख्या 250 s/180 s द्वारा बढ़ाया जाता है।
    3. डीआई-8-एनईपीएस + घटनाओं की संख्या को घटाकर डाइ में केवल नमूना #2 में उन लोगों से नियंत्रण करके डाइ पृष्ठभूमि की घटनाओं को हटा दें।
    4. नमूना #1 में DI-8-ANEPPS + घटनाओं की संख्या घटाकर आइसोटाइप पृष्ठभूमि की घटनाओं को हटा दें।
    5. नमूना #3 में डीआई-8-एएनपीएप्स + घटनाओं की संख्या घटाकर डिटर्जेंट-असंवेदनशील घटनाओं को हटा दें। यह मूल्य सदाशयी ईवीएस की संख्या है।
    6. माइक्रोन में विश्लेषण की गई मात्रा (चरण 5.3 में वर्णित 4.5 माइक्रोन) द्वारा चरण 5.5 में गणना किए गए मूल्य को विभाजित करके नमूना के 1 माइक्रोन में ईवीएस की संख्या की गणना करें और कमजोर पड़ने वाले कारक (चरण 2.5 में वर्णित 10x) द्वारा गुणा करें। इस मूल्य को ईवी तैयारी में शेष माइक्रोन की संख्या से गुणा करें। यह डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपलब्ध ईवीएस की संख्या है।

Figure 2
चित्रा 2: ईवी बहुतायत की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री नमूना तैयारी की योजनाबद्ध। (A)ईवी तैयारी को तीन समान नमूनों में विभाजित किया गया है। नमूना # 1 कोई अद्यतित नकारात्मक नियंत्रण है। डीआई-8-एएनपीएप्स को #2 और #3 के नमूनों में जोड़ा जाता है । इसके बाद ट्राइटन-एक्स 100 को सैंपल #3 में जोड़ा जाता है। हरे तीर इंगित करता है कि केवल नमूना #3 बाद में सोनिकेट किया जाता है। प्रवाह से डेटा FACS नमूनों में डिटर्जेंट संवेदनशील ईवीएस की पूर्ण संख्या निर्धारित करने में मदद और फिर कुल तैयारी में EVs की बहुतायत की गणना । रंग-सकारात्मक घटनाओं का निर्धारण करने के लिए गेट नमूना #1 के साथ सेट किया गया है, जिसमें कोई रंग नहीं होता है। स्प्रेडशीट डेटा पर लाल लेखन को वर्णन करना है कि डिटर्जेंट-इलाज नमूने से रंग-सकारात्मक घटनाओं को रंगे के साथ नमूने से घटाया जाता है। (ख)एक एफएसीएस में ईवीएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए समीकरणों ने नमूने का विश्लेषण किया और नमूने में ईवीएस की कुल संख्या की गणना की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Representative Results

ईवीएस को पैदा करने और शुद्ध करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं के लिए एक योजनाबद्ध चित्रित 1में दिखाया गया है। प्रत्येक चरण को पूरा करने के लिए आवश्यक विशिष्ट समय नीचे दिखाए जाते हैं। चित्रा 2 डीआई-8-एनिप्स(चित्रा 2ए)के साथ-साथ एक नमूने में ईवीएस की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए आवश्यक गणना(चित्रा 2B)का उपयोग करके एफएसीएस विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने के लिए एक योजनाबद्ध दिखाता है।

10 जैविक प्रतिकृतियों से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3एमें दिखाए गए हैं । प्रतिकृति यों के बीच परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण नहीं है और जनसंख्या के आकार का विशिष्ट एसईएम 10% से थोड़ा अधिक है(चित्रा 3बी)। कीड़े को छानने और ताजा उच्च विकास प्लेटों पर खेती करने से ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन के लिए उपयुक्त ग्राविद वयस्कों की एक बड़ी आबादी उत्पन्न होगी। इस तरह से संसाधित एक एकल भूखे प्लेट 1 x 106 या अधिक सिंक्रोनाइज्ड संतान की एक प्रयोगात्मक आबादी का उत्पादन कर सकती है क्योंकि प्रत्येक ग्राविद वयस्क में लगभग 10 अंडे होंगे। पुराने जानवरों से ईवीएस प्राप्त करने के लिए 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से अंडे और लार्वा को फ़िल्टर करके विकासात्मक रूप से सिंक्रोनाइज्ड आबादी की बड़ी आबादी को बनाए रखना संभव है। बनाए रखा वयस्कों प्रति प्लेट २०,००० जानवरों के घनत्व पर ताजा उच्च विकास प्लेटों को स्थानांतरित कर रहे हैं । यह प्रक्रिया हर 2 दिन में दोहराई जाती थी। चित्रा 3सी कृमि आबादी के तीन जैविक प्रतिकृति से पता चलता है तीन प्लेट हस्तांतरण भर में ले जाया जा रहा है । प्लेटों के बीच जानवरों के स्थानांतरित होने से जानवरों का लगभग 10% नुकसान होता है(चित्रा 3सी)जबकि लगभग 20% जानवर सुक्रोज फ्लोटेशन स्टेप(चित्रा 3डी)में खो जाते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: ईवी विश्लेषण के लिए सी एलिगेंस की बड़ी आबादी का परिमाणीकरण। (A)हाल ही में भूखे (<24 h) उच्च विकास प्लेट से अलग एल1 लार्वा चरण कीड़े की संख्या की तुलना । 10 जैविक प्रतिकृतियों में से प्रत्येक के मूल्यों की साजिश रची है। 10 प्रतिकृतियों में सभी डेटा बिंदुओं का योग भी एक वायलिन साजिश और S.E.M. के साथ बार के रूप में प्रस्तुत किया गया है इससे पता चलता है कि हाल ही में भूखे कीड़े की एक प्लेट ~ 80,000 L1 लार्वा चरण कीड़े निकलेगी। (ख)पैनल ए में 15 विभिन्न प्लेट जनसंख्या मापन के S.E.M. व्यक्तिगत बिंदुओं के रूप में साजिश रची । आम तौर पर, S.E.M. 10% से थोड़ा अधिक है । (ग)हर 4 घंटे प्लेटों के बीच दो स्थानान्तरण के बाद कृमि आबादी की तीन जैविक प्रतिकृति का अनुमान लगाया गया था । प्लेटों के बीच जानवरों के इस हस्तांतरण के परिणामस्वरूप जनसंख्या के आकार में काफी कमी नहीं आई। यह इंगित करता है कि कीड़े को स्थानांतरित करने के लिए यहां प्रस्तुत पद्धति के परिणामस्वरूप जानवरों का महत्वपूर्ण नुकसान नहीं होता है। (घ)तीन ईवी प्रायोगिक प्रतिकृतियों के पाठ्यक्रम के साथ ली गई जनसंख्या माप: प्रयोग शुरू करने वाले मूल एल1 लार्वा के लिए अनुमानित जानवरों की संख्या, सुक्रोज फ्लोट से बरामद युवा वयस्क जानवरों की संख्या और 24 घंटे ऊष्मायन अवधि के लिए तैयार, स्राव की वसूली पर ईवी तैयारी से गिने गए जानवरों की संख्या । L1 लार्वा चरण में प्रारंभिक जनसंख्या अनुमान के बीच जनसंख्या के आकार में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण कमी नहीं है और बाद में जब जानवर युवा वयस्क होते हैं। मतलब L1 जनसंख्या माप १००% के रूप में नामित किया गया था और अंय सभी माप इस मूल्य के लिए उनके संबंध से पहुंचा रहे थे । त्रुटि सलाखों के S.E.M. *= पी मूल्य & ०.०५, एन एस = एक पैरामेट्रिक बनती टी-टेस्ट में महत्वपूर्ण नहीं है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटीन से पशु अनुपात एक ईवी तैयारी की विशेषता के लिए एक उपयोगी मीट्रिक है। यह मीट्रिक EV तैयारी के बीच स्थिरता का निर्धारण करने के लिए एक त्वरित साधन प्रदान कर सकता है। औसतन, 1,000 जंगली प्रकार के युवा वयस्क जानवर अपने पर्यावरण में 10 केडीए से बड़े प्रोटीन के 1 μg स्रावित करेंगे(चित्र4ए)। जब यह अंश आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी से आगे अलग हो जाता है, तो कुल प्रोटीन एल्यूशन प्रोफाइल 8 mL के बाद 2-6 mL और एक बड़ी चोटी के बीच एक छोटा प्रोटीन चोटी दिखाता है। ईवीएस कॉलम एल्यूएट(चित्रा 4बी)के पहले 5 मिलील में निहित हैं। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण कॉलम एल्यूएट के पहले 5 mL में छोटे, ~ 150 एनएम ईवीएस(चित्रा 4सी)की मोनोडिस्फेव आबादी शामिल है। आकार अपवर्जन अंशों की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एल्यूएट के 2-6 मिलीआर अंश में प्रचुर मात्रा में ईवीएस का पता चलता है लेकिन बाद में एल्यूएट वॉल्यूम में नहीं। ईवीएस अपने कप की तरह आकार के लिए जाना जाता है और इसलिए ठोस कणों से भेदभाव करना आसान है जो नकारात्मक धुंधला परिस्थितियों(चित्रा 4डी)के तहत तैयार होने पर उज्ज्वल बिंदुओं को विराम देते हैं।

Figure 4
चित्रा 4: कुल स्रावित बायोमास से सी एलिगेंस ईवीएस का शुद्धिकरण। (क)10 जैविक प्रतिकृतियों की तैयारी में इनक्यूबेटेड कीड़े की संख्या के लिए 10 केडीए से बड़े कुल प्रोटीन के अनुपात की साजिश रची गई थी । अधिकांश तैयारियों में प्रति 1,000 जानवरों में 1 μg प्रोटीन था। (ख)केंद्रित स्राव के 1 मिलीग्राम से भरे 10 मिलीएल रेसिन कॉलम से प्रोटीन एल्यूशन प्रोफाइल। आगे के विश्लेषणों में समेकित अंश समूहों में छायांकित होते हैं । (C)समेकित रेसिन एल्यूट अंशों का नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण 2-6 मिलीएल। 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल को छायांकित ग्रे किया गया है। (D)समेकित रेसिन के टेम विश्लेषण से अंश ों का विश्लेषण किया जाता है । शुरुआती सामग्री में वेसिकल जैसे कण और गैर-वेसिकल कण दोनों थे। समेकित 2-6 मिलीएल एल्यूशन अंश कुछ गैर-वेसिकल कणों के साथ वेसिकल्स के लिए समृद्ध था। 7-11 मिलीस समेकित अंशों में कुछ वेसिकल जैसे कण थे लेकिन कई गैर-वेसिकल कण थे। 12-15 मिलीएल एल्यूशन अंशों में केवल गैर-वेसिकल कण थे। सभी माइक्रोग्राफ एक ही आवर्धन पर दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 200 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सी एलिगेंस और मानव ईवीएस के बीच प्रवाह साइटोमेट्री विशेषताओं की सीधे तुलना करने के लिए, हमने इस विधि के साथ मानव न्यूरॉन्स की कोशिका संस्कृतियों के वातानुकूलित मीडिया से ईवीएस को शुद्ध किया। फ्लो साइटोमेट्री प्रकाश बिखरने के आधार पर कणों को अलग करता है। छोटे कोण प्रकाश बिखरने (SALS) मोटे तौर पर आकार के साथ संबंधित है, और लंबे कोण प्रकाश बिखरने (लाल्स) आंतरिक झिल्ली संरचना के साथ संबंधित है । दोनों सेल संस्कृति और सी elegans EV तैयारी से कुल नमूना घटनाओं के बहुमत कसकर एक क्लस्टर में ध्यान केंद्रित कर रहे है १०३ साल्स और १०४ लाल्स(चित्रा 5ए)के आसपास केंद्रित है । सी एलिगेंस ईवी नमूना SALS द्वारा हल की घटनाओं के एक हिस्टोग्राम से पता चलता है कि सभी तैयारी ~ 103 (चित्रा 5बी)पर चोटी ।

Figure 5
चित्रा 5: सी elegans EVs स्पष्ट रूप से उनके प्रकाश बिखरने गुणों से परिभाषित कर रहे हैं । (A) सी एलिगेंस ईवीएस की तीन जैविक प्रतिकृतिमें साल्स की घटनाओं का हिस्टोग्राम। कुल नमूना घटनाओं का ~ 80% एक तंग, स्पष्ट रूप से परिभाषित आबादी के भीतर निहित हैं। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के समान, यह दर्शाता है कि सी एलिगेंस ईवीएस का आकार वितरण मोनोस्फेव है। नमूनों को पतला करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले एस बेसल बफर का हिस्टोग्राम तुलना के लिए दिखाया गया है। (ख) सी एलिगेंस और मानव कोशिका संस्कृति ईवीएस के अपवर्तक गुणों की तुलना इस पाठ में वर्णित तरीकों से शुद्ध होती है । दोनों EV प्रकार लगातार तुलनीय लघु और लंबे कोण प्रकाश बिखरने वितरण (SALS और लाल्स) मौजूद हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

DI-8-ANEPPS मजबूती से सी elegans EVs लेबल, लगातार दोनों सी elegans और सेल संस्कृति में कुल घटनाओं के बहुमत पर प्रकाश डाला नमूने व्युत्पन्न । अंशांकन मोतियों और नियंत्रणों को चित्र6एमें प्रस्तुत किया जाता है। व्यक्तिगत FACS तितर बितर भूखंडों एक सी elegans नमूना २००,००० जानवरों (#1) से तैयार और दो ५००,००० जानवरों(चित्र6बी)से तैयार से दिखाया गया है । या तो 100 मिलील (#1) या सेल संस्कृति के 200 मिलील (#2,3) से EVs का भी विश्लेषण किया गया(चित्र6सी)। सी एलिगेंस और सेल कल्चर दोनों व्युत्पन्न नमूनों में प्रचुर मात्रा में फ्लोरोसेंट घटनाओं को दिखाया गया है जो 0.05% ट्राइटन-एक्स 100 और प्रकाश ध्वनि के साथ इलाज करने पर गायब हो गए थे। यह दर्शाता है कि लेबल की घटनाएं डिटर्जेंट-असंवेदनशील ठोस लिपोप्रोटीन समुचित के बजाय डिटर्जेंट लेबिले फॉस्फोलिपिड संरचनाएं (वेसिकल्स) हैं। ईवी बहुतायत डिटर्जेंट के बिना अंशों के बीच DI-8-ANEPPS + गेट में घटनाओं की संख्या के बीच अंतर के रूप में गणना की है (-) और डिटर्जेंट (+) के साथ डाइ केवल नियंत्रण में घटनाओं को कम । स्पष्टता के लिए, चित्रा 6बी और चित्रा 6सी में व्यक्तिगत रूप से प्रस्तुत डेटा चित्रा 6डी और चित्रा 6ईमें बार रेखांकन के रूप में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है । शुद्ध EVs की बहुतायत सी elegans और सेल संस्कृति प्राप्त तैयारी(चित्र6एफ)के बीच काफी अलग नहीं था ।

Figure 6
चित्रा 6: ईवी बहुतायत की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के उदाहरण। (क)यह सुनिश्चित करने के लिए कि घटनाओं की संख्या सीधे नमूनों के बीच तुलना की जा सकती है, बफर केवल बफर और बफर और डीईई केवल नियंत्रण को ईवी नमूना अंशों के रूप में एक ही प्रवाह दर और संग्रह समय पर चलाने की आवश्यकता है। डीआई-8-एएनपीएप्स गेट में बहुत कम इवेंट होते हैं। (ख) सी एलिगेंससे डीआई-8-एएनपीएप्स और डिटर्जेंट ट्रीटमेंट प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि परिणाम । तीन जैविक प्रतिकृतियां दिखाई जाती हैं। जैविक नकल #1 २००,००० जानवरों से तैयार किया गया था, जबकि #2 और #3 ५००,००० जानवरों से तैयार किया गया । डिटर्जेंट उपचार के साथ ईवीएस का गायब होना सभी मामलों में स्पष्ट है। (ग)मानव कोशिका संस्कृति वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके डीआई-8-एएनपीएप्स और डिटर्जेंट उपचार प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि परिणाम । जैविक प्रतिकृति #1 और #2 वातानुकूलित मीडिया के २०० मिलील से तैयार किए गए थे, जबकि जैविक प्रतिकृति #3 १०० मीटर से तैयार किया गया था । (D) सी एलिगेंस ईवीएस की तीन जैविक प्रतिकृतियों से एकत्र किए गए आंकड़ों का बार ग्राफ। त्रुटि सलाखों = S.E.M. उपचार के बीच दो पूंछ टी परीक्षण बनती है । = पी वैल्यू एंड एलटी; 0.001। (ई)सेल संस्कृति के तीन जैविक प्रतिकृति से एकत्र किए गए आंकड़ों का बार ग्राफ ईवीएस प्राप्त करता है । उपचार के बीच दो पूंछ टी परीक्षण बनती है । = पी वैल्यू एंड एलटी; 0.001(एफ) सी एलिगन्स और सेल कल्चर की सभी जैविक प्रतिकृतियों के लिए प्रति माइक्रोन के अनुसार रंग-लेबल डिटर्जेंट-संवेदनशील घटनाओं की संख्या की गणना की गई थी। दो ईवी नमूना स्रोतों के बीच मूल्य काफी अलग नहीं है। उपचार पी मूल्य = 0.685 के बीच दो पूंछ टी परीक्षण जोड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1 में प्रत्येक नमूना प्रकार के पूर्ण 4.5 माइक्रोन के लिए कच्चे प्रयोगात्मक मूल्य शामिल हैं। 500,000 जानवरों से शुद्ध ईवी अंशों से एकत्र की गई घटनाओं की कुल संख्या अकेले बफर द्वारा एकत्र किए गए कणों की पृष्ठभूमि संख्या पर 10-20x थी जबकि 200,000 जानवरों से शुद्ध अंश में अकेले बफर के रूप में कई घटनाओं के बारे में 2x निहित था। प्रत्येक नमूने के लिए डीआई-8-एएनपीएपीएस + गेट के भीतर की घटनाओं की संख्या भी दिखाई गई है। इन मैट्रिक्स को ऊपर वर्णित रंग-सकारात्मक, डिटर्जेंट-संवेदनशील ईवीएस की संख्या की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट में आयात किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, दिखाए गए पहले सी एलिगेंस जैविक दोहराने के 1 मिलील में ईवीएस की संख्या की गणना इस तरह की जाएगी:

(18,974 - 3,853 - 1,487) एक्स (10/4.5) x 1,000 = 30,297,778।

तालिका 1: सारणीबद्ध प्रवाह साइटोमेट्री डेटा। चित्र6 में दिखाए गए डेटा को स्प्रेडशीट के रूप में प्रस्तुत किया गया है। प्रत्येक नमूने के लिए कुल घटनाओं और DI-8-ANEPPS + gated घटनाओं दिखाया जाता है । प्रोटोकॉल में नमूनों #1-3 के क्रम में प्रत्येक जैविक प्रतिकृति की व्यवस्था की जाती है। इन मैट्रिक्स से पता चलता है कि सी elegans ५००,००० जानवरों या सेल संस्कृति वातानुकूलित मीडिया के २०० mL से तैयार नमूनों से एकत्र की घटनाओं की कुल संख्या अकेले बफर द्वारा एकत्र कणों की पृष्ठभूमि संख्या पर 10-20x था, जबकि जैविक दोहराने २००,००० जानवरों से शुद्ध अकेले बफर के रूप में कई कुल घटनाओं के बारे में 2x निहित । प्रत्येक नमूने के लिए डीआई-8-एएनपीएपीएस + गेट के भीतर की घटनाओं की संख्या भी दिखाई गई है। इन मीट्रिक को ईवीएस की कुल संख्या की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट में निर्यात किया जा सकता है। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

ईवी क्षेत्र की एक मूलभूत चुनौती ईवी उपप्रकार2की विस्तृत विविधता को अलग कर रही है । यहां वर्णित विधियां छोटे ईवीएस की शुद्ध आबादी उत्पन्न करने के लिए निस्पंदन, अंतर केंद्रीकरण और आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करती हैं क्योंकि ~ 100 एनएम ईवी पहले बाहरी वातावरण में स्रावित और शारीरिक रूप से प्रासंगिक संचार मार्गों16में कार्य करते हुए दिखाए गए थे। आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से शुद्ध ईवीएस अभी भी एक्सोसोम और छोटे माइक्रोवेसिकल्स का मिश्रण हो सकता है क्योंकि ये ईवी उपवर्ग इसी तरह आकार के होते हैं। कशेरुकी ईवी उपवर्ग आमतौर पर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन से अलग होते हैं क्योंकि यह विधि चयनात्मक झिल्ली प्रोटीन मार्कर के लिए बाध्यकारी के माध्यम से ईवीएस को अलग करती है। वर्णित तरीकों सी elegans EV झिल्ली मार्कर प्रोटीन की पहचान की सुविधा । इसलिए, भविष्य में एनालॉग इम्यूनोप्रिसिप्रिशन विधियों के माध्यम से छोटे ईवी उपवर्गों को और अलग करना संभव हो सकता है। सिद्धांत रूप में, इम्यूनोप्रिसिप्रिशन ईवीएस को अच्छी तरह से खिलाया कीड़े से अलग कर सकता है क्योंकि ई. कोलाई ईवीएस को एंटीबॉडी के साथ बातचीत नहीं करनी चाहिए। बड़े EV उपवर्गों (>200 एनएम) के प्रोटीन और आनुवंशिक कार्गो की पहचान करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ता ०.२२ माइक्रोन निस्पंदन कदम को लंघन करके और फिर अतिशयोक्ति के बजाय गोली का विश्लेषण करके ऐसा कर सकते हैं । बड़े ईवीएस के प्रोटीन और आनुवंशिक कार्गो बहुतायत को उजागर करने से शारीरिक प्रक्रियाओं की अधिक व्यापक समझ स्थापित होगी जो सी एलिगेंस स्राव के माध्यम से कार्य करती हैं। पर्यावरण में स्रावित होने के अलावा, सी एलिगेंस ईवीएस ऊतकों के बीच आंतरिक रूप से स्थानांतरित किए जाते हैं। इसलिए, ये विधियां केवल कुल सी एलिगेंस ईवीएस के सबसेट को अलग करती हैं। हालांकि, आंतरिक ईवीएस की कार्गो खोज संभव नहीं है क्योंकि EVs को lysed कीड़े से अलग करने के लिए कोई तरीका नहीं है। इस बाहरी रूप से स्रावित ईवी सबसेट का कार्गो विश्लेषण आंतरिक ईवीएस को लेबल करने में सक्षम संभावित सामान्य ईवी प्रोटीन मार्कर की पहचान करने का साधन प्रदान करता है।

ईवी तैयारी का पैमाना प्रयोग की मांगों पर निर्भर करेगा। कुल 500,000 युवा वयस्क प्रवाह साइटोमेट्री, एलसी-एमएस-एमएस और समानांतर में RNAseq विश्लेषण आयोजित करने के लिए पर्याप्त ईवीएस प्रदान करते हैं। प्रायोगिक जरूरतों के आधार पर इस संख्या को बढ़ाया या नीचे किया जा सकता है। स्केलिंग के लिए सबसे बड़ा व्यावहारिक कारक आवश्यक 10 सेमी उच्च विकास प्लेटों की संख्या है। 20x के 500 माइक्रोन के साथ तैयार उच्च विकास प्लेटें रातोंरात NA22 संस्कृति वयस्कता के पहले दिन तक L1 लार्वा चरण से ~ 50,000 वयस्कों की आबादी का समर्थन करेंगी। इसलिए, 500,000 वयस्कों के साथ एक प्रयोग करने के लिए, 13 उच्च विकास प्लेटों की आवश्यकता होती है: एल1एस की आबादी उत्पन्न करने के लिए एक प्लेट, ब्लीचिंग के लिए वयस्कों को उत्पन्न करने के लिए दो प्लेटें, और प्रायोगिक जानवरों के विकास के लिए 10 प्लेटें। ये मीट्रिक उच्च विकास प्लेटों की सीडिंग और बैक्टीरियल विकास की स्थिति पर आकस्मिक हैं। इसलिए, सभी प्लेटों को मानकीकृत तरीके से बनाने और फिर ज्ञात मात्रा में जानवरों के साथ कैलिब्रेट करने की सिफारिश की जाती है।

कीड़े खेती की प्रक्रिया के दौरान दो चरणों में गिना जाता है: 1) प्लेटों पर कीड़े बोने से पहले और 2) वातानुकूलित मीडिया पैदा करने से पहले । पशु खेती घनत्व व्यवहार, विकास, और तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है15,,16,,17,,18 और इसलिए, यह भी EV कार्गो को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, लगातार खेती घनत्व के लिए कृमि आबादी का सही अनुमान लगाना आवश्यक है। नौ बूंदों में कीड़े की संख्या का पता लगाने से जनसंख्या अनुमानों का सांख्यिकीय विश्वास होता है । प्रत्येक बूंद को व्यक्तिगत रूप से इलाज करना, प्रत्येक बूंद के बीच भंवर करना और कीड़ा निलंबन में एक ही दूरी को पिपेट डालने के लिए आवश्यक है। इन सावधानियों को ध्यान में रखते हुए कुल आबादी का ~ 5-10% के एस.ई.एम. मूल्यसुनिश्चित होंगे। यदि एक कीड़ा आबादी के लिए S.E.M. 20% से अधिक है, तो कुछ धराशायी हो गया ।

24 एच बैक्टीरिया मुक्त ऊष्मायन अवधि के बाद, युवा, जंगली प्रकार सी elegans एक जीवाणु लॉन के अलावा तुरंत क्रॉल । यह इंगित करता है कि ऊष्मायन उनके स्वास्थ्य को गंभीर रूप से प्रभावित नहीं करता है। हालांकि, यह कदम जानवरों के शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है और इसलिए ईवी कार्गो की संरचना को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, बहुत बीमार जीनोटाइप या पुराने जानवरों के साथ काम करते समय, ऊष्मायन चरण के बाद व्यवहार्यता की जांच करना आवश्यक है। यदि सभी जानवरऊष्णा से जीवित नहीं रहते हैं, तो प्रायोगिक जनसंख्या का आकार बढ़ाएं और ऊष्मायन के समय को कम करें। वातानुकूलित मीडिया की बड़ी मात्रा के साथ काम करते समय, पुनर्जीवित नाइट्रोसेल्यूलोज से बने फिल्टर के साथ उभारा हुआ सेल केंद्रित का उपयोग करना अधिक व्यावहारिक है। ईवीएस इस फिल्टर रसायन विज्ञान को अन्य फिल्टर प्रकार14के रूप में दृढ़ता से बाध्य नहीं करते हैं ।

तैयारी करने के लिए इनक्यूबेटेड जानवरों की संख्या के लिए वातानुकूलित मीडिया से बरामद कुल प्रोटीन का अनुपात एक उपयोगी मीट्रिक है । यदि यह अनुपात अपेक्षा से कहीं अधिक है, तो यह संभव है कि जनसंख्या अनुमान बंद थे या कि पशुओं की मृत्यु हो गई और वातानुकूलित मीडिया में खराब हो गया । यदि यह अनुपात उम्मीद से बहुत कम है, तो एकाग्रता प्रक्रिया के दौरान फिल्टर पर कुछ प्रोटीन खो गया हो सकता है। जबकि FACS तरीके सीधे तैयारी में ईवीएस की मात्रा निर्धारित करेंगे, यह मीट्रिक उपयोगी है क्योंकि यह प्रक्रिया में जल्दी नमूना विसंगतियों को उजागर कर सकता है। ईवी तैयारी की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए एक और उपयोगी तरीका ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी है, जैसा कि चित्र4Dमें दिखाया गया है। हालांकि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल औपचारिक रूप से लंबाई के कारण इस तरीकों लेख में शामिल नहीं है, यह मानक तरीकों से आयोजित किया जा सकता है । ईवी तैयारियों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एफएसीएस के लिए एक मानार्थ विधि के रूप में कम से कम शुरू में इस प्रकार के विश्लेषण का संचालन करने की सिफारिश की जाती है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए ताजा डिस्चार्ज किए गए फॉर्म्वर-कार्बन ग्रिड का उपयोग करें और नमूनों को मूत्र एसीटेट के बजाय 2% फॉस्फोतुंगस्टिक एसिड के साथ दाग दें।

DI-8-ANEPPS चुना गया था क्योंकि यह मात्रात्मक लेबल EV झिल्ली के लिए दिखाया गया है, मानव बायोप्सी नमूनों और liposomes25के साथ अंय सामांय EV रंगों से बेहतर प्रदर्शन । माप जल्दी कर रहे हैं, प्रत्येक नमूने के लिए संग्रह समय के केवल 3 मिन ले । डिटर्जेंट-संवेदनशील ईवीएस के परिमाणीकरण का प्रत्यक्ष कार्यात्मक महत्व है क्योंकि यह ईवीएस और ठोस लिपोप्रोटीन समुचेश के बीच एक मौलिक भौतिक अंतर को भुनाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह विधि कुल प्रोटीन या गैर-ईवी समुचेय की संख्या की मात्रा से प्रभावित नहीं होती है और इसलिए निष्पक्ष तरीके से विभिन्न शुद्धिकरण विधियों के माध्यम से प्राप्त ईवी की मात्रा निर्धारित कर सकती है। FACS-सत्यापित EV मीट्रिक हम यहां वर्णन अध्ययन है कि शुद्ध EVs के शारीरिक प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा । यह सामान्य रूप से ईवी क्षेत्र को सार्वभौमिक मीट्रिक के रूप में एक FACS पद्धति स्थापित करने के लिए भी लाभ पहुंचा सकता है ताकि पूर्ण ईवी बहुतायत सीधे अध्ययन ों में तुलना की जा सके। महत्वपूर्ण रंग सी एलिगेंस ईवीएस को भी लेबल कर सकते हैं, लेकिन वे डीआई-8-एनिप्स के साथ लेबल किए गए ईवीएस के रूप में उज्ज्वल नहीं हैं।

यह शुद्धि दृष्टिकोण अक्षुण्ण, जीवित कीड़े के शरीर के बाहर ईवीएस के सक्रिय स्राव पर कैपिटल बनाता है। यह सी एलिगेंस ईवीएस को सेल संस्कृति, विनिर्देशों से तुलनीय शुद्धता और बहुतायत में अलग होने की अनुमति देता है जो एलसी-एमएस-एमएस और आरएनसेक विश्लेषण26के माध्यम से सैकड़ों प्रोटीन और आरएनए कार्गो की पहचान करने के लिए पर्याप्त हैं। इस प्रकार, सी एलिगेंस अनुसंधान के लिए उपलब्ध अभिकर्मकों की बड़ी लाइब्रेरी को ईवी कार्गो संरचना पर आनुवंशिक और शारीरिक क्षोभ के प्रभाव की जांच के लिए लीवरेज किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम कृतज्ञता से कृमि प्लेटों और अभिकर्मकों के लिए निक Terzopoulos स्वीकार करते हैं; N2 सूत्रकृमि लाइन के लिए अनुसंधान बुनियादी ढांचा कार्यक्रम (P40 OD010440) के एनआईएच कार्यालय में Caenorhabditis आनुवंशिकी केंद्र (सीजीसी); नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ सहायता के लिए लूसिया वोजटेक, पीएचडी; जेसिका यंग, पीएचडी, और मैरी क्लेयर, एमडी, पीएचडी, hiPSC-व्युत्पन्न न्यूरोनल वातानुकूलित सेल मीडिया के लिए; TEM इमेजिंग के साथ सहायता के लिए वाई वेदना । इस काम को जेसीआर को एमके और एनआईएच ग्रांट AG054098 को एनआईएच ग्रांट P30AG013280 ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05% to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2 L bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms

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References

  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
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Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).

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