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Biology

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

Published: March 31, 2020 doi: 10.3791/60596
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Washington

Summary

Este artigo apresenta métodos para gerar, purificar e quantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.

Abstract

A secreção de pequenas vesículas ligadas à membrana no ambiente externo é um processo fisiológico fundamental de todas as células. Essas vesículas extracelulares (EVs) funcionam fora da célula para regular processos fisiológicos globais, transferindo proteínas, ácidos nucleicos, metabólitos e lipídios entre tecidos. Os EVs refletem o estado fisiológico de suas células de origem. Os EVs estão implicados por terem papéis fundamentais em praticamente todos os aspectos da saúde humana. Assim, a proteína EV e as cargas genéticas estão sendo cada vez mais analisadas para biomarcadores de saúde e doenças. No entanto, o campo EV ainda carece de um sistema de modelo invertebrado tratável que permita o estudo da composição da carga EV. C. elegans é adequado para a pesquisa de EV porque secreta ativamente Os EVs fora de seu corpo em seu ambiente externo, permitindo o isolamento fácil. Este artigo fornece todas as informações necessárias para gerar, purificar e quantificar esses EVs C. elegans ambientalmente secretados, incluindo como trabalhar quantitativamente com populações muito grandes de worms sincronizados por idade, purificar EVs e um protocolo de citometria de fluxo que mede diretamente o número de EVs intactos na amostra purificada. Assim, a grande biblioteca de reagentes genéticos disponíveis para a pesquisa de C. elegans pode ser aproveitada para investigar os impactos das vias genéticas e processos fisiológicos na composição da carga EV.

Introduction

A secreção de vesículas extracelulares ligadas à membrana (EVs) facilita os processos fisiológicos globais transportando ativamente cargas específicas de proteína, ácido nucleico, metabólito e lipídio entre as células1. As células secretam EVs que abrangem um contínuo de tamanhos que variam de 2 μm ou superior a até 20 nm2. Pequenos EVs (<200 nm) são cada vez mais estudados devido à sua implicação em processos patológicos, incluindo distúrbios metabólicos, câncer, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas3,4,5. Essas patologias também têm sido demonstradas para influenciar a proteína e a composição genética de cargas EVs de pequenos EVs. Portanto, as assinaturas biomarcadores da patologia estão cada vez mais sendo descobertas através de métodos de descoberta de carga EV, tais como LC-MS-MS e RNAseq6,,7,,8,9.

C. elegans tem sido um modelo invertebrado útil para identificar vias de sinalização EV conservadas evolutivamente. Por exemplo, uma flippase c. elegans foi mostrada pela primeira vez para induzir a biogênese ev em embriões C. elegans, e o homolog humano foi mostrado para influenciar a liberação de EV em células humanas10,11. C. elegans EVs foram relatados para transportar sinais hedgehog necessários para o desenvolvimento de cutículas. A entrega de Ouriço e outros morfogênios foi demonstrada para desempenhar um papel de desenvolvimento importante dos EVs, e é conservada em zebrafish, camundongos e humanos12,13,14,15. C. elegans é adequado para a descoberta de biomarcadores EV porque secreta EVs fora de seu corpo que funcionam na comunicação animal-animal16,17 (Figura 1A). No entanto, a metodologia estabelecida através de um estudo anterior não pode ser utilizada porque a fonte de alimento E. coli dos nematóides também secreta os EVs18. Neste método, a maior parte da amostra é composta por contaminação por E. coli, limitando o poder das abordagens proteômicas ou RNAseq para a descoberta de cargas De C. elegans EV. Os métodos descritos aqui foram desenvolvidos para produzir EVs C. elegans altamente puros em níveis de abundância característicos de experimentos típicos de cultura celular e, assim, facilitar abordagens ômicas para a descoberta de biomarcadores EV.

Grandes populações de vermes são necessárias para gerar um número suficiente de EVs para análise de carga. Portanto, também estão incluídos métodos de condução do cultivo quantitativo de grandes populações de C. elegans sincronizados em desenvolvimento. Normalmente, quando um grande número de vermes são necessários para experimentos, eles são cultivados em mídia líquida. Embora isso seja eficaz para gerar grandes populações de vermes, a fisiologia dos animais é consideravelmente diferente dos vermes cultivados em condições padrão em placas de ágar do meio de crescimento de nematóides (NGM). Animais cultivados em líquido crescem mais lentamente, são mais finos, mostram heterogeneidade do desenvolvimento e são submetidos a um alto grau de variabilidade do lote. Portanto, apresentamos um meio simples, mas eficaz para o cultivo quantitativo de grandes populações de C. elegans sincronizados em desenvolvimento utilizando placas de crescimento de 10 cm de altura. A composição da mídia de placas de alto crescimento inclui mais peptoque do que placas NGM regulares e são semeadas com a estirpe E. coli NA22 que cresce mais robustamente do que OP50.

Os avanços na tecnologia de citometria de fluxo (FACS) permitiram a análise direta de EVs individuais20,21, permitindo a quantificação de EVs sem as limitações inerentes em outros métodos. Trabalhos anteriores mostraram que a proteína não é um proxy útil para a abundância de EV porque diferentes metodologias de purificação resultam em relações EV-proteínas significativamente diferentes22. Frações de EV extremamente puras contêm relativamente pouca proteína, dificultando a quantificação de amostras com géis BCA ou Coomassie. A análise ocidental pode identificar diferenças relativas de proteínas individuais, mas não pode identificar quantos EVs existem na amostra. A quantificação robusta do número de EV por análise de rastreamento de nanopartículas é dificultada pela sua estreita faixa de sinal-ruído, pela incapacidade de diferenciar entre EVs e agregados sólidos e pela falta de transferibilidade dos métodos entre instrumentos com diferentes especificações23. Portanto, este artigo também contém um procedimento citométrico de fluxo generalizável para discriminar e quantificar EVs.

Protocol

1. Preparação

  1. Adicione 2 g de gelatina a 100 mL de dH2O e aqueça no microondas até começar a ferver. Em seguida, mexa e deixe esfriar por 20 min.
  2. Passe a solução através de um filtro de 0,22 μm e distribua em tubos estéreis. Trate as pontas da pipeta com gelatina imediatamente antes do uso, encanando e expulsando a solução de gelatina. As pontas tratadas podem ser usadas imediatamente ou armazenadas.
  3. Corte a membrana de um filtro de tampa estéril.
  4. Mussei um quadrado de 20 cm de tecido de malha de nylon de 5 μm e coloque ao redor da parte superior de um filtro de tampa estéril. Fixá-lo com vários elásticos grossos.
    ATENÇÃO: Examine cuidadosamente o tecido para garantir que não haja vincos. Estes fazem lacunas de ar que dificultam a sucção.

2. Calculando grandes populações de vermes(Figura 1A)

  1. Vórtice e pipeta 10 μL da suspensão do verme em uma tampa de placa de cultivo de vermes ou um escorregador de vidro. Repita este processo 3x. Registre o número de animais em cada gota.
  2. Ajuste a suspensão do verme para dois animais por μL.
  3. Vórtice a suspensão e pipeta nove gotas (10 μL) em um slide ou uma tampa de placa. Conte manualmente o número de animais. Registre o número de animais em cada gota.
  4. Calcule o erro médio e padrão da média (S.E.M.) como uma porcentagem de cada população de vermes.
  5. Calcule o número total de animais em cada população dividindo o valor médio por 10 μL e, em seguida, multiplicando-se pelo volume total da suspensão do verme em μL.

Figure 1
Figura 1: Visões gerais do procedimento para gerar, quantificar e purificar EVs C. elegans. (A) Esquema para contar grandes populações de animais. (B) Esquema para geração de vermes para a colheita de EVs. (C) Esquema para purificar EVs de C. elegans supernatent. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cultivando elegans C. para purificação ev

  1. Gerar uma grande população de C. eleganssincronizados desenvolvimentista . Para isso, siga os passos abaixo.
    1. Adicione um único animal em uma placa de mídia de crescimento normal de 6 cm. Incubar por duas gerações e, em seguida, lavar os animais em duas placas médias de alto crescimento.
    2. Incubar até que os vermes tenham esgotado a comida.
    3. Filtre os vermes L1 com malha de nylon de 5 μm preparada sinuosamente na etapa 1.4. Coloque a tampa do parafuso na garrafa estéril, inicie o vácuo e despeje vermes sobre o filtro. Passe o mesmo volume do meio sobre os agregados do worm no filtro.
    4. Quantifique os worms e calcule o número total (ver passo 2). Recentemente, vermes famintos (<24 h) cultivados em uma placa de alto crescimento resultam em cerca de 80.000 larvas L1.
    5. Centrífuga l1 larvas a 2.000 x g por 3 min. Resuspender para ~100.000 animais por mL.
    6. Coloque ~50.000 animais por placa de alto crescimento. Cultive os animais a 20 °C até que sejam adultos gravid (cerca de 72 h).
    7. Branquear os adultos gravídicos por meiopadrão e permitir que os embriões eclodam em 10 mL de solução S Basal com colesterol 2,5 μg/mL.
    8. Quantifique as larvas L1 (ver passo 2) e adicione 50.000 vermes a cada placa de alto crescimento.
    9. Cultivar placas a 20 °C até que os animais sejam adultos jovens.
  2. Prepare C. elegans para a geração secretome.
    1. Lave os vermes das placas adicionando 15 mL de M9 estéril com carbenicina de 50 μg/mL a cada placa de alto crescimento. Deixe as placas saturadas sentarem-se por 5 min. Desaloque os vermes circulando o tampão ao redor da placa. Evite sloshing. Despeje o tampão de cada placa em um tubo cônico separado de 50 mL. Repita a etapa de lavagem 2x mais para um total de 45 mL de tampão por placa.
    2. Deixe os vermes se contentarem com 15 min. Decante o sobrenadante e adicione 50 mL de tampão M9 fresco ao tubo. Repita para um total de 4x.
    3. Flutue os vermes no topo de um gradiente de passo de sacarose de 30% e recupere animais na solução S Basal24.
      1. Ressuspensa brevemente os vermes em 15 mL de gelo frio de 100 mM NaCl, adicione 15 mL de sacarose gelada de 60% e inverta para misturar. Com uma pipeta de vidro suavemente camada 5 mL de gelo frio 100 mM NaCl na parte superior da mistura de sacarose.
      2. Centrífuga a 1.500 x g por 5 min. Os worms estarão concentrados na interface entre o NaCl e a sacarose.
      3. Pipette suavemente para fora os animais da interface em um novo tubo cônico de 50 mL. Adicione a solução S Basal a 50 mL. Permita que os vermes se acomodem 5 min.
      4. Decante o sobrenadante e adicione 50 mL frescos de solução S Basal. Repita isso pelo menos 3x.
    4. Quantifique o número de vermes conforme descrito na etapa 2.
    5. Resuspender os vermes a uma densidade de um animal por μL com solução S Basal estéril contendo 2,5 μg/mL de colesterol e 50 μM de carbenicina.
    6. Para preparar a amostra para a geração de seforme, adicione até 400 mL da suspensão a um frasco estéril de 2 L.
    7. Coloque os frascos no rotor circular em uma incubadora de 20 °C a 100 rpm por 24 horas.

4. Purificação EV

  1. Colheita e fracionamento
    1. Remova o frasco de 2L de vermes da incubadora e pelota os animais em frascos cônicos de 50 mL (500 x g por 2 min).
    2. Despeje o sobrenadante através de um filtro de vácuo de 0,22 μm para remover quaisquer detritos de partículas.
      NOTA: Neste ponto, o sobrenadante filtrado contendo o secário e as vesículas podem ser armazenados a -80 °C.
    3. Conte o número de animais conforme descrito na etapa 2.
    4. Determine a viabilidade dos vermes colocando uma gota de vermes suspensos em um gramado bacteriano. Espere 15 min e depois marque animais como em movimento, paralisados ou mortos.
    5. Concentre o supernadante filtrado de 0,22 μm a 700 μL usando unidades de filtro de nitrocelulose regeneradas de 10 kDa. Adicione 150 μL S Solução basal e, em seguida, pipeta sobre o filtro e vórtice. Repita 2x.
    6. Centrifugar o supernadante concentrado a 18.000 x g por 20 min a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta etapa remove quaisquer detritos potenciais ou partículas maiores que possam ter se acumulado durante o manuseio.
    7. Adicione o coquetel inibidor de protease + EDTA de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Neste ponto, o sobrenadante concentrado contendo o secretome e as vesículas podem ser armazenados a -80 °C.
  2. Cromatografia de exclusão de tamanho
    1. Despeje a resina de agarose de 80-200 μm (faixa de fracionamento do tamanho dos poros de 70.000 a 40.000.000 kDa para proteínas globulares) em um cartucho de coluna de fluxo de gravidade vazia. Solução Basal Flow S até que a cama de resina esteja embalada em um volume final de 10 mL.
      NOTA: Se a resina for derramada demais no cartucho da coluna, disperse a parte superior da coluna e remova o excesso com uma pipeta.
    2. Passe 40 mL de solução S Basal filtrada estéril através da coluna e deixe fluir gravidade.
      ATENÇÃO: Verifique se a resina não está perturbada.
    3. Deixe o buffer fluir até que a parte superior da resina não esteja submersa e, em seguida, tampe a parte inferior do cartucho da coluna. Coloque um tubo de coleta por baixo da coluna.
    4. Remova a tampa colocada no cartucho. Adicione o secretome concentrado obtido na etapa 2.1 dropwise ao topo da cama da coluna. Pipeta 1 mL de solução Basal S dropwise. Coloque um tubo de coleta fresco a coluna.
    5. Encha lentamente o reservatório da coluna superior com solução basal de 5 mL S para não perturbar a resina. Coletar os primeiros 2 mL de eluate, em seguida, mudar rapidamente os tubos e coletar os próximos 4 mL. Esta é a fração que é enriquecida para EVs.
    6. Concentre o eluate a 300 μL com um filtro de corte de peso molecular regenerado de 10 kDa (MWCO) e a transferência retentate para um tubo de microcentrífuga de baixa ligação.
    7. Lave a membrana do filtro 2x com 100 μL de solução S Basal, vórticando para 20 s e pipetando o tampão através do filtro. Adicione à amostra inicial um volume final de 500 μL.
    8. Adicione coquetel inibidor de protease de acordo com as instruções do fabricante.
    9. Realize os experimentos a jusante imediatamente (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, etc.) ou armazene a -80 °C.

5. Quantificação de citometria de fluxo da abundância de EV

  1. Preparação do tinseu
    1. Prepare um estoque de 10 mM de DI-8-ANEPPS usando DMSO fresco. Distribua em alíquotas de 10 μL e armazene a -20 °C.
    2. Prepare uma solução de trabalho de 1 mM adicionando 90 μL de PBS filtrado estéril a um tubo com 10 μL de estoque de tintura.
  2. Preparação experimental da amostra
    1. Adicione 840 μL de solução S Basal em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione 60 μL dos EVs purificados gerados na seção 4.2 e no vórtice.
    2. Alíquota 300 μL da amostra em dois novos tubos de microcentrífuga. Há agora um conjunto experimental de três tubos contendo 300 μL de EVs diluídos cada. Rotular os tubos #1-3. Para as amostras #2 e #3 adicionar 7 μL do estoque DI-8-ANEPPS preparado em 5.1.2. Em seguida, adicione 7 μL de 1% Triton-X 100 ao tubo #3. Misture cada tubo por vórtice.
    3. A amostra de sonicate #3 colocando a ponta do sônico no meio da amostra e pulsando 10 vezes a 20% de potência 30% do ciclo de trabalho.
      ATENÇÃO: Certifique-se de que a ponta da sonda sônica está no meio da amostra para que a geração de espuma seja mantida ao mínimo. A espuma pode comprometer a amostra fazendo com que os EVs se agreguem.
    4. Adicione 300 μL de solução S Basal a dois tubos de microcentrífuga. Adicione 7 μL do reagente de trabalho DI-8-ANNEPS preparado na etapa 5.1 para o segundo tubo e rotule "Somente de tinta". Rotular o outro tubo de "Somente buffer".
      NOTA: Prepare as amostras de controle Somente de Tintura e Tampão e as amostras experimentais com a mesma fonte S Basal.
    5. Incubar as amostras longe da luz direta e em temperatura ambiente por 1 h.
  3. Realizar experimentos FACS.
    1. Coloque o filtro de excitação FACS em 488 nm (azul) e o filtro de emissão em 605 nm (laranja). Defina a vazão para 1,5 μL por min.
    2. Executar a mistura de calibração FACS nanobead (opcional, mas recomendado).
    3. Execute cada amostra em uma máquina FACS por 3 min (180 s). Observe os tempos exatos de execução em segundos.
  4. Analisar os dados do FACS.
    1. Abra os arquivos com o software de análise FACS.
    2. Mude o eixo Y para 488-Org (Área) clicando no Eixo,selecionando no menu suspenso.
    3. Defina um portão retangular a partir do topo da trama, abrangendo do nível SALS 102 a 104 (<300 nm partículas de tamanho). Estenda o portão para baixo até que contenha 2,5% do total de eventos. Nomeie o portão "DI-8-ANEPPS+" eventos.
  5. Quantificação da abundância de EV amostral
    1. Copie este portão e cole-o nas outras duas amostras do seu conjunto experimental, bem como nos controles Somente buffer e tine. Exporte a análise para uma planilha.
    2. Se as amostras FACS não forem executadas para os 3 min (180 s) recomendados, normalizará todas as contagens de eventos na amostra para eventos por 180 s. Por exemplo, se uma amostra foi executada para 250 s, o número de evento DI-8-ANEPPS+ é dimensionado em 250 s/180 s.
    3. Remova os eventos de fundo do tineu subtraindo o número de eventos DI-8-ANEPPS+ no controle Somente de tineles daqueles em #2 amostra.
    4. Remova os eventos de fundo do isótipo subtraindo o número de eventos DI-8-ANEPPS+ em #1 de amostra.
    5. Remova eventos insensíveis ao detergente subtraindo o número de eventos DI-8-ANEPPS+ em #3 de amostra. Este valor é o número de EVs de boa fé.
    6. Calcular o número de EVs em 1 μL de amostra dividindo o valor calculado na etapa 5.5.5 pelo volume analisado em μL (4,5 μL analisado conforme descrito na etapa 5.3) e multiplicando-se pelo fator de diluição (10x conforme descrito na etapa 2.5). Multiplique este valor pelo número de μL restante na preparação do EV. Este é o número de EVs disponíveis para análise a jusante.

Figure 2
Figura 2: Esquemático da preparação da amostra de citometria de fluxo para quantificar a abundância de EV. (A) A preparação do EV é dividida em três amostras idênticas. A amostra nº 1 é o controle negativo sem tincrone. O DI-8-ANEPPS é então adicionado às amostras #2 e #3. Triton-X 100 é então adicionado à amostra #3. A seta verde indica que apenas a amostra #3 é subseqüentemente sônica. Os dados do fluxo ajudam a determinar o número absoluto de EVs sensíveis ao detergente nas amostras FACS e, em seguida, calcular a abundância de EVs na preparação total. O portão para determinar eventos positivos de tintura é definido com #1 amostra, que não contém tintura. A escrita vermelha nos dados da planilha é para ilustrar que os eventos positivos de tintura da amostra tratada com detergente são subtraídos da amostra com tintura. (B) Equações para quantificação de EVs em uma amostra de FACS analisada e cálculo do número total de EVs na amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representative Results

Um esquema para os processos necessários para a geração e purificação de EVs é mostrado na Figura 1. Os tempos típicos necessários para completar cada etapa são mostrados abaixo. A Figura 2 apresenta um esquema para preparação de amostras para análise de FACS utilizando DI-8-ANEPPS (Figura 2A),bem como os cálculos necessários para estimar o número total de EVs em uma amostra(Figura 2B).

Os resultados representativos de 10 réplicas biológicas são mostrados na Figura 3A. A variabilidade entre as réplicas não é significativa e o S.E.M. típico de tamanho populacional é de pouco mais de 10%(Figura 3B). Filtrar os vermes e cultivar nas placas frescas de alto crescimento gerará uma grande população de adultos gravídicos adequados para sincronização de alvejante. Uma única placa faminta processada desta forma pode produzir uma população experimental de 1 x 106 ou mais prole sincronizada porque cada adulto gravídico conterá cerca de 10 ovos. É possível manter grandes populações de populações sincronizadas em desenvolvimento filtrando ovos e larvas através de um filtro de 40 μm para obter EVs de animais mais velhos. Adultos retidos são transferidos para placas frescas de alto crescimento a uma densidade de 20.000 animais por prato. Esse processo era repetido a cada 2 dias. A Figura 3C mostra três réplicas biológicas de populações de vermes sendo movidas através de três transferências de placas. A transferência de animais entre as placas resulta em uma perda de cerca de 10% dos animais (Figura 3C), enquanto cerca de 20% dos animais são perdidos na etapa de flotação de sacarose(Figura 3D).

Figure 3
Figura 3: Quantificação de grandes populações de C. elegans para análise de EV. (A) Uma comparação do número de vermes de estágio larval L1 isolados de uma única placa de crescimento de alto crescimento recentemente faminta (<24 h). Os valores de cada uma das 10 réplicas biológicas são traçados. A soma de todos os pontos de dados nas 10 réplicas também é apresentada como um enredo de violino e barra com S.E.M. Isso mostra que um único prato de vermes famintos recentemente produzirá ~80.000 vermes de estágio larval L1. (B) O S.E.M. das 15 diferentes medidas populacionais de placas no painel A plotados como pontos individuais. Geralmente, o S.E.M. é ligeiramente maior que 10%. (C) Foram estimadas três réplicas biológicas de populações de vermes após cada uma das duas transferências entre as placas a cada 4 h. Essa transferência de animais entre placas não resultou em uma diminuição significativa do tamanho da população. Isso indica que a metodologia aqui apresentada para a movimentação de vermes não resulta em uma perda significativa de animais. (D) Medições populacionais realizadas ao longo de três réplicas experimentais de EV: O número de animais estimados para as larvas Originais L1 que iniciaram o experimento, o número de animais adultos jovens recuperados do flutuador de sacarose e prontos para o período de incubação de 24 h, o número de animais contados a partir da preparação de EV após a recuperação do secármico. Há uma pequena, mas não significativa diminuição do tamanho populacional entre a estimativa populacional inicial no estágio larval L1 e mais tarde quando os animais são adultos jovens. A medição média da população L1 foi designada como 100% e todas as outras medidas foram dimensionadas por sua relação com esse valor. Barras de erro S.E.M. * = p value < 0,05, N.S. = não significativa em um teste t emparelhado paramétrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A relação proteína-animal é uma métrica útil para caracterizar uma preparação de EV. Esta métrica pode fornecer um meio rápido para determinar a consistência entre as preparações de EV. Em média, 1.000 animais adultos jovens do tipo selvagem secretarão 1 μg de proteínas maiores que 10 kDa em seu ambiente(Figura 4A). Quando esta fração é ainda mais separada pela cromatografia de exclusão de tamanho, o perfil total de elução de proteínas mostra um pequeno pico de proteína entre 2-6 mL e um grande pico após 8 mL. Os EVs estão contidos nos primeiros 5 mL da coluna eluate(Figura 4B). Análise de rastreamento de nanopartículas os primeiros 5 mL da coluna eluate contém uma população monodispersa de pequenos EVs de ~150 nm(Figura 4C). A microscopia eletrônica de transmissão de frações de exclusão de tamanho revela EVs abundantes na fração de 2-6 mL de eluate, mas não nos volumes eluate posteriores. Os EVs são conhecidos por sua forma semelhante a um copo e, portanto, são fáceis de discriminar de partículas sólidas que aparecem como pontos brilhantes quando preparados as condições de coloração negativas(Figura 4D).

Figure 4
Figura 4: Purificação de EVs C. elegans da biomassa secretada total. (A) Arazão entre as proteínas totais maiores que 10 kDa ao número de vermes incubados na preparação de 10 réplicas biológicas foi traçada. A maioria das preparações continha 1 μg de proteína por 1.000 animais. (B) Perfil de elução protéica a partir de uma coluna de resina de 10 mL carregada com 1 mL do secretome concentrado. As frações que são consolidadas em análises posteriores são sombreadas em grupos. (C) Análise de rastreamento de nanopartículas das frações eluidas de resina consolidada 2-6 mL. O intervalo de confiança de 95% é cinza sombreado. (D) Análise TEM das frações eluidas de resina consolidada. O material inicial tinha partículas semelhantes a vesículas e partículas não vesículas. A fração de elução consolidada de 2-6 mL foi enriquecida para vesículas com poucas partículas não vesículas. As frações consolidadas de 7-11 mL continham poucas partículas semelhantes a vesículas, mas muitas partículas não vesículas. As frações de elução de 12 a 15 mL continham apenas partículas não vesículas. Todos os micrografos são mostrados na mesma ampliação. Barra de escala = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para comparar diretamente as características de citometria de fluxo entre C. elegans e EVs humanos, purificamos Os EVs a partir da mídia condicionada das culturas celulares dos neurônios humanos com este método. A citometria de fluxo separa partículas baseadas na dispersão de luz. A dispersão de luz de pequeno ângulo (SALS) se correlaciona aproximadamente com o tamanho, e a dispersão de luz de ângulo longo (LALS) se correlaciona com a estrutura da membrana interna. A maioria dos eventos amostrais totais tanto da cultura celular quanto das preparações de Ev de C. elegans são fortemente focadas em um cluster centrado em torno de 103 SALS e 104 LALS(Figura 5A). Um histograma de eventos de amostra de C. elegans EV classificados pela SALS mostra que todos os preparativos atingem ~103 (Figura 5B).

Figure 5
Figura 5: C. elegans EVs são claramente definidos por suas propriedades de dispersão de luz. (A) Histograma de eventos SALS em três réplicas biológicas de EVs C. elegans. ~80% dos eventos amostrais totais estão contidos em uma população apertada e claramente definida. Semelhante à análise de rastreamento de nanopartículas, mostra que a distribuição de tamanho de EVs C. elegans é monodispersa. O histograma do tampão Basal S usado para diluir as amostras é mostrado para comparação. (B) Comparação das propriedades refrativas de C. elegans e eVs de cultura celular humana purificadas com os métodos descritos neste texto. Ambos os tipos de EV apresentam consistentemente distribuições de dispersão de luz de ângulo curto e longo comparável (SALS e LALS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O DI-8-ANEPPS rotula robustamente Os EVs c. elegans, destacando consistentemente a maioria dos eventos totais tanto em amostras derivadas de C. elegans quanto de cultura celular. As contas de calibração e os controles são apresentados na Figura 6A. As parcelas individuais de dispersão FACS são mostradas a partir de uma amostra de C. elegans preparada a partir de 200.000 animais (#1) e dois preparados de 500.000 animais(Figura 6B). Também foram analisados EVs de 100 mL (#1) ou 200 mL (#2,3) de cultura celular (Figura 6C). Tanto c. elegans quanto amostras derivadas da cultura celular mostraram eventos fluorescentes abundantes que desapareceram quando tratados com 0,05% Triton-X 100 e sônica leve. Isso demonstra que os eventos rotulados são estruturas fosfolipídeas labile detergentes (vesículas) em vez de agregados de lipoproteína sominais insensíveis a detergentes. A abundância de EV é calculada como a diferença entre o número de eventos no portão DI-8-ANEPPS+ entre as frações sem detergente (-) e com detergente (+) menos os eventos no controle Somente de Tintura. Para clareza, os dados apresentados individualmente nas Figuras 6B e Figura 6C são resumidos como gráficos de barras nas Figuras 6D e Figura 6E. A abundância dos EVs purificados não foi significativamente diferente entre os C. elegans e as preparações derivadas da cultura celular(Figura 6F).

Figure 6
Figura 6: Exemplos de dados de citometria de fluxo utilizados para calcular a abundância de EV. (A)Para garantir que o número de eventos possa ser comparado diretamente entre as amostras, os controles Buffer Only e Buffer e Dye Only precisam ser executados na mesma taxa de fluxo e tempo de coleta que as frações da amostra EV. Há muito poucos eventos no portão DI-8-ANEPPS. (B) Resultados representativos do DI-8-ANEPPS e do protocolo de tratamento de detergente de C. elegans. Três réplicas biológicas são mostradas. A #1 de réplica biológica foi preparada a partir de 200.000 animais, enquanto #2 e #3 foram preparadas a partir de 500.000 animais. O desaparecimento de EVs com o tratamento de detergente é claro em todos os casos. (C) Resultados representativos do DI-8-ANEPPS e do protocolo de tratamento de detergente utilizando mídia condicionada à cultura celular humana. As réplicas biológicas #1 e #2 foram preparadas a partir de 200 mL de mídia condicionada, enquanto a #3 de réplica biológica foi preparada a partir de 100 mL. (D) Gráfico de barras dos dados coletados das três réplicas biológicas dos EVs C. elegans. Barras de erro = S.E.M. Emparelhadas t-testes de duas caudas entre os tratamentos. = p value < 0,001. (E) Gráfico de barras dos dados coletados das três réplicas biológicas de EVs derivados da cultura celular. Testes t emparelhados de duas caudas entre os tratamentos. = p value < 0,001(F) O número de eventos sensíveis ao detergente por μL foi calculado para todas as réplicas biológicas de C. elegans e cultura celular. Os valores entre as duas fontes de amostra de EV não são significativamente diferentes. Testes t de duas caudas emparelhados entre tratamentos p valor = 0,685. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Tabela 1 contém os valores experimentais brutos para os 4,5 μL completos de cada tipo de amostra analisada. O número total de eventos coletados das frações ev purificadas de 500.000 animais foi de 10 a 20x sobre o número de antecedentes de partículas coletadas apenas por tampão, enquanto a fração purificada de 200.000 animais continha cerca de 2x quanto muitos eventos como buffer sozinho. O número de eventos dentro do portão DI-8-ANEPPS+ também é mostrado para cada amostra. Essas métricas podem ser importadas em uma planilha para calcular o número de EVs sensíveis ao dine positivo e sensível ao detergente, conforme descrito acima. Por exemplo, o número de EVs em 1 mL da primeira réplica biológica de C. elegans mostrada seria calculado assim:

(18.974 – 3.853 – 1.487) x (10/4.5) x 1.000 = 30.297.778.

Tabela 1: Dados de citometria de fluxo tabulado. Os dados apresentados na Figura 6 são apresentados como uma planilha. Para cada amostra são mostrados os eventos totais e os eventos fechados DI-8-ANEPPS+. Cada réplica biológica é organizada na ordem das amostras #1-3 no protocolo. Essas métricas revelam que o número total de eventos coletados das amostras de C. elegans preparadas a partir de 500.000 animais ou 200 mL de mídia condicionada à cultura celular foi de 10 a 20x sobre o número de antecedentes de partículas coletadas apenas pelo buffer, enquanto a réplica biológica purificada de 200.000 animais continha cerca de 2x quanto os eventos totais como buffer sozinho. O número de eventos dentro do portão DI-8-ANEPPS+ também é mostrado para cada amostra. Essas métricas podem ser exportadas para uma planilha para calcular o número total de EVs. Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

Discussion

Um desafio fundamental do campo EV é separar a grande variedade de subtipos EV2. Os métodos descritos aqui utilizam filtração, centrifugação diferencial e cromatografia de exclusão de tamanho para gerar uma população pura de Pequenos EVs porque ~100 nm EVs foram previamente mostrados como secretados no ambiente externo e funcionam em vias de comunicação fisiologicamente relevantes16. EVs purificados através da cromatografia de exclusão de tamanho ainda podem ser uma mistura de exosóis e microvesículas pequenas porque essas subclasses ev são de tamanho semelhante. As subclasses de VERTEBRAdos EV são comumente separadas pela imunoprecipitação porque este método isola os EVs através da ligação a marcadores de proteína de membrana seletiva. Os métodos descritos facilitam a identificação de proteínas marcadoras de membrana C. elegans EV. Portanto, no futuro, pode ser possível separar ainda mais pequenas subclasses de EV através de métodos análogos de imunoprecipitação. Em teoria, a imunoprecipitação poderia isolar Os EVs de vermes bem alimentados porque os EVs E. coli não devem interagir com o anticorpo. Pesquisadores interessados em identificar as cargas proteicas e genéticas de subclasses maiores de EV (>200 nm) podem fazê-lo pulando a etapa de filtração de 0,22 μm e, em seguida, analisando a pelota em vez do sobrenadante. Descobrir as abundâncias de proteínas e cargas genéticas de grandes EVs estabelecerá uma compreensão mais abrangente dos processos fisiológicos que funcionam através do C. elegans secretome. Além de serem secretados no ambiente, os EVs C. elegans são transferidos internamente entre tecidos. Portanto, esses métodos apenas isolam um subconjunto de EVs C. elegans totais. No entanto, a descoberta de carga de EVs internos não é possível porque não há método para separar Os EVs de worms lysed. A análise de carga deste subconjunto EV secretado externamente fornece um meio para identificar potenciais marcadores de proteína EV gerais capazes de rotular EVs internos também.

A escala da preparação do EV dependerá das demandas do experimento. Um total de 500.000 jovens adultos fornece EVs suficientes para a realização de citometria de fluxo, LC-MS-MS e análise RNAseq em paralelo. Este número pode ser ampliado para cima ou para baixo, dependendo das necessidades experimentais. O maior fator prático para a ampliação é o número de placas de crescimento de 10 cm de altura necessárias. Placas de alto crescimento preparadas com 500 μL de 20x concentrados durante a noite cultura NA22 apoiarão uma população de ~50.000 adultos do estágio larval L1 até o primeiro dia da idade adulta. Portanto, para realizar um experimento com 500.000 adultos, são necessárias 13 placas de alto crescimento: uma placa para gerar a população de L1s, duas placas para gerar os adultos para branqueamento, e 10 placas para o crescimento dos animais experimentais. Essas métricas são condicionadas às condições de semeação e crescimento bacteriano das placas de alto crescimento. Por isso, recomenda-se fazer todas as placas de forma padronizada e, em seguida, calibrar com quantidades conhecidas de animais.

Os vermes são contados em duas etapas durante o processo de cultivo: 1) antes de semear vermes em placas e 2) antes de gerar a mídia condicionada. A densidade do cultivo animal tem sido demonstrada para impactar o comportamento, o desenvolvimento e as respostas ao estresse15,,16,17,18 e pode, portanto, influenciar também as cargas ev. Portanto, para uma densidade de cultivo consistente é necessário estimar com precisão as populações de vermes. Quantificar o número de vermes em nove gotas dá confiança estatística das estimativas populacionais. É essencial tratar cada gota individualmente, vórticando entre cada gota e inserindo a pipeta a mesma distância na suspensão do verme. Tomar essas precauções garantirá valores s.e.m. de ~5-10% da população total. Se o S.E.M. para uma população de vermes é maior que 20%, então algo deu errado.

Após o período de incubação sem bactérias de 24 h, jovens, selvagens tipo C. elegans rastejam imediatamente após a adição a um gramado bacteriano. Isso indica que a incubação não afeta severamente sua saúde. No entanto, essa etapa influencia a fisiologia dos animais e, portanto, pode influenciar a composição das cargas EV. Portanto, ao trabalhar com genótipos muito doentes ou animais mais velhos, é essencial verificar a viabilidade após a etapa de incubação. Se todos os animais não sobreviverem à incubação, então aumente o tamanho da população experimental e diminua o tempo de incubação. Ao trabalhar com grandes volumes de mídia condicionada, é mais prático usar um concentrador de células agitadas com um filtro feito de nitrocelulose regenerada. Os EVs não se ligam a esta química do filtro tão fortemente quanto outros tipos defiltro14.

A proporção da proteína total recuperada da mídia condicionada ao número de animais incubados para fazer a preparação é uma métrica útil. Se essa proporção for muito maior do que o esperado, então é possível que as estimativas populacionais estavam desligadas ou que os animais morreram e se deterioraram na mídia condicionada. Se essa razão for muito menor do que o esperado, então alguma proteína pode ter sido perdida nos filtros durante o processo de concentração. Embora os métodos FACS quantifiquem diretamente os EVs na preparação, essa métrica é útil porque pode destacar anomalias amostrais no início do processo. Outro método útil para verificar a qualidade da preparação do EV é a microscopia eletrônica de transmissão, conforme mostrado na Figura 4D. Embora o protocolo de microscopia eletrônica de transmissão não esteja formalmente incluído neste artigo de métodos devido ao comprimento, ele pode ser conduzido por métodos padrão. Recomenda-se realizar esse tipo de análise, pelo menos inicialmente, como um método complementar ao FACS para avaliar a qualidade das preparações de EV. Para obter melhores resultados, utilize grades formvar-carbono recém-descarregadas e manche as amostras com ácido fosfotungstic de 2% em vez de acetato de uranyl.

O DI-8-ANEPPS foi escolhido porque foi demonstrado para rotular quantitativamente as membranas EV, superando outros corantes ev gerais com amostras de biópsia humana e liposódeiros25. As medidas são rápidas, levando apenas 3 minutos de tempo de coleta para cada amostra. A quantificação de EVs sensíveis ao detergente tem significância funcional direta porque capitaliza uma distinção física fundamental entre EVs e agregados de lipoproteínas sólidas. É importante ressaltar que este método não é influenciado pela quantidade total de proteínas ou número de agregados não-EV e, portanto, pode quantificar Os EVs obtidos através de diferentes métodos de purificação de forma imparcial. A métrica de EV verificada pelo FACS que descrevemos aqui seria especialmente útil para estudos que demonstram impactos fisiológicos de EVs purificados. Também poderia beneficiar o campo ev em geral para estabelecer uma metodologia FACS como uma métrica universal para que as abundâncias absolutas de EV possam ser diretamente comparadas entre os estudos. Corantes vitais também podem rotular EVs C. elegans, mas eles não são tão brilhantes quanto os EVs rotulados com Di-8-ANEPPS.

Esta abordagem de purificação capitaliza a secreção ativa de EVs fora dos corpos de vermes vivos intactos. Isso permite que os EVs C. elegans sejam isolados em pureza e abundância comparáveis a partir da cultura celular, especificações suficientes para identificar centenas de cargas de proteína e RNA via lc-MS-MS e análise RNAseq26. Assim, a grande biblioteca de reagentes disponíveis para a pesquisa de C. elegans pode ser aproveitada para investigar a influência da perturbação genética e fisiológica na composição da carga EV.

Disclosures

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgments

Reconhecemos com gratidão Nick Terzopoulos por placas de vermes e reagentes; o Centro de Genética caenorhabditis (CGC) do NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) para a linha n2 nematode; Lucia Vojtech, PhD, para assistência na análise de rastreamento de nanopartículas; Jessica Young, PhD, e Marie Claire, MD, PhD, para mídia celular climatizada de hiPSC; Wai Pang para assistência com imagens TEM. Este trabalho foi apoiado pelo subsídio do NIH P30AG013280 à MK e ao NIH grant AG054098 à JCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05% to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2 L bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms

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References

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Purificação e Análise de <em>Catadores Elegans Extracelulares</em>
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Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).

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