Summary
Denna artikel presenterar metoder för att generera, rena och kvantifiera Caenorhabditis elegans extracellulära blåsor.
Abstract
Utsöndringen av små membranbundna vesiklar i den yttre miljön är en grundläggande fysiologisk process av alla celler. Dessa extracellulära blåsor (EVs) fungerar utanför cellen för att reglera globala fysiologiska processer genom att överföra proteiner, nukleinsyror, metaboliter och lipider mellan vävnader. Elbilar återspeglar det fysiologiska tillståndet hos deras ursprungsceller. Elfordon är inblandade för att ha grundläggande roller i praktiskt taget alla aspekter av människors hälsa. Således analyseras EV-protein och genetiska laster alltmer för biomarkörer för hälsa och sjukdom. Ev-fältet saknar dock fortfarande ett tarmvräknat ryggradslösa modellsystem som gör det möjligt att studera EV-lastsammansättning. C. elegans lämpar sig väl för EV-forskning eftersom den aktivt utsöndrar elbilar utanför kroppen i sin yttre miljö, vilket möjliggör lättisolering. Denna artikel innehåller all nödvändig information för att generera, rena och kvantifiera dessa miljömässigt utsöndrade C. elegans EVs inklusive hur man arbetar kvantitativt med mycket stora populationer av ålderssynkroniserad maskar, renande elbilar och ett flödescytometriprotokoll som direkt mäter antalet intakta elbilar i det renade provet. Det stora biblioteket av genetiska reagenser som finns tillgängliga för C. elegans forskning kan utnyttjas för att undersöka effekterna av genetiska vägar och fysiologiska processer på EV lastsammansättning.
Introduction
Utsöndringen av membranbundna extracellulära blåsor (EVs) underlättar de globala fysiologiska processerna genom att aktivt transportera specifikt protein, nukleinsyra, metabolit och lipidlaster mellan cellerna1. Celler utsöndrar elbilar som spänner över ett kontinuum av storlekar från 2 μm eller större till så små som 20 nm2. Små elbilar (<200 nm) studeras alltmer på grund av deras implikation i patologiska processer, inklusive metabola sjukdomar, cancer, hjärt-kärlsjukdom, och neurodegenerativa sjukdomar3,4,5. Dessa patologier har också visat sig påverka protein och genetisk sammansättning av elbilar laster av små elbilar. Därför är biomarkör signaturer av patologin alltmer avslöjas genom EV last upptäckt metoder såsom LC-MS-MS och RNAseq6,7,8,9.
C. elegans har varit en användbar ryggradslös modell för att identifiera evolutionärt bevarade EV signalering vägar. Till exempel visades en C. elegans flippas först att inducera EV-biogenesen i C. elegans embryon, och den mänskliga homologen visade sig påverka EV-utsläpp i mänskliga celler10,11. C. elegans EVs rapporterades bära Igelkott signaler som är nödvändiga för nagelband utveckling. Leveransen av Igelkott och andra morfoogener visade sig spela en viktig utvecklingsroll av elbilar, och det bevaras i zebrafisk, möss och människor12,13,14,15. C. elegans lämpar sig väl för ev biomarkör upptäckt eftersom det utsöndrar elbilar utanför sin kropp som fungerar i djur-till-djur kommunikation16,17 (Figur 1A). Den metod som fastställts genom en tidigare studie kan dock inte användas eftersom nematodernas E. coli-näringskälla också utsöndrar elbilar18. I denna metod består det mesta av provet av E. coli-kontaminering, vilket begränsar kraften hos proteomiska eller RNAseq-metoder för upptäckten av C. elegans EV-laster. De metoder som beskrivs här har utvecklats för att ge mycket ren C. elegans EVs på överflöd nivåer som är karakteristiska för typiska cellkultur experiment och därmed underlätta omics metoder för EV biomarkör upptäckt.
Stora populationer av maskar behövs för att generera ett tillräckligt antal elbilar för lastanalys. Därför ingår också metoder för kvantitativ odling av stora populationer av utvecklingsmässigt synkroniserade C. elegans. Vanligtvis, när ett stort antal maskar behövs för experiment, de odlas i flytande media. Även om detta är effektivt för att generera stora populationer av maskar, är fysiologi av djuren skiljer sig avsevärt från maskar odlas under normala förhållanden på nematod tillväxt medium (NGM) agar plattor. Djur odlade i vätska växer långsammare, är tunnare, visar utvecklingsmässig heterogenitet och utsätts för en hög grad av batchvariation. Därför presenterar vi ett enkelt men effektivt sätt för kvantitativ odling av stora populationer av utvecklingsmässigt synkroniserade C. elegans med 10 cm högtillväxtplattor. Mediesammansättningen av högtillväxtplattor innehåller mer pepton än vanliga NGM-plattor och sås med E. coli-stammen NA22 som växer mer robust än OP50.
Framsteg inom flödescytometriteknik (FACS) har möjliggjort en direkt analys av enskilda elbilar20,,21,vilket möjliggör kvantifiering av elfordon utan de inneboende begränsningarna i andra metoder. Tidigare arbete har visat att protein inte är en användbar proxy för EV överflöd eftersom olika reningsmetoder resultera i betydligt olika EV-till-protein nyckeltal22. Extremt rena EV-fraktioner innehåller relativt lite protein, vilket gör det svårt att kvantifiera prover med BCA- eller Coomassie-geler. Västerländsk analys kan identifiera relativa skillnader i enskilda proteiner men kan inte identifiera hur många elbilar som ingår i provet. Robust kvantifiering av EV-nummer genom nanopartikelspårningsanalys hämmas av dess smala signal-till-brus-intervall, oförmåga att skilja mellan elbilar och fasta aggregat och bristen på överförbarhet av metoder mellan instrument med olika specifikationer23. Därför innehåller den här artikeln också ett generaliserbart flöde cytometriskt förfarande för att diskriminera och kvantifiera elbilar.
Protocol
1. Förberedelser
- Tillsätt 2 g gelatin till 100 ml dH2O och värm i mikrovågsugnen tills det börjar koka. Rör sedan om och låt den svalna i 20 min.
- Passera lösningen genom ett 0,22 μm filter och fördela i sterila rör. Behandla pipettspetsar med gelatin omedelbart före användning genom pipettering upp och utstötning av gelatinlösningen. Behandlade tips kan antingen användas omedelbart eller förvaras.
- Klipp ut membranet från ett sterilt lockfilter.
- Blöt en 20 cm kvadrat med 5 μm nylonnättyg och placera runt toppen av ett sterilt lockfilter. Säkra den med flera tjocka gummiband.
VARNING: Undersök försiktigt tyget för att säkerställa att det inte finns några veck. Dessa gör luftspalter som hindrar sug.
2. Beräkning av stora populationer av maskar(figur 1A)
- Vortex och pipett 10 μL av maskfjädringen på ett maskodlingsplåtslock eller en glasrutschbana. Upprepa denna process 3x. Registrera antalet djur i varje droppe.
- Justera maskfjädringen till två djur per μL.
- Vortex fjädringen och pipetten nio droppar (10 μL) på en rutschkana eller ett plåtlock. Räkna manuellt antalet djur. Registrera antalet djur i varje droppe.
- Beräkna medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (S.E.M.) som en procentandel av varje maskpopulation.
- Beräkna det totala antalet djur i varje population genom att dividera medelvärdet med 10 μl och multiplicera sedan med den totala volymen av maskfjäsningen i μL.
Figur 1: Proceduröversikter för att generera, kvantifiera och rena C. elegans EVs. (A)Schematiskt för räkning av stora populationer av djur. (B)Schematisk för att generera maskar för skörd av elbilar. (C)Schematisk för rening av EVs från C. elegans supernatent. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Odla C. elegans för EV Rening
- Generera en stor population av utvecklingsmässigt synkroniserade C. elegans. Följ stegen nedan för att göra det.
- Tillsätt ett enda djur på en 6 cm normal tillväxt media platta. Inkubera i två generationer och tvätta sedan djuren på två högväxande medelplattor.
- Inkubera tills maskarna har uttömt maten.
- Filtrera L1 maskar med 5 μm nylonnät förberett i steg 1.4. Placera skruvlocket på den sterila flaskan, starta vakuumet och häll maskarna över filtret. Passera samma volym av mediet över maskaggregat på filtret.
- Kvantifiera maskarna och beräkna det totala antalet (se steg 2). Nyligen utsvultna (<24 h) maskar som odlas på en hög tillväxtplatta resulterar i ca 80.000 L1 larver.
- Centrifug L1 larver vid 2000 x g i 3 min. Resuspend till ~100 000 djur per ml.
- Placera ~ 50.000 djur per hög tillväxt platta. Odla djuren vid 20 °C tills de är gravida vuxna (ca 72 h).
- Bleka de gravida vuxna med standardmedel och låt embryon kläckas i 10 ml S Basal lösning med 2,5 μg/ml-kolesterol.
- Kvantifiera L1 larver (se steg 2) och tillsätt sedan 50 000 maskar till varje högtillväxtplatta.
- Odla plattor vid 20 °C tills djuren är unga vuxna.
- Förbered C. elegans för utsöndrnad generation.
- Tvätta maskar från plattorna genom att tillsätta 15 ml steril M9 med 50 μg/ml karbatikillin till varje högtillväxtplatta. Låt de mättade plattorna sitta i 5 min. Lossa maskar genom att cirkla bufferten runt plattan. Undvik sloshing. Häll bufferten från varje platta i ett separat koniskt rör på 50 ml. Upprepa tvättsteget 2x mer för totalt 45 ml buffert per platta.
- Låt maskarna nöja sig med 15 min. Dekantera supernatanten och tillsätt 50 ml färsk M9-buffert till röret. Upprepa för totalt 4x.
- Flyta maskarna på toppen av en 30% sackaros steg-gradient och återvinna djur i S Basal lösning24.
- Kort resuspend maskarna i 15 ml iskall 100 mM NaCl, tillsätt 15 ml iskall 60% sackaros, och invertera att blanda. Med en glaspipett skikta försiktigt 5 ml läkande 100 mM NaCl på toppen av sackarosblandningen.
- Centrifug vid 1500 x g i 5 min. Maskar kommer att koncentreras till gränssnittet mellan NaCl och sackaros.
- Försiktigt pipett ut djuren från gränssnittet till en ny 50 ml konisk rör. Tillsätt S Basal lösning till 50 ml. Låt maskar lösa 5 min.
- Dekantera supernatanten och tillsätt färska 50 ml S Basal-lösning. Upprepa detta minst 3x.
- Kvantifiera antalet maskar enligt beskrivningen i steg 2.
- Resuspend maskarna till en densitet av ett djur per μL med steril S Basal lösning som innehåller 2,5 μg/ml kolesterol och 50 μM karbatikillin.
- För att förbereda provet för utsöndring, tillsätt upp till 400 ml av suspensionen till en steril 2 L botten-förbryllad kolv.
- Placera kolvarna på den cirkulära rotatorn i en 20 °C-inkubator vid 100 varv/min i 24 timmar.
4. EV Rening
- Skörd och fraktionering
- Ta bort 2L-kolven maskar från inkubatorn och pelleten djuren i 50 ml koniska flaskor (500 x g i 2 min).
- Häll supernatanten genom ett vakuumfilter på 0,22 μm för att avlägsna eventuella partiklar.
OBS: Vid denna punkt kan det filtrerade supernatanten som innehåller sekreten och blåsorna förvaras vid -80 °C. - Räkna antalet djur enligt beskrivningen i steg 2.
- Bestäm maskarnas livskraft genom att placera en droppe upphängda maskar på en bakteriegräsmatta. Vänta i 15 min och sedan poäng djur som rör sig, förlamad, eller död.
- Koncentrera den filtrerade supernatanten på 0,22 μm till 700 μL med regenererade nitrocellulosa 10 kDa-filterenheter. Tillsätt 150 μL S Basallösning och pipett sedan över filtret och virveln. Upprepa 2x.
- Centrifugera det koncentrerade supernatanten vid 18 000 x g i 20 min vid 4 °C och överför supernatanten till ett nytt rör. Detta steg tar bort eventuellt skräp eller större partiklar som kan ha samlats under hanteringen.
- Tillsätt proteashämmarcocktailen + EDTA enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Vid denna punkt kan det koncentrerade supernatanten som innehåller sekreten och blåsorna förvaras vid -80 °C.
- Storlek uteslutning kromatografi
- Häll 80–200 μm agarose harts (porstorlek fraktioneringsområde på 70 000 till 40 000 000 kDa för klotformiga proteiner) i en tom patron för gravitationsflödeskolumnpatron. Flow S Basallösning tills hartsbädden är packad med en slutlig volym på 10 ml.
OBS: Om för mycket harts hälls i kolonnpatronen, sprid sedan ut toppen av kolonnen och ta bort överskottet med en pipett. - Passera 40 ml steril filtrerad S Basallösning genom kolonnen och låt den flöda under tyngdkraften.
VARNING: Kontrollera att hartset inte är störd. - Låt bufferten flöda tills toppen av hartset inte är nedsänkt och sedan locket botten av kolumnen patronen. Placera ett uppsamlingsrör under kolonnen.
- Ta bort locket som är placerat på patronen. Tillsätt den koncentrerade sekreterare som erhålls i steg 2.1 dropwise till toppen av kolonnbädden. Pipett 1 ml S Basal lösning droppvis. Placera ett nytt uppsamlingsrör under kolonnen.
- Fyll långsamt den övre kolonnbehållaren med 5 ml S Basallösning för att inte störa hartset. Samla de första 2 ml eluate sedan snabbt byta rör och samla nästa 4 ml. Detta är den fraktion som är berikad för elbilar.
- Koncentrera eluatet till 300 μL med ett regenererat nitrocellulosa 10 kDa molekylviktsavskuret (MWCO) och överföringen återtenta till ett mikrocentrifugrör med låg bindning.
- Tvätta filtermembran 2x med 100 μL S Basallösning genom att virvla i 20 s och pipettera bufferten över filtret. Tillsätt i det ursprungliga provet för en slutlig volym på 500 μL.
- Tillsätt proteashämmarecocktail enligt tillverkarens anvisningar.
- Utför experimenten nedströms omedelbart (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, etc.) eller förvara på -80 °C.
- Häll 80–200 μm agarose harts (porstorlek fraktioneringsområde på 70 000 till 40 000 000 kDa för klotformiga proteiner) i en tom patron för gravitationsflödeskolumnpatron. Flow S Basallösning tills hartsbädden är packad med en slutlig volym på 10 ml.
5. Flöde Cytometri Kvantifiering av EV Överflöd
- Beredning av färgämne
- Förbered ett 10 mM lager av DI-8-ANEPPS med färsk DMSO. Fördela i 10 μL alikvoter och förvara på -20 °C.
- Förbered en arbetslösning på 1 mM genom att tillsätta 90 μl steril filtrerad PBS till ett rör med 10 μl färgämne.
- Experimentell provberedning
- Tillsätt 840 μL S Basallösning i ett mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan 60 μl av de renade elbilar som genereras i avsnitt 4.2 och virvel.
- Aliquot 300 μL av provet i två nya mikrocentrifugrör. Det finns nu en experimentell uppsättning av tre rör som innehåller 300 μL utspädda elbilar vardera. Märk rören #1–3. Tillsätt 7 μl av DI-8-ANEPPS-lagret som beretts i 5.1.2 till prover #2 och #3. Tillsätt sedan 7 μL av 1% Triton-X 100 till röret #3. Blanda varje rör genom att virvla.
- Sonicate prov #3 genom att placera sonicator spets i mitten av provet och pulserande 10 gånger vid 20% effekt 30% arbetscykel.
VARNING: Se till att ljudbehandlingssondens spets är mitt i provet så att skumgenereringen hålls till ett minimum. Skum kan äventyra provet genom att få elbilarna att aggregeras. - Tillsätt 300 μL S Basallösning till två mikrocentrifugrör. Tillsätt 7 μl av DI-8-ANNEPS arbetsreagens som beretts i steg 5.1 till det andra röret och märk "Endast färgämne". Märk det andra röret "Endast buffert".
OBS: Förbered endast färgämne och buffert kontrollprover och försöksprover med samma S Basal-källa. - Inkubera proverna bort från det direkta ljuset och vid rumstemperatur i 1 h.
- Genomföra FACS-experiment.
- Ställ in FACS magnetiseringsfilter på 488 nm (blå) och utsläppsfiltret på 605 nm (orange). Ställ in flödet på 1,5 μl per minut.
- Kör nanobead FACS kalibreringsmix (tillval men rekommenderas).
- Kör varje prov på en FACS-maskin i 3 min (180 s). Notera de exakta körtider i sekunder.
- Analysera FACS-data.
- Öppna filerna med FACS-analysprogramvara.
- Växla Y-axeln till 488-Org (Area) genom att klicka på Axisoch välja från den nedrullningsbara menyn.
- Ställ in en rektangulär grind som börjar högst upp på tomten, som sträcker sig från SALS-nivå 102 till 104 (<300 nm-partiklar). Förläng grinden nedåt tills den innehåller 2,5% av den totala händelser. Namnge gate "DI-8-ANEPPS+" händelser.
-
Kvantifiering av urval EV överflöd
- Kopiera den här porten och klistra in den på de andra två proverna i din experimentella uppsättning samt kontrollerna Endast buffert och endast färgämnen. Exportera analysen till ett kalkylblad.
- Om FACS-exemplen inte kördes under de rekommenderade 3 min (180 s), normalisera alla händelseantal i urvalet till händelser per 180 s. Om ett exempel kördes för 250 s skalas händelsenumret DI-8-ANEPPS+med 250 s/180 s.
- Ta bort färgämnets bakgrundshändelser genom att subtrahera antalet DI-8-ANEPPS+-händelser i dynkontrollen Endast från dem i #2.
- Ta bort isotypbakgrundshändelser genom att subtrahera antalet DI-8-ANEPPS+-händelser i #1.
- Ta bort rengöringsmedelsokänsliga händelser genom att subtrahera antalet DI-8-ANEPPS+ händelser i #3. Detta värde är antalet äkta elbilar.
- Beräkna antalet elbilar i 1 μl prov genom att dividera det värde som beräknas i steg 5.5.5 med den volym som analyseras i μL (4,5 μL analyseras enligt beskrivningen i steg 5.3) och multiplicera med utspädningsfaktorn (10x enligt beskrivningen i steg 2.5). Multiplicera detta värde med det antal μL som återstår i EV-preparatet. Detta är antalet elbilar som är tillgängliga för analys i efterföljande led.
Figur 2: Schematisk av flödescytometriprovberedning för att kvantifiera EV-överflöd. (A)EV-preparatet är uppdelat i tre identiska prover. Prov # 1 är nej färgnegativ kontroll. DI-8-ANEPPS tillsätts sedan i prover #2 och #3. Triton-X 100 tillsätts sedan i provet #3. Den gröna pilen anger att endast #3 därefter är sonisk. Data från flödet hjälper till att bestämma det absoluta antalet tvättmedelskänsliga elbilar i FACS-proverna och beräknar sedan förekomsten av elbilar i den totala beredningen. Porten för att bestämma färg-positiva händelser ställs in med prov #1, som inte innehåller något färgämne. Den röda skriften på kalkylbladsdata är att illustrera att färg-positiva händelser från tvättmedel-behandlade provet subtraheras från provet med färgämne. (B) Ekvationer för kvantifiering av elbilar i ett FACS-analyserat prov och beräkning av det totala antalet elbilar i provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Ett schema för de processer som krävs för att generera och rena elbilar visas i figur 1. De typiska tider som krävs för att slutföra varje steg visas under. Figur 2 visar ett schema för beredning av prover för FACS-analys med DI-8-ANEPPS (figur 2A) samt de beräkningar som krävs för att uppskatta det totala antalet elbilar i ett prov (figur 2B).
Representativa resultat från 10 biologiska replikat visas i figur 3A. Variationen mellan replikat är inte signifikant och den typiska S.E.M. av befolkningsstorlek är drygt 10%(figur 3B). Filtrering av maskar och odling på färska högtillväxtplattor kommer att generera en stor population av gravida vuxna som lämpar sig för blekning synkronisering. En enda utsvulten platta bearbetas på detta sätt kan producera en experimentell population på 1 x 106 eller mer synkroniserad avkomma eftersom varje gravid vuxen kommer att innehålla cirka 10 ägg. Det är möjligt att upprätthålla stora populationer av utvecklingsmässigt synkroniserade populationer genom att filtrera ägg och larver genom ett 40 μm filter för att erhålla elbilar från äldre djur. Kvar vuxna överförs till färska högtillväxtplattor med en densitet på 20 000 djur per platta. Denna process upprepades varannan dag. Figur 3C visar tre biologiska replikat av maskpopulationer som flyttas över tre plåtöverföringar. Överföring av djur mellan plattorna leder till cirka 10 % förlust av djur (figur 3C) medan cirka 20 % av djuren går förlorade i sackarosflotationssteget (figur 3D).
Figur 3: Kvantifiering av stora populationer av C. elegans för EV-analys. (A) En jämförelse av antalet L1 larvsteg maskar isolerade från en enda nyligen utsvulten (<24 h) hög tillväxt platta. Värdena för var och en av 10 biologiska replikat ritas. Summeringen av alla datapunkter i de 10 replikaten presenteras också som en violintomt och bar med S.E.M. Detta visar att en enda platta av nyligen utsvultna maskar kommer att ge ~ 80.000 L1 larvscenmaskar. (B)S.E.M. av de 15 olika plattpopulationsmätningarna i panel A ritad som enskilda punkter. Generellt är S.E.M. något större än 10%. (C)Tre biologiska replikat av maskpopulationer uppskattades efter var och en av två överföringar mellan plattorna var fjärde timme. Denna överföring av djur mellan plattorna ledde inte till en signifikant minskning av populationens storlek. Detta tyder på att den metod som presenteras här för att flytta maskar inte leder till någon betydande förlust av djur. D) Populationsmätningar som gjorts under tre ev-försöksreplikationer: Antalet djur som uppskattades för de ursprungliga L1-larver som påbörjade försöket, antalet unga vuxna djur som återvunnits från sackarosflottören och redo för inkubationstiden på 24 timmar, antalet djur som räknats från ev-beredningen vid återhämtning av sekret. Det finns en liten men inte signifikant minskning av populationsstorleken mellan den ursprungliga populationsuppskattningen vid L1 larvstadiet och senare när djuren är unga vuxna. Den genomsnittliga L1-populationsmätningen betecknades som 100 % och alla andra mätningar skalades av deras förhållande till detta värde. Felstaplar S.E.M. * = p-värde < 0,05, N.S. = inte signifikant i ett parametriskt parkopplat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protein-till-djur förhållandet är ett användbart mått för att karakterisera en EV beredning. Det här måttet kan ge ett snabbt sätt att bestämma överensstämmelsen mellan EV-preparat. I genomsnitt utsöndrar 1 000 unga vuxna djur av vildtyp 1 μg proteiner som är större än 10 kDa i sin omgivning (figur 4A). När denna fraktion separeras ytterligare av storleksbestängningskromatografin visar den totala proteinutellitprofilen en liten proteintopp mellan 2–6 ml och en stor topp efter 8 ml. Elfordonen finns i de första 5 mlna i kolumnen eluate (figur 4B). Nanopartikel spårning analys de första 5 ml av kolumnen eluate innehåller en monodisperse population av små, ~ 150 nm EVs (Figur 4C). Transmissionselektronmikroskopi av storleksavslutningsfraktioner avslöjar rikliga elfordon i 2–6 ml-fraktionen av eluate men inte i de senare eluatevolymerna. Elbilar är kända för sin koppliknande form och är därför lätta att skilja från fasta partiklar som visas som punktat ljusa prickar när de bereds under de negativa färgningsförhållandena (figur 4D).
Figur 4: Rening av C. elegans EVs från total utsöndrade biomassa. (A) Förhållandet mellan de totala proteiner som är större än 10 kDa och antalet maskar som ruvade i preparatet för 10 biologiska replikat ritades. De flesta preparat innehöll 1 μg protein per 1 000 djur. ( B)Protein elueringsprofil från en 10 ml hartskolonn laddad med 1 ml koncentrerad sekre. De fraktioner som konsolideras i ytterligare analyser skuggas till grupper. C)Nanopartikelspårningsanalys av de konsoliderade hartsens eluerade fraktioner 2–6 ml. Konfidensintervallet på 95 % är grått. DTEM-analys av de konsoliderade hartsens eluerade fraktioner. Utgångsmaterialet hade både vesikelliknande partiklar och icke-vesikelpartiklar. Den konsoliderade 2-6 ml eluering fraktionen var berikad för blåsor med få icke-vesicle partiklar. De konsoliderade fraktionerna på 7–11 ml innehöll få vesikelliknande partiklar men många icke-vesikelpartiklar. De 12–15 ml elueringsfraktionerna innehöll endast icke-vesikelpartiklar. Alla mikrografer visas med samma förstoring. Skalstång = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att direkt jämföra flödescytometriegenskaperna mellan C. elegans och mänskliga elbilar renade vi elbilar från de konditionerade medierna i cellkulturer hos mänskliga nervceller med denna metod. Flödescytometri separerar partiklar baserat på ljusspridning. Den småvinkelljusspridning (SALS) korrelerar ungefär med storleken, och den långa vinkelljusspridningen (LALS) korrelerar med inre membranstruktur. Majoriteten av de totala provhändelserna från både cellkultur och C. elegans EV-preparat är tätt fokuserade i ett kluster centrerat kring 103 SALS och 104 LALS (figur 5A). Ett histogram av C. elegans EV-provhändelser sorterade efter SALS visar att alla preparat når en topp på ~103 (figur 5B).
Figur 5: C. elegans EVs definieras tydligt av deras ljusspridningsegenskaper. (A) Histogram av SALS-händelser i tre biologiska replikat av C. elegans EVs. ~ 80% av det totala urvalet händelser finns i en stram, tydligt definierad population. I likhet med nanopartikelspårningsanalysen visar den att storleksfördelningen för C. elegans EVs är monodippers. Histogrammet för S Basal-bufferten som används för att späda ut proverna visas för jämförelse. (B)Jämförelse av brytningsegenskaper hos C. elegans och human cellkultur EVs renat med de metoder som beskrivs i denna text. Båda EV-typerna uppvisar konsekvent jämförbara kort- och långvinkelljusspridningsfördelningar (SALS och LALS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
DI-8-ANEPPS etiketter robust C. elegans EVs, konsekvent belyser en majoritet av de totala händelserna i både C. elegans och cell kultur härledda prover. Kalibreringspärlorna och reglagen presenteras i figur 6A. De enskilda FACS-ströområdena visas från ett C. elegans-prov berett från 200 000 djur (#1) och två beställda av 500 000 djur (figur 6B). EVs från antingen 100 ml (#1) eller 200 ml (#2,3) av cellodlingen analyserades också (figur 6C). Både C. elegans och cell kultur härrör prover visade rikliglysrör händelser som försvann när de behandlades med 0,05% Triton-X 100 och ljus ultraljudsbehandling. Detta visar att de märkta händelserna är tvättmedel labile fosfolipid strukturer (vesicles) snarare än tvättmedel-okänsliga fasta lipoprotein aggregat. Ev-förekomst beräknas som skillnaden mellan antalet händelser i DI-8-ANEPPS+ porten mellan fraktionerna utan tvättmedel (-) och med tvättmedel (+) minus händelserna i dye-kontrollen. För tydlighetens skull sammanfattas de uppgifter som presenteras individuellt i figur 6B och figur 6C som stapeldiagram i figur 6D och figur 6E. Överflödet av renade elbilar skilde sig inte nämnvärt mellan C. elegans och cellodlingens härledda preparat (figur 6F).
Figur 6: Exempel på flödescytometridata som används för att beräkna EV-överflöd. (A)För att säkerställa att antalet händelser kan jämföras direkt mellan proverna måste kontrollerna Endast buffert och färgämne köras med samma flödeshastighet och insamlingstid som ev-provfraktionerna. Det finns mycket få händelser i DI-8-ANEPPS gate. b)Representativa resultat av DI-8-ANEPPS och tvättmedelsbehandlingsprotokoll från C. elegans. Tre biologiska replikat visas. Biologisk replikat #1 utarbetades från 200.000 djur medan #2 och #3 var beredda från 500.000 djur. Försvinner elbilar med tvättmedelsbehandling är tydligt i samtliga fall. C)Representativa resultat av DI-8-ANEPPS och tvättmedelsbehandlingsprotokoll med hjälp av betingade medier för mänsklig cellodling. Biologiska replikat #1 och #2 har framställts från 200 ml konditionerade medier medan biologiska replikat #3 utarbetades från 100 ml. (D)Stapeldiagram över de data som samlats in från de tre biologiska replikaten av C. elegans EVs. Felstaplar = S.E.M. Parade tvåsidiga t-tester mellan behandlingarna. = p-värde < 0,001. (E)Stapeldiagram över de data som samlats in från de tre biologiska replikaten av cellodlingsbaserade elbilar. Parade tvåstjärtade t-tester mellan behandlingar. = p-värde < 0,001(F)Antalet färgkänsliga tvättmedelskänsliga händelser per μL beräknades för alla biologiska replikat av C. elegans och cellodling. Värdena mellan de två EV-provkällorna skiljer sig inte nämnvärt. Parade tvåsidiga t-tester mellan behandlingarna p-värde = 0,685. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1 innehåller de råa försöksvärdena för hela 4,5 μl av varje analyserad provtyp. Det totala antalet händelser som samlats in från EV fraktioner renas från 500.000 djur var 10-20x över bakgrundsantalet partiklar som samlats in av buffert ensam medan fraktionen renas från 200.000 djur innehöll ca 2x så många händelser som buffert ensam. Antalet händelser inom DI-8-ANEPPS+-porten visas också för varje prov. Dessa mått kan importeras till ett kalkylblad för att beräkna antalet färg-positiva, tvättmedelskänsliga elbilar som beskrivs ovan. Till exempel skulle antalet elbilar i 1 ml av den första C. elegans biologiska replikat som visas beräknas så här:
(18.974 - 3.853 - 1.487) x (10/4.5) x 1.000 = 30.297.778.
Tabell 1: Tabellformad flödescytometridata. De data som visas i figur 6 presenteras som ett kalkylblad. För varje prov visas de totala händelserna och DI-8-ANEPPS+ gated events. Varje biologisk replikat arrangeras i den ordning som prover #1–3 i protokollet. Dessa mätvärden visar att det totala antalet händelser som samlats in från C. elegans prover som utarbetats från 500.000 djur eller 200 ml cellkultur konditionerade media var 10-20x över bakgrundsantalet partiklar som samlats in av buffert ensam medan den biologiska replikera renas från 200.000 djur innehöll ca 2x så många totala händelser som buffert ensam. Antalet händelser inom DI-8-ANEPPS+-porten visas också för varje prov. Dessa mått kan exporteras till ett kalkylblad för att beräkna det totala antalet eVs. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).
Discussion
En grundläggande utmaning för EV-fältet är att skilja det stora utbudet av EV-undertyper2. De metoder som beskrivs här använder filtrering, differentialcentrifugering och storleksbeskluderingkromatografi för att generera en ren population av små elbilar eftersom ~100 nm EVs tidigare visat sig vara utsöndrade i den yttre miljön och funktion i fysiologiskt relevanta kommunikationsvägar16. Elfordon renas genom storlek-uteslutning kromatografi kan fortfarande vara en blandning av exosomer och små mikrovesicles eftersom dessa EV underklasser är lika stora. Ryggradsdjur EV underklasser är ofta åtskilda av immunprecipitation eftersom denna metod isolerar EVs genom bindning till selektiva membranproteinmarkörer. De beskrivna metoderna underlättar identifieringen av C. elegans EV-membranmarkörproteiner. Därför kan det i framtiden vara möjligt att ytterligare separera små EV-underklasser genom liknande immunoprecipitationsmetoder. I teorin kan immunprecipitation isolera elbilar från välmatade maskar eftersom E. coli EVs inte bör interagera med antikroppen. Forskare som är intresserade av att identifiera protein och genetiska laster av större EV-underklasser (>200 nm) kan göra det genom att hoppa över filtreringssteget på 0,22 μm och sedan analysera pelleten snarare än supernatanten. Att upptäcka protein- och genetiska lastförekomster av stora elbilar kommer att skapa en mer omfattande förståelse av de fysiologiska processer som fungerar genom C. elegans secretome. Förutom att utsöndras i miljön överförs C. elegans eVs internt mellan vävnader. Därför isolerar dessa metoder endast en delmängd av totala C. elegans EVs. Det går dock inte att upptäcka interna elbilar eftersom det inte finns någon metod för att separera elbilar från lysed maskar. Cargo analys av denna externt utsöndras EV delmängd ger ett sätt att identifiera potentiella allmänna EV protein markörer som kan märka interna elbilar också.
Omfattningen av EV-preparatet beror på kraven i experimentet. Totalt 500.000 unga vuxna ger tillräckligt med elbilar för att genomföra flöde cytometri, LC-MS-MS och RNAseq analys parallellt. Detta nummer kan skalas upp eller ned beroende på försöksbehoven. Den största praktiska faktorn för uppskalning är antalet 10 cm högtillväxtplattor som krävs. Hög tillväxt plattor beredda med 500 μL av 20x koncentrerad över natten NA22 kultur kommer att stödja en befolkning på ~ 50.000 vuxna från L1 larvstadiet fram till den första dagen i vuxen ålder. Därför, för att utföra ett experiment med 500.000 vuxna, 13 hög tillväxt plattor behövs: en platta för att generera befolkningen av L1s, två plattor för att generera de vuxna för blekning, och 10 plattor för tillväxten av försöksdjur. Dessa mått är beroende av sådd och bakteriell tillväxt villkor för hög tillväxt plattor. Därför rekommenderas att alla plattor görs på ett standardiserat sätt och sedan kalibrera med kända mängder djur.
Maskar räknas i två steg under odlingsprocessen: 1) före såddmaskar på tallrikar och 2) innan de genererar det konditionerade mediet. Djurodlingstäthet har visat sig påverka beteende, utveckling och stresssvar15,16,17,18 och kan därför också påverka EV-laster. Därför, för konsekvent odling densitet är det nödvändigt att exakt uppskatta maskpopulationer. Att kvantifiera antalet maskar i nio droppar ger statistiskt förtroende för befolkningsuppskattningar. Det är viktigt att behandla varje droppe individuellt, virvla mellan varje droppe och sätta in pipetten på samma avstånd i maskfjädringen. Att vidta dessa försiktighetsåtgärder kommer att säkerställa S.E.M. värden på ~ 5-10% av den totala befolkningen. Om S.E.M. för en maskpopulation är högre än 20%, så gick något snett.
Efter den 24 h bakteriefria inkubationstiden kryper ung, vild typ C. elegans omedelbart efter tillägg till en bakteriematta. Detta tyder på att inkubationen inte allvarligt påverkar deras hälsa. Detta steg påverkar dock djurens fysiologi och kan därför påverka ev-lastens sammansättning. Därför, när man arbetar med mycket sjuka genotyper eller äldre djur, är det viktigt att kontrollera lönsamheten efter inkubationssteget. Om alla djur inte överlever inkubationen, öka sedan den experimentella populationens storlek och minska inkubationstiden. När man arbetar med stora volymer konditionerade medier är det mer praktiskt att använda en omrörd cellkoncentrator med ett filter av regenererad nitrocellulosa. Elbilar binder inte till denna filterkemi lika starkt som andra filtertyper14.
Förhållandet mellan det totala protein som återvinns från det konditionerade mediet och antalet djur som inkuberas för att göra preparatet är ett användbart mått. Om detta förhållande är mycket högre än väntat, då är det möjligt att befolkningen uppskattningar var avstängd eller att djur dog och försämrades i de konditionerade medierna. Om detta förhållande är mycket lägre än väntat, då något protein kan ha gått förlorade på filtren under koncentrationsprocessen. Medan FACS-metoderna direkt kvantifierar eVs i beredningen, är det här måttet användbart eftersom det kan markera exempelavvikelser tidigt i processen. En annan användbar metod för att kontrollera kvaliteten på EV-preparatet är transmissionselektronmikroskopi, som visas i figur 4D. Även om protokollet för transmissionselektronmikroskopi inte formellt ingår i denna metodartikel på grund av längd, kan det utföras med standardmetoder. Det rekommenderas att denna typ av analys, åtminstone inledningsvis, genomförs som en kostnadsfri metod för FACS för att bedöma kvaliteten på ev-preparat. För bästa resultat använd nyurladdade formvar-kol galler och fläckproverna med 2% fosfotungstic syra istället för uranylacetat.
DI-8-ANEPPS valdes eftersom det har visat sig kvantitativt märka EV membran, bättre än andra allmänna EV färgämnen med mänskliga biopsi prover och liposomer25. Mätningarna är snabba och tar bara 3 minuter av insamlingstiden för varje prov. Kvantifieringen av tvättmedelskänsliga elfordon har direkt funktionell betydelse eftersom den drar nytta av en grundläggande fysisk distinktion mellan elbilar och fasta lipoproteinaggregat. Viktigt är att denna metod inte påverkas av mängden totalt protein eller antal icke-EV aggregat och därför kan kvantifiera elbilar som erhållits genom olika reningsmetoder på ett opartiskt sätt. Den FACS-verifierade EV-metriska vi beskriver här skulle vara särskilt användbart för studier som visar fysiologiska effekter av renade elbilar. Det skulle också kunna gynna EV-fältet i allmänhet att etablera en FACS-metod som ett universellt mått så att absolut EV-överflöd kan jämföras direkt mellan studierna. Vitala färgämnen kan också märka C. elegans EVs, men de är inte lika ljusa som elbilar märkta med Di-8-ANEPPS.
Denna reningsmetod kapitaliserar på den aktiva utsöndringen av elbilar utanför kropparna av intakta, levande maskar. Detta gör det möjligt att isolera C. elegans EVs med jämförbar renhet och överflöd från cellodling, specifikationer som är tillräckliga för att identifiera hundratals protein- och RNA-laster via LC-MS-MS och RNAseq-analys26. Det stora biblioteket av reagenser som finns tillgängliga för C. elegans-forskning kan därför utnyttjas för att undersöka påverkan av den genetiska och fysiologiska störningen på EV-lastsammansättningen.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt Nick Terzopoulos för maskplattor och reagenser; Caenorhabditis Genetics Center (CGC) vid NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) för N2-nematodlinjen. Lucia Vojtech, PhD, för hjälp med nanopartikelspårningsanalys; Jessica Young, PhD, och Marie Claire, MD, PhD, för hiPSC-härledda neuronala konditionerade cellmedia; Wai Pang för hjälp med TEM imaging. Detta arbete stöddes av NIH-bidraget P30AG013280 till MK och NIH-bidrag AG054098 till JCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
| 1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05% to lyse EVs |
| 10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
| 2 L bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
| 40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
| 5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
| 6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
| Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
| ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
| DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
| Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
| HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
| Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
| S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
| Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |
References
- Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
- Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
- Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).
- Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589 (2013).
- Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
- Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
- Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
- Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069 (2019).
- Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
- Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
- Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
- Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
- Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
- Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
- Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
- Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502 (2016).
- Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
- de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
- Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).
