Summary
本文演示了一种外膜方法，用于消灭豚鼠内膜囊，用精细的挑料伤害内膜导管，以诱导实验性内膜水肿。
Abstract
内溶性水ps是一种鳞状体的扩大，通常与梅尼埃的疾病有关，尽管病理生理学机制仍不清楚。为了充分研究内溶性水ps的特性，如低频听力损失的起源，需要一个可靠的模型。豚鼠是一个很好的模型，因为它听到低频区域，这是假定受到内溶性水液的影响。先前的研究表明，内淋巴水肿可以通过内膜或外部方法手术诱发，这些方法涉及在内膜导管和囊上钻孔。然而，是否有可能创建一个内向水肿模型使用外膜方法，避免危险的钻在内膜管道和囊是未知的。这项研究的目的是演示一种经过修订的外膜方法，通过在术后30天内诱导实验性内膜水肿，通过消灭内目囊，用精细的挑料伤害内膜导管。样本大小包括七只豚鼠。对听力进行了功能测量，随后采集了时间骨骼进行组学分析。该方法在实现内性水ps方面成功率为86%。脑脊液泄漏的风险很小。样本中未发生术中半圆形运河的围手术死亡或伤害。该方法演示了一种安全可靠的方法，在相对快速的时间点30天诱导内性水解。临床意义在于，该方法为进一步探索低频听力损失的起源提供了可靠的模型，这种损失可与内溶性水ps相关。
Introduction
内部溶性水液是鳞状介质的扩大。可以使用scala介质的横截面区域测量内性水ps的存在。据认为，临床内心水ps可能与低频感神经性听力损失有关，如梅尼埃病中所看到的。但听力损失的来源仍不清楚。为了充分研究与内溶性水ps相关的低频听力损失的起源，需要一个可靠的模型。
1965年，木村和舒克内赫特描述了如何使用内膜方法1在豚鼠中诱导内淋巴水皮。他们的技术涉及使用后颅口方法访问手术和亚弧线。这些步骤包括切口杜拉，用林格溶液浸湿棉垫收回小脑，以及钻取内心管和内心囊的中间部分。骨蜡然后放入手术管中，将内质导管与远端内溶性囊分离开来。颅内切除术缺陷通过放置可吸收的明胶粉（例如，凝胶泡胶）和重合上覆的肌肉而关闭。在术后的第1、3、7、14、21和30天，不断发现内溶性水ps的组织证据，这表明内核方法是诱导组织确认的内溶性水培的可靠方法。使用与木村和舒克内赫特相同的分道法，但不同的时间点，萨尔特和德莫特证实，在第4天和第2天以后，在耳蜗的第二回合中，scala介质显著扩大。虽然原始研究中没有报告使用木村和舒克内赫特的内膜方法诱导脑脊液（CSF）泄漏的实际发病率，但CSF泄漏的存在可能会增加脑膜炎的风险。有人建议，CSF的丧失可能导致淋巴流出，导致同时暂时扩大几内亚猪3的内部性体积。诱导内淋巴水ps的外膜方法将是一个更安全的选择。
1989年，安德鲁斯和博默描述了两种超前手术方法，通过中颅刀法或后颅骨法方法，达到内质囊和导管，以消灭内心囊4。他们描述了用钻石钻去除手术线，然后钻取内心囊的中间部分，或者使用精细的拾取来破坏内溶性囊和管道。1993年，李、赖特和迈尔霍夫描述了类似的方法，包括钻穿内膜囊和管道，但不同之处在于，它们同时阻塞了耳蜗水渠5。它们表明，在消灭内溶性囊和阻塞耳蜗水渠四周后，通过组学评估的内淋巴水肿的存在。Megerian等人是第一个发表视频文章，展示内膜囊和管道的外层消融，涉及直接钻在手术的中段进入内溶囊和管道6。他们展示了在手术后28周牺牲的豚鼠中内性水蛋白的免疫学，以及在16千赫兹区域6的听力损失。能否在早期时间点用外听觉方法诱导组织学确认的内方水ps和低频听力损失，目前尚不得而知。
本报告的总体目标是演示一种外部方法，通过在术后30天内诱导实验性内膜水肿，通过消灭内溶性囊，用精细的挑料伤害内膜导管。使用这种技术背后的原理是避免在岩石上钻骨，从而消除意外伤害杜拉和导致CSF泄漏的风险，降低后半圆形运河受伤的可能性，并降低对sigmoid正着肠受伤的风险。
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Protocol
下文在《议定书》部分所列的所有程序均按圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准的议定书所述进行。
1. 生命体征的麻醉诱导和监测
注：这项研究使用了从内部繁殖群获得的色素NIH菌株豚鼠。
- 使用任何性别的豚鼠，体重至少350克。
- 将豚鼠放入新生儿暖化异体中，并给予氯胺酮/锡兰辛混合物内腹（50毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克xylazine）诱导麻醉。观察豚鼠，直到它失去脚趾捏反射。
- 一旦失去脚趾捏反射发生，用通常为人类宣传的毛发修剪器，将豚鼠的后颈部和头部修剪。
- 将12 mL哺乳林格溶液的皮下波卢斯注射到动物的后部。
- 将豚鼠的支撑放在有腿抬起的加热垫上，并内腹放置27.5 G蝴蝶针。通过确保仅吸入空气，验证蝴蝶针在腹内空间的正确位置。如果血液或液体被吸气，则担心输送到血管或肠道系统。蝴蝶针用于反复麻醉。
- 将豚鼠翻转到易发位置，并将头部固定到立体策略支架上。
- 将脉搏氧仪固定在脚上。如果使用色素豚鼠，色素爪可以防止阅读氧饱和。因此，将脉冲氧仪放在任何未着色的爪子上。
- 插入直肠温度探头以监测体温。直肠探头是加热毯系统的一部分，将体温保持在38°C。在直肠探头到位之前，请勿打开加热毯，以免加热毯过热。如果放置直肠探头有困难，它可以放在豚鼠的身体旁边。
- 在豚鼠的两只眼睛上涂抹润滑剂，以防止角膜擦伤。
- 根据需要通过位于鼻子附近的橡胶管管理补充氧气，以保持 90% 以上的氧饱和度水平。
- 给苯丙酮0.5毫克/千克皮下作为抗生素预防。
- 在预期的切口部位给予0.25毫克/千克bupivacaine，在预期的切口部位给予1：100，000肾上腺素，以产生局部麻醉和血管收缩作用。
- 每20分钟提供一次维护麻醉，每次4个周期，然后仅根据需要根据生命体征进行。通过体温、呼吸速率、氧饱和度和心率定期监测麻醉深度。
- 每 15 分钟监测一次生命体征（温度、呼吸速率、心率和氧饱和度）。
2. 手术准备
- 一旦豚鼠的头部牢固地放置在立体支架中，将一块遮蔽胶带放在背面，以在皮肤上保持足够的张力。将磁带的末端固定到立体策略支架上。
- 用碘溶液和70%乙醇在无菌方式上自由准备皮肤覆盖的occput和后颈部。
- 此时，使用无菌预防措施和自动灭菌仪器。把无菌窗帘放在豚鼠的上。
3. 外科手术
- 使用 15 刀片，沿着后切口进行一个小的中线切口，向下延伸到后颈部。一旦皮肤下，使用虹膜剪刀从骨骼中分离右后颈椎肌肉。如果在切割肌肉时发生任何出血，则使用无菌棉球施加压力来控制。
-
将#3毫米、#2毫米和#1毫米钻石毛刺与 5-0 吸力和无菌灌溉相结合，进行由外部八角峰、羊角脊、八角质缝合线和角质膜的背缘边界组成的颅面切除术。
- 轻轻地将一小块盐水润湿的棉球放在骨头下面，同时将骨骼与杜拉分离。
- 用#0.5毫米的钻石毛刺将 sigmoid 心子进行骨架，并小心地取出覆盖它的骨头。
- 一旦 sigmoid 正着声暴露，使用棉球轻轻缩回 sigmoid 正月，然后切换到使用 3-0 吸力。
- 将操作像识别为位于岩石临时骨骼内的狭缝结构。下弧线fosssa将位于优越，西格莫伊德鼻声将中联。内溶性囊的超囊部分被可视化为进入手术图的透明囊，并附着在覆盖sigmoid正着话的杜拉上。工作点呈椭圆形，约3至4毫米x1.5至2毫米。然而，从手术的角度来看，手术图数显示为大约1毫米的狭缝。从手术视图中的囊的可见部分的大小与手术图的可见部分大致相同，如果不是小。
-
以温和地对淋巴心腹应用缓缩，以清楚地显示内心囊的外腹部分，并增加内溶性囊的外骨和内骨部分之间的张力。
- 使用细角拾取轻轻清除内心囊的中间部分。清除过程在杜拉和操作台之间没有明显联系至关重要;然后在手术盘内放置一个精细的拾取，沿骨骼内部广泛刮去，使其受伤。
- 将精细拾取方向转向内向导管，并盲目地破坏衬里。此时，操作器内的容器可能会出现一些出血。它可以通过一小块棉花进行控制。
- 用一小块棉花擦干空的手术。根据需要使用 3-0 吸力保持棉花干燥。
- 使用小卷曲沿时态骨的鳞片部分刮擦，获取骨尘。慷慨地用骨尘包好手术。使用棉球和吸力保持区域干燥，同时用骨尘包装。
- 将骨蜡涂在手术上以将其密封。确保头骨没有多余的骨蜡。
- 使用骨蜡覆盖颅骨缺陷。
- 以4-0编织的、可吸收的缝合线以中断的方式近似后颈椎肌肉。
- 使用 4-0 编织的可吸收缝合线执行潜角闭合。
4. 手术后护理
- 从自定义立体策略支架中取出豚鼠，并转移到加热的异体。
- 给予2毫克/千克阿蒂帕梅佐尔和24 mL哺乳林格的溶液（皮下远离切口）。由于青金的利尿作用，给哺乳林格提供溶液。为术后镇痛覆盖下皮施用0.2毫克/千克梅洛西康。
- 每15分钟获得生命体征，直到豚鼠完全从麻醉中显现出来。
- 在恢复期手术结束约2小时后，再给予12 mL乳液栓液。
- 一旦豚鼠处于戒备状态、排空、排空和排便，将豚鼠送回动物设施。豚鼠完全从麻醉中出来大约需要2到4个小时。
- 术后头三天每天监测豚鼠两次。如果观察到不适迹象，根据需要每24小时进行一次0.2mg/kg梅洛西卡姆下皮。或者，如果梅洛西坎没有充分管理症状，可对丁丙诺啡（0.05毫克/千克）进行皮下管理。
- 每天给12 mL液体波鲁斯哺乳期林格溶液，最多三天，直到豚鼠达到术前体重。如果豚鼠在术后第三天之前达到术前体重，则停止液体波乐。如果豚鼠在前三天后继续减肥，使用一种补充营养奶昔，通常供人类食用，与碎豚鼠食品颗粒混合使用。
- 每周监测豚鼠，直到其终点。
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Representative Results
提出的方法采用外部方法，在7头豚鼠中，由2头雄性猪和5只雌性猪组成，用精挑剂来消灭内膜囊，并伤害内心管。手术的平均持续时间从切口到闭合2小时。总钻孔时间从5-10分钟不等。豚鼠需要长达4小时才能完全从麻醉中出来。样本中没有术内或术后死亡。任何豚鼠的后半圆形运河或杜拉没有受伤。一只豚鼠（不包括数据分析），对sigmoid罪子的损伤。
豚鼠在牺牲日（术后第30天）进行了第二次手术，进行听觉功能测量，包括听觉神经重叠波形（ANOW）和耳蜗复合作用电位（CAPs）。使用前面描述的方法7、8、9， 进行了 ANOW 和 CAP 测量并进行了分析。ANOW是一个纯粹的神经测量，起源于神经激发在半77，8，98,9的神经激发。在听觉功能测试之后，耳朵立即被收获，并使用前面描述的方法为分析10做好准备。成功的组织制剂在六只耳朵中完成，但一只耳朵在雷斯纳的膜上流下了眼泪。从组织学分析中消除有泪水的耳朵，但保持生理分析。使用 ImageJ11测量了 scala 介质的横截面区域。对时间骨骼的生物学分析显示，与左耳蜗相比，在右耳蜗的7只豚鼠中，有6头有内性水蛋白（图1）。在图 1中，与左耳（蓝色）相比，操作中的右耳（红色）上的鳞状介质横截面区域被放大，在右耳显示内性水肿。每个回合的scala介质的横截面区域也被量化，与控制豚鼠相比（图2）。由于组织制剂问题导致Reisner膜撕裂，图2中未包括单耳测量。控制豚鼠要么接受了假手术（其中内心囊被识别，但没有受到干扰），或者除了做出听觉功能措施所需的手术外，没有进行任何手术。与对照组相比，在内溶性囊被抹杀30天后，耳朵的横截面面积一般较大（图2）。与控制豚鼠相比，七分之六的豚鼠表现出内通性水性，其中六只表现出内通性水性，因此ANOW阈值（±1 kHz）增加，这表明存在低频听力损失（图3）。听觉脑干反应的第1波，或耳蜗复合作用电位（CAP），阈值在频率高于8 kHz的正常范围内，在七只豚鼠中的六只（图3）。
图1：豚鼠耳蜗中模耳切的形态学图像。这头豚鼠在用外部方法消灭内溶性囊后存活了30天。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：作为耳蜗长度函数的 scala 介质的横截面区域。七只耳朵中有六只是红色的。灰色虚线表示来自控制耳朵的度量值的 ±1 标准偏差。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：术后第30天测量的听觉功能测量（ANOW和CAPs）。ANOW 测量为 ±1 kHz，CAP 测量为 >1 kHz。单个耳朵的测量是红色的。灰色虚线表示控制豚鼠阈值的 ±1 标准差。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
提出的外膜法在实现组织学确认的内溶性水ps和低频听力损失方面成功率为86%。该方法在术后第30天可靠地获得了内溶性水ps组织学证据，这与先前使用内膜方法2的研究一致。该方法对现有方法的意义是不需要 CSF 泄漏，从而消除了一个潜在的混淆变量，该变量已被建议导致内性卷3的补偿性、暂时扩展。总体而言，该方法演示了一种快速、安全、可靠的诱导实验内性水解的方法。
与先前的研究相比，该方法具有几个优点。首先，这种方法是外在的，最大限度地减少了CSF泄漏的潜在发病率和混淆效应。其次，通过使用精细拾取代替钻头来清除内心囊并伤害内心管，该方法避免了对后半圆形运河的任何潜在伤害。关键步骤是确保杜拉和操作图之间没有可见的连接。第三，该方法在叶骨代替钻头中采用精细采摘法，将钻在岩石状骨上造成声学创伤的可能性降至最低。最后，该方法提供了一个优化的术外动物协议，以确保豚鼠的快速恢复和成功的术后过程。该方法的一个局限性是使用氯胺酮/辛烷，通过使用允许异氟烷输送的立体分类设备可以克服。
研究结果的科学意义是开发一种安全可靠的方法，在相对快的时间点30天诱导内淋巴水扑。临床意义在于，该方法提供了一个可靠的内位水ps模型，以进一步探讨相关低频听力损失的起源。该方法的未来应用将用于进一步研究与内淋巴水ps相关的低频听力损失的起源。最后，该方法是一种经过修改的支外方法，涉及切除内心囊，用精细的挑料伤害内心导管，在豚鼠术后30天内诱导实验性内膜水肿。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢香农·勒夫勒在数字和材料表方面给予的帮助。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院内国家耳聋和其他通信障碍研究所的支持，通过"学术耳鼻喉科临床医生/研究人员的发展"培训补助金，奖励编号T32DC000022（C.V.V.）和R01 DC014997（J.T.L.）。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mL syringe | Henke-Sass Wolf | 5100-X00V0 | |
| 1 mL and 3 mL syringe | BD Precision(Ordered from Fischer Sci) | 14-826-87 15859152 | |
| 27.5 butterfly gauge needle | Terumo Surflo Winged Infusion Set, Terumo Corporation, Japan) (Ordered from McKesson) | 448407 | |
| 4-0 suture | McKesson | 1034507 | |
| 4 x 4 gauze sponges | Dukal (Ordered form McKesson) | 374454 | |
| 60 mL syringe | Fisher Sci | 22-031-375 | |
| Anspach otologic drill | Anspach | SC2100 | |
| atipamezole | Zoetis | 107204-6 | |
| autoclave | Fisher sci | 15-103-0508 | |
| autoclave bags | McKesson | 524881 | |
| bayonet separator | Olympus | AL 130564 | |
| bupivicaine | auro Medics Pharma | 555150-169-10 | |
| clear sterile drape | 3M | 1020 | |
| cotton balls | Fisherbrand (ordered from Fisher Sci) | 22-456-885 | |
| cotton swabs | McKesson | 508716 | |
| diamond burrs #3, #2, #1, and #0.5 mm | Anspach | QD8-3SD; QD8-2SD; QD8-1SD; QD8-05SD | |
| diaper pad | McKesson | 945330 | |
| disposable 15 blade | Swann-Morton | 0305 | |
| enrofloxacin | Hospira | 0409-4888-01 | |
| epinephrine | McKesson | 63739-0456 | |
| eye ointment | Dechra Vet Products | 17033-211-38 | |
| Freer elevator | Grace Medical | 215100FX | |
| gelfoam | Pfizer (Ordered from McKesson) | 82830 | |
| hair trimmers | Oster Power Pro Cordless (ordered from Amazon) | 078400-020-000 | |
| iodine scrub | Purdue Pharma (ordered from mcKesson) | 521243 | |
| iris scissors | Olympus | CL-542114 | |
| ketamine | Henry Schein Animal Health | 55853 | |
| lactated ringers | B. Braun Medical (ordered from McKesson) | 186662 | |
| lancet knife by Rosen | Grace Medical | 151100FX | referred to as curette in the text |
| lubricant | Milex (ordered from Cooper Surgical) | MX5030 | |
| masking tape | 3M (ordered from fisher sci | 19047259 | |
| metal rectangle basin | Amazon | B07NQDBC6T | |
| needle holder | Olympus | CR 213015-ENT | |
| needles: 27 gage, 18 gauge | BD Precision(Ordered from Fischer Sci) | 14-826-48 14-826-5D | |
| neonatal warming isollete | Air Borne Life Support Systems | 731-1800 | |
| operating microscope | Carl Zeiss | OPMI pico | |
| oxygen tank | AirGas | OX USP200 | |
| pulse ox | CapnoTrue (Ordered from Medacx) | M-3090112001 | |
| rectal probe with heating blanket | Harvard Apparatus | probe: PY2 50-7217 Heating Blanket: PY2 50-7214 | |
| red body holder | Lichtenhan Lab | N/A | In-house product |
| right angle | Olympus | BV-230337 | |
| rosen needle | Olympus | AM-130566 | customized, it is the instrument I use to tear the sac |
| rubber tubing for O2 administration | Fisher Sci | 14-171-104 | |
| saran wrap | Fisher Sci | NC9617977 | |
| stereotactic head holder | WUSTL Instrument Machine Shop | N/A | In-house product |
| sterile drapes | Cardinal Health | 7553 | |
| suction tube by Baron | Grace Medical | 034903FX 034905FX | #3 and #5 Suction |
| tissue forceps adson brown | Grace Medical | 325112FX | |
| Weitlander retractor | Olympus Grace Medical | BL200011 100313FX | |
| xylazine | Akorn | 59399-110-20 |
References
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