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Immunology and Infection

慢性假单位病伤口感染的延迟接种模型

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

我们描述了一种延迟的接种方案,用于在免疫能力小鼠中产生慢性伤口感染。

Abstract

假单胞(P.aeruginosa)是一种与人类健康和疾病越来越相关的主要肿瘤病原体,特别是在糖尿病和住院患者慢性伤口感染的设置中。迫切需要慢性感染模型,以帮助研究伤口发病机制和开发针对这种病原体的新疗法。在这里,我们描述了一个协议,使用延迟接种24小时后,全厚度外伤。目前存在的临时伤口基质的感染可以阻止感染的快速清除或传播,相反,这种感染将形成持续7-10天的慢性感染,而无需植入异物或免疫抑制。该协议模仿人类术后感染的典型时间过程。使用发光P.aeruginosa菌株(PAO1:lux)允许定量的每日评估P.aeruginosa伤口感染的细菌负担。这一新模型可能是研究细菌发病机制和开发慢性P.aeruginosa伤口感染新疗法的有用工具。

Introduction

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伪单抗(P.aeruginosa)是一种与人类健康和疾病密切相关的革兰氏阴性棒状细菌。它负责广泛的发病率和死亡率在不治疗环境,特别是涉及伤口感染的免疫功能低下患者1,2。这种病原体的耐多药菌株的出现,为进一步推动了对导致P.aeruginosa毒性的因素、P.aeruginosa抗生素耐药性机制以及预防和治疗这种致命感染的新方法的进一步推动。因此,对慢性伤口感染的动物模型作为研究这些研究问题的工具的需求从未像现在这样大。

不幸的是,许多动物模型的P.aeruginosa感染往往模拟急性感染与快速解决感染或快速下降由于败血症4,5,这没有充分模拟这些感染的经常慢性性质。为了解决这一缺点,一些模型利用异物的植入,如琼脂珠,硅胶植入物,或藻酸盐凝胶6,7,8。其他模型使用由于年高龄、肥胖或糖尿病而免疫功能低下的小鼠,或通过药理学手段,如环磷酰胺引起的中性粒细胞减少9,10,11,12。然而,无论是使用异物或免疫受损的宿主可能会改变局部炎症过程,使得很难了解在具有正常免疫系统的宿主慢性伤口感染中涉及的病理生理学。

我们已经开发了一种小鼠P.aeruginosa伤口感染的慢性模型,该模型涉及在外伤后延迟接种细菌。延迟接种允许实验评估细菌负担延长到至少7天。这一模型为研究P.aeruginosa慢性感染的发病机制和新的治疗方法开辟了新的机会。

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Protocol

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此处描述的所有方法均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

1. 细菌的制备和生长

  1. 根据研究人员的机构生物安全委员会和动物使用委员会的指导方针,使用BSL-2预防措施与A.aeruginosa和动物进行所有工作。在生物安全柜中执行此处描述的所有步骤,包括小鼠接种。
  2. 可应要求从我们的实验室获得P. aeruginosa的发光 PAO1:lux 菌株。Streak PAO1,储存为冷冻甘油库存,在莱索根布(LB)琼脂。对于发光PAO1:lux菌株,LB琼脂应含有选择性抗生素(100微克/mL卡比西林和12.5微克/mL卡那霉素)。在细菌培养箱中一夜在37°C生长。
  3. 选择一个孤立的菌群,在3ml LB介质pH 7.4中,在37°C下生长过夜。对于发光菌株,肉汤应含有100微克/mL的卡比西林。在摇动、有氧条件下生长。

2. 程序准备

  1. 让所有接受手术的人员都穿干净的长袍/实验室外套、面罩、发网和手套。
  2. 高压灭菌所有手术工具,包括剪刀和钳子。使用无菌技术对动物之间的工具进行消毒。
  3. 用乙醇清洁手术台,并准备干净的手术场。

3. 脱毛

  1. 麻醉 8-12 周老 C57BL/6J 小鼠使用 1%~3% 的异常胶。使用非曲子时,调查人员应遵循其机构的兽医人员麻醉指南。
    1. 开始麻醉,提供1%~3%的异常,并将氧气流量调整到1.5升/分钟。
    2. 捏住老鼠的脚趾,评估麻醉深度。当鼠标不再对刺激做出反应时,将其从感应室中取出,并将其放在手术台上,其鼻子位于离室鼻锥中。
    3. 在双眼上涂抹眼部润滑剂。
  2. 称量鼠标以获得基线预处理重量。
  3. 将鼠标置于易放置位置。在小鼠皮下注射预加热无菌 0.9% 氯化钠,每个齿面 250 μL,共 500 μL。
  4. 使用电动量勒机对鼠标的背区域进行扫描。剃须应在与手术台不同的位置进行,以防止伤口的头发污染。
  5. 化妆水涂抹一层薄薄的脱毛。让化妆水坐20-60s。用温水中润湿的纱布去除头发和多余的化妆水。脱毛后,继续外伤程序。

4. 全厚外伤手术

  1. 在小鼠的中端区域使用25G针在皮下注射持续释放丁丙诺啡0.6⁄1mg/kg。缓慢释放丁丙诺啡在48-72小时内提供止痛。
  2. 消毒手术部位。用无菌贝塔丁拭子擦拭背表面。用无菌酒精拭子擦去过量的贝塔丁。这应该执行3次(在贝塔丁和酒精之间交替),通过从中心以圆形的方式移动到边缘进行拭子。让区域通风干燥。
  3. 使用无菌纱布或塑料粘附膜在手术部位周围创建窗帘。
  4. 伸展皮肤紧绷。使用无菌 6 毫米直径的皮肤活检冲床,通过左背表皮进行初始切口。在右背表皮上重复上述步骤。
  5. 使用钳子将皮肤从左侧轮廓伤口区域的中心搭起。使用剪刀去除表皮和皮肤层。在右侧轮廓伤口区域重复重复,以产生对称的外伤。
  6. 用50μL无菌盐水清洗伤口。让手术部位和周围皮肤空气干燥。然后,用透明的薄膜敷料盖住伤口和伤口。
  7. 将鼠标放回干净的笼子里。每个笼子有1只动物。
  8. 将保持架放在加热垫和显示器上,直到鼠标唤醒。
  9. 在多只动物身上进行上述手术时,使用热珠消毒器清洁动物之间的所有手术器械。
  10. 让小鼠从外科手术中恢复24小时,并在伤口上形成临时伤口基质,然后再用细菌进行接种。

5. 接种P.aeruginosa

  1. 稀释隔夜 PAO1:lux 培养至 OD600 = 0.05 在 75 mL 的 LB 介质中含有 100 μg/mL 的卡比西林,并生长细菌,直到培养处于早期指数阶段 (OD600 = 0.3)。这大约需要 2 到 3 小时。
  2. 稀释 PAO1:在 PBS 中的 lux 浓度为 (7.5 ± 2.5) x 102 CFU/mL。请务必准备过量的接种,以确保足够的体积,并允许在实验后电镀。如果在设施之间运输(即从实验室运送到活体室),请使用明显标有 Biohazard 的防漏箱中的双密封。
  3. 使用经批准的个人防护设备在动物生物生物安全等级 2 (ABSL-2) 批准的生物安全柜 (BSC) 中与P. aeruginosa和小鼠一起执行所有工作。可重复使用的设备(如称重秤)应用粘附包装覆盖,以防止污染。
  4. 如上所述,使用 3% 的异常胶进行麻醉。称量鼠标并记录重量。在小鼠皮下注射预加热无菌 0.9% 氯化钠,每个齿面 250 μL,共 500 μL。
  5. 如果鼠标的透明薄膜敷料在一夜之间脱落,请小心地去除任何产生的疤痕,并穿上新的敷料。
  6. 使用 500 μL 结核菌参 27 G 安全帽注射器,通过透明薄膜敷料将 40 μL 的 PAO1:lux 悬浮液注入每个伤口。应使用不同的小鼠进行非接种/PBS 伤口控制,以防止从反面交叉污染。
  7. 将鼠标放回加热垫上的笼子中并监控,直到它醒来。所有小鼠应单独安置在单独的笼子中,以防止交叉污染。
  8. 提供高热量营养补充膏夹在笼子地板上的食物颗粒之间。
  9. 使用剩余的接种物条纹 LB 琼脂板。计数菌落以确认施用的细菌数量。

6. 受感染伤口的体内成像

  1. 遵循BSL-2密封协议,将小鼠运送到成像仪器,包括使用辅助容器。在将鼠标转移到感应室或成像仪器期间,请注意不要将任何动物床上用品转移或掉落。
  2. 诱导麻醉小鼠吸入1%~3%的硫二苯在诱导室如步骤3.1所述。
  3. 一旦对小鼠进行麻醉,将其置于光学成像系统的成像室中,鼻在异常鼻锥中。
  4. 打开软件程序。
  5. 采集参数将因同时成像的动物数量和生物发光强度而异。要设置的基本参数包括曝光时间、分箱、f/停止和视野 (FOV)。我们的默认启动设置是曝光时间 30 秒、分箱低 (2)、f/停止 1.2 和 FOV 25。根据需要调整这些设置,具体取决于研究人员的需求。
  6. 使用成像程序分析发光数据(参见材料表)。发光将表示为覆盖在小鼠彩色照片上的伪彩色图像。
    1. 在伤口部位创建感兴趣的区域 (ROI),并测量检测到的平均通量(光子/秒)。请注意,数据也可以报告为辐射(光子/秒/cm2/steradian),但只要成像平台与相机之间的距离在成像之间保持恒定,通量就足够了。
    2. 通过在成像平台上的随机区域创建 ROI 来测量背景。减去光子/秒的背景数。
    3. 将数据导出到电子表格进行进一步分析。
  7. 执行上述成像,每天经常跟踪感染进展。

7. 术后管理

  1. 根据研究人员的IACUC协议设定的指南对小鼠进行监测。我们每天监测所有小鼠的前4天,然后每隔一天,直到实验结束。在BSC手术后的头4天,每天称量一次小鼠。在感染后1和2天注射250μL0.9%氯化钠皮下。
  2. 检查小鼠疼痛/疼痛的迹象,包括驼背姿势、粗糙的外衣、嗜睡、呼吸困难、面部脸色和体重减轻。
  3. 如果动物表现出健康恶化的迹象,请咨询兽医。任何似乎显示疼痛/疼痛和体重减轻20%或以上的恶化迹象的小鼠都应安乐死。

8. 伤口切除

  1. 在实验结束时,牺牲使用CO2吸入的小鼠,然后是宫颈脱位。根据该机构的ABSL-2协议处理动物尸体。
  2. 使用无菌剪刀和钳子在BSC中切除伤口床。将每张伤口床放入1 mL无菌PBS中,放入1.5 mL聚丙烯管中。用剪刀把伤口组织切碎。所有伤口应视为ASBL-2,即使它们不被视为受感染。
  3. 在 300 rpm 转速下孵育振动器 2 小时,在 4°C 下孵育。涡旋每个管10s,并连续稀释PBS中的细菌流出物。将稀释的细菌流出物在LB琼脂上,以列举细菌负担。
  4. 如果伤口中的发光信号高于背景发光,并且伤口流出物中检测到的细菌比用 PBS 作为对照接种的伤口中检测到的细菌多,则考虑感染的伤口。

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Representative Results

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我们使用带有质粒编码luxABCDE报告系统(PAO1:lux)的PAO1发光菌株,对小鼠进行切除伤,24小时后用浮游P.aeruginosa接种这些伤口,并测量细菌随时间的负荷(图1图2)。使用成像光学系统获得的代表性图像表明,该模型产生了可检测到的发光(3A)。感染在接种后第3天达到高峰,并根据生物发光和菌群计数在接种后持续7天(图3B+C)。使用这个模型,我们能够可靠地产生伤口持续7-10 ays取决于细菌的菌株和小鼠背景。从伤口分离的细菌的培养表明,定量的CFU/伤口与检测到的发光相关(3D)。最后,尽管可证明和可量化的P.aeruginosa感染,小鼠存活至少7天。虽然在感染后立即迅速减重,但盐水注射和补充营养导致体重恢复(3E)。最后,我们计算了接种剂量,其中50%的伤口会持续感染PAO1。计算出的 IC50值为 ±7.7 x 102 CFU/mL。剂量高于104 CFU/mL导致100%感染率(图3F)。这些结果改编自先前公布的数据13。

Figure 1
图1:描述具有生物发光P.aeruginosa延迟接种的外泄全厚伤口感染模型的架构。条纹 PAO1:勒克斯第-2天。选择第 -1 天的殖民地,在 LB 肉汤中一夜生长。在-1日进行外伤手术。第0天,通过透明薄膜敷料注射到伤口床上,用PAO1:lux接种。接种后进行生物发光成像。每天在 7-10 天重复成像。在7-10日,牺牲动物和收获伤口。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:切除伤口手术的原理图。去除头发后,用酒精和βdine对皮肤进行灭菌后,使用6毫米活检冲床,通过左右端的表皮进行初始切口。使用剪刀和钳子去除皮肤层和表皮层。用 PBS 清洗。盖上透明敷料。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
3:P.阿鲁吉诺萨伤口感染可以通过7天的感染来检测。A) 老鼠感染 PAO1:lux 的代表性图像,其生物发光叠加在外伤上。(B) 发光信号反射伤口细菌负担.N = 6 个伤口。接种:105 CFU/mL PAO1。(C) PAO1:lux感染的伤口的体内发光信号和细菌CFU的线性回归分析,接种后4-7天,接种10 5CFU/mL,以承受一系列细菌负担。D) CFU/伤口中感染 105 CFU/mL PAO1:lux 的小鼠的细菌负担随时间而加重。(E) 体重变化 (相对于 T = -1 伤口切除手术前的体重) N = 4 小鼠/组。所描绘的是 5-95 百分位数的箱形图。统计数据是双向ANOVA更正与西达克多重比较。(F) 伤口感染率的非线性回归分析,用于计算接种后三天的 PAO1 IC50。所有图形都代表 n+3 实验。这个数字已由Sweere等人2019年13日修改。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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我们开发了一种新的延迟接种P.aeruginosa伤口感染模型。在切除伤伤后,将细菌延迟接种到24小时的策略,可以在1周的时限内评估伤口感染。通过使用P.aeruginosa的发光菌株,可以跟踪整个感染过程的感染进展。与其他阿鲁吉诺萨感染模型相比,更长的感染过程将为研究宿主-病原体相互作用和针对P. aeruginosa伤口感染的新疗法提供新的机会。例如,我们已经使用这个模型来演示Pf噬菌体在刺激抗病毒免疫反应中的作用,它允许P.aeruginosa避开宿主免疫系统14。

在切除伤口手术和细菌接种之间包含24小时的恢复时间是这种伤口感染模型的关键步骤。它允许动物在被感染之前从伤口手术中恢复,这可能影响它们至少7天的生存能力。此外,它支持在接种前形成临时伤口基质,结合透明膜敷料,提供有利于生物膜形成的环境。在开发这个模型期间,我们进行了一系列的探索性实验,观察了从伤人和接种到接种之间的不同时间。根据我们的经验,伤后立即接种往往会导致败血症和死亡。相反,在48小时及以后的时间点接种导致小鼠之间和同一小鼠伤口之间的异质性水平令人无法接受。如图3A所示,即使24小时延迟接种,感染伤口的细菌负荷中仍有某种程度的异质性。弥补这一损失的一个方法是在每个实验中使用多种动物。

该协议的一个独特方面是独立切除两个伤口,而不是像在其他一些伤口模型中那样,将皮肤折叠到中线和冲穿,以创建两个双边伤口。我们发现,这种折叠方法对于产生具有清洁边缘对称的伤口也有效。然而,以这种方式治疗的小鼠通常在细菌接种后迅速成为败血症,并死亡。我们认为,这可能是因为这种折叠方法去除了皮肤潘尼库斯肌松 - 一个薄薄的肌肉层,在小鼠的皮肤下不存在在人类。我们推测,这种屏障可以帮助防止细菌传播。

该协议的一个重要组成部分是足够的脱毛从手术部位,因为多余的头发可以提供一个尼杜斯超级感染和干扰坚持透明薄膜敷料。我们发现,剃须除了脱毛霜提供最佳脱毛与最小的皮肤刺激,虽然彻底洗掉霜与温水仍然很重要。

另一个组成部分是营养支持,水化和疼痛控制在手术后和感染过程的头几天。为了解决这个问题,我们第1天和第0天施用500μL的皮下0.9%氯化钠,第1天和第2天施用250μL。我们还在切除伤口手术时提供多种维生素和热量液体凝胶补充剂。如图3E所示,这些措施允许在第3天充分恢复体重。关于心甘肽,我们发现,在切除伤口手术之前给予持续释放0.5毫克/千克丁丙诺啡,为72小时提供足够的疼痛控制,但如果根据任何单个小鼠的疼痛发现,可以给予额外的剂量。

虽然P.aeruginosa伤口感染的模型延长到7-10天是一个显著的优势,比更急性的感染模型,这仍然可能不足以回答某些研究问题涉及更慢性感染。造成这种限制的一个原因是,PAO1:luluna的发光信号在第2-3天峰值(3B)。~7天后,荧光素酶信号可能变得不可靠。因此,我们通过在LB板上电镀伤口流出物并计算CCF,以确认每个伤口在实验结束时的感染来量化细菌。此模型的另一个可能的缺点是需要体内成像系统,某些实验室可能无法访问该系统。绕过这个障碍的一个方法是使用非发光野生型细菌菌株。这仍然允许研究人员利用这种慢性感染模型,如上所述,细菌CCF在实验结束时可以量化。

我们描述了延迟接种P.aeruginosa伤口感染的新模型,使实验延长到7-10天。该模型将作为一个有用的工具,以评估宿主-病原体与P.aeruginosa的相互作用,以及新疗法的开发。该模型具有多个未来方向的潜力,包括适应其他伤口病原体,如金黄色葡萄球菌,以及多微生物感染,包括P.aeruginosa与其他病原体结合。

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Disclosures

作者没有相互竞争的经济利益可披露。

Acknowledgments

pUT-Tn5-EM7-lux-Km1发光构造载体是J.哈代赠送的一份厚礼。原理图是使用BioRender.com创建的。我们感谢G.Gurtner实验室对伤口感染模型的建议。我们还感谢斯坦福Vivo成像创新中心的 T. Doyle 的技术专长。这项工作得到了R21AI133370、R21AI133240、R01AI12492093的赠款的支持,以及斯坦福SPARK、法尔克医学研究信托基金和囊性纤维化基金会(CFF)对P.L.B.C.R.D的赠款,得到了T32AI007502的支持。加比兰·斯坦福科学和工程研究生奖学金和卢伯特·斯特勒生物-X斯坦福跨学科研究生奖学金为J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
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慢性<em>假单位</em>病伤口感染的延迟接种模型
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de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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