Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים פרוטוקול חיסונים מושהה ליצירת זיהומים כרוניים הפצע בעכברים המוסמכים.

Abstract

פסאודומונס aeruginosa (P. aeruginosa) הוא פתוגן מחלה נוזוקומיאלית העיקריים של רלוונטיות הגוברת לבריאות האדם ומחלות, במיוחד בהגדרה של זיהומים הפצע כרונית חולי סוכרת ומאושפזים. יש צורך דחוף מודלים זיהום כרונית כדי לסייע בחקירת הפתוגנזה הפצע ופיתוח של טיפולים חדשים נגד פתוגן זה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שעושה שימוש בחיסון מושהה 24 שעות לאחר שפצעו מלאה במלוא הנסיבות. הזיהום של מטריצה הפצע הזמני נוכח בזמן זה מפורקים או הפצה מהירה או הפצת זיהום ובמקום זאת יוצר זיהום כרוני נמשך 7 – 10 ימים ללא צורך השרשה של חומרים זרים או הדיכוי החיסונית. פרוטוקול זה מחקה קורס זמני טיפוסי של זיהום שלאחר הניתוח בבני אדם. השימוש של הזנים P. aeruginosa מאיר (PAO1: lux) מאפשר הערכה יומית כמותית של נטל בקטריאלי עבור P. aeruginosa זיהומים הפצע. זה מודל הרומן עשוי להיות כלי שימושי בחקירת הפתוגנזה חיידקי ופיתוח של טיפולים חדשים עבור כרונית P. מחלות הפצע.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פסאודומונס aeruginosa (P. aeruginosa) הוא חיידק שלילי בצורת מוט עם רלוונטיות גוברת לבריאות האדם ומחלות. הוא אחראי על תחלואה נרחבת תמותה בהגדרות מחלה נוזוקומיאלית, במיוחד מעורבים דלקות פצעים בחולים חיסוני1,2. הופעתה של זנים עמידים בפני סמים מרובים של פתוגן זה סיפק תנופה נוספת לחקירת גורמים לתרום P. aeruginosa התקפה אלימה, מנגנונים של P. aeruginosa עמידות לאנטיביוטיקה, ושיטות חדשות למניעה וטיפול של זיהום זה קטלני3. ככזה, הצורך במודלים של בעלי חיים של זיהום הפצע כרונית כמו כלים לחקירת שאלות מחקר אלה מעולם לא היה גדול יותר.

למרבה הצער, דגמים רבים של בעלי חיים של P. aeruginosa זיהום נוטים לדמות זיהום אקוטי עם רזולוציה מהירה של זיהום או ירידה מהירה עקב אלח דם4,5, אשר אינה מהווה הדמיה מספקת של הטבע הכרוני לעתים קרובות של זיהומים אלה. כדי לטפל בחיסרון זה, כמה דגמים לנצל את ההשתלה של גופים זרים כגון חרוזים אגר, סיליקון שתלים, או קילוף פלסטיצידיות ג ' לים6,7,8. דגמים אחרים להשתמש בעכברים כי הם בסיכון חיסוני בשל גיל מתקדם, השמנת יתר, או סוכרת, או באמצעות אמצעים תרופתי כגון נויטרופילים המושרה הנגרמת כציקלופומיה9,10,11,12. עם זאת, או השימוש בחומרים זרים או מארחים החיסונית פרוצים כנראה משנה את התהליך הדלקתי המקומי, מה שמקשה להשיג הבנה של הפתופסולוגיה מעורב זיהומים הפצע כרונית במחשבים מארחים עם מערכות חיסונית נורמלית אחרת.

פיתחנו מודל כרוני של P. aeruginosa זיהום הפצע בעכברים הכרוכים החיסון מתעכב עם חיידקים לאחר שפצעו. החיסון העיכוב מאפשר ניסויים בהערכת נטל חיידקי הנמשך לפחות 7 ימים. מודל זה פותח הזדמנויות חדשות עבור חקירת הן פתוגנזה טיפולים חדשים של P. aeruginosa זיהומים כרוניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת סטנפורד.

1. הכנה וצמיחה של חיידקים

  1. לנהל את כל העבודה עם P. aeruginosa ובעלי חיים עם אמצעי זהירות bsl-2 לכל ועדת בטיחות מוסדית של החוקר ובעלי החיים להשתמש הנחיות הוועדה. האם כל הצעדים המתוארים כאן מעורבים ב -P. aeruginosa, כולל עכבר החיסון, בארונית ביולוגית.
  2. PAO1 זורח: לוקס זן של P. aeruginosa זמין מהמעבדה שלנו על ידי בקשה. פס PAO1, המאוחסן כמו מלאי הגליצרול הקפוא, בציר ליססוגנזה (LB) אגר. עבור זורח PAO1: lux להתאמץ, LB אגר צריך להכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית (100 μg/mL carbenicillin ו 12.5 μg/mL kanamycin). גדל ב 37 ° c לילה באינקובטור חיידקי.
  3. בחר מושבה מבודדת ולצמוח לילה ב 37 ° c ב 3 מ"ל LB בינונית, pH 7.4. עבור זנים זורח, ציר צריך להכיל 100 μg/mL carbenicillin. , לגדול תחת רעידות. מצבים אירוביים

2. הכנה לפרוצדורה

  1. האם כל העובדים לבצע ניתוח ללבוש שמלה נקייה מעיל המעבדה, מסכת פנים, רשת שיער, וכפפות.
  2. , אוטוקלב כל כלי הניתוח. כולל מספריים ומלקחיים השתמש בטכניקה אספטי לעקר כלים בין בעלי חיים.
  3. נקו את שולחן הניתוחים באתנול והכינו שדה כירורגי נקי.

3. הסרת שיער

  1. שימוש בעכבר C57BL/6J בשבוע 2%-3% שבועות באמצעות 1%. החוקרים צריכים לעקוב אחר ההנחיות של המוסד שלהם וטרינרי להרדמה בעת שימוש isofלאנה.
    1. הפעל הרדמה על ידי אספקת 1% – 3% isofלפני ולהתאים את קצב זרימת החמצן ל 1.5 L/min. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה.
    2. צבוט את הבוהן של העכבר כדי להעריך את עומק ההרדמה. כאשר העכבר לא מגיב עוד לגירוי, להסיר אותו מן החדר אינדוקציה ומניחים אותו על הספסל כירורגי עם האף שלו בקונוס האף isofהלוראן.
    3. החלת חומר סיכה עינית על שתי העיניים.
  2. שקול את העכבר כדי לקבל משקל טרום ההליך הבסיסי.
  3. למקם את העכבר במצב נוטה. להזריק את העכבר תת-עורי עם מראש מחומם סטרילי 0.9% נתרן כלוריד, 250 μL בכל אגף עבור סך של 500 μL.
  4. לגלח את האזור החלק הימני של העכבר באמצעות מכונת גילוח חשמלית. הגילוח צריך להתרחש במקום אחר מאשר התחנה הכירורגית כדי למנוע זיהום שיער של הפצע.
  5. להחיל שכבה דקה של קרם הסרת שיער. תנו לתחליב לשבת במשך 20 עד 60. הסירו את השיער והקרם העודף עם גזה הלחלח במים חמים. בעקבות הסרת שיער, המשך אל הליך הפצועים.

4. בעובי מלא ניתוח הפצע הקצר

  1. הכנסת שחרור מתמשך בופרנורפין 0.6 – 1 מ"ג/ק"ג תת-עורי באמצעות מחט של 25 גרם באזור באמצע העכבר. בופרינורטין שחרור איטי מספק הקלה על הכאב מעל 48 – 72 h.
  2. . חטא את האתר הכירורגי נגב את המשטח הפנימי. עם דגימה סטרילית בבטאדין לנגב את העודף בבטאדין. עם ספוגית אלכוהול סטרילי זה צריך להתבצע 3 פעמים (לסירוגין בין הבטאדין לבין אלכוהול), שאיפה באמצעות הזזת מהמרכז בצורה מעגלית לקצה. הניחו לאזור להתייבש באוויר.
  3. צור העטוף סביב האתר כירורגי באמצעות גזה סטרילי או לעטוף פלסטיק הנצמד.
  4. מתיחה עור מתוח הזנה. שימוש סטרילי בקוטר 6-mm העור ביופסיה לעשות חתך הראשונית דרך האפידרמיס השמאלית הימנית. חזרו על האפידרמיס הימני.
  5. השתמש מלקחיים לאוהל את העור מהמרכז של אזור הפצע השמאלי המתואר. בלו את הרבדים העוריות והעורי באמצעות מספריים. חזור על האזור הימני המוקף הפצע כדי ליצור פצעים סימטריים.
  6. שטוף פצעים עם 50 μL של תמיסת מלח סטרילית. הניחו לאתר הכירורגי ולעור שמסביב להתייבש באוויר. לאחר מכן, כסו את הפצעים והדורסום בעזרת הקרנת סרטים שקופה.
  7. מניחים את העכבר חזרה בכלוב נקי. . בבית 1 חיה לכל כלוב
  8. הניחו את הכלוב על כרית החימום והצג עד שהעכבר יתעורר.
  9. בעת ביצוע הניתוח לעיל על בעלי חיים מרובים, להשתמש בעיקור חרוז חם כדי לנקות את כל כלי הניתוח בין בעלי חיים.
  10. אפשר 24 שעות על העכברים להתאושש מהליך כירורגי ולהקמת מטריצת הפצע הזמני על הפצעים לפני שתמשיך לחיסון נגד חיידקים.

5. חיסונים עם פ. אירוגסק

  1. לדלל לילה PAO1: לוקס התרבות כדי OD600 = 0.05 ב 75 mL של מדיה LB המכיל 100/mL carbenicillin ולגדול את החיידקים עד התרבות היא בשלב מעריכי מוקדם (OD600 ≈ 0.3). הדבר אמור להימשך כ-2-3 שעות.
  2. לדלל PAO1: lux ב PBS לריכוז של (7.5 ± 2.5) x 102 cfu/mL. הקפידו להכין את העודפים כדי להבטיח נפח מספיק ולאפשר ציפוי לאחר הניסוי. אם מעבירים בין מתקנים (כלומר מהמעבדה לוייונום), השתמשו בבלימה כפולה בתיבת הוכחה שמסומנת באופן ברור בהסגר.
  3. בצע את כל העבודה עם P. aeruginosa ועכברים באמצעות ציוד מגן אישי מאושר ברמת בטיחות ביולוגית 2 (בדרך-2) מאושר ארון בטיחות ביולוגי (תואר ראשון). ציוד הניתן לשימוש חוזר כגון סולם המשקל צריך להיות מכוסה עם להיאחז לעטוף כדי למנוע זיהום.
  4. שימוש ב-3% isofלמטה כמתואר לעיל. שוקלים עכבר ולהקליט את המשקל. להזריק את העכבר תת-עורי עם מראש מחומם סטרילי 0.9% נתרן כלוריד, 250 μL בכל אגף עבור סך של 500 μL.
  5. אם ההלבשה של הסרט השקוף של העכבר הגיע לילה, להסיר את כל המפר כתוצאה בזהירות ולשים על ההלבשה החדשה.
  6. השתמש 500 μL טוברקולב 27 מזרק כובע בטיחות כדי להזריק 40 μL של PAO1: lux ההשעיה דרך הסרט השקוף ההלבשה לתוך כל פצע. עכברים שונים צריכים לשמש עבור שאינם מחוסן/הפצע הערוץ כדי למנוע זיהום צולב של הצד הקונאלצידי.
  7. מניחים את העכבר חזרה בכלוב שלו על משטח חימום לפקח עד שהוא מתעורר. כל העכברים צריכים להיות מאוחסן בנפרד בכלובים נפרדים כדי למנוע זיהום צולב.
  8. מספקים תוספי תזונה גבוהים קלוריות להדביק בין כדורי מזון על רצפת הכלוב.
  9. השתמש ביתר הצורך לרצף לוחית של LB אגר. מושבות לספור כדי לאשר את מספר החיידקים מנוהל.

6. בvivo הדמיה של פצעים נגועים

  1. עקבו אחר פרוטוקולי BSL-2 להובלת עכברים אל ומכלי הדימות, כולל שימוש במיכל משני. להיזהר לא להעביר או לשחרר מצעים בעלי חיים במהלך העברת העכבר לחדר אינדוקציה או מכשיר הדמיה.
  2. לגרום הרדמה של העכבר עם שאיפה 1% – 3% isofלוריאן בחדר אינדוקציה כמתואר בשלב 3.1.
  3. לאחר העכבר מורדם, למקם אותו במיקום נוטה בחדר ההדמיה של מערכת הדמיה אופטית עם האף בקונוס של האף isofהלוראן.
  4. פתח את תוכנת התוכנה.
  5. פרמטרי הרכישה ישתנו בהתאם למספר בעלי החיים המבוססים בו ובאינטנסיביות של ביולומינסנציה. הפרמטרים הבסיסיים להגדרה כוללים זמן חשיפה, ביננג, f/stop ושדה תצוגה (FOV). הגדרות ההתחלה המהווה ברירת מחדל הן בזמן החשיפה 30 שניות, בניה נמוכה (2), f/stop 1.2 ו-FOV 25. התאם הגדרות אלה לפי הצורך, בהתאם לצורכי החוקר.
  6. ניתוח נתונים באמצעות תוכנית הדמיה (ראה טבלת חומרים). לומינסנציה תהיה מיוצגת כתמונת צבע מדומה הצופה על תצלום צבע של העכברים.
    1. צור אזור של עניין (ROI) באתר הפצע ולמדוד שטף הממוצע (פוטונים/שנייה) זוהה. שים לב כי ניתן גם לדווח על נתונים כזוהר (פוטונים/שנייה/cm ²/סטרדיאן), אבל כל עוד המרחק של פלטפורמת ההדמיה מן המצלמה נשאר קבוע בין הדמיה, שטף מספיק.
    2. למדוד את הרקע על ידי יצירת ROI באזור אקראי בפלטפורמת ההדמיה. הפחת את מספר הרקע של פוטונים/שניה.
    3. יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
  7. לבצע הדמיה כמתואר לעיל לעתים קרובות כיום כדי לעקוב אחר התקדמות הזיהום.

7. ניהול פוסט-פעיל

  1. לנטר עכברים לפי קווים מנחים שנקבעו על-ידי פרוטוקול IACUC של החוקר. אנו מפקחים על כל העכברים מדי יום במשך ארבעת הימים הראשונים, ואז כל יומיים עד סוף הניסוי. שקול את העכברים פעם ביום במשך 4 הימים הראשונים שלאחר הניתוח בתואר ראשון. הכנס 250 μL של 0.9% נתרן כלוריד תת-עורי בימים שלאחר ההדבקה 1 ו-2.
  2. בדקו סימנים של כאב/מצוקה בעכברים, כולל תנוחה מוזנחת, מעיל מוזנח, עייפות, קשיי נשימה, הפנים וירידה במשקל.
  3. אם בעלי חיים מציגים סימני בריאות מתדרדרים, התייעצו עם וטרינר. כל עכבר שנראה להראות מחמיר סימנים של כאב/מצוקה וירידה במשקל של 20% או יותר צריך להיות מורדמים.

8. כריתה של הפצע

  1. בסוף הניסוי, להקריב את העכברים באמצעות שאיפת CO2 , ואחריו פריקה צוואר הרחם. היפטר מגופת החיה בהתאם. לפרוטוקולים של המוסד
  2. מיטות של פציעת בלו באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים בתואר ראשון. מניחים כל מיטת הפצע ב-1 מ ל סטרילי בתוך צינור פוליפרופילן 1.5 mL. . הללו את רקמת הפצע עם מספריים יש לטפל בכל הפצעים כ-ASBL-2, גם אם אינם נחשבים לנגועים.
  3. דגירה על שייקר ב 300 סל ד עבור 2 h ב 4 ° c. . ומדלל את השפכים החיידקיים בערוץ הPBS צלחת הקולחים בקטריאלי מדולל על LB אגר כדי לספור את הנטל החיידקי.
  4. שקול פצעים נגועים אם האות זורח בפצע הוא מעל לאור הרקע חיידקים יותר מזוהים הפצע בקולחים מאשר פצעים שחוסנו עם PBS כמו שליטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

באמצעות זן זורח של PAO1 עם קידוד פלבאמצע מערכת הכתבת היוקרה (PAO1: lux), אנו ביצעו פציעה מוטעית על עכברים, חוסנו פצעים אלה עם P. aeruginosa 24 שעות מאוחר יותר, ומדד נטל חיידקי לאורך זמן (איור 1 ואיור 2). תמונה ייצוגית שהושגה באמצעות מערכת הדמיה אופטית ממחישה כי מודל זה מביא לאור לגילוי (איור 3א). הזיהום הגיעה ביום 3 לאחר החיסון והמשיך 7 ימים לאחר החיסון המבוסס על שני ביולומינציה וספירות מושבה (איור 3ב – ג). באמצעות מודל זה, אנו מסוגלים ליצור באופן אמין פצעים שנמשכים 7-10 ס בהתאם למתח של חיידקים ורקע העכבר. התרבות של החיידקים מבודדים מן הפצע הראה כי כימות CFU/פצע בקורלציה עם לומינציה מזוהה (איור 3ד). לבסוף, למרות ונאה וככמת P. aeruginosa זיהום, עכברים שרדו לפחות 7 ימים. למרות שהיה הראשון הרזיה הראשונית מיד לאחר ההדבקה, זריקות מלוחים ותזונה משלימה הביא שחזור של משקל (איור 3E). לבסוף, הצלחנו לחשב את מינון החיסונים שבו 50% מפצעיו הפכו לנגועים באופן בר קיימא בPAO1. ערך ה-IC50 המחושב היה ~ 7.7 x 102 cfu/mL. מינונים גבוהים יותר 104 cfu/mL התוצאה 100% שיעור זיהום (איור 3F). תוצאות אלה הותאמו מתוך נתונים שפורסמו בעבר13.

Figure 1
איור 1: סכמטי המתאר את הדגם המלא של זיהום בעובי הפצע עם החיסונים המושהים עם ביולומיזנטיפ. aerginosa פס PAO1: lux ביום 2. בחר מושבה על יום -1 ולצמוח לילה במרק LB. ביצוע ניתוח הפצע המאולשל ביום -1. ביום 0, האיחסן עם PAO1: lux על ידי הזרקת לתוך מיטת הפצע דרך הסרט שקוף להתלבש. ביצוע הדמיה ביולומינסנציה לאחר חיסון. חזור על הדמיה בדרך כלל מדי יום עד יום 7 – 10. ביום 7 – 10, הקריבו חיות ופצעי קציר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכימטי של ניתוח הפצע המאולשל. לאחר הסרת שיער ועיקור של העור עם אלכוהול בבטאדין, להשתמש 6 מילימטר ביופסיה אגרוף לעשות חתך הראשונית דרך האפידרמיס של שמאל וימין dorsum. השימוש מספריים מלקחיים כדי להסיר את השכבות העורי ובאפידרמיס. . שטוף עם הערוץ הPBS . לכסות ברוטב ברור אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הידבקות בפצע משנת , ניתן להבחין באמצעות 7 ימים של זיהום. (א) דמות מייצגת של עכבר נגוע PAO1: lux עם שכבת ביולומינסנציה על פצעים מלציטיות. (ב) אות זורח המשקף נטל חיידקי הפצע. N = 6 פצעים. חיסון: 105 cfu/mL PAO1. (ג) ניתוח רגרסיה לינארית באות vivo זורח ובקטריאלי cfu של PAO1: לוקס פצעים נגועים, שנאספו 4 – 7 ימים לאחר החיסון עם 105 cfu/mL כדי לאפשר מגוון של נטל חיידקי. (ד) נטל חיידקי ב-cfu/פצע לאורך זמן עכברים נגועים 105 CFU/mL PAO1: lux. (ה) שינוי משקל (ביחס למשקל לפני ניתוח כריתה של הפצע ב-T =-1) N = 4 עכברים/קבוצה. מתוארים הם מגרשים עבור 5-95 אחוזון. נתונים סטטיסטיים מתוקנים על ידי 2 כיוון עם Sidak השוואה מרובה. (ו) ניתוח רגרסיה לא לינארית של שיעור זיהום הפצע המשמש לחישוב ה-IC50 עבור PAO1 שלושה ימים לאחר החיסון. כל הגרפים מייצגים של n ≥ 3 ניסויים. דמות זו השתנתה מ-סווייר ואח '. 201913. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פיתחנו רומן מתעכב . במודל לזיהום בפצע האסטרטגיה של עיכוב הידבקות בחיידקים עד 24 שעות לאחר פציעה מהצועית מאפשרת הערכה של דלקות פצעים במשך שבוע אחד. באמצעות זן זורח של P. aeruginosa, ניתן לעקוב אחר התקדמות הזיהום במהלך הקורס זיהום. מסלול ארוך יותר של זיהום לעומת אחרים P. aeruginosa מודלים זיהום יאפשר הזדמנויות חדשות ללמוד אינטראקציות הפתוגן המארחים וטיפולים הרומן מיקוד P. aeruginosa הפצע זיהומים. לדוגמה, כבר השתמשנו במודל זה כדי להדגים את התפקיד של בקטאוגיה Pf בעירור תגובה חיסונית אנטי ויראלית המאפשרת P. aeruginosa כדי להתחמק המערכת החיסונית מארח14.

הכללה של 24 שעות של זמן ההתאוששות בין ניתוח הפצע הקצר והחיסון החיידקי הוא צעד קריטי במודל זה זיהום הפצע. זה מאפשר לבעלי חיים להתאושש מניתוח הפצע לפני שנדבקו, מה שכנראה ממלא תפקיד ביכולתם לשרוד לפחות 7 ימים. כמו-כן, היא תומכת בהיווצרות מטריצת פציעה זמנית לפני החיסון, שבשילוב עם הקרנת הסרט השקוף, מספקת סביבה התורמת ליצירת המבנה. במהלך הפיתוח של מודל זה בוצעו שורה של ניסויים במהלך ההתפתחות של המודל הזה בזמן שונה בין פצועים לחיסון. בניסיון שלנו, חיסון מיידי לאחר שפצעו מביא לעיתים קרובות אלח דם ומוות. לעומת זאת, החיסון 48 שעות ונקודות זמן מאוחרות יותר הובילו לרמות לא מקובלות של טרוגניות בין עכברים ובין פצעים באותו עכבר. כפי שניתן להבין באיור 3א, עדיין יכול להיות מידה מסוימת של טרוגניות צפוי בעומס חיידקי של פצעים נגועים, אפילו עם מתעכב 24-h החיסון. דרך אחת לפצות על כך היא להשתמש בחיות מרובות בכל ניסוי.

היבט ייחודי של פרוטוקול זה הוא כריתה של שני פצעים באופן עצמאי ולא לקפל את העור לאורך קו האמצע והניקוב כדי ליצור שני פצעים דו-צדדיים, כפי שנעשה בדגמים אחרים של הפצע. מצאנו כי שיטה זו מתקפלים היה גם יעיל להפקת פצעים סימטריים עם שוליים נקיים. עם זאת, עכברים שטופלו באופן זה בדרך כלל הפכו ספיגה מהר לאחר החיסון חיידקי ומת. אנו מאמינים כי זה עשוי להיות בגלל שיטה זו מתקפלת מסיר את Panniculus carnosus-שכבה דקה של שרירים המשמשים את העור של עכברים שאינו נוכח בבני אדם. אנו משערים כי מכשול זה עשוי לסייע במניעת הפצת חיידקים.

מרכיב חשוב של פרוטוקול זה הוא מספיק הסרת שיער מהאתר כירורגי, כמו שיער עודף יכול לספק nidus עבור זיהום על ומפריעה לדבקות של הסרט שקוף ההלבשה. מצאנו כי גילוח בנוסף קרם להסרת שיער מספק הסרת שיער אופטימלית עם גירוי בעור מינימלי, למרות ביסודיות שטיפת הקרם עם מים חמים הוא עדיין חשוב.

גורם אינטגרלי נוסף הוא תמיכה תזונתית, לחות, ושליטה בכאב במהלך הימים הראשונים של קורס כירורגי וזיהום. כדי לענות על כך, אנו מנהלים 500 μL של תת עורית 0.9% נתרן כלוריד ביום -1 ו -0, ואז 250 μL ביום 1 ו-2. אנו מספקים גם מולטי ויטמין והקלוריק תוספת ג'ל נוזלי בזמן ניתוח הפצע excisional. כפי שמתואר באיור 3E, אמצעים אלה מאפשרים התאוששות נאותה של משקל ביום 3. לגבי כאבים, מצאנו כי שחרור מתמשך 0.5 מ"ג/ק"ג בופרנורפין נתון לפני ניתוח הפצע excisional מספק שליטה מספקת בכאב עבור 72 h, אבל מינונים נוספים ניתן להעניק אם מבוסס על ממצאי מצוקה בעכבר בודדים.

למרות המודל של P. aeruginosa פצע זיהום הארכה ל -7 – 10 ימים הוא יתרון משמעותי על פני מודלים חריפה יותר של זיהום, זה עדיין לא יכול להיות מספיק לענות על שאלות מחקר מסוימות מעורבים זיהומים כרוניים יותר. אחת הסיבות למגבלה זו היא כי האות זורח של PAO1: lux המתח של P. aeruginosa פסגות ביום 2 – 3 (איור 3ב). לאחר ~ 7 ימים האות לוציפראז יכול להיות לא אמין. מסיבה זו, אנו מכמת את החיידקים על ידי הציפוי הקולחים הפצע על לוחות LB וספירת CFUs כדי לאשר זיהום של כל פצע בסוף הניסוי. חיסרון אפשרי נוסף של מודל זה הוא הדרישה עבור מערכת הדמיה vivo, אשר כמה מעבדות אולי לא תהיה גישה. אחת הדרכים סביב מכשול זה היא להשתמש לא מזורח פראי סוג בקטריאלי. זה עדיין מאפשר לחוקר לנצל את המודל הזה זיהום כרונית, כפי שצוין לעיל, החיידק הקטפוס ניתן לכמת בסוף הניסוי.

התחלנו לתאר את המודל הרומן של זיהום הפצע מתעכב . המאפשר ניסויים הארכת עד 7 – 10 ימים. דגם זה ישמש ככלי שימושי להערכת האינטראקציה עם הפתוגן המארח עם P. aeruginosa, כמו גם פיתוח של טיפולים חדשים. לדגם זה יש פוטנציאל לכיוונים מרובים בעתיד, כולל הסתגלות לפתוגנים פצעים אחרים כגון האורלולוקוקוס, כמו גם זיהומים פוליחיידקים, כולל P. aeruginosa בשילוב עם פתוגנים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לגלות.

Acknowledgments

לשים-Tn5-EM7-lux-Km1 לבנות וקטור זורח היה מתנה אדיבה של J. הארדי. . השרטוטים נוצרו עם BioRender.com אנו מודים למעבדה של הג גורטנר על העצה שלהם על מודל זיהום הפצע. כמו כן, אנו מודים ל-T. דויל ממרכז סטנפורד לחדשנות ב Vivo הדמיה למומחיות הטכנית שלו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, ומענקים מאוניברסיטת סטנפורד ספארק, הקרן לחקר הרפואה של פלק ובסיס סיסטיק פיברוזיס (CFF) ל P.L.B. C. R. D נתמך על ידי T32AI007502. מלגת לימודים למדעים ולהנדסה באוניברסיטת לוברט סטרייר ביוגרפיה באוניברסיטת סטנפורד הנתמכת ב-J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13, (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25, (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85, (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3, (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80, (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21, (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20, (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190, (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202, (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89, (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363, (6434), (2019).
מדבקת החיסון נגד הידבקות <em>כרונית</em> בנגיף הדלקת בפצע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter