Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En forsinket inokulasjonmodell av kroniskpseudomonas aeruginosa sårinfeksjon

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en forsinket inokulasjonsprotokoll for generering av kroniske sårinfeksjoner hos immunkompetente mus.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er et stort nosocomial patogen av økende relevans for menneskers helse og sykdom, spesielt i innstillingen av kroniske sårinfeksjoner hos diabetikere og innlagte pasienter. Det er et presserende behov for kroniske infeksjonsmodeller for å hjelpe til med undersøkelsen av sårpatogenogenese og utvikling av nye terapier mot dette patogenet. Her beskriver vi en protokoll som bruker forsinket inokulasjon 24 timer etter eksisjonssåret i full tykkelse. Infeksjonen i den provisoriske sårmatrisen som finnes på denne tiden skogaller enten rask clearance eller formidling av infeksjon og i stedet etablerer kronisk infeksjon som varer 7-10 dager uten behov for implantasjon av fremmedlegemer eller immunundertrykkelse. Denne protokollen etterligner et typisk timelig kurs av postoperativ infeksjon hos mennesker. Bruk av en selvlysende P. aeruginosa stamme (PAO1:lux) gir kvantitativ daglig vurdering av bakteriell byrde for P. aeruginosa sårinfeksjoner. Denne nye modellen kan være et nyttig verktøy i undersøkelsen av bakteriell patogenese og utvikling av nye terapier for kroniske P. aeruginosa sårinfeksjoner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er en Gram-negativ stangformet bakterie med økende relevans for menneskers helse og sykdom. Det er ansvarlig for omfattende sykelighet og dødelighet i nosocomial-miljøer, spesielt med sårinfeksjoner hos immunkompromitterte pasienter1,2. Fremveksten av multiresistente stammer av dette patogenet har gitt ytterligere drivkraft for undersøkelse av faktorer som bidrar til P. aeruginosa virulence, mekanismer for P. aeruginosa antibiotikaresistens, og nye metoder for forebygging og behandling av denne dødeligeinfeksjonen 3. Som sådan har behovet for dyremodeller av kronisk sårinfeksjon som verktøy for å undersøke disse forskningsspørsmålene aldri vært større.

Dessverre har mange dyremodeller av P. aeruginosa infeksjon en tendens til å simulere akutt infeksjon med rask infeksjonsoppløsning eller rask nedgang på grunn av sepsis4,5, som ikke tilstrekkelig simulerer ofte kronisk natur disse infeksjonene. For å løse denne ulempen, bruker noen modeller implantasjon av fremmedlegemer som agarperler, silikonimplantater eller alginatgeler6,7,8. Andre modeller bruker mus som er immunkompromittert på grunn av avansert alder, fedme eller diabetes, eller gjennom farmakologiske midler som cyklofosfamidindusert nøytropeni9,10,11,12. Imidlertid endrer enten bruk av fremmedlegemer eller immunkompromitterte verter sannsynligvis den lokale inflammatoriske prosessen, noe som gjør det vanskelig å få en forståelse av patofysiologien involvert i kroniske sårinfeksjoner hos verter med ellers normale immunsystem.

Vi har utviklet en kronisk modell av P. aeruginosa sårinfeksjon hos mus som innebærer forsinket inokulasjon med bakterier etter excisional såret. Forsinket inokulasjon gjør det mulig for eksperimenter som vurderer bakteriell byrde som strekker seg ut til minst 7 dager. Denne modellen åpner opp nye muligheter for å undersøke både patogenesen og nye behandlinger av P. aeruginosa kroniske infeksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stanford University.

1. Forberedelse og vekst av bakterier

  1. Gjennomføre alt arbeid med P. aeruginosa og dyr med BSL-2 forholdsregler i henhold til forskerens institusjonelle biosikkerhetskomité og retningslinjer for dyrebrukskomité. Gjør alle skritt som er beskrevet her som involverer P. aeruginosa, inkludert mus inokulasjon, i et biosikkerhetsskap.
  2. Den selvlysende PAO1: lux stamme av P. aeruginosa er tilgjengelig fra vår lab på forespørsel. Streak PAO1, lagret som frossen glyserol lager, på Lysogeny Broth (LB) agar. For den selvlysende PAO1:lux-stammen skal LB agar inneholde selektive antibiotika (100 μg/ml karbenicillin og 12,5 μg/ml kanamycin). Vokse ved 37 °C over natten hos en bakteriell inkubator.
  3. Velg en isolert koloni og vokse over natten ved 37 °C i 3 ml LB medium, pH 7.4. For selvlysende stammer skal kjøttkraft inneholde 100 μg/ml karbenicillin. Vokse under risting, aerobe forhold.

2. Prosedyre forberedelse

  1. Få alle personell til å utføre kirurgi bære en ren kjole / Lab frakk, ansiktsmaske, hårnett, og hansker.
  2. Autoklav alle kirurgiske verktøy, inkludert saks og tang. Bruk aseptisk teknikk for å sterilisere verktøy mellom dyr.
  3. Rengjør det kirurgiske bordet med etanol og lag et rent kirurgisk felt.

3. Hårfjerning

  1. Bedøve 8-12 uker gamle C57BL/6J mus ved hjelp av 1%-3% isoflurane. Etterforskerne bør følge institusjonens veterinærstabsretningslinjer for anestesi ved bruk av isoflurane.
    1. Start anestesi ved å levere 1%-3% isofluran e og justere oksygenstrømningshastigheten til 1,5 L/min. Plasser musen i induksjonskammeret.
    2. Klyp musens tå for å vurdere dybden av anestesi. Når musen ikke lenger reagerer på stimulering, fjern den fra induksjonskammeret og legg den på kirurgisk benk med nesen i isoflurannesekjeglen.
    3. Påfør okulær smøremiddel på begge øynene.
  2. Vei musen for å oppnå en baseline pre-prosedyre vekt.
  3. Plasser musen i utsatt posisjon. Injiser musen subkutant med forhåndsoppvarmet steril 0,9% natriumklorid, 250 μL ved hver flanke for totalt 500 μL.
  4. Barber dorsalområdet av musen ved hjelp av en elektrisk barbermaskin. Barbering bør oppstå på et annet sted enn kirurgisk stasjon for å forhindre hårforurensning av såret.
  5. Påfør et tynt lag med hårfjerningslotion. La lotionen sitte i 20–60 s. Fjern håret og overflødig lotion med gasbind fuktet i varmt vann. Etter hårfjerning, fortsett til eksisional såret prosedyren.

4. Full tykkelse eksisjonal sår kirurgi

  1. Injiser vedvarende frigjøring buprenorfin 0,6–1 mg/kg subkutant ved hjelp av en 25 G nål midt i musens midtdorsalområde. Langsom frigjøring buprenorfin gir smertelindring over 48–72 timer.
  2. Desinfiser operasjonsstedet. Tørk av dorsaloverflaten med en steril betadinvattpinne. Tørk overflødig betadin med en steril alkoholvattpinne. Dette bør utføres 3 ganger (vekslende mellom betadin og alkohol), vattpinne ved å flytte fra midten på en sirkulær måte til kanten. La området lufttørke.
  3. Lag en drapering rundt operasjonsstedet ved hjelp av steril gasbind eller plastplastfolie.
  4. Strekk huden stramt caudally. Bruk en steril 6 mm diameter hudbiopsi slag for å gjøre et første snitt gjennom venstre dorsal epidermis. Gjenta på høyre dorsal epidermis.
  5. Bruk tang til å telte huden fra midten av venstre skissert sårområde. Avgiftsy epidermal og dermal lag ved hjelp av saks. Gjenta til høyre skissert sår område for å skape symmetriske excisional sår.
  6. Vask sår med 50 μL steril saltvann. La operasjonsstedet og den omkringliggende huden lufttørke. Deretter dekker du sårene og dorsum med en gjennomsiktig filmdressing.
  7. Plasser musen tilbake i et rent bur. Hus 1 dyr per bur.
  8. Plasser buret på en varmepute og skjerm til musen våkner.
  9. Når du utfører ovennevnte kirurgi på flere dyr, bruk en varm perle sterilisator for å rense alle kirurgiske instrumenter mellom dyr.
  10. Tillat 24 timer for musene å komme seg fra den kirurgiske prosedyren og for dannelse av en foreløpig sårmatrise over sårene før du fortsetter å inokulere med bakterier.

5. Inokulasjon med P. aeruginosa

  1. Fortynn over natten PAO1: lux kultur til OD600 = 0,05 i 75 ml LB-medier som inneholder 100 μg/ml karbenicillin og dyrke bakteriene til kulturen er i tidlig eksponentiell fase (OD600 ‰ 0,3). Dette bør ta ca 2-3 t.
  2. Fortynn PAO1: lux i PBS til en konsentrasjon på (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/ml. Sørg for å forberede overflødig inonoto for å sikre tilstrekkelig volum og for å tillate plating etter eksperimentet. Hvis transport mellom anlegg (dvs. fra laboratoriet til vivarium), bruk dobbel inneslutning i en lekkasjesikker boks tydelig merket Biohazard.
  3. Utfør alt arbeid med P. aeruginosa og mus ved hjelp av godkjent personlig verneutstyr i et Animal Biosafety Level 2 (ABSL-2) godkjent biologisk sikkerhetsskap (BSC). Gjenbrukbart utstyr som veievekten skal dekkes med plastfolie for å forhindre kontaminering.
  4. Bedøve ved hjelp av 3 % isofluran som beskrevet ovenfor. Veie musen og registrere vekten. Injiser musen subkutant med forhåndsoppvarmet steril 0,9% natriumklorid, 250 μL ved hver flanke for totalt 500 μL.
  5. Hvis musens gjennomsiktige filmdressing har løsnet over natten, fjern eventuelle resulterende nøye og ta på seg en ny dressing.
  6. Bruk en 500 μL tuberculin 27 G sikkerhetsdeksel sprøyte for å injisere 40 μL av PAO1: lux suspensjon gjennom gjennomsiktig film dressing i hvert sår. Ulike mus bør brukes til ikke-inokulerte/PBS sårkontroller for å forhindre krysskontaminering fra den kontralaterale siden.
  7. Plasser musen tilbake i buret på en varmepute og skjerm til den våkner. Alle mus skal plasseres individuelt i separate bur for å forhindre krysskontaminering.
  8. Gi høy kalori kosttilskudd pasta klemt mellom mat pellets på gulvet i buret.
  9. Bruk den gjenværende inoculum til å strekke en LB agar plate. Telle kolonier for å bekrefte antall bakterier som administreres.

6. In vivo bildebehandling av infiserte sår

  1. Følg BSL-2-inneslutningsprotokoller for transport av mus til og fra bildeinstrumentet, inkludert bruk av en sekundær beholder. Vær forsiktig så du ikke overfører eller slipper dyresengetøy under overføring av musen til induksjonskammeret eller bildeinstrumentet.
  2. Indusere anestesi av musen med inhalert 1%-3% isofluran i et induksjonskammer som beskrevet i trinn 3.1.
  3. Når musen er bedøvet, plasser den i utsatt stilling i bildekammeret i et optisk bildesystem med nesen i isoflurannesekonen.
  4. Åpne programmet.
  5. Oppkjøpsparametrene vil variere basert på antall dyr som avbildet samtidig og intensiteten av bioluminescens. De grunnleggende parametrene for å angi inkluderer eksponeringstid, binning, f/stop og synsfelt (FOV). Våre standard startinnstillinger er eksponeringstid 30 sekunder, binning lav (2), f / stopp 1.2 og FOV 25. Juster disse innstillingene etter behov avhengig av forskerens behov.
  6. Analyser luminescensdata ved hjelp av et bildeprogram (se Materialtabell). Luminescence vil bli representert som et pseudocolor bilde lagt på et fargefotografi av musene.
    1. Opprett et område av interesse (ROI) på sårstedet og mål gjennomsnittlig fluks (fotoner/ sekund) oppdaget. Vær oppmerksom på at data også kan rapporteres som utstråling (fotoner/sekund/cm²/steradian), men så lenge avstanden til bildeplattformen fra kameraet forblir konstant mellom bildebehandling, er fluks tilstrekkelig.
    2. Mål bakgrunn ved å opprette en avkastning på et tilfeldig område på bildeplattformen. Trekk fra bakgrunnsnummeret til fotoner/sekund.
    3. Eksporter dataene til et regneark for videre analyse.
  7. Utfør bildebehandling som beskrevet ovenfor så ofte som daglig for å spore infeksjonsprogresjon.

7. Postoperativ ledelse

  1. Overvåk mus i henhold til retningslinjer fastsatt av forskerens IACUC-protokoll. Vi overvåker alle mus daglig de første 4 dagene, deretter annenhver dag til slutten av eksperimentet. Vei musene en gang per dag de første 4 dagene etter operasjonen i en BSC. Injiser 250 μL på 0,9 % natriumklorid subkutant på postinfeksjonsdager 1 og 2.
  2. Se etter tegn på smerte/nød hos musene, inkludert hunched holdning, scruffy pels, sløvhet, pustevansker, ansikts grimase, og vekttap.
  3. Hvis dyr viser tegn på forverret helse, rådfør deg med en veterinær. Enhver mus som ser ut til å vise forverrede tegn på smerte / nød og et vekttap på 20% eller større bør euthanized.

8. Såreksisjon

  1. På slutten av eksperimentet, ofre musene ved hjelp av CO2 innånding, etterfulgt av cervical dislokasjon. Kast dyrekadaveret i henhold til institusjonens ABSL-2-protokoller.
  2. Avgiftssår senger ved hjelp av steril saks og tang i en BSC. Plasser hver sårseng i 1 ml steril PBS i et 1,5 ml polypropylenrør. Hakk sårvevet med saks. Alle sår skal behandles som ASBL-2, selv om de ikke anses som infiserte.
  3. Inkuber på en shaker ved 300 o/min i 2 timer ved 4 °C. Vortex hvert rør for 10 s og serielt fortynne bakterieavløp i PBS. Plate fortynnet bakteriell avløpsvann på LB agar for å liste opp bakteriebyrden.
  4. Vurder sår infisert hvis selvlysende signal i såret er over bakgrunnsluminescens og flere bakterier oppdages i såravløpsvannet enn i sår inokulert med PBS som kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjelp av en selvlysende stamme av PAO1 med en plasmid koding av luxABCDE reportersystem (PAO1:lux), utførte vi excisional såret på mus, inokulerte disse sårene med planktononp 24 timer senere, og måltbakteriell byrde over tid (Figur 1 og figur 2). Et representativt bilde innhentet ved hjelp av et optisk bildesystem viser at denne modellen resulterer i påvisbar luminescens (figur 3A). Infeksjonen nådde toppen på dag 3 etter inokulasjon og vedvarte 7 dager etter inokulasjon basert på både bioluminescence og kolonitelling (figur 3B-C). Ved hjelp av denne modellen, er vi i stand til å pålitelig generere sår som varer 7-10 ays avhengig av bakteriestammen og musebakgrunnen. Kultur av bakterier isolert fra såret viste at kvantifisert CFU / sår korrelert med oppdaget luminescens (Figur 3D). Til slutt, til tross for påviselig og kvantifiserbar P. aeruginosa infeksjon, overlevde mus i minst 7 dager. Selv om det var innledende raskt vekttap umiddelbart etter infeksjon, gain injeksjoner og supplerende ernæring resulterte i restaurering av vekt (Figur 3E). Til slutt beregnet vi inokulasjonsdosen der 50% av sårene ville bli bærekraftig smittet med PAO1. Den beregnede IC50-verdien var ~7,7 x 102 CFU/ml. Doser høyere enn 104 CFU/ml resulterte i 100 % infeksjonsrate(figur 3F). Disse resultatene ble tilpasset fra tidligere publiserte data13.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk skildrer den eksisjonelle sårinfeksjonsmodellen med forsinket inokulasjon med bioluminescerende P. aeruginosa. Streak PAO1: lux på dag -2. Velg en koloni på dag -1 og vokse over natten i LB kjøttkraft. Utfør eksisjonssårkirurgi på dag -1. På dag 0, inokulere med PAO1: lux ved å injisere i sårsengen gjennom gjennomsiktig filmdressing. Utfør bioluminescensavbildning etter inokulasjon. Gjenta bildebehandling så ofte som daglig til og med dag 7-10. På dag 7-10, ofre dyr og høste sår. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk for eksisional sårkirurgi. Etter hårfjerning og sterilisering av hud med alkohol og betain, bruk en 6 mm biopsi slag for å gjøre et første snitt gjennom epidermis av venstre og høyre dorsum. Bruk saks og tang for å fjerne dermal og epidermal lag. Vask med PBS. Dekk med en klar dressing. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: S. aeruginosa sårinfeksjon kan oppdages gjennom 7 dager med infeksjon. (A) Representativt bilde av en mus infisert med PAO1: lux med bioluminescence overlegg på excisional sår. (B) Selvlysende signal som reflekterer sår bakteriell byrde. N = 6 sår. Inokulasjon: 105 CFU/ml PAO1. (C)Lineær regresjonsanalyse av in vivo selvlysende signal og bakteriell CFU av PAO1: lux-infiserte sår, samlet 4–7 dager etter inokulasjon med 105 CFU/ml for å tillate en rekke bakterielle byrder. (D) Bakteriell byrde i CFU/sår over tid hos mus infisert med 105 CFU/ml PAO1:lux. (E) Vektendring (i forhold til vekt før såreksisjonskirurgi på T = -1) N = 4 mus/gruppe. Avbildet er boxplots for 5-95 persentil. Statistikk er Toveis ANOVA korrigert med Sidak flere sammenligning. (F) Ikke-lineær regresjonsanalyse av sårinfeksjonsrate som brukes til å beregne IC50 for PAO1 tre dager etter inokulasjon. Alle grafer er representative for n≥3 eksperimenter. Dette tallet er endret fra Sweere et al. 201913. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har utviklet en ny forsinket inokulasjon P. aeruginosa sår infeksjon modell. Strategien om å forsinke inokulasjon med bakterier til 24 timer etter eksisional såret muliggjør evaluering av sårinfeksjoner over en 1-ukers tidsramme. Ved å bruke en selvlysende stamme av P. aeruginosa, er det mulig å spore infeksjonsprogresjon gjennom infeksjonskurset. Jo lenger infeksjonsforløpet sammenlignet med andre P. aeruginosa infeksjonsmodeller vil tillate nye muligheter for å studere host-patogen interaksjoner og nye terapier rettet mot P. aeruginosa sårinfeksjoner. For eksempel har vi allerede brukt denne modellen til å demonstrere rollen som Pf-bakteriofager i å stimulere en antiviral immunrespons som gjør det mulig for P. aeruginosa å unngå vertsimmunsystemet14.

Inkluderingen av 24 h utvinning ser ut mellom eksisional sår kirurgi og bakteriell inokulasjon er et kritisk skritt i denne sårinfeksjonsmodellen. Det gjør at dyrene kan komme seg etter såroperasjonen før de blir smittet, noe som sannsynligvis spiller en rolle i deres evne til å overleve gjennom minst 7 dager. Videre støtter den dannelsen av en foreløpig sårmatrise før inokulasjon, som i kombinasjon med den gjennomsiktige filmdressingen gir et miljø som bidrar til biofilmdannelse. Vi utførte en rekke utforskende eksperimenter under utviklingen av denne modellen som ser på ulike mengder tid mellom såret og inokulasjon. Etter vår erfaring, umiddelbar inokulasjon etter såret ofte resulterer i sepsis og død. Omvendt førte inokulasjon på 48 timer og senere tidspunkter til uakseptable nivåer av heterogenitet mellom mus og mellom sår på samme mus. Som tydelig i figur 3A, kan det fortsatt være en viss grad av forventet heterogenitet i bakteriell belastning av infiserte sår, selv med 24-h forsinket inokulasjon. En måte å kompensere for dette på er å bruke flere dyr i hvert eksperiment.

Et unikt aspekt ved denne protokollen er utskjæring av to sår uavhengig i stedet for å brette huden ned midtlinjen og slå gjennom for å skape to bilaterale sår, som det gjøres i noen andre sårmodeller. Vi fant ut at denne sammenleggbare metoden også var effektiv for å produsere symmetriske sår med rene marginer. Men mus behandlet på denne måten ble vanligvis septisk raskt etter bakteriell inokulasjon og døde. Vi tror at dette kan skyldes at denne sammenleggbare metoden fjerner dermal Panniculus carnosus - et tynt lag av muskel underliggende huden av mus som ikke er tilstede hos mennesker. Vi spekulerer i at denne barrieren kan bidra til å forhindre bakteriell spredning.

En viktig del av denne protokollen er tilstrekkelig hårfjerning fra operasjonsstedet, da overflødig hår kan gi en nidus for superinfeksjon og forstyrrer overholdelse av gjennomsiktig filmdressing. Vi har funnet ut at barbering i tillegg til hårfjerningkrem gir optimal hårfjerning med minimal hudirritasjon, men grundig vasking av kremen med varmt vann er fortsatt viktig.

En annen integrert faktor er ernæringsmessig støtte, hydrering og smertekontroll i løpet av de første dagene av postkirurgisk og infeksjonskurs. For å løse dette administrerer vi 500 μL subkutan 0,9 % natriumklorid på dag -1 og 0, deretter 250 μL på dag 1 og 2. Vi leverer også et multivitamin og kaloriflytende gelsupplement på tidspunktet for eksisjonssårkirurgien. Som vist i figur 3E,gir disse tiltakene tilstrekkelig gjenvinning av vekt etter dag 3. Med hensyn til analgesi, har vi funnet ut at vedvarende frigjøring 0,5 mg / kg buprenorfin gitt før eksisjonssårkirurgi gir tilstrekkelig smertekontroll i 72 timer, men ytterligere doser kan gis hvis garantert basert på funn av nød i en individuell mus.

Selv om en modell av P. aeruginosa sårinfeksjon som strekker seg til 7-10 dager er en betydelig fordel over mer akutte modeller for infeksjon, kan dette fortsatt ikke være tilstrekkelig for å svare på visse forskningsspørsmål som involverer mer kroniske infeksjoner. En grunn til denne begrensningen er at det selvlysende signalet til PAO1: lux-stammen til P. aeruginosa topper på dag 2-3 (figur 3B). Etter ~7 dager luciferase signalet kan bli upålitelig. Av denne grunn kvantifiserer vi bakteriene ved plating sår avløpsvann på LB plater og telle CFUer for å bekrefte infeksjon av hvert sår på slutten av eksperimentet. En annen mulig ulempe med denne modellen er kravet til et in vivo bildesystem, som noen laboratorier kanskje ikke har tilgang til. En vei rundt denne hindringen er å bruke ikke-lumen vill type bakteriellstammer. Dette gjør det fortsatt mulig for forskeren å dra nytte av denne kroniske infeksjonsmodellen, og som angitt ovenfor kan bakterie-CFUene kvantifiseres på slutten av eksperimentet.

Vi har beskrevet en ny modell av forsinket inokulasjon P. aeruginosa sårinfeksjon som gjør det mulig for eksperimenter som strekker seg til 7-10 dager. Denne modellen vil tjene som et nyttig verktøy for å evaluere host-patogen interaksjon med P. aeruginosa, samt utvikling av nye terapier. Denne modellen har potensial for flere fremtidige retninger, inkludert tilpasning for andre sår patogener som Staphylococcus aureus,samt polymikrobielle infeksjoner inkludert P. aeruginosa kombinert med andre patogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.

Acknowledgments

Den pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 selvlysende konvektoren var en nådig gave fra J. Hardy. Skjemaer ble opprettet med BioRender.com. Vi takker laboratoriet til G. Gurtner for deres råd om sårinfeksjonsmodellen. Vi takker også T. Doyle fra Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging for hans tekniske ekspertise. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, og tilskudd fra Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust og Cystic Fibrosis Foundation (CFF) til P.L.B. C.R.D ble støttet av T32AI007502. En Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering og en Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship støttet J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13, (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25, (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85, (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3, (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80, (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21, (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20, (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190, (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202, (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89, (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363, (6434), (2019).
En forsinket inokulasjonmodell av <em>kroniskpseudomonas aeruginosa</em> sårinfeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter