Summary
우리는 면역 적격 마우스에서 만성 상처 감염을 생성하기위한 지연 접종 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
슈도모나스 녹농균(P.aeruginosa)은특히 당뇨병 및 입원 환자에서 만성 상처 감염의 설정에서 인간의 건강과 질병에 대한 관련성을 증가시키는 주요 항균 병원체이다. 상처 병인의 조사와이 병원체에 대한 새로운 치료법의 개발을 돕기 위해 만성 감염 모델이 절실히 필요합니다. 여기서, 우리는 전체 두께 의외감 후 24시간 지연된 접종을 사용하는 프로토콜을 기술한다. 이 때 존재하는 잠정적인 상처 매트릭스의 감염은 감염의 급속한 통관 또는 보급을 포리스트로 하고 대신 이물질 또는 면역 억제의 이식의 필요 없이 7-10 일 지속되는 만성 감염을 설치합니다. 이 프로토콜은 인간에 있는 수술 후 감염의 전형적인 시간적 과정을 모방합니다. 발광 P. aeruginosa 긴장의 사용 (PAO1:lux) P. aeruginosa 상처 감염에 대 한 세균 성 부담의 정량적 매일 평가 에 대 한 허용. 이 새로운 모형은 만성 P. aeruginosa 상처 감염을 위한 세균성 병인 그리고 새로운 치료의 발달의 조사에 있는 유용한 공구일지도 모릅니다.
Introduction
슈도모나스 aeruginosa (P. aeruginosa)인간의 건강과 질병에 대한 관련성을 증가와 그람 음성 막대 모양의 박테리아입니다. 그것은 면역 손상환자에서특히 상처 감염을 포함, nosocomial 설정에서 광범위한 사망률과 사망률에 대한 책임이1,2. 이 병원체의 다제내성 균주의 출현은 P. aeruginosa 독성, P. aeruginosa 항생 저항의 기계장치 및 이 치명적인 감염의 예방 및 처리를 위한 새로운 방법에 기여하는 요인에 대한 조사를 위한 추가 자극을 제공했습니다3. 이와 같이, 이러한 연구 질문을 조사 하기 위한 도구로 만성 상처 감염의 동물 모델에 대 한 필요성은 그 어느 때 보 다 더 큰 되었습니다.
불행하게도, P. aeruginosa 감염의 많은 동물 모델은 패혈증4,5로인한 감염의 급속한 해상도 또는 급속한 감소로 급성 감염을 시뮬레이션하는 경향이 있으며, 이는 이러한 감염의 종종 만성 적 특성을 적절히 시뮬레이션하지 못한다. 이러한 단점을 해결하기 위해 일부 모델은 한천 비드, 실리콘 임플란트 또는 알긴산 겔6,7,8과같은 이물질의 이식을 활용한다. 다른 모델은 고령, 비만 또는 당뇨병으로 인해 면역 손상되는 마우스를 사용하거나, 사이클로포스파미드 유도 호중구 감소증9,10,11,12와같은 약리학적 수단을 통해 사용한다. 그러나, 외국 물자 또는 면역 손상된 호스트의 사용은 가능성이 그렇지 않으면 일반적인 면역 계통을 가진 호스트에 있는 만성 상처 감염에서 관련시킨 병리생리학의 이해를 얻기 어렵게 만드는 현지 선동적인 프로세스를 변경합니다.
우리는 절제 상처 후 박테리아와 지연 접종을 포함 하는 쥐에 P. aeruginosa 상처 감염의 만성 모델을 개발 했습니다. 연기된 접종은 적어도 7 일까지 연장하는 세균성 부담을 평가하는 실험을 허용합니다. 이 모형은 P. aeruginosa 만성 감염의 병인 그리고 새로운 처리 둘 다 조사하기를 위한 새로운 기회를 엽니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 박테리아의 준비 와 성장
- 연구원의 기관 생물 안전 위원회 및 동물 사용 위원회 지침에 따라 BSL-2 예방 조치와 P. aeruginosa 및 동물과 함께 모든 작업을 수행. 마우스 접종을 포함하여 P. aeruginosa와관련된 모든 단계를 생물 안전 성 캐비닛에 수행하십시오.
- P. aeruginosa의 발광 PAO1:lux 변형은 요청에 따라 저희 실험실에서 구할 수 있습니다. 리소제니 브로스 (LB) 한천에 냉동 글리세롤 스톡으로 보관된 Streak PAO1. 발광 PAO1:lux 변형의 경우, LB 한천은 선택적 항생제 (100 μg / mL 카베니실린 및 12.5 μg / mL 카나마이신)를 포함해야합니다. 세균 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 자랍니다.
- 분리된 콜로니를 선택하고 3 ml LB 배지, pH 7.4에서 37°C에서 하룻밤 동안 성장한다. 발광 균주의 경우, 국물은 100 μg / mL 카베니실린을 포함해야합니다. 흔들림, 에어로빅 조건하에서 자랍니다.
2. 절차 준비
- 수술을 수행하는 모든 직원이 깨끗한 가운 / 실험실 코트, 얼굴 마스크, 헤어 그물 및 장갑을 착용하게하십시오.
- 가위와 집게를 포함한 모든 수술 도구를 오토클레이브합니다. 무균 기술을 사용하여 동물 사이의 도구를 살균하십시오.
- 에탄올로 수술 테이블을 청소하고 깨끗한 수술 장을 준비하십시오.
3. 제모
- 1%-3% 이소플루란을 사용하여 8-12주 된 C57BL/6J 마우스를 마취시다. 조사관은 isoflurane를 사용할 때 마취에 대한 기관의 수의학 직원 지침을 따라야합니다.
- 마취를 시작하여 1%-3% 이소플루란을 제공하고 산소 유량을 1.5L/min로 조정합니다.
- 마취의 깊이를 평가하기 위해 마우스의 발가락을 꼬집습니다. 마우스가 더 이상 자극에 반응하지 않는 경우, 유도 챔버에서 제거하고 이소플루란 코 콘에 코와 수술 벤치에 배치.
- 두 눈에 안구 윤활제를 바르습니다.
- 베이스라인 사전 프로시저 무게를 얻기 위해 마우스를 무게.
- 마우스를 취약한 위치에 놓습니다. 마우스를 미리 데운 멸균 0.9% 염화나트륨, 각 측면에 250 μL로 피하 주사하여 총 500 μL.
- 전기 면도기로 마우스의 등가 부위를 면도합니다. 면도는 상처의 모발 오염을 방지하기 위해 수술 실과 다른 위치에서 발생해야합니다.
- 제모 로션의 얇은 층을 적용합니다. 로션을 20-60s. 따뜻한 물에 적신 거즈로 머리카락과 과도한 로션을 제거하십시오. 제모 후, 절제 상처 절차를 진행하십시오.
4. 전체 두께 절제 상처 수술
- 마우스의 중간 등쪽 영역에서 25 G 바늘을 사용하여 서지속 방출 buprenorphine 0.6-1 mg/kg을 피하 주사. 느린 방출 buprenorphine 이상 통증 완화를 제공 48-72 시간.
- 수술 부위를 소독하십시오. 멸균 베타딘 면봉으로 등지 표면을 닦으소. 멸균 알코올 면봉으로 여분의 베타딘을 닦으소서. 이것은 3 번 (베타 딘과 알코올 을 번갈아 가며) 중앙에서 가장자리로 이동하여 스와핑해야합니다. 공기가 건조되도록 하십시오.
- 멸균 거즈 또는 플라스틱 집착 랩을 사용하여 수술 부위를 둘러싼 드레이프를 만듭니다.
- 스트레칭 피부 팽팽한 caudally. 멸균 6mm 직경의 피부 생검 펀치를 사용하여 왼쪽 등쪽 표피를 통해 초기 절개를 합니다. 오른쪽 등도 표피에 반복합니다.
- 포셉을 사용하여 왼쪽 윤곽이 있는 상처 부위의 중앙에서 피부를 텐트로 막습니다. 가위를 사용하여 표피와 진피 층을 절제하십시오. 오른쪽 윤곽이 있는 상처 부위에서 반복하여 대칭적인 절제 상처를 만듭니다.
- 멸균 식염수 50 μL로 상처를 씻으소서. 수술 부위와 주변 피부가 공기 건조되도록 하십시오. 그런 다음 상처와 도르섬을 투명 필름 드레싱으로 덮습니다.
- 깨끗한 케이지에 마우스를 다시 놓습니다. 케이지 당 1 개의 동물을 집.
- 가열 패드에 케이지를 놓고 마우스가 깨어날 때까지 모니터합니다.
- 여러 동물에 위의 수술을 수행 할 때, 동물 사이의 모든 수술 기구를 청소하는 뜨거운 비드 소독기를 사용합니다.
- 마우스가 수술 절차에서 회복하고 박테리아와 접종을 진행하기 전에 상처 위에 임시 상처 매트릭스의 형성을 위해 24 시간 허용.
5. P. aeruginosa와 접종
- 하룻밤 PAO1:lux 배양을 OD600 = 0.05 lb 배지의 75 mL에서 100 μg/mL카르베니실린을 함유하고 배양이 초기 기하수계 단계에 있을 때까지 박테리아를 성장시다(OD600 0.3). 이 약 2-3 시간이 소요됩니다.
- PBS에서 (7.5 ± 2.5) x 102 CFU / mL의 농도로 PAO1 : 럭스를 희석하십시오. 충분한 부피를 보장하고 실험 후 도금을 허용하기 위해 과잉 접종을 준비해야합니다. 시설 간에 운송하는 경우(예: 실험실에서 사육장까지), 누출 방지 상자에 이중 봉쇄를 사용하면 Biohazard로 명확하게 표시되어 있습니다.
- 동물 생물 안전 수준 2 (ABSL-2) 승인 된 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 승인 된 개인 보호 장비를 사용하여 P. aeruginosa 및 마우스와 함께 모든 작업을 수행하십시오. 계량 스케일과 같은 재사용 가능한 장비는 오염을 방지하기 위해 클링 랩으로 덮여있어야 합니다.
- 위에서 설명한 바와 같이 3 % 이소플루란을 사용하여 마취하십시오. 마우스를 계량하고 무게를 기록합니다. 마우스를 미리 데운 멸균 0.9% 염화나트륨, 각 측면에 250 μL로 피하 주사하여 총 500 μL.
- 마우스의 투명 필름 드레싱이 하룻밤 사이에 벗겨지면 결과있는 딱지를 조심스럽게 제거하고 새 드레싱을 입습니다.
- 500 μL 결핵 27 G 안전 캡 주사기를 사용하여 PAO1:lux 서스펜션의 40 μL을 각 상처에 투명 필름 드레싱을 통해 주입합니다. 반대측에서 교차 오염을 방지하기 위하여 다른 마우스는 비 접종/PBS 상처 통제를 위해 이용되어야 합니다.
- 가열 패드의 케이지에 마우스를 다시 놓고 깨어날 때까지 모니터합니다. 모든 마우스는 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 케이지에 개별적으로 보관해야합니다.
- 케이지 바닥에 음식 펠릿 사이에 끼어 있는 고칼로리 영양 보충제 페이스트를 제공합니다.
- 남은 접종을 사용하여 LB 한천 접시를 줄무늬로 놓습니다. 투여 된 박테리아의 수를 확인하기 위해 식민지를 계산합니다.
6. 감염된 상처의 생체 내 이미징
- 보조 용기 사용을 포함하여 이미징 기기에서 마우스를 수송하기 위한 BSL-2 격납 프로토콜을 따르십시오. 유도 챔버 또는 이미징 기기로 마우스를 옮기는 동안 동물 침구를 옮기거나 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.
- 3.1단계에서 기재된 바와 같이 유도 챔버에서 흡입된 1%-3% 이소플루란으로 마우스의 마취를 유도한다.
- 일단 마우스가 마취되면, 이소플루란 코 콘에 코를 가진 광학 화상 진찰 시스템의 화상 진찰 실에 있는 경향이 있는 위치에 놓습니다.
- 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
- 획득 파라미터는 동시에 이미지화되는 동물의 수와 생물 발광의 강도에 따라 달라집니다. 설정하는 기본 매개변수에는 노출 시간, 비닝, f/stop 및 시야(FOV)가 포함됩니다. 기본 시작 설정은 노출 시간 30초, 비닝 로우(2), f/stop 1.2 및 FOV 25입니다. 연구원의 필요에 따라 필요에 따라 이러한 설정을 조정합니다.
- 이미징 프로그램을 사용하여 발광 데이터를 분석합니다(재료 표참조). 발광은 마우스의 컬러 사진에 중첩된 가짜 색 이미지로서 표현될 것이다.
- 상처 부위에 관심 영역(ROI)을 생성하고 감지된 평균 플럭스(광자/초)를 측정합니다. 데이터는 광도(광자/초/cm²/스테라디안)로 보고될 수도 있지만 카메라에서 이미징 플랫폼의 거리가 이미징 사이에 일정하게 유지되는 한 플럭스는 충분합니다.
- 이미징 플랫폼의 임의 영역에 ROI를 생성하여 배경을 측정합니다. 초분의 배경 광자 수를 뺍니다.
- 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
- 감염 진행을 추적하기 위해 매일 위에서 설명한 대로 이미징을 수행합니다.
7. 수술 후 관리
- 연구원의 IACUC 프로토콜에 의해 설정 된 지침에 따라 마우스를 모니터링 합니다. 우리는 실험이 끝날 때까지 매일, 그 다음 격일로 처음 4 일 동안 모든 마우스를 모니터링합니다. BSC에서 수술 후 처음 4 일 동안 하루에 한 번 마우스를 무게. 감염 후 1일과 2일에 0.9% 염화나트륨 250 μL을 피하주사합니다.
- 구치진 자세, 처진 털, 혼수, 호흡 곤란, 안면 찡그린 얼굴, 체중 감소를 포함하여 마우스의 통증/고민 징후를 확인합니다.
- 동물이 건강이 악화되는 징후를 보이는 경우 수의사와 상의하십시오. 통증/고민의 악화 징후와 20% 이상의 체중 감소를 보이는 마우스는 안락사되어야 합니다.
8. 상처 절제
- 실험의 끝에서,CO2 흡입을 사용하여 마우스를 희생하고, 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다. 기관의 ABSL-2 프로토콜에 따라 동물 시체를 폐기하십시오.
- BSC에서 멸균 가위와 집게를 사용하여 상처 베드를 절제하십시오. 각 상처 베드를 1mL 멸균 PBS에 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브에 놓습니다. 상처 조직을 가위로 잘라내소. 모든 상처는 감염된 것으로 간주되지 않더라도 ASBL-2로 치료해야합니다.
- 4 °C에서 2 시간 동안 300 rpm에서 셰이커에 인큐베이션합니다. 10 s에 대 한 각 튜브를 소용돌이 하 고 연속적으로 PBS에서 세균 유출물을 희석. LB 한천에 희석된 세균 유출물을 플레이트하여 세균 부담을 열거한다.
- 상처의 발광 신호가 배경 발광 이상이고 더 많은 박테리아가 PBS로 접종 된 상처보다 상처 유출물에서 발견되면 감염된 상처를 고려하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
luxABCDE 리포터 시스템(PAO1:lux)을 코딩하는 플라스미드와 함께 PAO1의 발광 균주를 사용하여, 우리는 마우스에 절제상처를 수행하고, 플랑크토닉 P. aeruginosa 24 시간 후에 이러한 상처를 접종하고, 시간이 지남에 따라 세균 부담을 측정하였다(도1 및 그림 2). 이미징 광학 시스템을 사용하여 얻어진 대표적인 이미지는 이러한 모델이 검출 가능한 발광을 초래한다는 것을보여준다(도 3A). 감염은 3일째에 정점에 이르렀고 생물 발광 및 식민지 수모두에 기초하여 7일 후 접종 을 지속하였다(그림3B-C). 이 모델을 사용하여 박테리아의 변형과 마우스 배경에 따라 7-10 ays 지속되는 상처를 안정적으로 생성 할 수 있습니다. 상처로부터 분리된 박테리아의 배양체는 검출된 발광과 상관관계가 있는 CFU/상처를 정량화한 것으로나타났다(도 3D). 마지막으로, 입증 가능하고 정량화 가능한 P. aeruginosa 감염에도 불구하고, 마우스는 적어도 7 일 동안 살아남았습니다. 비록 감염 직후 에 초기 급속 한 체중 감소 했다, 식염수 주사 및 보충 영양 체중의 복원 귀착되 었어(그림 3E). 마지막으로, 우리는 상처의 50 %가 PAO1에 지속 가능하게 감염될 수있는 접종 용량을 계산했습니다. 계산된 IC50 값은 ~7.7 x 102 CFU/mL이었다. 104 CFU/mL 보다 높은 복용량 결과 100% 감염 률(그림 3F). 이러한 결과는 이전에 게시된 데이터13에서수정되었습니다.
도 1: 생체 발광 P. aeruginosa를가진 연기한 접종을 가진 절제된 전체 두께 상처 감염 모형을 묘사하는 회로도. 행진 PAO1 :럭스 에 일 -2. 1일째에 식민지를 선택하고 LB 국물에서 하룻밤 동안 자랍니다. 1일째에 절제 상처 수술을 실시하십시오. 0 일째에 투명 필름 드레싱을 통해 상처 침대에 주입하여 PAO1:lux로 접종하십시오. 접종 후 생물 발광 이미징을 수행합니다. 7-10일까지 매일 이미징을 반복합니다. 7-10일째에 동물을 희생하고 상처를 수확하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 절개 상처 수술의 개략적. 알코올과 베타딘으로 피부를 제모하고 살균 한 후 6mm 생검 펀치를 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 도르섬의 표피를 통해 초기 절개를합니다. 가위와 집게를 사용하여 진피 와 표피 층을 제거하십시오. PBS로 씻으시다. 투명한 드레싱으로 커버합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: P. aeruginosa 상처 감염은 감염의 7 일을 통해 검출될 수 있습니다. (A)PAO1:lux에 감염된 마우스의 대표적인 이미지로, 절제상처에 생물발광 오버레이가 있다. (B)발광 신호는 상처 세균 부담을 반영합니다. N = 6 상처. 접종: 105 CFU/mL PAO1. (C)생체 내 발광 신호 및 PAO1:lux 감염 상처의 선형 회귀 분석, 수집 4-7 일 후 접종 후 105 CFU/mL 세균 부담의 범위를 허용. (D)10 5 CFU/mL PAO1:lux에 감염된 마우스에서 시간이 지남에 따라 CFU/상처에 세균 부담이 있습니다. (E)체중 변화 (T = -1에 상처 절제 수술 전에 무게에 상대) N = 4 마우스 / 그룹. 묘사된 것은 5-95백분위수의 박스플롯입니다. 통계는 시닥 다중 비교로 수정된 양방향 ANOVA입니다. (f)접종 후 3일 동안 PAO1에 대한 IC50을 계산하는데 사용되는 상처 감염률의 비선형 회귀 분석. 모든 그래프는 n≥3 실험을 대표합니다. 이 수치는 Sweere 외. 201913에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 새로운 지연 접종 P. aeruginosa 상처 감염 모델을 개발했습니다. 절제 상처 후 24 시간까지 박테리아와 접종을 연기하는 전략은 1 주 기간 동안 상처 감염의 평가를 가능하게합니다. P. aeruginosa의발광 균주를 사용하여 감염 과정 전반에 걸쳐 감염 진행을 추적 할 수 있습니다. 다른 P. aeruginosa 감염 모형에 비해 감염의 더 긴 과정은 P. aeruginosa 상처 감염을 표적으로 하는 호스트 병원체 상호 작용 및 새로운 치료를 공부를 위한 새로운 기회를 허용할 것입니다. 예를 들어, 우리는 이미 P. aeruginosa가 숙주 면역 계통14를회피하는 것을 허용하는 항바이러스 면역 반응을 자극하는 Pf 박테리오파지의 역할을 입증하기 위하여 이 모델을 이용했습니다.
절제 상처 수술과 세균 접종 사이의 회복 시간 24 시간을 포함하는 것은이 상처 감염 모델에서 중요한 단계입니다. 그것은 동물이 감염되기 전에 상처 수술에서 회복 할 수 있습니다, 이는 가능성이 적어도 통해 생존 할 수있는 능력에 역할을 7 일. 또한, 그것은 투명 필름 드레싱과 함께 생물 막 형성에 도움이되는 환경을 제공하는 접종 전에 임시 상처 매트릭스의 형성을 지원합니다. 우리는 상처와 접종 사이의 다른 시간을보고이 모델의 개발 중에 탐구 실험의 시리즈를 수행. 우리의 경험에서, 상처 후 즉각적인 예방 접종은 종종 패혈증과 죽음을 초래합니다. 반대로, 48 시간 및 나중에 시점에서 접종은 마우스 사이 와 같은 마우스에 상처 사이 이질성의 허용 할 수없는 수준으로 이어졌다. 그림 3A에서알 수 있듯이, 24-h 지연 접종에도 불구하고 감염된 상처의 세균 부하에서 어느 정도 예상되는 이질성이 있을 수 있습니다. 이를 보완하는 한 가지 방법은 각 실험에서 여러 동물을 사용하는 것입니다.
이 프로토콜의 독특한 측면은 다른 상처 모델에서와 같이 두 개의 양측 상처를 만들기 위해 피부를 미드 라인 아래로 접고 펀칭하는 대신 독립적으로 두 개의 상처를 절제하는 것입니다. 우리는 이 접는 방법이 깨끗한 여백을 가진 대칭적인 상처를 생성하기 위한 효과적이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 그러나, 이러한 방식으로 처리된 마우스는 전형적으로 세균 접종 후 신속하게 패혈증이 되어 죽었다. 우리는 이 접는 방법이 인간에서 존재하지 않는 마우스의 피부를 근간이 되는 근육의 얇은 층인 진피 판니큘러스 카르누스를 제거하기 때문일 수 있다고 믿습니다. 우리는이 장벽 세균 성 보급을 방지 하는 데 도움이 수 있습니다 추측.
이 프로토콜의 중요한 구성 요소는 과도한 모발이 과다 감염을위한 nidus를 제공하고 투명 필름 드레싱의 준수를 방해 할 수 있기 때문에 수술 부위에서 충분한 제모입니다. 우리는 제모 크림 이외에 면도가 최소한의 피부 자극으로 최적의 제모를 제공한다는 것을 발견했습니다, 그러나 온수로 크림을 철저히 씻는 것은 여전히 중요합니다.
또 다른 필수적인 요소는 수술 후 및 감염 과정의 처음 며칠 동안 영양 지원, 수분 공급 및 통증 조절입니다. 이 문제를 해결하기 위해 피하 0.9% 염화나트륨 500 μL을 1일과 0일, 1일과 2일에는 250 μL로 투여합니다. 우리는 또한 절제 상처 수술 시 종합 비타민 과 칼로리 액체 젤 보충제를 공급합니다. 그림 3E에서설명한 바와 같이, 이러한 측정은 3일째까지 체중을 적절히 회복할 수 있도록 한다. 진통에 관하여, 우리는 흥분상처 수술 이전에 주어진 서방성 방출 0.5 mg/kg buprenorphine가 72 시간 동안 충분한 고통 통제를 제공한다는 것을 것을을 발견했습니다, 그러나 추가 복용량은 어떤 개별 마우스에 있는 고민의 사실 인정에 근거를 둔 보증하는 경우에 주어질 수 있습니다.
P. aeruginosa 상처 감염의 모델은 7-10 일까지 연장하는 감염의 더 심각한 모형에 중요한 이점이지만, 이것은 아직도 더 만성 감염을 관련시키는 특정 연구 질문에 대답하기를 위해 충분하지 않을 수 있습니다. 이러한 제한에 대한 한 가지 이유는 PAO1:lux 스트레인의 발광 신호가 2-3일째에 피크가 된다는 것이다(도3B). ~ 7 일 후 루시퍼라아제 신호가 신뢰할 수 없게 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 LB 판에 상처 유출물을 도금하고 실험의 끝에 각 상처의 감염을 확인하기 위해 CFUs를 계산하여 박테리아를 정량화. 이 모형의 또 다른 가능한 단점은 몇몇 실험실이 접근할 수 없는 생체 내 화상 진찰 시스템에 대한 요구 사항입니다. 이 장애물 주위에 한 가지 방법은 비 발광 야생 형 세균 성 균주를 사용하는 것입니다. 이것은 아직도 연구원이 만성 감염 모형을 이용하는 것을 허용하고, 위에 표시된 대로, 박테리아 CFUs는 실험의 끝에 정량화될 수 있습니다.
우리는 7-10 일까지 연장하는 실험을 가능하게 하는 연기된 접종 P. aeruginosa 상처 감염의 새로운 모형을 기술했습니다. 이 모형은 P. aeruginosa를가진 호스트 병원체 상호 작용을 평가하기 위한 유용한 공구로, 뿐만 아니라 새로운 치료의 발달로 봉사할 것입니다. 이 모형은 황색포도상구균과같은 그밖 상처 병원체를 위한 적응을 포함하여 다중 미래 방향을 위한 잠재력을 가지고 있습니다, 뿐만 아니라 P. aeruginosa를 포함하여 polymicroal 감염은 그밖 병원체와 결합했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 발광 구조 벡터는 J. 하디의 은혜로운 선물이었습니다. 회로도는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 우리는 상처 감염 모델에 대한 조언에 대한 G. Gurtner의 실험실에 감사드립니다. 우리는 또한 그의 기술 적 전문성에 대한 비보 이미징의 혁신을위한 스탠포드 센터에서 T. Doyle 감사합니다. 이 작품은 보조금 R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, 스탠포드 SPARK에서 보조금, 포크 의료 연구 신탁 및 낭포성 섬유증 재단 (CFF) P.L.B. C.R.D에 의해 지원되었다 T32AI070에 의해 지원되었다. 과학 및 공학에 대한 개빌란 스탠포드 대학원 펠로우십과 루버트 스트라이커 바이오-X 스탠포드 학제 간 대학원 동호회는 J.M.S를 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection | Hospira | 2484457 | |
| 18 G x 1 sterile needle | BD | 305195 | |
| 25 G x 1 1/5 sterile needle | BD | 305127 | |
| Alcohol swab | BD | 326895 | |
| Aura Imaging Software | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| Betadine | Purdue Frederick Company | 19-065534 | |
| Buprenorphine SR LAB | Zoopharm | n/a | |
| C57BL/6J male mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Disposable biopsy punch, 6mm | Integra | 33-36 | |
| Fine scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Glass Bead Dry Sterilizer | Harvard Apparatus | 61-0183 | |
| Granulated Agar | Fisher BioReagents | BP9744 | |
| Heating Pad | Milliard | 804879481218 | |
| Insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| Lago X Imaging System | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| LB broth | Fisher BioReagents | BP1426 | |
| Leur-Lok 1 mL syringe | BD | 309628 | |
| Mini Arco Animal Trimmer | Wahl Professional | 919152 | |
| Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil | Church and Dwight | n/a | Available at any pharmacy |
| Octagon Forceps | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Press and Seal Cling Wrap | Glad | n/a | |
| SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle | BD | 305934 | |
| Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
| Scale | Ohaus Scout Pro | SP202 | |
| Supplical Nutritional Supplement | Henry Schein Animal Health | 29908 | |
| Tegaderm, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).
- Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
- Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85 (1), (2017).
- Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).
- Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
- van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).
- Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).
- Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
- Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).
